KR20080107353A - 발광성의 비인간 형질전환 동물들과 그 자손 및 세포유도체들, 및 이들의 용도 - Google Patents
발광성의 비인간 형질전환 동물들과 그 자손 및 세포유도체들, 및 이들의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20080107353A KR20080107353A KR1020087016720A KR20087016720A KR20080107353A KR 20080107353 A KR20080107353 A KR 20080107353A KR 1020087016720 A KR1020087016720 A KR 1020087016720A KR 20087016720 A KR20087016720 A KR 20087016720A KR 20080107353 A KR20080107353 A KR 20080107353A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell
- cells
- progeny
- human transgenic
- photina
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 41
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 310
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 claims description 101
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 claims description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 65
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 60
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 49
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 43
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 41
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 40
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 33
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 25
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 18
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 17
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 16
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 12
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 11
- 108010089402 phialidin Proteins 0.000 claims description 11
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 10
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 8
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 claims description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 2
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 claims 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 4
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 82
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 101710122864 Major tegument protein Proteins 0.000 description 46
- 101710148592 PTS system fructose-like EIIA component Proteins 0.000 description 46
- 101710169713 PTS system fructose-specific EIIA component Proteins 0.000 description 46
- 101710199973 Tail tube protein Proteins 0.000 description 46
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 46
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 36
- 241000566742 Photina Species 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 34
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 33
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 33
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 29
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 28
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 16
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 15
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 15
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 15
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 15
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 15
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 15
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 15
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 14
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 13
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 102000038650 voltage-gated calcium channel activity Human genes 0.000 description 9
- 108091023044 voltage-gated calcium channel activity Proteins 0.000 description 9
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 8
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 7
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 7
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 6
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 6
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 108010091047 neurofilament protein H Proteins 0.000 description 6
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 6
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 6
- 101150032244 uidB gene Proteins 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 102000005604 Myosin Heavy Chains Human genes 0.000 description 5
- 108010084498 Myosin Heavy Chains Proteins 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 5
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 5
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N Fluo-4 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(F)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 4
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 102000010825 Actinin Human genes 0.000 description 3
- 108010063503 Actinin Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 3
- 101150001754 Gusb gene Proteins 0.000 description 3
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 3
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 3
- 102100024007 Neurofilament heavy polypeptide Human genes 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 3
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 3
- 229940125400 channel inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 108010093301 halistaurin Proteins 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 3
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001597 nifedipine Drugs 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 2
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 101710128071 Mitrocomin Proteins 0.000 description 2
- 241001126922 Mnemiopsis Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241001455930 Obelia longissima Species 0.000 description 2
- 102000002584 Octamer Transcription Factor-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010068425 Octamer Transcription Factor-3 Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000001405 anti-neuronal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000003185 calcium uptake Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 108010023206 mnemiopsin Proteins 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- FDQZTPPHJRQRQQ-NZPQQUJLSA-N omega-conotoxin GVIA Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N4C[C@H](O)C[C@H]4C(=O)N1)=O)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1C[C@@H](O)CN1C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CSSC3)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1C[C@H](O)C[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N2)=O)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 FDQZTPPHJRQRQQ-NZPQQUJLSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 210000003014 totipotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 108091058553 ω-conotoxin GVIA Proteins 0.000 description 2
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 1
- ZKAMEFMDQNTDFK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-b]pyrazine Chemical compound C1=CN=C2NC=NC2=N1 ZKAMEFMDQNTDFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000037068 Abnormal Karyotype Diseases 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N Ala-Asp-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCCN PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IHMCQESUJVZTKW-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 IHMCQESUJVZTKW-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- DHONNEYAZPNGSG-UBHSHLNASA-N Ala-Val-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 DHONNEYAZPNGSG-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- RYRQZJVFDVWURI-SRVKXCTJSA-N Arg-Gln-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RYRQZJVFDVWURI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- POZKLUIXMHIULG-FDARSICLSA-N Arg-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N POZKLUIXMHIULG-FDARSICLSA-N 0.000 description 1
- BKDDABUWNKGZCK-XHNCKOQMSA-N Asn-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O BKDDABUWNKGZCK-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- KNMRXHIAVXHCLW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)C(=O)O KNMRXHIAVXHCLW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NRIFEOUAFLTMFJ-AAEUAGOBSA-N Asp-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O NRIFEOUAFLTMFJ-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- LBFYTUPYYZENIR-GHCJXIJMSA-N Asp-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N LBFYTUPYYZENIR-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N Asp-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- CTWCFPWFIGRAEP-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CTWCFPWFIGRAEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 241000700668 Beroe ovata Species 0.000 description 1
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 241000700108 Ctenophora <comb jellyfish phylum> Species 0.000 description 1
- YUZPQIQWXLRFBW-ACZMJKKPSA-N Cys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YUZPQIQWXLRFBW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 201000009051 Embryonal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000010180 Endothelin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050001739 Endothelin receptor Proteins 0.000 description 1
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010015719 Exsanguination Diseases 0.000 description 1
- OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N Fluo-3 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018715 GATA4 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010052320 GATA4 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- CYTSBCIIEHUPDU-ACZMJKKPSA-N Gln-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CYTSBCIIEHUPDU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- CGVWDTRDPLOMHZ-FXQIFTODSA-N Gln-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CGVWDTRDPLOMHZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- YHOJJFFTSMWVGR-HJGDQZAQSA-N Glu-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YHOJJFFTSMWVGR-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- CBWKURKPYSLMJV-SOUVJXGZSA-N Glu-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CBWKURKPYSLMJV-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- ZTNHPMZHAILHRB-JSGCOSHPSA-N Glu-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 ZTNHPMZHAILHRB-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NZOAFWHVAFJERA-OALUTQOASA-N Gly-Phe-Trp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O NZOAFWHVAFJERA-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N Gly-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- LDTJBEOANMQRJE-CIUDSAMLSA-N His-Cys-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N LDTJBEOANMQRJE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000726355 Homo sapiens Cytochrome c Proteins 0.000 description 1
- 241000243320 Hydrozoa Species 0.000 description 1
- ZLFNNVATRMCAKN-ZKWXMUAHSA-N Ile-Ser-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)O)N ZLFNNVATRMCAKN-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N Ile-Val-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004016 L-Type Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000420 L-Type Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTFHTMHHKXUYPW-ZPFDUUQYSA-N Leu-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KTFHTMHHKXUYPW-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N Leu-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 241000530268 Lycaena heteronea Species 0.000 description 1
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BRSGXFITDXFMFF-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N BRSGXFITDXFMFF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N Lys-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- YXTKSLRSRXKXNV-IHRRRGAJSA-N Lys-His-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCCN)N YXTKSLRSRXKXNV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IVFUVMSKSFSFBT-NHCYSSNCSA-N Lys-Ile-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IVFUVMSKSFSFBT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N Lys-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- GIKFNMZSGYAPEJ-HJGDQZAQSA-N Lys-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GIKFNMZSGYAPEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N Lys-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- PNDCUTDWYVKBHX-IHRRRGAJSA-N Met-Asp-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PNDCUTDWYVKBHX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101100013973 Mus musculus Gata4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241001102657 Obelia geniculata Species 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000025414 Pentalagus furnessi Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000577973 Peromyscus aztecus Species 0.000 description 1
- 241000144952 Peromyscus californicus Species 0.000 description 1
- WMGVYPPIMZPWPN-SRVKXCTJSA-N Phe-Asp-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N WMGVYPPIMZPWPN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DJPXNKUDJKGQEE-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DJPXNKUDJKGQEE-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 241000425347 Phyla <beetle> Species 0.000 description 1
- VDGTVWFMRXVQCT-GUBZILKMSA-N Pro-Glu-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 VDGTVWFMRXVQCT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- TZJSEJOXAIWOST-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N TZJSEJOXAIWOST-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N Thr-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N Thr-Ser-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- QAXCHNZDPLSFPC-PJODQICGSA-N Trp-Ala-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 QAXCHNZDPLSFPC-PJODQICGSA-N 0.000 description 1
- NLLARHRWSFNEMH-NUTKFTJISA-N Trp-Lys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N NLLARHRWSFNEMH-NUTKFTJISA-N 0.000 description 1
- JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- ZRSZTKTVPNSUNA-IHRRRGAJSA-N Val-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O ZRSZTKTVPNSUNA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 102000030619 alpha-1 Adrenergic Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020004102 alpha-1 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 150000001669 calcium Chemical class 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002057 chronotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000003459 common hepatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 231100000415 developmental toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007673 developmental toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 231100000994 embryonic stem cell test for embryotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001779 embryotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000238 embryotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000006362 insulin response pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 230000008567 mammal embryogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002779 membrane potential assay Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000441 neoplastic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012911 target assessment Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000015961 tonic Nutrition 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000716 tonics Drugs 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108091058550 ω-conotoxin Proteins 0.000 description 1
- KNJNGVKTAFTUFL-OCMUWRIYSA-N ω-conotoxin Chemical compound N([C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]1C(N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CSSC1)C(N)=O)=O)=O)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1 KNJNGVKTAFTUFL-OCMUWRIYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
본 발명은 생체내에서(in vivo) 아포광단백질(apophotoprotein)을 합성하고 발현시킬 수 있는 비인간 형질전환 동물과 그 자손 및 세포 유도체들, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생체내에서(in vivo) 아포광단백질(apophotoprotein)을 합성하고 발현시킬 수 있는 비인간 형질전환 동물들 및 이들의 용도에 관한 것이다.
줄기 세포들은 장기간 동안 세포 분할을 통해 스스로 재생할 수 있는 특화되지 않은 세포(unspecialized cell)들이다(참고 문헌 1 참조). 더욱이, 특정 생리적 또는 실험적 조건하에서, 줄기 세포들은 박동 심장근육세포(beating cardiomyocyte)들 또는 췌장의 인슐린-생성 세포들과 같은 상이한 세포 유형들로 분화될 수 있다(참고 문헌 2 및 3 참조).
줄기 세포들은 재분할될 수 있고, 이들의 효능(potency)에 기초하여 분류될 수 있다. 전능성(totipotent) 줄기 세포들은 난자 세포(egg cell)와 정자 세포(sperm cell)간의 융합으로부터 생성된다. 수정된 난자 세포의 최초의 극소수의 분할에 의해 생성된 세포들도 또한 전능성이다. 이들 세포들은 임의의 세포 유형으로 성장할 수 있다. 다능성(multipotent) 줄기 세포들은 전능성 세포들의 자손들이고, 전능성 세포들 이외의 임의의 세포 유형으로 분화될 수 있다. 다능성 줄기 세 포들은 밀접하게 관련된 패밀리(family) 세포들(예컨대, 적혈구 세포들, 백혈구 세포들 및 혈소판들과 같은 혈액 세포들)만을 생산할 수 있다. 선조(progenitor) 세포들[때로는 단성능(unipotent) 세포들이라 칭함]은 단지 하나의 세포 유형만을 생산할 수 있지만, 비(非)-줄기 세포들과 구별되는 자가-재생(self renewal) 특성을 가진다(참고 문헌 3-6 참조).
또한, 줄기 세포들은 이들의 근원(source)에 따라 성체 줄기 세포들과 배아 줄기 세포들로 분류될 수 있다. 성체 줄기 세포들은 특이 조직의 분화된 세포들 중에서 발견된 미분화 세포들이고, 대부분 다능성이며, 몇몇 한정된 수의 세포 유형들만을 생산할 수 있다. 또한, 이들은 신생 탯줄, 태반 및 양수 유도된 줄기 세포들을 포함한다. 또한, 이들은 신체 줄기 세포 또는 조직 줄기 세포라 불리우고, 분화된 조직들에서 발견되는데, 분화된 조직에서 조절된 방식으로 이들은 분화하고/분화하거나 분할하여, 이들이 발생하는 조직의 모든 특화된 세포 유형들을 생산한다(참고 문헌 7-9 참조).
배아 줄기 세포들은 생식 세포들을 비롯한 모든 유형의 특화된 세포들이 될 수 있는 잠재력을 가진다(다능성). 이들은 분화 없이 증식하는 것을 허용하는 조건하에 배양액에서 무한히 증식할 수 있는 능력을 가진다(참고 문헌 3 참조). 지금까지 설치류(rodent)와 인간으로부터 3가지 유형의 다능성 배아 줄기 세포들이 발견되었다.(참고 문헌 10 참조):
- 착상전 배반포(pre-implantation blastocyte) 단계의 배아의 내부세포괴(inner cell mass)로부터 유래한 배아 줄기(ES) 세포들. 이들은 통상적으로 핵 형(karyotype)이다. 몇몇 유형들의 마우스 및 인간 배아 줄기 세포들은 공지되어 있거나 또는 반포된 간행물에 기재되어 있는데, 마우스 ES TBV2, R1, D3 세포들이 그 예이다(참고 문헌 11-13 및 63 참조).
- 기형암(teratocarcinoma)들로부터 유래한 배아 암(EC) 세포들. 기형암들은 3가지 1차 배엽들(내배엽, 중배엽 및 외배엽)로부터 유래한 다양한 조직들내에 존재하는 다능성 줄기 세포들을 포함하는 생식샘 종양들이다. 가장 많이 사용되는 것들은 마우스 EC P19 세포주들이다. 이들 세포들은 통상의 핵형(karyotype)을 보유하지 않는다(참고 문헌 14-18 참조).
- 태아 생식 융선(foetal genital ridge)의 배양된 원시 생식 세포(Primordal Germ Cell, PGC)들로부터 유래한 배아 생식(EG) 세포들. 이들은 통상의 핵형(karyotype)을 보유하지만, 비정상적으로 유전적으로 각인된다(참고 문헌 19-22 참조).
ES 및 EG 세포들은 키메라 동물들을 야기시키는 수용자 마우스의 배반포들내에 주입될 수 있다. 키메라 마우스에서, 이들 다능성 세포들은 생식세포주(germ line)을 비롯한 모든 세포 유형에 기여할 수 있다(참고 문헌 20, 21, 23 및 24 참조). 이와는 대조적으로, 배아에 도입된 마우스의 EC 세포들은 대부분의 배아계(embryonic lineage)를 집락 형성시키지나, 하나의 실험적인 예외가 있기는 하지만 일반적으로 생식세포주를 집락 형성시키지 않는다(참고 문헌 25-27 참조). 기능적인 배우자들을 형성시킬 수 없는 EC 세포들의 무능은 대부분 유사하게 이들의 비정상적인 핵형을 반영한다(참고 문헌 28 참조). 줄기 세포들은 자가-재생 특성을 유지하면서 장기간 동안 생체외에서 배양 및 팽창될 수 있고, 소형화(miniaturization)될 수 있기 때문에, 고성능 스크리닝(HTS) 기법들을 위한 매우 강력한 도구이다. 이들은 순수 개체군 ES 세포들의 제조를 위한 선택가능하고 유도가능한 마커(marker)들의 사용을 허용한다. 유전자 표적화/동종 재조합 기법은 특이 유전자들의 녹 아웃(Knock Out, KO) 또는 녹 인(Knock In)을 허용한다. 또한, 배아 줄기 세포들은 1차 세포들을 닮은 임의의 세포 유형으로 분화될 수 있다(왜냐하며느 이들은 비종양 세포들이기 때문이다). 이와 같은 방식으로, 배아 줄기 세포들은 표적을 위한 자연 환경을 제공하고, 고유한 방식으로 조절 및 발현되는 (멀티-서브유닛 이온 채널들과 유사한) 복합 표적(complex target)들을 어드레스(address)할 수 있다. 이는 매우 중요한 개선(改善)인데, HTS 스크리닝에 있어서 통상적으로 세포에 기초한 검정(cell-based assay)들은 종양 세포주들을 이용하여 설정되며, 이러한 종양 환경이 생리적 세포 조건을 변경시킬 수 있다고 알려져 있기 때문이다.
다능성 배아 줄기 세포들의 이용은 약학 분야에 기본적인 역할을 하였다(참고 문헌 29 참조). 예를 들어, 표적 평가의 경우, 약물 발견에 있어서의 유전자 기능의 이해는 성공을 위한 기본이기 때문에, 마우스 ES 세포들은 KO(녹 아웃) 마우스에 비하여 보다 신속하고 비용이 덜 소요되는 도구에 해당한다. 또한, 치명적인 KO(녹 아웃)의 경우, ES 세포들의 이용은 유전자 기능 평가에 매우 도움이 될 수 있다.
또한, 줄기 세포들은 EVCAM(유럽 대체 시험법 검증 센터) 연구에 의해 긍정 적으로 평가된 배아 줄기 세포 시험(EST)에 사용되어 왔다. 이는 3가지 생식세포계(germ lineage)(내배엽, 중배엽 및 외배엽)로부터 생성된 세포 및 조직 분화시 약물에 대한 독성 및 기형의 시험이다. 또한, 줄기 세포들은 다능성 줄기 세포들의 분화에 의해 수득된 심장근육세포를 펄싱(pulsing)할 때의 변시성(chronotropic) 활동에 대한 약물들의 2차 효과들의 분석에 매우 중요하다. 이러한 종류의 시험은 독성학적 연구들에 사용되는 동물들의 수를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 유럽 연합에서는 현재 시판되는 최대 30000개의 화학약품이 앞으로 10년 내에 재평가되어야 한다. 이는 약 1000만개의 동물들의 사용을 의미한다. EST와 같은 생체외 시험의 개발은 이러한 의미에서 중요할 수 있으며, 또한 종래의 전체 동물을 그대로 사용하는 실험보다 시간이 덜 소요되면서 보다 많은 화학약품들을 시험하는 것을 허용할 수 있다(참고 문헌 30, 31 및 32 참조).
생물발광(bioluminescence)은 살아있는 생물체들에 의해, 또는 다양한 화학발광 반응 시스템들을 통해 살아있는 생물체들로부터 유래한 물질에 의해 가시광이 방사되는 현상이다. 생물발광 반응들은 다음과 같은 3가지 주요 성분들을 필요로 한다: 루시페린 (기질), 루시페라제 (효소) 및 분자상 산소(molecular oxygen). 그러나, 일부 반응에는 양이온들(Ca++ 및 Mg++) 및 보조 인자들(ATP, NAD(P)H)를 비롯한 다른 성분들도 필요할 수 있다. 루시페라제들은 기질인 루시페린의 산화를 촉매하는 효소이고, 불안정한 중간체를 생성시킨다. 불안정한 중간체가 분해되어 바닥 상태로 될 때 빛이 방사되고, 옥시루시페린이 생성된다. 적어도 7가지 문(phyla)으 로부터 유래한 다수의 종(種)들이 코엘렌테라진으로 알려진 동일한 루시페린을 사용할지라도, 서로 관련없는 다수의 상이한 유형의 루시페린이 존재한다. 일부 동물들(예컨대, 젤리피쉬)에 있어서, 루시페린/루시페라제 시스템은 칼슘 결합시 빛을 방사시키는 안정한 "광단백질(photoprotein)"의 형태로 추출될 수 있다. 광단백질들은 루시페라제와 루시페린의 안정화된 산소화 중간체 복합체들이라는 점에서 루시페라제와 상이하다. 광단백질들은 다수의 해양 강장동물에 존재하고, 이들 생물체들이 사육(breeding), 급식(feeding) 및 방어(defense)를 비롯한 여러 가지 목적을 위해 빛을 방사하도록 한다(참고 문헌 33 참조). 다수의 발광 생물체들이 존재하지만, 지금까지 단지 7가지 광단백질들, 즉 탈라시콜린(Thalassicolin)(참고 문헌 34 및 35 참조), 에쿼린(Aequorin)(참고 문헌 36, 37 및 38 참조), 미트로코민(Mitrocomin)[할리스타우린(Halistaurin)이라고도 불림](참고 문헌 39 및 40 참조), 클라이틴(Clytin)[피알리딘(Phialidin)이라고도 불림](참고 문헌 40 및 41 참조), 오벨린(Obelin)(참고 문헌 34, 38, 42 및 43 참조), 네미옵신(Mnemiopsin)(참고 문헌 44 및 45 참조) 및 베로빈(Berovin)(참고 문헌 44 및 45 참조)이 분리되었다. 이들 단백질은 모두 아포단백질, 이미다조피라진 발색단(즉, 코엘렌테라진) 및 산소에 의해 형성된 복합체들이다. 이들의 아미노산 서열들은 특히 3개의 칼슘 결합 부위들(EF-핸드 구조물들)을 함유하는 영역에서 고도로 보존된다. "광단백질"이란 용어는 발광 가능한 코엘렌테라진-결합 폴리펩티드를 의미하는데 반하여, "아포광단백질"은 코엘렌테라진이 없는 단백질을 의미한다.
가장 연구가 많이 된 광단백질들은 에쿼레아 빅토리아(Aequorea Victoria)로 부터 분리된 에쿼린(Aequorin)(참고 문헌 46 참조)과 오벨리아 롱기시마(Obelia longissima)로부터 분리된 오벨린(Obelin)(참고 문헌 47 참조)이다. 광단백질은 코엘렌테라진, 분자상 산소, EDTA, 및 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 또는 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 이용한 항온배양에 의해 아포광단백질로부터 재생될 수 있다. 코엘렌테라진은 광단백질들인 에쿼린(Aequorin), 미트로코민(Mitrocomin), 클라이틴(Clytin) 및 오벨린(Obelin)에 의해 사용되는 통상의 발광 기질이기 때문에, 발광 반응(light-emitting reaction)은 이들 4가지 광단백질들에 있어서 거의 같다(참고 문헌 48, 49, 50 및 51 참조).
세포 이벤트(cellular event)들과 이들의 조절에 대한 연구는 감작적이고, 비침습적이며, 분석적인 방법들을 필요로 한다. 광단백질, 및 일반적으로 생물발광의 이용은 우수한 리포터 시스템(reporter system)들인데, 이는 이들 시스템들이 발광 시스템들에 비하여 실제로 배경(background)가 없기 때문이다.
광단백질들은 세포 배양 시스템들에서 신호 전이(signal transduction) 및 유전자 발현과 연관된 세포 이벤트들을 모니터링하는 리포터 유전자들로서 광범위하게 사용된다(참고 문헌 33, 34 및 46 참조). 광단백질들은 포유동물 세포들에서 발현되어, 상이한 자극들에 대한 반응으로 칼슘 변화를 모니터링한다. 세포내 칼슘 농도는 아포광단백질을 발현시키고 광자(photon) 방사를 검출하는 포유동물 세포들에 보조 인자인 코엘렌테라진을 첨가함으로써 측정될 수 있는데, 광자 방사는 세포내 칼슘 농도를 나타내는 지표이다. 세포내 칼슘 농도의 조절과 관련된 수용체와 아포광단백질을 발현시키는 세포들의 이용은 세포내 칼슘의 방출에 대한 효과에 관 하여 화합물들을 스크리닝하기 위한 유효한 시스템을 제공한다.
고성능 스크리닝 검정(high throughput screening assay)들은 종종 리포터 시스템으로서의 광단백질을 이용하여 설계된다. 상기 시스템의 감작성(sensitivity) 및 상기 시스템의 높은 신호 대(對) 노이즈 비율은 작은 반응체량(assay-volume)의 사용을 허용한다.
칼슘 유량(calcium flux) 검정들은 통상적으로 다수의 샘플들의 동시 분석에 적합하고 발광 이미징 시스템(luminescence imaging system)들이 장착된 광학 스크리닝 장치를 이용하는 HTS 포맷(format)에서 수행된다.
그러나, HTS 검정에서 가장 많이 사용되는 기구들 중 하나인 FLIPR
[미국 캘리포니아주 써니베일 소재 Molecular Devices Corporation의 형광정량 이미징 평판 판독기(Fluorometric Imaging Plate Reader)]와 같은 형광정량 기구들을 이용하여, 예컨대 Fluo3, Fluo4, Fura2와 같은 형광성 칼슘 염료들과 칼슘 염료들(Molecular Devices and Molecular Probes)를 사용하여 칼슘 유량(calcium flux) 검정을 수행할 수도 있다. 상기 장치는 세포 단층(cell-monolayer) 상에서의 신호 분리를 허용함으로써 세포에 기초한 검정들에 대한 감작성을 증강시키는 광학 검출 소자가 장착되어 있다.
가장 최근의 FLIPR
버젼들은 비록 CCD-카메라에 기초한 장비들에 비하여 낮은 감작성을 가질지라도, 발광 검정들에도 적합하도록 제작되어 왔다. 이 시스템의 보다 낮은 발광 감작성을 극복하기 위하여, 증강된 발광을 갖는 광단백질들은 매우 유리하다.
본 발명자들은 아포광단백질(apophotoprotein)을 발현시킬 수 있는, 오리지날 게놈(original genome)의 유전자 변형(genetic modification)에 의해 수득된 비인간 형질전환 동물을 개발하였다. 가임신(pseudopregnant) 암컷 마우스의 섬유아세포에 아포광단백질을 발현시키는 배아 줄기 세포를 주입하고, 생성된 키메라(chimera)들을 야생형(wild type) 마우스들과 교배시킴으로써, 동물 모델로서의 형질전환 마우스를 수득하였다.
본 발명은 세포내 칼슘 농도 변화에 대한 반응으로 생물발광 신호(bioluminescent signal)를 생성시킬 수 있으며, 아포광단백질 유전자(apophotoprotein gene)를 발현시킬 수 있는 비인간 형질 전환 동물과 그 자손 및 이들의 세포 유도체들을 제공하는 것이다.
세포 유도체(cell derivative)는 1차 또는 줄기 세포, 수임 세포(committed cell), 분화 세포(differentiated cell), 세포 그룹(cell group), 조직 또는 기관인 의도된 세포(intended cell)일 수 있다.
바람직한 실시양태에 있어서, 세포내 칼슘 농도의 변화에 대한 반응인 생물발광 신호의 생성 및/또는 아포광단백질 유전자 발현은 편재되어 있다.
다른 바람직한 실시양태에 있어서, 세포내 칼슘 농도의 변화에 대한 반응인 생물발광 신호의 생성 및/또는 아포광단백질 유전자 발현은 유도성이고/유도성이거나, 기관-, 세포- 또는 발육 단계(development step)-특이적이다.
바람직한 실시태양에 있어서, 비인간 형질전환 동물은 비인간 포유동물, 보다 바람직하게는 설치류(rodent), 가장 바람직하게는 마우스이다.
본 발명의 비인간 형질전환 동물은 당업계에 공지된 기법들에 의해, 즉 세포내 칼슘 농도 변화에 대한 반응으로 적당한 발색단 기질(chromophore substrate)의 존재하에 생물발광 신호를 생성시킬 수 있으며 아포광단백질을 발현시킬 수 있는 배아 줄기 세포의 사용에 의해 수득된다. 광단백질, 및 일반적으로 생물발광은 종종 효과적인 리포터 시스템(reporter system)들로서 사용된다.
본 발명의 비인간 형질전환 동물은 오리지날 게놈의 유전자 변형에 의해 수득되며, 아포광단백질 발현을 가능하게 하는 의도된 비인간 동물이다. 일반적으로, 형질전환 동물은 당업계에 공지된 기법들에 의해, 즉 가임신 암컷의 섬유아세포에 아포광단백질을 발현시키는 배아 줄기 세포들을 주입하고, 생성되는 키메라(chimera)들을 야생형 동물들과 교배시키는 것에 의해 수득된다.
아포광단백질(apophotoprotein)은 의도된 임의의 천연, 재조합 또는 합성 아포광단백질이다. 아포광단백질은 또한 향상된 발광 활성 및/또는 칼슘 감작성을 갖는 천연 돌연변이체 또는 돌연변이화된 돌연변이체일 수 있고, 2가지 상이한 천연 아포광단백질들로부터 유래한 키메라 단백질일 수 있으며, 또한 발광 및 칼슘 반응성의 관점에서 광단백질의 활성 프로필이 유지되거나 증가된다면 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 아포광단백질 서열들은 또한 포유동물 코돈 사용(mammalian codon usage)을 최적화되고/최적화되거나 미토콘드리아 표적 서열들에 융합될 수 있다(참고 문헌 52, 53 및 54 참조). 증강된 생물발광을 갖는 광단백질들은 이미 선행기술 문헌에 개시되어 있다. 즉, 클라이틴(Clytin) 단백질의 기원을 갖는, 단백질 오벨린(Obelin)의 키메라화 (chimerization)에 의해 수득된 광단백질 Photina
이 EP 1413584(여기서, 광단백질 Photina
은 서열번호 1)에 개시되어 있다.
증강된 생물발광을 갖는 광단백질들은 또한 국제공개공보 WO2006/094805호에 기재되어 있는 바와 같이 돌연변이 유발로부터 유도될 수 있는데, 142번 위치에서 Gly142→Cys으로 돌연변이 유발된 클라이틴(Clytin) 서열(GenBank 접수 번호 Q08121); 또는 58번, 69번, 70번, 76번, 77번, 78번, 81번, 86번, 87번, 90번, 92번 및 97번 위치에서 각각 Gly58→Glu, Asp69→Val, Ala70→Cys, Lys76→Arg, Lys77→Gly, Ile78→Cys, Asp81→Glu, Val86→Ile, Glu87→Ala, Ala90→Gln, Val92→Leu, 및 Glu97→Gln으로 돌연변이 유발된 클라이틴(Clytin) 서열(GenBank 접수 번호 Q08121)이 그 예이다.
리포터 아포광단백질은 편재하는(ubiquitous), 기관-특이적, 조직-특이적, 세포-특이적, 발육 단계(development stage)-특이적 또는 유도성(inducible) 프로모터의 조절하에 클로닝될 수 있다.
일반적으로, 줄기 세포는 의도된 전능성(totipotent) 및/또는 다능성 (pluripotent) 비인간 세포; 또는 인간 또는 비인간 다능성 종양 세포, 또는 다능성 세포 또는 이들의 전구세포(progenitor)로서, 배아, 태반 또는 양수 유도된 것이거나 성체 기원인 것이다. 형질전환 동물들의 생성을 위한 바람직한 줄기 세포들은 전능성 및 다능성 배아 줄기 세포들이다.
특히 바람직한 줄기 세포들은 마우스 배아 줄기 세포들, 바람직하게는 ES TBV2(참고 문헌 63 참조) 세포들이다.
일반적으로, 배아 줄기 세포들은 아포광단백질 코딩 유전자(apophotoprotein coding gene)를 함유하는 발현 벡터로 안정적으로 형질감염된다.
아포광단백질을 발현시키는 최종 양성 클론들은 이들의 광단백질 함량과 적당한 자극들에 반응할 수 있는 능력에 기초하여 선택된다.
가임신 암컷 마우스의 섬유아세포에 배아 줄기 세포들을 주입한다. 이어서, 이러한 방식으로 생성된 키메라 마우스들을 다른 마우스들과 교배시킴으로써, 형질전환 이형접합 동물을 생성시킨다.
동종접합 동물들을 수득하기 위하여, 2종의 이형접합 동물들을 함께 교배시킨다.
본 발명의 비인간 형질전환 동물은 약물학적 생체외(ex-vivo) 연구들 또는 이식(transplantation) 실험들에 사용될 수 있는 조직들 또는 기관들의 귀중한 근원(source)이다. 예컨대, 췌장 랑게르한스 섬들은 생체외에서(ex-vivo) 글루시딕(glucidic) 또는 탈분극(depolarizing) 자극시 칼슘 이동(calcium movement)들을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 비인간 형질전환 동물은 예컨대 대식세포 전구체들과 같이 아포광단백질 리포터 유전자(protein reporter gene)들을 함유하는 1차 세포들 및/또는 성체 및 배아 기원의 줄기 세포들과 같은 세포 유도체들의 귀중한 근원이다. 본 발명과 관련하여, 세포 유도체는 배아 또는 성체 기원의 전능성(totipotent), 다능성(pluripotent) 또는 중복성(multipotent) 줄기 세포 또는 1차 세포이다.
리포터 시스템(reporter system)으로서의 아포광단백질을 함유하는 세포 유도체들은 코엘렌테라진(coelenterazine)의 적재(loading)하거나 또는 동물에 코엘렌테라진을 정맥 주사한 이후에 시험(test) 분자 또는 자극을 가한 후에, 세포계 검사(cell based assay)들을 야기시키는데 직접 사용될 수 있다.
리포터 시스템으로서의 아포광단백질을 함유하는 1차 세포 유도체들은 ES/광단백질 세포들의 분화 후에 수득된 "1차-유사(primary-like)" 세포들에 대한 양성 대조군으로서 또는 특이 표적(specific target)에 대한 작동제(agonist) 또는 길항제(antagonist)를 동정하기 위하여, 스크리닝 목적을 위해 직접 사용될 수 있다.
줄기 세포 유도체는 특이 세포계(specific cell lineage)로 분화되어 특이 표적의 발현을 얻을 수 있다. 줄기 세포 유도체들은 분화된 단계에서 특이 표적에 대한 작동제들 또는 길항제들을 동정하기 위하여 코엘렌테라진을 적재한 이후의 세포계 검사를 야기시키는데 사용될 수 있거나, 또는 미분화된 단계에서 전분화 제제(pro-differentiative agent)들 또는 항분화 제제(anti-differentiative agent)들을 동정하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 특이 세포계는 심장 근육 세포계, 또는 뉴론계, 또는 조혈 또는 간엽 세포계로부터 유도된 세포계들이다.
유리하게는, 본 발명은 다수의 용도(예컨대, 치료, 진단 용도)를 위한 화합물들의 생체내(in vivo) 동정 및/또는 시험을 위한 방법들을 제공한다.
본 발명과 관련하여, 화합물 라이브러리는 화합물 라이브러리(compound library)(compound library)는 시험 또는 동정 대상인 합성 또는 재조합 화합물들의 집합(collection)이다.
본 발명의 다른 목적은 다양한 세포내 Ca++가 수득되도록 특이 표적(specific target)을 자극할 수 있는 리간드를 동정하는 방법으로서, 다음과 같은 단계들을 포함하는 방법을 제공하는 것이다:
a) 1차 또는 줄기 세포들인 본 발명에 따른 세포 유도체(cell derivative)를 제공하는 단계;
b) 종국적으로 특이 세포계에 상기 세포들을 분화시키는 것에 의해서도, 상기 표적의 발현을 얻는 단계;
c) 상기 세포들에 기질로서 적당한 발색단(chromophore)을 적재(loading)하는 단계;
d) 상기 표적에 대한 리간드들로 추정되는 리간드들을 포함하는 화합물 라이브러리와 상기 세포들을 접촉시키는 단계; 및
e) 광단백질의 생물발광(bioluminescence)을 검출하는 단계.
1차 또는 줄기 세포들은 내인성으로 표적을 발현시킬 수 있다.
바람직하게는, 특이 세포계는 심장 근육 세포계, 또는 뉴론계, 또는 조혈 또는 간엽 세포계로부터 유도된 세포계들이다.
보다 바람직하게는, 상기 방법은 고성능 스크리닝에 의해 수행된다.
본 발명의 또 다른 목적은 다양한 세포내 Ca++가 수득되도록 표적에 대한 길항제를 동정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하는 것이다:
a) 1차 또는 줄기 세포들인 본 발명에 따른 비인간 형질전환 동물의 세포 유도체를 제공하는 단계;
b) 종국적으로 특이 세포계에 상기 세포들을 분화시키는 것에 의해서도, 상기 표적의 발현을 얻는 단계;
c) 상기 세포들에 기질로서 적당한 발색단(chromophore)을 적재(loading)하는 단계;
d) 상기 표적에 대한 길항제들로 추정되는 길항제들을 포함하는 화합물 라이브러리와 상기 세포들을 접촉시키는 단계;
e) 상기 표적을 자극할 수 있는 리간드와 상기 세포들을 접촉시키는 단계; 및
f) 광단백질의 생물발광 변화를 검출하는 단계.
1차 또는 줄기 세포들은 내인성으로 표적을 발현시킬 수 있다.
바람직하게는, 특이 세포계는 심장 근육 세포계, 뉴론계, 또는 조혈 또는 간엽 세포계로부터 유도된 세포계들이다.
보다 바람직하게는, 상기 방법은 고성능 스크리닝에 의해 수행된다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 세포 유도체들의 특이 세포계로의 분화를 자극하는 제제를 동정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하는 것이다:
a) 미분화된 상태에서 본 발명에 따른 비인간 형질전환 동물의 줄기 세포 유도체를 제공하는 단계;
b) 분화를 유도하는 제제들로 추정되는 제제들을 포함하는 화합물 라이브러리에 상기 줄기 세포 유도체를 노출시키는 단계;
c) 적어도 하나의 특이 세포계 표적의 발현을 얻는 단계;
d) 상기 세포들에 기질로서 적당한 발색단을 적재하는 단계;
e) 다양한 Ca++ 가 수득되도록 리간드에 의해 상기 특이 세포계 표적을 자극하는 단계; 및
f) 광단백질의 생물발광을 검출하는 단계.
바람직한 실시태양에 있어서, 상기 방법은 고성능 스크리닝에 의해 수행된다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 세포 유도체들의 특이 세포계로의 분화를 저해하는 제제를 동정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하는 것이다:
a) 미분화된 단계에서 본 발명에 따른 비인간 형질전환 동물의 줄기 세포 유도체들을 제공하는 단계;
b) 분화를 저해하는 제제들로 추정되는 제제들을 포함하는 화합물 라이브러리에 상기 줄기 세포 유도체들을 노출시키는 단계;
c) 분화를 유도하는 제제로 공지된 제제에 상기 줄기 세포 유도체들을 노출시켜, 적어도 하나의 특이 세포계 표적의 발현을 얻는 단계;
d) 세포들에 기질로서 적당한 발색단을 적재하는 단계;
e) 다양한 Ca++가 수득되도록, 리간드에 의해 상기 특이 세포계 표적을 자극하는 단계; 및
f) 광단백질의 생물발광을 검출하는 단계.
바람직한 실시태양에 있어서, 상기 방법은 고성능 스크리닝에 의해 수행된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 ES/광단백질 세포들의 분화 후에 수득되는 "1차-유사(primary-like)" 세포들에 대한 양성 대조군으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 비인간 형질전환 동물의 세포 유도체{리포터 시스템으로서의 광단백질을 함유하는 상기 세포 유도체는 화합물들[일반적으로, 작동제들, 길항제들, 전분화 제제(pro-differentiative agent)들 또는 항분화 제제(anti-differentiative agent)들]의 스크리닝에 사용됨}의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 동물 모델들에 있어서의 약물학적 생체외(ex-vivo) 연구들 및 이식 실험들에 사용되는 것을 특징으로 하는, 리포터 시스템으로서의 광단백질을 함유하는 본 발명에 따른 비인간 형질전환 동물의 조직 또는 기관 유도체들의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 생체이미징(bio-imaging) 연구들에 사용되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 비인간 형질전환 동물 및 이의 자손(progeny)의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 약물학적으로 관련성 있는 동물 모델들과 교배시키는데 사용되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 비인간 형질전환 동물 및 이의 자손의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 동물 모델은 리포터 유전자들을 운반하는 형질전환 동물, 또는 KO(KnockOut, 녹아웃) 또는 KI(KnockIn, 녹인) 돌연변이 동물 모델들이다. 약물학적으로 관련성 있는 동물 모델들과의 교배(cross)들은 다른 형질전환 유전자들(예컨대, 리포터들) 및/또는 형질전환된 유전자들(예컨대, 동종 재조합들에 의해 수득된 유전자들)과 함께 본 발명의 광단백질 리포터 유전자를 운반하는 새로운 동물 모델 자손들의 생성을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 물질의 독성(toxicity) 및/또는 기형(teratology)의 생체내 시험에 사용되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 비인간 형질전환 동물의 용도를 제공한다.
본 발명은 첨부되는 도면을 참고하여 하기 실험 섹션을 통하여 보다 상세히 기술될 것이다.
재료 및 방법
광단백질에
대한 기술(記述)
Photina
키메라 광단백질 Photina
가 유럽특허공보 제1413584호에 기재되어 있으며, 상기 유럽특허공보 제1413584호의 명세서에 서열 번호 1로서 보고되어 있다:
i-
Photina
i-Photina
(유럽 특허출원 제05005390.9호)는 클라이틴(Clytin) 광단백질(GenBank 접수 번호 Q08121)의 돌연변이 유발 Gly142→Cys에 의해 수득된다.
c-
Photina
c-Photina
(유럽 특허출원 제06000171호)는 다음과 같은 12개의 위치에서 클라이틴(Clytin) 서열(GenBank 접수 번호 Q08121)의 돌연변이에 의해 수득된다:
Gly58→Glu, Asp69→Val, Ala70→Cys, Lys76→Arg, Lys77→Gly, Ile78→Cys, Asp81→Glu, Val86→Ile, Glu87→Ala, Ala90→Gln, Val92→Leu, 및 Glu97→Gln.
포유동물 세포들에서의 발현을 위한
광단백질
최적화
c- Photina 
및 i- Photina 
유전자들의 코돈 사용(codon usage)은 고도로 발현된 포유동물 유전자들의 코돈 편향(codon bias)에 적합하다. 또한, 매우 높거나(>80%) 또는 매우 낮은(<30%) GC 함량의 영역들은 가능한 한 회피되었다.
효율적인 번역 개시를 위해, 코작-컨센서스 서열(Kozak-consensus sequence)을 개시 코돈의 업스트림에 도입하였다. 2개의 정지(STOP) 코돈들을 첨가하여, 효율적인 종결을 확실하게 하였다.
클로닝
방법
미토콘드리아 표지(mito)가 있거나 없는 pcDNA3.1+벡터(Invitrogen)에서 유전자들을 클로닝하여, pcDNA3 mito c-Photina
, pcDNA3 mito i-Photina
, 및 pcDNA3 mito i-Photina
를 수득하였다. 미토콘드리아 표적화(참고 문헌 52-54 참조)를 위해, 인간 사이토크롬 c 산화효소, 서브유닛 VIII, 신호 서열을 사용하였다:
5'-ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTT
GACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGC
CAAGATCCATTCGTTGGGATCCGCCACC-3'(서열번호 2)
수득된 구조물(construct)은 전장 디데옥시 서열화(full-length dideoxy sequencing)에 의해 확인하였다.
ES
세포 배양
표준 방법들(참고 문헌 55 및 56 참조)을 사용하여 ES 세포들을 배양하였다.
ES 배양 배지, 접종 및 항온배양:
37℃, 5% CO2에서, 15% 우태아 혈청, FBS (정량된 ES, Invitrogen, Cat. N. 16141079) DMEM 둘베코 변형 이글 배지, 피루브산나트륨이 없는 고농도의(high) 글루코오스(Invitrogen, Cat. N. 10313021), 100 μM의 β-머캅토에탄올(Invitrogen, Cat. N. 31350010), 2 mM의 글루타민(Invitrogen, Cat. N. 25030024), 1000 U/ml의 백혈병 저해 인자, LIF(Prodotti Gianni, Cat. N. ESG1107)를 이용하여 TBV2 (129S/SvPas) 배아 줄기 세포들(참고 문헌 63 참조)을 배양하였다.
37℃, 5% CO2에서, 10% 우태아 혈청, FBS (Celbio, Cat. N. CHA11152) DMEM 둘베코 변형 이글 배지, 고농도의(high) 글루코오스(Invitrogen, Cat. N. 10313021), 1 mM의 피루브산나트륨(Invitrogen, Cat. N. 11360039), 비필수 아미노산들(Invitrogen, Cat. N. 11140-035), 2 mM의 글루타민(Invitrogen, Cat. N. 25030024)을 이용하여 1차 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 세포들을 배양하였다.
안정적인 형질감염
전기천공 방법들을 사용하여, 광단백질들에 상응하는 DNA 구조물(construct)들을 형질감염시켰다. 7×106개의 ES 세포들[전기천공 조건: 500 μF, 0.24 kV, Biorad 유전자 펄서(pulser)]를 사용하여, BglII(New England Biolabs)로 선형화된(linearized) mito c- Photina
, mito i-Photina
및 i-Photina
DNA를 30-40㎍ 형질감염시키고, 10-20분 동안 얼음 상에서 항온배양하였다. LIF를 함유하는 ES 세포 배지에서 세포 현탁액을 희석시키고, 젤라틴화된 100mm 직경의 평판 상에 전이시켰다. 대략 48시간 후, 200 ㎍/ml의 G148(Geneticin, SIGMA, Cat. N. G5013)을 함유하는 ES 배지를 사용하여 선별을 시작하였다.
콜로니들은 일반적으로 전기천공 후 8-9일째에 피킹(picking)될 준비가 되어 있었다.
클론 선별 방법:
1. 114 ES pcDNA3/mito c-Photina
, 130 ES pcDNA3/mito i-Photina
및 99 ES pcDNA3/i-Photina
클론들을 피킹(picking)하였다.
2. 접종 후 24시간째 및 48시간째에, LIF를 보유하는 ES 배지 내의 2×96MTP 백색 평판에 형질감염된 세포들을 도말하였다.
3. 배지는 50 ㎕/웰의 타이로드(130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM NaHCO3 및 20 mM HEPES, pH 7.4, 2 mM Ca2 +) 및 코엘렌테라진 10 μM(Pharma Tech International)로 대체하였다.
4. 다음과 같은 평가에 의해 양성 클론들을 선별하였다
- 100 μM 히스타민에 대한 반응(Sigma, Cat. N. H7125-5G). CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
- Triton X-100을 이용한 세포 분리 후에 측정된 전체 잔류 광단백질 활성. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 5초.
각 구조물에 대하여 12개의 클론들을 선택하고, 팽창시키고, 계수된 세포들, 즉 96 MTP에서 10000-20000 세포/웰 및 384 MTP에서 2500 세포/웰을 재시험하였다.
- 100 μM 히스타민에 대한 반응. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
- Triton X-100을 이용한 세포 분리 후에 측정된 전체 잔류 광단백질 활성. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 5초.
DNA
추출
표준 단백분해효소 K 소화 및 페놀-클로로포름-이소프로판올 추출 방법(참고 문헌 59 참조)을 사용하여, 젤라틴 코팅된 접시들 상에 도말된 ES 세포들로부터 유래한 DNA를 추출하였다.
정량적
PCR
에 의한 삽입(
insertion
) 수의 측정
"Platinum
SYBR Green
QPCR SuperMix UDG" 프로토콜(참고 문헌 60 참조, Invitrogen)과 반응당 대략 3 ng의 DNA를 사용하여 ES/mito c-Photina
세포들 상에서 QPCR(정량적 중합효소 연쇄 반응)을 수행하였다. c-Photina
(CPH) 및 네오마이신(neo) 유전자들 상에서 Primer Express
소프트웨어 버젼 2.0(Applied Biosystems)을 사용하여 사용대상 프라이머들을 설계하여, 형질감염에 사용되고, 게놈 DNA를 검출하는 gusB 유전자에 특이적인 플라스미드를 검출하였다:
CPH-for: CACCAAGTGTGCGTGGAGG (서열번호 3);
CPH-rev: GCGATCTCCTTGCCGTACTC (서열번호 4);
neq-for: CACGTACTCGGATGGAAGCC (서열번호 5);
neo-rev: CCCTGATGCTCTTCGTCCAG (서열번호 6);
gusB-for: GGAGGTGATTCAGCCACAGC (서열번호 7);
gusB-rev: TCGGCTTCTGATGCGTCTTA (서열번호 8).
모든 QPCR 실험들은 ABI 프리즘 7700 서열 검출기(Applied Biosystems) 상에서 수행하였다.
PCR 프로토콜은 다음과 같았다: 2분 동안 50℃ 유지, 2분 동안 95℃ 유지, 40 주기(cycle): 95℃, 15초, 60℃, 1분; 15초 동안 95℃. 20분-60℃에서 95℃까지의 긴 온도 구배(용융 곡선 단계).
프로토콜 수행 말기에, ABI 프리즘 7700 사용자 매뉴얼에 기재되어 있는 바와 같이 PCR 기간 중에 획득된 형광 데이터를 처리하였다.
"Dissociation Curves 1.0" 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여, PCR 생성물들의 용융 온도 프로필 분석을 하였다. 여하한 QPCR 실험들에서도 프라이머-이량체는 생성되지 않았다.
이배체 게놈당(즉, 세포당) 네오마이신 및/또는 c- Photina 
유전자의 복제물들의 수를 계산하기 위하여, 본 발명자들은 하기 공식에서 Ct[주기 역치(Cycle Threshold)]들 및 PCR 효율들을 기록하였다:
세포당 복제물들의 수(#) =
2 ×[(PCR 효율 표적)-( Ct 표적)]/[(PCR 효율 gusB)-( Ct gusB )]
상기 공식에 있어서,
PCR 효율 표적 = 네오마이신 또는 c- Photina 
유전자의 PCR 효율;
PCR 효율 gusB = gusB 유전자의 PCR 효율;
Ct 표적 = 네오마이신 또는 c- Photina 
유전자의 Ct;
Ct gusB = gusB 유전자의 Ct.
상기 공식의 오른쪽 부분의 비율(fraction)은 gusB 복제물당 삽입 DNA의 복제물들의 수를 나타낸다. 2개의 gusB 복제물들은 이배체 게놈에 존재하기 때문에, 상기 비율에 2를 곱한다.
서던 블롯(
Southern
Blot
)
0.8% 아가로스 겔 상에 적재된 상이한 제한 효소들, HindIII, XbaI, BamHI, HindIII/XbaI(Biolabs)로 ES/mito c-Photina
세포들의 게놈 DNA 10㎍을 소화시키고, 양(陽)으로 하전된 나일론 막(Roche, Cat. N. 1417240) 상에 전이시켰다. [32P]dCTP-라벨링된 c- Photina 
코딩 서열을 프로브(probe)로서 사용하였다(참고 문헌 59 참조).
0.8% 아가로스 겔 상에 적재된 EcoRI 제한 효소(Biolabs)로 ES/mito i-Photina
및 ES/i-Photina
세포들의 ES 게놈 DNA 10㎍을 소화시키고, 양(陽)으로 하전된 나일론 막(Roche, Cat. N. 1417240) 상에 전이시켰다. [32P]dCTP-라벨링된 i- Photina 
코딩 서열을 프로브(probe)로서 사용하였다(참고 문헌 59 참조).
면역형광
분석
1. 배지를 제거하고, 1×PBS를 이용한 3회 세척을 수행하였다.
2. 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA, 미국 뉴저지주 화이트하우스 스테이션 소재 MERCK, Cat. N. 1.04005.1000) 용액으로 ES 세포들을 고정시켰다.
3. 고정(fixing) 용액을 제거하고, 1×PBS를 이용한 3회 세척을 수행하였다.
4. 실온에서 30분 동안 1×PBS 중의 10% 정상 염소 혈청(Chemicon, Cat. N. S26-100ml)/0.2% Triton X-100을 이용하여 세포들을 항온배양하여, 블로킹(blocking) 및 투과화(permeabilization) 공정을 수행하였다.
5. 블로킹 용액을 제거하고, 실온에서 1×PBS를 이용한 2회 세척을 수행하였다.
6. 실온에서 2시간 동안 1×PBS 중의 10% 정상 염소 혈청(Chemicon, Cat. N. S26-100ml)/0.1% Triton X-100에서 상이한 항체들을 항온배양하였다.
- 마우스 단일클론 항체 항 oct 3/4(C-10)(Santa Cruz Biotechnology, Cat. N. SC-5279)을 1:100으로 희석하여 사용하였다.
- Triton X-100 투과화 제제를 함유하지 않은 완충액 중에서 마우스 단일클론 항체 항 SSEA-1(Santa Cruz Biotechnology, Cat. N. SC21702)을 1:100으로 희석하여 사용하였다.
- 토끼 다클론 항체 항 미오신 중쇄(MHC)(H-300)(Santa Cruz Biotechnolog y, Cat. N. SC-20641)을 1:50으로 희석하여 사용하였다.
- 토끼 다클론 항체 항 GATA-4(H-112)(Santa Cruz Biotechnology, Cat. N. SC-9053)를 1:50으로 희석하여 사용하였다.
- 마우스 단일클론 항체 항 육종 알파-악티닌(EA-53)(SIGMA, Cat. N. A 7811)을 1:50으로 희석하여 사용하였다.
- 토끼 다클론 항체 항 신경필라멘트 H(NF-H)(Chemicon, Cat. N. AB1989)를 1:100으로 희석하여 사용하였다.
- 마우스 단일클론 항체 항 뉴론성 핵(NeuN)(Chemicon, Cat. N. MAB377)을 1:100으로 희석하여 사용하였다.
- 토끼 다클론 항체 항 아교 섬유 산성 단백질(Dako, Cat. N. Z0334)을 1:100으로 희석하여 사용하였다.
- 마우스 단일클론 항체 항 네스틴(Rat-401)(Chemicon, Cat. N. MAB353)을 1:100으로 희석하여 사용하였다.
7. 실온에서 1×PBS를 이용한 3회 세척을 수행하였다.
8. 실온에서 1시간 동안 1×PBS 중의 10% 정상 염소 혈청/0.1% Triton X-100에서 플루오레신화된(fluoresceinated) 항-마우스 또는 항 토끼 FITC 2차 항체만을 이용하거나, 또는 플루오레신화된(fluoresceinated) 항-마우스 또는 항 토끼 FITC 2차 항체와 로다민화된(rhodaminated) 항-마우스 항체(염소 및 마우스 IgG/IgM 로다민. Chemicon, Cat. N. AP130R)를 이용하여, 2차 항체의 항온배양을 수행하였다. 상기 항체들은 1:200으로 희석하여 사용하였다.
9. 실온에서 1×PBS를 이용한 3회 세척을 수행하였다.
10. 4℃에서 1×PBS에 세포들을 방치하였다.
배아체들
(
EBs
) 형성 단계를 갖는
심장근육세포
분화 프로토콜
참고 문헌 57에 기재되어 있는 프로토콜을 참조하라.
심장근육세포들에 대한
CCD
카메라에 기초한
발광계
측정
- 분화 9일째에 AccutaseTM(Chemicon, Cat. N. SCR005)로 EBs(배아체들)를 해리시키고, 계수하고, 37℃에서 3시간 동안 표준 타이로드 완충액(GqPCRs에 대한 시험의 경우) 및 KCl이 없는 타이로드(L형 칼슘 채널들에 대한 시험의 경우) 중의 10 μM 코엘렌테라진에서 항온배양하였다(96 MTP에서 20000 세포/웰).
- 세포 접종 후 3시간째에 시험을 수행하였다.
- CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초)에서 50 nM 엔도테린-1, 100 μM 노르에피네프린에 대한 반응을 측정하였다.
- 전압 감응성 칼슘 채널(Voltage gated Calcium Channel)들을 40 mM KCl로 자극하였다. 5 μM 니페디핀(특이적 L형 전압 감응성 칼슘 채널 저해제)(SIGMA, Cat. N. N7634)을 이용하여 측정하기 15분 전에 세포들을 항온배양하여, 상기 채널들의 특이성을 조사하였다.
- Triton X-100을 이용한 세포 분리 후에 CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 30초)에서 전체 잔류 광단백질 활성을 측정하였다.
배아체들
(
EBs
) 형성 단계를 갖는
뉴론
분화 프로토콜
참고 문헌 64 및 65에 기재되어 있는 프로토콜을 참조하라.
뉴론에
대한
CCD
카메라에 기초한
발광계
측정
레티노산(RA. Sigma, Cat. N. R-2625)-유도된 EBs(배아체들)을 해리시키고, 폴리 D-리신(Sigma, Cat. N. G7121) 코팅된 384 MTP에서 6500 세포/웰을 접종하고, 추가의 분화 기간 동안 94 MTP 포맷에서 24000 세포/웰을 접종하였다.
분화 14일째에, 37℃에서 3시간 동안 6 μM의 오메가코노톡신 GVIA(특이적인 N형 전압 감응성 칼슘 채널 저해제)(BACHEM, Cat. N. H6615.1000)의 15분 예비항온배양(preincubation)의 존부하에, 표준 타이로드 완충액(글루타메이트 반응 시험의 경우) 및 KCl이 없는 타이로드(전압 감응성 칼슘 채널들에 대한 시험의 경우) 중의 10 μM 코엘렌테라진에서 상기 세포들을 항온배양하였다.
- CCD 카메라에 기초한 발광계(96 MTP에서의 글루타메이트 반응을 위한 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 60초; 384 MTP에서의 전압 감응성 칼슘 채널들 반응을 위한 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초)에서 반응들을 측정하였다.
분화된
뉴론들
및 미분화된
ES
/
mito
c-
Photina
ES
/29 클론에 대한 형광정량
이미징
평판 판독기(
Fluorometric
Imaging
Plate
Reader
)(
FLIPR
) 측정
16일째에, 분화된 세포들(레티노산-유도된 EBs(배아체들)의 해리, 및 폴리 D-리신 코팅된, 384개의 흑색 벽, 투명한 바닥의 평판들 상에서 6500 세포/웰의 세포 접종 이후에 수득됨)을 측정하였다.
젤라틴 코팅된, 384개의 흑색 벽, 투명한 바닥의 평판들 상에서 시험하기 24시간 전에, 미분화된 ES/mito c-Photina
ES/29 클론을 10000 세포/웰로 접종하였다.
실험들을 수행하기 전에, 배지를 제거하고, 37℃에서 30분 동안 타이로드 중에 가용화된 25 ㎕/웰의 막 전위(Membrane Potential) 염료(Molecular Devices, Cat. N. R8034)에서 세포들을 항온배양하였다. 120 mM KCl(3×)(15 mM NaCl, 120 mM KCl, 2 mM CaCl2, 5 mM NaHCO3, 20 mM Hepes)를 함유하는 12.5 ㎕/웰의 타이로드를 주입하고, 250초 동안 형광 신호를 기록하고, RFU(상대 형광 단위)로서 표시하였다.
FLIPR 384 세팅:
실험 시간: 0.3 초
주입 속도: 20 ㎕/초
주입 높이: 50 ㎕
광단백질
형질전환 마우스들에 대한
광단백질
조직 분석
2마리의 마우스, 즉 c-Photina
형질전환 유전자에 대하여 양성인 마우스 하나와 음성인 마우스 하나를 사용하였다. 상기 2마리의 마우스들의 꼬리 정맥으로부터 각각 200 ㎕의 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액 오염물들을 제거하기 위하여, 이들 샘플에 생리적 용액을 살포하였다. 상기 2마리의 마우스들로부터 몇몇 기관들(뇌, 소뇌, 간, 지방, 비장, 골격근, 좌골 신경, 전체 췌장, 폐, 신장, 혈액, 위, 고환, 심장)을 외식(explantation)하고, 실온에서 3시간 동안 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 20 μM 코엘렌테라진 및 프로테아제 저해제 칵테일들(Roche, Cat. N. 1836145)을 함유하는 용액을 이용하여 항온배양하였다.
조직을 보다 작은 조각으로 축소시키기 위하여, 수술용 가위로 상기 샘플들을 모두 절단하였다.
이어서, 백색의 96 백색 웰/평판의 3개의 웰에 샘플들을 분할하여 넣었다.
Triton X-100 및 250 mM CaCl2의 용액을 주입한 후, CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초, 통합 시간 0.6초)에서 이들을 판독하였다.
상이한 조직/기관들에서의 광단백질 리포터 단백질(photoprotein reporter protein)의 존재 및 안정성을 조사하기 위하여, 다음과 같이 상이한 연령의 6마리의 동물들(c-Photina
형질전환 유전자에 대하여 양성인 3마리와 음성인 3마리)을 추가로 도살하였다: 2마리의 마우스는 3개월, 다른 2마리의 마우스는 6개월, 또 다른 2마리의 마우스는 10개월. 혈액 오염물들을 제거하기 위하여, 상기 6마리의 마우스들 모두에 생리적 용액을 살포하였다. 상기 마우스들로부터 뇌, 소뇌, 비장, 폐, 신장, 위, 생식샘들 및 심장을 외식하고, 실온에서 3시간 동안 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 20 μM 코엘렌테라진 및 프로테아제 저해제 칵테일들을 함유하는 용액을 이용하여 항온배양하였다.
조직을 보다 작은 조각들로 축소시키기 위하여, 수술용 가위로 상기 샘플들을 모두 절단한 후, 백색의 96 백색 웰/평판의 3개의 웰에 샘플들을 분할하여 넣었다.
Triton X-100 및 250 mM CaCl2의 용액을 주입한 후, CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초, 통합 시간 0.6초)에서 이들을 판독하였다.
2차 실험
2마리의 마우스(하나의 마우스는 c-Photina
형질전환 유전자에 대하여 양성이고, 다른 하나는 c-Photina
형질전환 유전자에 대하여 음성임)를 사용하였다. 2.8 mg 코엘렌테라진/kg 마우스를 함유하는 300 ㎕의 코엘렌테라진 용액(생리적 용액 중의 373 μM 코엘렌테라진, 3.3% DMSO, 990 nM 글루타티온)을 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
3시간 후, 상기 마우스들의 꼬리 정맥으로부터 각각 200 ㎕의 혈액 샘플을 채취하였다.
- 상기 마우스들을 애버틴(Avertin)(12.5 ㎕/g 체중)으로 마취하였다. 간관(hepatic duct)에의 콜라게나제(타입 V, 1mg/ml)(미국 미주리주 세인트루이스 소재 Sigma Chemical)의 주입에 의해 마우스들로부터의 췌장 섬 분리를 수행하였다. 이어서, 복부 대정맥/대동맥(abdominal vena cava/aorta)의 절단 후의 방혈(exsanguination)에 의해 마우스들을 도살하였다. 분리된 췌장을 소화시키고, 밀도 구배(Histopaque-1077; Sigma)에 의해 베타-섬(beta-islet)들을 정제하였다. 5% CO2로 가습화된 대기하에, 10% 태아 송아지 혈청, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 M199 배지(Invitogen, Cat. N. 22350-029)에서 37℃에서 밤새도록 상기 베타-섬들을 배양하였다.
10 mito c-Photina
형질전환 마우스 섬들(islets)/웰(well)을 백색 96 MTP에 넣고, 37℃에서 4시간 동안 10 μM 코엘렌테라진을 함유하는 표준 타이로드 용액에서 항온배양하였다. 음성 대조군으로서의 글루코오스(11 mM) 또는 만니톨(11 mM)로 자극한 후, Luminoskan Ascent(Labsystems) 발광계(조건: 판독 시간 150초, 통합 시간 0.5초)에서 상기 섬들의 칼슘 반응속도(calcium kinetics reaction)를 측정하였다. 이어서, 글루코오스 농도를 3 mM로 표준화한 후, CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초)에서 탈분극 자극에 의해 상기 섬들을 자극하였다. Triton X-100계 완충액을 이용한 세포 분리 후에, 상기 섬들의 전체 광단백질 함량을 측정하였다(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초).
- 상기 마우스들로부터 몇몇 조직들(뇌, 소뇌, 간, 지방, 비장, 심장, 좌골 신경, 위, 폐, 고환, 뼈, 골격근, 신장, 피부 및 흉선)을 외식하고, 상기 조직들을 보다 작은 조각들로 축소시키기 위하여 수술용 가위로 절단하였다. 모든 샘플들을 2개의 배치(batch)로 분할하였다. 하나의 파트(part)는 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 및 프로테아제 저해제 칵테일들의 용액(코엘렌테라진을 함유하지 않음)에 넣고, 즉시 CCD 카메라에 기초한 발광계에서 시험하는 한편; 다른 파트(part)는 CCD 카메라에 기초한 발광계 시험 이전에 실온에서 3시간 동안 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 20 μM 코엘렌테라진 및 프로테아제 저해제 칵테일들을 함유하는 용액을 이용하여 항온배양하였다.
이어서, 백색의 96 백색 웰/평판의 2개의 웰에 모든 샘플들을 분할하여 넣었다.
Triton X-100 및 250 mM CaCl2의 용액을 주입한 후, CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초, 통합 시간 0.6초)에서 이들을 판독하였다.
3차 실험
(대식세포들에서 생체외 분화된) 골수로부터 단핵세포들을 분리하기 위하여, 하나의 다른 c-Photina
형질전환 마우스 및 하나의 음성 마우스를 도살하였다(참고 문헌 68 참조).
전체 세포 분리 활성(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초, 통합 시간 0.6초)을 조사하기 위하여, 각 마우스에 대하여 96 MTP 평판에서 20000 세포/웰을 접종하고, Triton X-100 용액을 이용하여 세포들을 분리하였다.
P19
세포 배양
P19
배양 배지, 접종 및 항온배양
5% CO2를 보유하는 가습화된 대기, 및 37℃에서, 10% 우태아 혈청, FBS(정량된 ES, Invitrogen, Cat. N. 16141079) αMEM, GLUTAMAX(Invitrogen, Cat. N. 32571028)을 보유하는 이글 최소 필수 배지, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Cat. N. 15140122)을 이용하여, P19 배아 암 다능성 줄기 세포들(ATCC, Cat. N. CRL-1825)들을 배양하였다.
Mito
c-
Photina
안정적 형질감염
바람직한 프로토콜로 대체될 수 있는 전기천공 방법들을 사용하여, DNA 구조물을 형질감염시켰다.
pcDNA3 DNA 내의 약 10 ㎍의 mito c- photina 
를 BglII(New England Biolabs)로 선형화하고, 2.5×106개의 세포들에서의 전기천공(전기천공 조건: 500 μF, 0.24 kV, BioRad 유전자 펄서)에 의해 형질감염시켰다.
700 ㎍/ml G418로 형질감염시킨지 48시간 후에 선별을 시작하였다.
콜로니들은 일반적으로 전기천공 후 8-9일째에 피킹(picking)될 준비가 되어 있었다.
클론 선별 방법:
1. P19 pcDNA3/mito c-Photina
클론들
2. 접종 후 24시간 및 48시간째에, 10000 및 15000 세포/웰의 형질감염된 세포들을 2×96MTP 백색 평판들에 도말하였다.
3. 배지는 50 ㎕/웰의 타이로드(2 mM Ca2 + 및 10 μM 코엘렌테라진)으로 대체하였다.
4. 다음과 같은 평가에 의해 양성 클론들을 선별하였다.
- 100 μM 히스타민에 대한 반응. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
- Triton X-100을 이용한 세포 분리 후에 전체 잔류 광단백질 활성을 측정하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 30초.
P19
/
mito
c-
Photina
/1A1 클론
생체외
뉴론
분화
참고 문헌 67에 기재되어 있는 프로토콜을 참조하라.
P19
/
mito
c-
Photina
/1A1 클론으로부터 유도된
뉴론들에
대한
CCD
카메라에 기초한
발광계
측정
뉴론 분화 프로토콜 8일째 및 11일째(폴리 D-리신 코팅된 384 MTP에서의 접종후 4일째 및 7일째)에, 37℃에서 4시간 동안 표준 타이로드 완충액 중의 10 μM 코엘렌테라진 25 ㎕/웰을 이용하여, P19/mito c-Photina
/1A1 클론으로부터 분화된 뉴론들을 항온배양하였다.
CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초)에서 40 mM KCl의 주입에 의해 유도된 탈분극 자극에 대한 반응을 기록하였다.
P19
/
mito
c-
Photina
/1A1 클론으로부터 유도된
뉴론들에
대한
FLIPR
측정
뉴론 분화 프로토콜 8일째(폴리 D-리신 코팅된 384 MTP에서의 접종후 4일째)에, 암소에서 Flu-4NW
칼슘 감작성 형광 염료(Invitrogen, Cat. N. F36205) 25 ㎕/웰을 이용하여, P19/mito c-Photina
/1A1 클론으로부터 분화된 뉴론들을 항온배양하였다.
37℃에서 30분 동안 평판들을 항온배양한 후, 실온에서 30분 동안 추가로 항온배양하였다.
12.5 ㎕/웰의 120 mM KCl(3×) 용액을 주입하고, 360초 동안 형광 신호를 기록하고 RFU(상대 형광 단위)로 표시하였다.
FLIPR 384 세팅:
실험 시간: 0.3 초
주입 속도: 20 ㎕/초
주입 높이: 50 ㎕
미분화된
P19
/
mito
c-
Photina
/1A1 클론, 및
P19
/
mito
c-
Photina
/1A1 클론으로부터 유도된
뉴론들에
대한
FLIPR
측정
미분화된 P19/mito c-Photina
/1A1 클론의 경우, 젤라틴 코팅된 384 웰 평판들에서 3000 세포/웰의 세포들을 접종하였다. 접종후 24시간째에, 암소에서 Flu-4NW
칼슘 감작성 형광 염료 25 ㎕/웰을 이용하여, 세포들을 항온배양하였다.
미분화된 P19/mito c-Photina
/1A1 클론으로부터 분화된 뉴론들의 경우, 뉴론 분화 프로토콜 8일째(폴리 D-리신 코팅된 384 웰 평판들에서의 접종후 4일째)에, 암소에서 Flu-4NW
칼슘 감작성 형광 염료 25 ㎕/웰을 이용하여, 세포들을 항온배양하였다.
37℃에서 30분 동안 상기 평판들을 항온배양한 후, 실온에서 30분 동안 추가로 항온배양하였다.
타이로드 완충액 중의 하기 3× 화합물들 12.5 ㎕/웰을 주입하고, 330초 동안 형광 신호를 기록하고 RFU로 표시하였다.
3× 화합물들: 300 μM 히스타민, 및 300 μM 글루타메이트.
FLIPR 384 세팅:
실험 시간: 0.3 초
주입 속도: 20 ㎕/초
주입 높이: 50 ㎕
일시적인 형질감염 분석
1. 형질감염후 24시간째에, 배지는 타이로드(2mM Ca2 + 및 10 μM 코엘렌테라진) 50 ㎕/웰로 대체하고, 37℃에서 4시간 동안 항온배양하였다.
2. Luminoskan Ascent 발광계(Labsystems)를 사용하여, 200 μM 히스타민(2×) 50 ㎕/웰을 주입하였다. 발광계 조건: 통합 시간 1초, 판독 시간 60초.
- Triton X-100을 이용한 세포 분리 후, Microlumat LB 96P(EG&G Berthold)에서 전체 잔류 광단백질 활성을 측정하였다. 판독 시간 3초.
mito
i-
Photina
및
mito
Photina
의 안정적인 형질감염
바람직한 프로토콜로 대체될 수 있는 전기천공 방법들을 사용하여, DNA 구조물을 형질감염시켰다.
약 10 ㎍의 mito i-Photina
및 DNA를 BglII(New England Biolabs)로 선형화하고, 2.5×106개의 세포들에서의 전기천공(전기천공 조건: 500 μF, 0.24 kV, BioRad 유전자 펄서)에 의해 형질감염시켰다.
700 ㎍/ml G418로 형질감염시킨지 48시간 후에 선별을 시작하였다.
콜로니들은 일반적으로 전기천공 후 8-9일째에 피킹(picking)될 준비가 되어 있었다.
- 50, 100 및 150 μM 히스타민에 대한 반응. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
- Triton X-100을 이용한 세포 분리 후에 전체 잔류 광단백질 활성을 측정하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 30초.
형광정량
이미징
평판 판독기(
FLIPR
) 측정
384개의 흑색 벽, 투명한 바닥의 평판들(MATRIX, Cat. N. 4332)(25 ㎕/웰)에 20000 세포/웰의 세포들을 도말하고, 세포 접종후 24시간째에 시험들을 수행하였다. 실험들을 수행하기 전에, 배지를 제거하고, 37℃에서 30분 동안 50 ㎕/웰 칼슘 3 검정 키트(Calcium 3 Assay Kit) 0.5×(Molecular Devices, Cat. N. R8090)에서 세포들을 항온배양하였다. 히스타민 300 μM (3×) 25 ㎕/웰을 주입하고, 60초 동안 형광 신호를 기록하고, RFU(상대 형광 단위)로 표시하였다.
FLIPR 384 세팅:
실험 시간: 0.2 초
주입 속도: 20 ㎕/초
주입 높이: 50 ㎕
도 1. 114개의 네오마이신 내성 클론들의 클론 풀(clone pool) 분석. A. 히 스타민 반응 속도론(histamine response kinetics)(100 μM)은 CCD 카메라에 키초한 발광계에서 측정되었고, RLU(상대 발광 단위) 값으로 기록되었다. 실험들은 세포 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 수행된다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 60초 동안의 높은 감작성. B. 전체 광단백질 잔류 활성은 Triton X-100 세포 분리 후에 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 5초.
도 2. 12개의 ES/mito c-Photina
최상(最上) 클론들의 분석. A. 12개의 최상 mito c-Photina
클론들의 히스타민 반응(100 μM)은 2000 세포/웰의 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초. B. 12개의 최상 mito c-Photina
ES 클론들의 전체 광단백질 잔류 활성은 Triton X-100 세포 분리 후에 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 5초.
도 3. 2개의 ES/mito c-Photina
최종 클론들의 분석. A. 히스타민 반응(100 μM)은 10000 세포/웰의 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초. B. 히스타민 반응(100 μM)은 20000 세포/웰의 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
도 4. 미분화된 ES/mito c-Photina
/29 클론에 대한 면역형광 분석. 면역형광 검정은 하기 항체들을 사용하여 수행되었다:
A. 마우스 항-SSEA-1 1차 항체 + 항-마우스 FITC 2차 항체.
B. 마우스 항-oct3/4 1차 항체 + 항-마우스 FITC 2차 항체.
도 5. ELF
포스파타제 염색 키트를 이용하여 측정된 알칼리 포스파타제 활성.
도 6. ES/mito c-Photina
/29 클론에 대한 생체외에서의 심장근육세포 분화 검정. A. 분화 2일째의 현탁액 중의 배아체들.
B. 젤라틴 코팅된 접시 상에의 도말 이전 분화 5일째에 현탁액 중의 배아체들.
C. 형태학적 분석에 의해 평가된 펄싱(pulsing) 영역들을 포함하는 배아체들의 백분율.
도 7. ES/mito c-Photina
/29 클론으로부터 유래한, 생체외에서 분화된 심장근육세포들에 대한 면역형광 분석. 면역형광 검정은 하기 항체들을 사용하여 수행되었다:
A: 마우스 항-육종 알파-악티닌 1차 항체 + 항-마우스 FITC 2차 항체.
B: 토끼 항-미오신 중쇄(MHC) 1차 항체 + 항-토끼 FITC 2차 항체.
C: 토끼 항-GATA4 1차 항체 + 항-토끼 FITC 2차 항체.
도 8. ES/mito c-Photina
/29 클론으로부터 유래한, 생체외에서 분화된 심장근육세포들에 대한 CCD 카메라에 기초한 형광 기능 시험.
A. 타이로드 완충액(Tyrode buffer), 노르에피네프린(100 μM) 및 엔토테린-1(50 nM) 반응들은 20000 세포/웰의 접종 후 4시간째에 96 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
B. 탈분극 자극(40 mM KCl)은 5 μM의 니페디핀의 존부하에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
C. 전체 광단백질 잔류 활성은 Triton X-100 세포 분리 후에 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 30초.
도 9. ES/mito c-Photina
/29 클론에 대한 생체외에서의 뉴론 분화 검정의 가시광선 이미징(visible imaging).
A: 분화 7일째에 젤라틴 코팅된 접시들 상에 도말된 배아체들.
B: 분화 9일째에 젤라틴 코팅된 접시들 상에 도말된 배아체들.
C: 분화 11일째에 젤라틴 코팅된 접시들 상에 도말된 배아체들.
D: 분화 13일째에 젤라틴 코팅된 접시들 상에 도말된 배아체들.
도 10. ES/mito c-Photina
/29 클론으로부터 유래한, 생체외에서 분화된 뉴론들에 대한 96 MTB 상에서의 면역형광 분석. 면역형광 검정은 하기 주요 항체들을 사용하여 수행되었다.
A: 토끼 항-신경필라멘트 H(NF H) 1차 항체 + 항-토끼 FITC 2차 항체(B와 동일한 장(場, field)).
B: 마우스 항-뉴론성 핵(NeuN) 1차 항체 + 항-마우스 로다민화(rhodaminated) 2차 항체(A와 동일한 장(場, field)).
C: 토끼 항-아교 섬유 산성 단백질(GFAP) 1차 항체 + 항-토끼 FITC 2차 항체.
D. 마우스 항-네스틴 1차 항체 + 항-마우스 FITC 2차 항체.
도 11. ES/mito c-Photina
/29 클론으로부터 유래한, 생체외에서 분화된 뉴론들에 대한 CCD 카메라에 기초한 발광 기능 시험.
A: 표준 타이로드 및 글루타메이트(100 μM) 반응들은 14일째에 96 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 60초.
B. 표준 타이로드 및 40 mM KCl 반응들은 6 μM의 오메가코노톡신의 존부하에 14일째에 384 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
도 12. ES/mito c-Photina
/29 클론으로부터 유래한, 생체외에서 미분화된 뉴론들 및 분화된 뉴론들에 대한 FLIPR384 기능 시험. FLIPR384 분석을 위해, 막 전위 검정 키트(Membrane Potential Assay Kit)를 이용하여 37℃에서 30분 동안 항온배양한 후, 40 mM의 최종 농도로 KCl을 주입하였다. 형광 신호는 250초 동안 기록하고, RFU(FLIPR384 세팅: 실험 시간: 0.3초; 주입 속도: 20 ㎕/초; 주입 높이: 50 ㎕; 판독 시간: 360초)로 나타내었다.
도 13. 형질전환 mito c-Photina
마우스들에서의 광단백질 조직 편재화(localisation). A. mito c-Photina
를 발현시키는 음성 및 양성 마우스들로부터 14개의 상이한 조직/기관들을 외식한 후, 실온에서 20 μM의 코엘렌테라진을 이용하여 3시간 동안 항온배양하였다. 250 mM의 CaCl2 및 Triton X-100 용액을 주입하 면서, 각 조직내의 광단백질 함량을 측정하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초. B. mito c-Photina
를 발현시키는 상이한 연령(3개월, 6개월, 10개월)의 음성 및 양성 마우스들로부터 8개의 상이한 조직/기관들을 외식한 후, 실온에서 20 μM의 코엘렌테라진을 이용하여 3시간 동안 항온배양하였다. 250 mM의 CaCl2 및 Triton X-100 용액을 주입하면서, 각 조직내의 광단백질 함량을 측정하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
도 14. 상이한 조건에서 코엘렌테라진을 이용하여 항온배양된 조직들 및 기관들. A. 양성 형질전환 mito c-Photina
마우스 및 음성 대조군에의 2.8 mg/kg의 코엘렌테라진의 시스템내 주입(intra-systemical injection) 이후의 상이한 조직/기관들의 CCD 카메라에 기초한 발광계 분석. 3시간 후, 양성 형질전환 mito c-Photina
마우스 및 음성 대조군 마우스로부터 16개의 상이한 조직/기관들을 외식하였다. 재료의 절반은 백색 96 MTB에 직접 접종하였다. B. 20 μM의 코엘렌테라진을 이용하여 3시간 동안 실온에서 추가로 항온배양된 잔류 재료의 CCD 카메라에 기초한 발광계 분석. 250 mM의 CaCl2 및 Triton X-100 용액의 주입 후에 방사된 빛을 기록함으로써, CCD 카메라에 기초한 발광계에서 모든 샘플들의 광단백질 함량을 분석하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
도 15. 형질전환 mito c-Photina
마우스들로부터 분리된 췌장 섬(pancreatic islet) 상에서 수행된 CCD 카메라에 기초한 발광계 기능 시험. 1개 의 양성 mito c-Photina
마우스와 1개의 음성 마우스로부터 췌장 섬들을 분리하였다. 밤새도록 항온배양한 후, 10 섬/웰(islet/well)을 백색 96 MTP에 넣었다.
A. 10 μM의 코엘렌테라진을 이용하여 각각 10개의 섬들을 함유하는 2개의 상이한 웰들을 3시간 동안 항온배양하고, 음성 대조군으로서의 11 mM 글루코오스 또는 11 mM 만나톨로 각각 자극하였다. Luminoskan 발광계 조건: 통합 시간(integration time) 0.5초, 판독 시간 150초.
B. 이어서, 40 mM KCl로 상기 섬들을 자극하였다. 다음과 같은 세팅(setting)들을 갖는 CCD 카메라에 기초한 발광계에서 방사된 빛을 측정하였다: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
C. 상기 섬들의 전체 광단백질 잔류 활성은 Triton X-100을 함유하는 용액을 이용한 세포 분리 후에 방사된 빛을 기록하여 평가하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
도 16. c-Photina
형질전환 마우스-유도된 대식세포들의 세포 분리시에 측정된 전체 광 방출. 96 MTP 평판에 20000 세포/웰을 접종하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 통합 시간 0.6초, 판독 시간 60초.
도 17. 2개의 ES/mito i-Photina
최종 클론들의 분석. A. 10000 세포/웰의 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 측정된 클론 N. 70의 히스타민 용량 반응. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초. B. 2개의 최상 ES/mito i-Photina
클론들의 전체 광단백질 잔류 활성은 Triton X-100을 함유하는 용액을 이용한 세포 분리 후에 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 5초.
도 18. 2개의 ES/i-Photina
최종 클론들의 분석. A. 10000 세포/웰의 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 측정된 클론 N. 113의 히스타민 용량 반응. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초. B. 2개의 최상 ES/mito i-Photina
클론들의 전체 광단백질 잔류 활성은 Triton X-100을 함유하는 용액을 이용한 세포 분리 후에 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 5초.
도 19. 2개의 P19/mito c-Photina
최종 클론들의 분석. A. P19/mito c-Photina
1A1 클론의 히스타민 반응은 20000 세포/웰의 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초. B. P19/mito c-Photina
1A2 클론의 히스타민 반응은 20000 세포/웰의 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초. C. 전체 광단백질 잔류 활성은 Triton X-100을 함유하는 용액을 이용한 세포 분리 후에 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 낮은 감작성, 판독 시간 30초.
도 20. P19/mito c-Photina
/1A1 클론으로부터 유래한, 생체외에서 분화된 뉴론들에 대한 96 MTP 상에서의 면역형광 분석. 면역형광 검정은 하기 주요 항체들을 사용하여 수행되었다:
A. 토끼 항-신경필라멘트 H(NF H) 1차 항체 + 항-토끼 FITC 2차 항체.
B. 형광 및 가시광 현미경을 사용하여 관찰할 때 보이는 바와 같이, 마우스 항-뉴론성 핵 1차 항체 + 항-마우스 로다민화 2차 항체.
C. 형광 및 가시광 현미경을 사용하여 관찰할 때 보이는 바와 같이, 마우스 항-네스틴 1차 항체 + 항-마우스 FITC 2차 항체.
도 21. P19/mito c-Photina
/1A1 클론으로부터 유래한, 생체외에서 분화된 뉴론들에 대한 CCD 카메라에 기초한 기능 시험.
A. 타이로드(Tyrode), 및 40 mM KCl 반응은 뉴론들의 분화 후 8일째에 384 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초. B. 타이로드(Tyrode), 및 40 mM KCl 반응은 뉴론들의 분화 후 11일째에 384 MTP에서 측정되었다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초.
도 22. 8일째에, P19/mito c-Photina
/1A1 클론으로부터 유래한, 생체외에서 분화된 뉴론들에 대한 FLIPR384 기능 시험.
FLIPR384 분석을 위해, 배지는 Fluo-4 NW
칼슘 감작성 형광 염료로 대체하였다. 이어서, 37℃에서 30분 동안, 그리고 실온에서 30분 동안 평판을 항온배양한 후, KCl 용액(40 mM의 최종 농도)을 주입하였다. 형광 신호를 360초 동안 기록하고, RFU(FLIPR384 세팅: 실험 시간: 0.3초; 주입 속도: 20 ㎕/초; 주입 높이: 50 ㎕; 판독 시간: 360초)로서 나타내었다.
도 23. 8일째에, P19/mito c-Photina
/1A1 클론으로부터 유래한, 미분화된 뉴론들 및 생체외에서 분화된 뉴론들에 대한 FLIPR384 기능 시험. FLIPR384 분석을 위해, 배지는 25 ㎕/웰의 Fluo-4 NW
칼슘 감작성 형광 염료로 대체하였다. 이어서, 평판을 1시간 동안 항온배양한 후, 히스타민 또는 글루타메이트(100 μM의 최종 농도)를 주입하였다. 형광 신호를 360초 동안 기록하고, RFU(FLIPR384 세팅: 실험 시간: 0.3초; 주입 속도: 20 ㎕/초; 주입 높이: 50 ㎕; 판독 시간: 330초)로서 나타내었다. A. 3000 세포/웰의 미분화된 P19/mito c-Photina
/1A1 클론 세포들의 FLIPR384 반응들은 접종 후 24시간째에 시험하였다. B. 8일째에, P19/mito c-Photina
/1A1 클론으로부터 유래한 분화된 뉴론들의 FLIPR384 반응들.
도 24. P19 세포들에서의 상이한 광단백질들(mito Photina
, mito c-Photina
, mito i-Photina
)의 일시적인 형질감염. A. Luminoskan 발광계에서 100 μM 히스타민 반응을 측정하였다. 판독 시간 60초. B. Berthold 발광계에서 Triton X-100을 이용한 세포 분리 후에 전체 광 방사(light emission)를 측정하였다. 판독 시간 3초.
도 25. mito i-Photina
(A.) 및 mito Photina
(B.)의 풀의 분석. 10000 세포/웰의 세포 접종 후 24시간째에 96 MTP에서의 50, 100 및 150 μM 히스타민 반응을 측정하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60 초. C. 10000 세포/웰 및 20000 세포/웰의 세포 접종 후 24시간째에 96 MTP에서 Triton X-100을 이용한 세포 분리 이후에, 전체 광 방사(light emission)를 측정하였다.
도 26. 2개의 mito i-Photina
최종 클론들의 FLIPR과 CCD 카메라에 기초한 발광계에서의 대비. P19/mito c-Photina
/1A1 클론(A.) 및 P19/mito c-Photina
/1A2 클론(B.)의 히스타민 반응은 20000 세포/웰의 세포 접종 후 24시간째에 384 MTP에서 측정하였다. CCD 카메라에 기초한 발광계 분석을 위해, 37℃에서 10 μM의 코엘렌테라진 용액을 이용하여 판독하기 4시간 전에 배지를 교체하였다(CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초). FLIPR
분석을 위해, 칼슘 3 검정 키트(Calcium 3 Assay Kit) 0.5×를 이용하여 판독하기 30분 전에 배지를 교체하였다(FLIPR384 세팅: 실험 시간: 0.2초; 주입 속도: 20 ㎕/초; 주입 높이: 50 ㎕; 판독 시간: 60초). 두가지 측정을 위해, 히스타민의 최종 농도는 100 μM이었다. 발광계로 측정된 신호 대(對) 노이즈 비율[RLU(상대 발광 단위)로 표시됨] 및 형광계로 측정된 신호 대(對) 노이즈 비율[RFU(상대 발광 단위)로 표시됨] 비율을 계산하여 기록하였다.
1.
광단백질들로
형질감염된
ES
세포주의 생성
1.1.1.
mito
c-
Photina
ES
TBV2
클론
BglII 제한 효소로 선형화된 mito c-Photina
광단백질 유전자를 함유하는 pcDNA3 벡터를 이용한 ES TBV2 p16 세포들의 전기천공에 의해 마우스 ES TBV2 mito c-Photina
세포주를 수득하였다(전술한 재료 및 방법 참조).
형질감염후 48시간째에, 200 ㎍/ml G418을 이용하여 세포들을 선별하였다. 선별한지 8일 후에, 152개의 약물 내성 콜로니들을 피킹(picking)하였다. 형태학적 분석 후, 다음과 같은 96 웰/평판들에 5개의 복제물씩 집합(confluence)을 이룰 때까지 MEF 층들 상에서 약 114개의 약물 내성 콜로니들만을 팽창시켰다:
1. 2개의 복제물(replicate)들은 접종후 24시간째 및 48시간째에 CCD 카메라에 기초한 발광계에서의 시험을 위해, 젤라틴 코팅된 96개의 백색 MTP 상에 존재하였다.
2. 1개의 복제물(replicate)은 DNA 추출을 위해, 젤라틴 코팅된 96개의 백색 MTP 상에 존재하였다.
3. 2개의 복제물(replicate)은 -80℃에서의 동결 및 저장을 위해, 영양 세포층(feeder layer) 상에 존재하였다.
1.1.2.
mito
c-
Photina
ES
TBV2
클론 선별
측정하기 4시간 전에, 활성 광단백질을 재구성하기 위하여, 양성 클론들의 배지는 5% CO2로 가습화된 대기하에 암소에서 2mM Ca2 + 및 10 μM 코엘렌테라진을 함유하는 타이로드 완충액 50 μM로 대체하였다.
광 방사(light emission) 측정의 경우, ES 내인성 히스타민-1 수용체(참고 문헌 58 참조)를 자극하고 세포질의 Ca2 + 농도를 상승시키는 것으로 알려진 히스타 민에 대하여 (발광 신호) 반응할 수 있는 세포들의 능력을 먼저 분석하였다. 최초 60초 동안 100 μM 히스타민의 주입후에 방사된 광자들의 수를 CCD 카메라에 기초한 발광계에 의해 측정하였다. 얻어진 반응 속도론(reaction kinetics)은 도 1에 나타나 있다.
각 실험의 말기에, (Triton X-100을 함유하는 용액에 의해) 세포들을 분리하였다. 유리(free) 칼슘 및 방사된 빛과 반응하는 세포들내에서 발현된 모든 광자를 특정하였다(도 1B 참조). 신호는 세포들내에 함유된 광단백질의 총량의 지표(indicator)이다.
12개의 최상(最上, best) 히스타민 반응 클론들을 선별하고, 96 MTP에서 계수된 세포들로 재시험하였다(도 2A 및 2B 참조).
상이한 마라미터(parameter)에 기초하여 2개의 최종 클론들을 선별하였다. 히스타민에 반응할 수 있는 능력(도 3 참조) 및 세포 분리 후의 전체 광단백질 함량(데이타가 나타나 있지 않음)은 주요 식별 인자들이었으며, 또한 세포 형태(cell morphology) 및 성장 속도(growth rate)도 분석하였다. 또한, 서던 블롯 분석(참고 문헌 59 참조) 및 정량적 PCR(참고 문헌 60)을 수행하였다. 서던 블롯 분석은 단 하나의 무작위 삽입(random insertion)이 일어난다는 것을 확증하는데 기본적인 것이다. 이를 조사하기 위하여, (연쇄(concatenate)들을 찾기 위해) 형질감염된 벡터내에서 단 1회 절단하는 제한 효소로 게놈 DNA를 소화시키거나, 또는 광 유전자를 절단할 수 있는 2개의 효소들(이들 2개의 효소는 단일 소화에도 사용됨)로 게놈 DNA를 이중 소화(double digestion)[이중 소화는 결과의 특이성(specificity)을 확 증시킴]시킨다. 검정을 위해 사용된 프로브(probe)는 광단백질 유전자이었다. 또한, 유전자 삽입의 수를 분석하기 위하여, 정량적 PCR을 수행하였다.
또한, 최종 클론들은 핵형(karyotype) 분석(참고 문헌 61 참조)에 의해 특징지워졌다. 클론 N. 29 및 84를 선별하였다. 클론 N. 29는 게놈내에 통한된 단 하나의 광단백질 유전자 복제물물을 보유하는 반면에, 클론 N. 84는 게놈내에 단 한번 통합된 연전된 연쇄(inverted concatenate)로서의 2개의 복제물을 보유한다.
또한, 클론 N. 29 및 84는 현적(hanging drop) 배아체들 형성 표준 방법 수행 이후에 자발적으로 박동 심장근육세포(beating cardiomyocyte)들로 분화되고, 레티노산 존재하에서의 배아체들 형성 이후에 뉴론 세포 유형들로 분화되었다.
1.1.3.
ES
/
mito
c-
Photina
/29 클론의
줄기성
(
stemness
) 증명
- 특이 세포들 표면 항원(SSEA -1)(도 4 참조) 및 전사 인자 oct 3/4(도 4B 참조)와 같은, 미분화된 다능성 마우스 배아 줄기 세포들의 특이 마커들의 존재를 조사하기 위하여, ES/mito c-Photina
/29 클론에 대하여 간접 면역형광 검정들을 수행하였다. 결과는 좋았고, 도 4A 및 4B에 나타나 있다.
- 이들 세포들에 의해 나타난 다른 줄기성 특성은 ELF
포스파타제 염색 키트(ATCC, Cat. N. SCRR-3010)을 이용하여 측정된 알칼리성 포스파타제 효소 활성의 존재이다(도 5 참조).
1.1.4.
ES
/
mito
c-
Photina
/29 클론을 이용하여 수행된
생체외
분화 검정들
또한, 29개의 클론 세포들의 다능성은 심장근육세포들 및 뉴론들과 같은, 상 이한 배엽(germ layer)으로부터 유래한 세포 유형들에서 생체외(in vitro) 분화할 수 있는 이들 세포들의 능력에 의해 증명되었다.
배아체(EB) 형성 단계를 포함하는 현탁(suspension) 프로토콜들 및 부착(adhesion)(데이터에 나타나 있지 않음) 프로토콜들과 같은 상이한 방법들을 이용하여 분화 실험들을 수행하였다.
특히 EBs(배아체들) 형성 단계(전술한 재료 및 방법 참조)를 포함하는 프로토콜들을 사용하여 최적 결과를 얻었다.
심장근육세포들
전술한 방법을 사용하여, 본 발명자들은 분화 6일째부터 시작하여 자발적으로 펄싱(pulsing)하는 심장근육세포들의 외관을 보았다. 펄싱 영역(pulsing area)들을 함유하는 EBS(배아체들)의 백분율은 약 80%이었다(도 6 참조). 이러한 백분율은 상이한 지지체(support)들, 즉 젤라틴 코팅된 24 MTP, 96 MTP, 384 MTP와 같은 상이한 지지체들 및 챔버 슬라이드(chamber slide)들(데이터에 나타나 있지 않음)을 사용하는 경우에도 유지되었다.
성숙한 심장근육세포들의 존재를 증명하기 위하여, 세포골격 단백질 알파-악티닌(도 7A 참조),미오신 중쇄(MHC)(도 7B 참조), 또는 전사 인자 GATA-4(도 7C 참조)와 같은 특이 심장근육세포 마커들의 존재를 탐색하면서 면역형광 검정을 수행하였다.
Accutase
완충액을 이용한 배아체들 분해(disaggregation) 및 10 μM 코엘렌테라진 타이로드 완충액에서의 재현탁 후에, CCD 카메라에 기초한 발광계 기구에 서 예비 기능 시험들을 수행하였다. 세포들을 계수하고, 96 MTP에서 20000 세포/웰의 세포 농도로 세포들을 접종하였다. 4시간 후, 37℃에서 대조군으로서의 표준 타이로드 완충액, 50 nM 엔도테린-1 및 100 μM 노르에피네프린[엔도테린-1은 GqPCR 엔도테린 수용체에 대한 아고니스트이고, 노르에피네프린은 α1-아드레날린 수용체에 대한 아고니스트이며, 엔도테린-1과 노르에피네프린은 둘다 심장근육세포들내에 고농도로 존재한다]으로 세포들을 자극하였다(CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초). 나타난 반응들은 강하고(거의 모두 엔도테린 수용체에 대한 것임) 특이적이었다(도 8A 참조). 심장근육세포들에 고농도로 존재하는 L형 전압 감응성 칼슘 채널들을 활성화시키기 위하여, 40 mM KCl로 동일한 세포들을 자극시켜 탈분극 자극시켰다. 특이적인 L형 전압 감응성 캘슘 채널 저해제인 5 μM의 니페디핀을 이용하여 세포들을 예비항온배양(preincubating)하거나, 또는 (KCl 주입전에는) 15분동안 예비항온배양하지 않으면서 반응들의 특이성을 조사하였다(도 8B 참조).
세포 분리 완충액을 주입하여 잔류 광단백질 활성을 조사하였다(CCD 카메라에 기초한 발광계 조건: 높은 감작성, 판독 시간 30초)(도 8C 참조).
뉴론들
뉴론 분화의 경우, 배아체들은 조직 배양 처리된 접시들 상에 도말한 후 2일째에 모두 트랜스(trans)형인 레트노산 1 μM의 존재하에서 형성되었고, 그 길이가 시간의 경과에 따라 증가하는 세포 연장(cellular prolongation)의 존재가 가시적이었다(도 9 참조).
레티노산 처리된 EBs(배아체들)은 분해(disaggregation)되고, 상이한 코팅 기질들 상에 재도말되고, 혈청의 부재하에 뉴론 특이성 배지를 이용하여 배양될 수 있다. 이들 세포에 있어서, 면역형광(신경필라멘트 H, 뉴론성 핵 항원, 2가지 상이한 형광색소들을 이용한 이중 염색시에 보고됨, 도 10A 및 10B 참조), 또는 아교세포 마커(glial marker)(아교 섬유 산성 단백질, 도 10C 참조), 또는 뉴론 전구체 세포들에 대한 마커들(네스틴, 도 10D 참조)에 의해 특이 마커들의 존재를 조사하였다. 이러한 유형의 세포 집단(cell population)이 완전히 분화된 뉴론들에 의해 만들어지지 않지만 아교 세포들 및 뉴론 전구체들을 함유한다는 사실에 주목하는 것은 중요하다. 도 10에 이와 같은 세포 집단(분화 18일째)의 예가 보고되어 있다.
CCD 카메라에 기초한 발광계에서 이들 세포들의 기능성(functionality)을 조사하였다. 분화 14일째에, 10 μM 코엘렌테라진을 함유하는 타이로드 용액을 이용하여 4시간 동안 세포들을 항온배양하였다. 글루타메이트 수용체 반응을 조사하기 위하여 100 μM 글루타메이트(도 11A 참조)를 주입하여 세포들을 자극하거나, 또는 N형 전압 감응성 칼슘 채널들을 특이적으로 저해하기 위하여 6 μM 오메가코노톡신 GVIA(15분 동안 예비항온배양됨)의 존재 또는 부재 하에서 40 mM KCl을 이용하여 세포들을 탈분극시켰다(도 11B).
또한, FLIPR384에서 이들 세포들의 기능성을 조사하였다. 분화 16일째에, 배지들을 제거하고, 37℃에서 30분 동안 표준 타이로드 완충액에 가용화된 막 전위 염료를 이용하여 세포들을 항온배양하였다. 40 mM KCl로 자극시킨 후, 180초 동안 형광 신호를 기록하고 RFU로 표시하였다(도 12 참조, 연속 라인). 대조군으로서의 미분화 ES/mito c-Photina
/29 클론에 대하여 동일한 실험을 수행하였다(도 12 참조, 파선).
1.1.5.
생식세포주
투과(
germline
transmission
) 분석
생식세포주 투과(germline transmission)에 의해, 당단백질 리포터 유전자를 함유하는 마우스 배아 줄기 세포들(ES TBV2)을 시험하였다. 클론 N. 29 및 84는 둘다 임신한 다수의 암컷 마우스들(EMBL Monterotondo)의 섬아아세포들내에 주입하였다. 자손들은 고도의 키메리즘(chimerism)(거의 100%)과 수컷 표현형을 나타내었다. 클론 N. 29로부터 유도된 2개의 최상(最上) 키메라 수컷 마우스들을 선별하고, 이들이 성적 성숙(sexual maturity) 상태에 도달시 BL6 암컷 마우스들과 교배시켜, 형질전환 ES 세포들의 생식세포주 투과 능력을 조사하였다. 생식세포주 투과는 마우스 배아 줄기 세포들의 전능성(totipotency)을 증명할 수 있는 논쟁의 여지가 없는 유일한 방법이다.
기대된 대로, 교배에 의해 태어난 마우스들의 절반은 광단백질 유전자에 대하여 이형접합성인 형질전환 마우스들이다.
동형접합성 집단(homozygous population)을 얻기 위하여, 이들 이형접합성 형질전환 마우스들을 자가 교배하였다. 태어난 마우스들의 1/4은 동형접합성이고, 표현형이 정상이었는데, 이는 형질전환 유전자가 중요한 유전자를 봉괴시키지 않았다는 것을 증명한다.
c-Photina
형질전환 마우스들은 성체 줄기 세포들(예컨대, 조혈 또는 간엽 줄기 세포들), 수임 전구세포(committed progenitor)들, 및 광단백질을 함유하는 1차 세포들과 같은 세포들의 매우 중요한 근원(source)이다.
광단백질 형질전환 동물들로부터 유도된 세포들은 "1차 유사(primary-like)" 세포들(ES 세포들로부터 분화후에 수득됨)을 위한 양성 대조군으로서 사용될 수 있지만, 그 자체로서 HTS 프로세스를 위한, 광단백질 함유 1차 세포들의 중요한 근원이다.
이러한 이유로 인하여, 본 발명자들은 조직들에서 광단백질이 발현되었는지 여부를 조사하기로 하였다.
본 발명자들은 2마리의 마우스들(하나는 c-Photina
형질전환 유전자에 대하여 양성이고, 다른 하나는 c-Photina
형질전환 유전자에 대하여 음성임)을 도살하였다. 몇몇 조직들은 상기 2마리의 마우스들로부터 외식(explantation)하고, 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 20 μM 코엘렌테라진 및 프로테아제 저해제 칵테일들을 함유하는 용액을 이용하여 항온배양하였다. 실온에서 항온배양한지 3시간 후에, 본 발명자들은 포화되지 않은 칼슘 환경에서 샘플내에 존재하는 모든 광단백질을 방출시키기 위해, 250 mM CaCl2와 동시에 Triton X-100의 용액을 주입하여 조직/기관들을 분리하였다(도 13A). 상이한 연령(3개월, 6개월, 10개월)의 동물들에 있어서의 상이한 조직들내의 광단백질 형질전환 유전자의 존재를 조사하고, 동시에 전술한 방법과 동일한 방법으로 더 많은 동물들을 분석하였다. 측정된 신호들은 샘플들 양이 정규분포화(normalization)되 지 않았다는 사실을 감안하더라도 안정적인 것처럼 보인다(도 13B). 이어서, 본 발명자들은 2차 실험을 수행하였는데, 2차 실험에서 본 발명자들은 코리 정맥을 통한 2.8 mg 코엘렌테라진/kg의 정맥 전신 주입(참고 문헌 66 참조) 후에 상이한 조직/기관들에 존재하는 광단백질을 확산 및 하전시킬 수 있는 코엘렌테라진의 능력을 조사하였다. 세포 분리 및 칼슘 용액의 주입 이후에 CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초, 통합 시간 0.6초)에서 재료의 절반을 직접적으로 시험하였다(도 14A). 재료의 나머지 절반을 다른 96 MTP에 전이시키고, 20 μM 코엘렌테라진을 함유하는 용액을 이용하여 추가로 3시간 동안 항온배양하였다. 또한, 세포 분리 및 칼슘 용액의 주입 이후에 CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초, 통합 시간 0.6초)에서 이 다른 평판을 시험하였다(도 14B).
도살 전에, 본 발명자들은 또한 췌장 섬 분리 및 정제를 수행하였다(전술한 재료 및 방법 참조). 37℃에서 밤새도록 췌장 섬들을 배양하였다. 다음날 췌장 섬들을 수작업으로 피킹(picking)하고, 96 MTP에 넣었다[10개의 섬/웰(istlet/well)].
37℃에서 3시간 동안 10 μM 코엘렌테라진을 함유하는 표준 타이로드 완충액에서 췌장 섬들을 항온배양하였다.
그 후, 칼슘-매개 인슐린 경로(calcium-mediated insulin pathway)를 활성화시키기 위하여, 11 mM 글루코오스로 췌장 섬들을 자극하였다. 또한, 대조군으로서, 다른 당류(sugar)(칼슘-매개 인슐린 반응을 유도할 수 없음), 만니톨(11 mM의 최종 농도로)로 췌장 섬들을 자극하였다. Luminoskan 발광계(조건: 판독 시간 150초, 통합 시간 0.5초)에서 이들을 측정하였다(도 15A 참조).
이어서, 글루코스 농도를 3 mM에서 정규분포화하고, 또한 탈분극 제제(40 mM KCl)로 췌장 섬들을 자극하고, CCD 카메라에 기초한 발광계(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초)에서 측정하였다(도 15B 참조). 세포 분리 완충액을 주입하여 잔류 광단백질 활성을 조사하였다(조건: 높은 감작성, 판독 시간 60초)(도 15C 참조).
또한, 형질전환 동물들은 광단백질을 함유하는 1차 세포들의 매우 중요한 근원이다. 이 목적을 위해, 1차 세포들의 예로서 단핵세포들을 대조군으로서의 양성 및 음성 마우스의 골수로부터 분리하였다. 이어서, 대식세포들을 얻기 위하여 이들 세포들을 생체외에서 분화시켰다(참고 문헌 68 참조). 세포 배양의 확립 후, Triton X-100 용액을 이용하여 세포들을 분리하여, c-Photina
형질전환 유전자의 존재를 조사하였다.
1.2.1.
mito
i-
Photina
ES
TBV2
클론
BglII 제한 효소로 선형화된 mito i-Photina
광단백질 유전자를 함유하는 pcDNA3 벡터를 이용한 ES TBV2 p16 세포들의 전기천공에 의해 마우스 ES TBV2 mito i-Photina
세포주를 수득하였다(전술한 재료 및 방법 참조).
형질감염후 48시간째에, 200 ㎍/ml G418을 이용하여 세포들을 선별하였다. 선별한지 8일 후에, 130개의 약물 내성 콜로니들을 피킹(picking)하고, 다음과 같은 96 웰/평판들에 5개의 복제물씩 집합(confluence)을 이룰 때까지 MEF 층들 상에 서 팽창시켰다:
- 2개의 복제물(replicate)들은 접종후 24시간째 및 48시간째에 CCD 카메라에 기초한 발광계에서의 시험을 위해, 젤라틴 코팅된 96개의 백색 MTP 상에 존재하였다.
- 1개의 복제물(replicate)은 DNA 추출을 위해, 젤라틴 코팅된 96개의 백색 MTP 상에 존재하였다.
- 2개의 복제물(replicate)은 -80℃에서의 동결 및 저장을 위해, 영양 세포층(feeder layer) 상에 존재하였다.
1.2.2.
mito
i-
Photina
ES
TBV2
클론 선별
ES TBV2 mito c-Photina
세포주에 대하여 앞에서 보고된 바와 같이, 클론들을 정확하게 선별하였다.
최종 클론들은 N. 70 및 N. 43이었다. N. 70 클론은 가장 높은 히스타민 반응을 나타내었고(도 17A 참조), N.43 클론도 또한 양호한 히스타민 용량 반응을 나타내었다(데이터는 나타나 있지 않음). 세포 분리시의 전체 광 방사는 둘다 양호하였다(도 17B).
단 하나의 통합(intergration)을 나타내는(실시간 PCR의 경우에는 그러하지 아니하였음) 서던 불롯에 의해 이들을 분석하였다.
N. 70 및 N. 43 클론들에 대한 핵형(karyotype)은 정확하였다.
1.3.1.
i-
Photina
ES
TBV2
클론
BglII 제한 효소로 선형화된 i-Photina
광단백질 유전자를 함유하는 pcDNA3 벡터를 이용한 ES TBV2 p16 세포들의 전기천공에 의해 마우스 ES TBV2 i-Photina
세포주를 수득하였다(전술한 재료 및 방법 참조).
형질감염후 48시간째에, 200 ㎍/ml G418을 이용하여 세포들을 선별하였다. 선별한지 8일 후에, 99개의 약물 내성 콜로니들을 피킹(picking)하고, 다음과 같은 96 웰/평판들에 5개의 복제물씩 집합(confluence)을 이룰 때까지 MEF 층들 상에서 팽창시켰다:
- 2개의 복제물(replicate)들은 접종후 24시간째 및 48시간째에 CCD 카메라에 기초한 발광계에서의 시험을 위해, 젤라틴 코팅된 96개의 백색 MTP 상에 존재하였다.
- 1개의 복제물(replicate)은 DNA 추출을 위해, 젤라틴 코팅된 96개의 백색 MTP 상에 존재하였다.
- 2개의 복제물(replicate)은 -80℃에서의 동결 및 저장을 위해, 영양 세포층(feeder layer) 상에 존재하였다.
1.3.2.
i-
Photina
ES
TBV2
클론 선별
ES TBV2 mito c-Photina
세포주에 대하여 앞에서 보고된 바와 같이, 클론들을 정확하게 선별하였다.
최종 클론들은 N. 113 및 N. 109이었다. N. 113 클론은 가장 높은 히스타민 반응을 나타내었다(도 18A 참조). 세포 분리시의 전체 광 방사는 둘다 양호하였다 (도 18B).
단 하나의 통합(intergration)을 나타내는(실시간 PCR의 경우에는 그러하지 아니하였음) 서던 불롯에 의해 이들을 분석하였다.
N. 113 및 N. 109 클론들에 대한 핵형(karyotype)은 정확하였다.
2.
광단백질들로
형질감염된
P19
세포주의 생성
2.1.1.
mito
c-
Photina
P19
클론
BglII 제한 효소로 선형화된 mito c-Photina
광단백질 유전자를 함유하는 pcDNA3 벡터를 이용한 P19 세포들의 전기천공에 의해 마우스 P19 mito c-Photina
세포주를 수득하였다(전술한 재료 및 방법 참조).
형질감염후 48시간째에, 700 ㎍/ml G418을 이용하여 세포들을 선별하였다. 선별한지 약 7-8일 후에, 약물 내성 콜로니들을 피킹(picking)하고, 확장시켰다.
2.1.2.
mito
c-
Photina
P19
클론 선별
측정하기 4시간 전에, 활성 광단백질을 재구성하기 위하여, 배지는 5% CO2로 가습화된 대기하에 37℃의 암소에서 2mM Ca2 + 및 10 μM 코엘렌테라진을 함유하는 타이로드 완충액 50 μM로 대체하였다.
광 방사(light emission) 측정의 경우, P19 내인성 히스타민-1 수용체(참고 문헌 58 참조)를 자극하고 세포질의 Ca2 + 농도를 상승시키는 것으로 알려진 히스타민에 대하여 (발광 신호) 반응할 수 있는 세포들의 능력을 먼저 분석하였다.
히스타민에 대한 반응의 결과인 광단백질 활성과 Triton X-100을 이용한 세포 분리 후에 측정된 전체 광단백질 함량에 기초하여 2개의 최종 클론들을 선별하였다(도 19 참조). 심장근육세포들 발육용 유도제로서의 0.5-1% DMSO 및 뉴론 발육용 레티노산의 존재 및 부재 하에서의 배아체들 형성을 사용하여 얻어진, 분화 과과정 후에 자발적으로 박동하는 심장근육세포들과 뉴론들로 분화할 수 있는 상기 클론들의 능력이 또한 고려되었다(참고 문헌 61, 62, 64 및 67 참조).
2.1.3.
뉴론계(neuronal lineage)로의
P19
/
mito
c-
Photina
/1A1 클론의
생체외
분화
mito c-Photina
세포들을 발현시키는 다능성 배아 암 P19의 1A1 클론은 생체외에서 뉴론 세포 유형들로 분화할 수 있는 것으로 나타났다.
이들 세포들이 신경필라멘트 H(NF H) 및 뉴론성 핵(NeuN)(도 20A 및 20B 참조)과 같은 뉴론 특이성 마커들, 또는 뉴론 천구체 세포들 마커들(네스틴)(도 20C 참조)을 발현시킨다는 것을 면역형광에 의해 증명하였다.
또한, CCD 카메라에 기초한 발광계에서 이들 세포들의 기능성을 조사하였다. 분화 8일째 및 11일째(배아체들의 분해, 및 384 MTP에서의 폴리 D-리신 상에서의 접종 후 각각 4일째 및 7일째)에, 10 μM 코엘렌테라진을 함유하는 타이로드 용액을 이용하여 4시간 동안 세포들을 항온배양하였다. 40 mM KCl의 주입을 이용하거나, 또는 대조군으로서의 표준 타이로드 완충액을 이용하여 전압 감응성 칼슘 채널들을 자극하였는데, 최적의 반응들을 나타내었다(도 21 참조).
또한, 분화 8일째에, Fluo-4 NW
을 이용하여 세포들을 항온배양하고 40 mM KCl 탈분극 제제를 주입하면서, FLIPR384에서 동일한 세포들을 분석하였다. 또한, 이 경우에, 비록 이후에 발광 리포터 시스템(luminescence reporter system)으로 관찰시 속도론 형상(kinetics shape)들이 최악일지라도, 세포내에 칼슘이 들어가기 때문에 신호의 지각할 수 있는 증가(sensible increase)가 존재한다(도 22 참조).
동일한 발육 단계(8일째)에서, 대사성 또는 이온성 글루타메이트 수용체들(도 23B 참조, 대쉬 라인) 또는 히스타민-1 수용체들(GqPCR)(도 23B 참조, 연속 라인)의 존재에 대하여 FLIPR384에서 이들 세포들을 분석하였다. (384 MTP에서의 3000 세포/웰의 세포들의 접종 후 24시간째에) 미분화 P19/mito c-Photina
1A1 클론에 대하여 동일한 실험을 동시에 수행하였다. 특히, 히스타민 자극 후에 기록된 신호는 미분화 세포들에서 더 높았고(이 단계에서 고도로 발현되기 때문에 예상된 바와 같음), 분화 기간 중에 감소한다. 글루타메이트 자극의 경우에는 그 결과가 반대로 나타났는데, 이는 미분화 세포들에서보다 분화된 세포들에서 더 높기 때문이다. 글루타메이트 수용체들의 존재는 이들 세포들의 뉴론 위임(neuronal commitment)의 또 다른 증거이다.
3. 일시적인 형질감염들
상이한 미토콘드리아 표지된 광단백질들은 세포내 칼슘 방출을 측정할 수 있고 광단백질 발현 레벨에 대한 정보를 얻을 수 있는 이들 다른 광단백질의 능력을 평가하기 위하여, P19 세포들로 형질감염시켰다(전술한 재료 및 방법 참조).
측정하기 4시간 전에, 배지는 활성 광단백질을 재구성하기 위하여 5% CO2로 가습화된 대기하에 37℃ 암소에서 타이로드 완충액 및 10 μM 코엘렌테라진으로 대체하였다.
100 μM 히스타민 주입 후에 60초 동안 발광 신호를 기록하였다.
이어서, 전체 광 방출을 검출하기 위하여 Triton X-100으로 세포들을 분리하였다(도 24 참조).
4. 안정적 형질감염들
안정적으로 통합된 방식으로 광단백질 발현의 레벨을 조사하고, P19 세포들에서 안정적으로 발현된 광단백질들이 배양액에서 장기간 비독성이라는 것을 증명하기 위하여, P19 세포들에서의 상이한 미토콘드리아 표지된 광단백질의 안정적 형질감염들(전술한 재료 및 방법 참조)을 수행하였다.
측정하기 4시간 전에, 배지는 활성 광단백질을 재구성하기 위하여 5% CO2로 가습화된 대기하에 37℃ 암소에서 타이로드 완충액 및 10 μM 코엘렌테라진으로 대체하였다.
50, 100 및 150 μM 히스타민 주입 후에 60초 동안 발광 신호를 기록하였다.
이어서, 전체 광 방출을 검출하기 위하여 Triton X-100으로 세포들을 분리하였다(도 25 참조).
5.
FLIPR
384
에서의
세포계
형광 검정(
cell
-
based
fluorescence
assay
)들
발광 대신에 형광을 사용하는 검출 방법을 이용한 내인성 히스타민 1 수용체 의 활성화에 의해 유도된 칼슘 농도 변화를 측정함으로써, FLIPR384에서도 P19 mito c-Photina
최종 클론들(1A1 및 1A2)을 시험하였다.
칼슘 3 검정 키트(Calcium 3 assay kit)(미국 캘리포니아주 써니베일 소재 Molecular Devices Corporation)를 이용하여 세포들을 항온배양하였다.
이러한 실험들을 수행하여, 발광계 칼슘 검출 대신에 형광 칼슘 검출 방법을 사용하여 얻은 결과를 비교하고, 형광과 대비되는 발광의 장점들을 평가하였다. 얻은 결과는 형광계 방법이 발광에 비하여 더 높은 배경(higher background)을 갖는다는 것을 보여준다. 이는 형광의 보다 낮은 신호 대(對) 노이즈 배경에서 반영된다. 이와 반대로, 발광의 경우의 신호 대(對) 노이즈 배경은 보다 높고, 이는 형광에 비하여 보다 넓은 동적 범위(wider dynamic range)에 있다는 것을 반영한다.
참고 문헌
1. Burdon T., Smith A., Savatier P. (2002) Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends Cell Biol.; 12(9), 432-8.
2. Odorico J.S., Kaufman D. S., Thomson JA. (2001) Stem Cells. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines.; 19(3), 193-204.
3. Wobus, AM and Boheler, KR. (2005) Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Physiological Reviews; 85, 635-678.
4. Spangrude, G. J., Heimfeld, S. and Weissman, I. L. (1988) Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science; 241, 58-62.
5. Krause D. S., Theise N.D. Collector M.I., Henegariu O., Hwang S., Gardner R., Neutzel S., Sharkis SJ. (2001) Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow derived stem cell. Cell; 105, 369-377.
6. Reya T., Sean J. Morrison SJ., Clarke M.F.3 and Weissman LL. (2001) Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature; 414, 105-111.
7. Wagers AJ, Weissman LL. (2004) Plasticity of adult stem cells. Cell; 116(5), 639-648.
8. Baksh D., Song L., Tuan R.S. (2004) Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med.; 8(3), 301-316.
9. Cai J., Weiss MX., Rao MS (2004) In search of "sternness". Exp Hematol.; 32(7), 585-598.
10. Donovan PJ., and Gearhart J. (2001) The end of the beginning for pluripotent stem cells. Nature; 414, 92-97.
11. Evans MJ., Kaufman M. H. (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature; 292(5819), 154-156.
12. Martin G.R. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A.; 78(12), 7634-7638.
13. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S., Waknitz M.A., Swiergiel JJ., Marshall V. S., Jones J. M. (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science; 282(5391), 1145-1147.
14. Stevens, L. C. (1967) The biology of teratomas. Adv. Morphogeny 6, 1-31.
15. Gearhart J.D., Mintz B. (1974) Contact-mediated myogenesis and increased acetylcholinesterase activity in primary cultures of mouse teratocarcinoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A.; 71(5), 1734-1738.
16. Kahan B.W., Ephrussi BJ. (1970) Developmental potentialities of clonal in vitro cultures of mouse testicular teratoma. Natl Cancer Inst.; 44(5), 1015-1036.
17. Jiang, L. I. and Nadeau, J. H. (2001) 129/Sv mice~a model system for studying germ cell biology and testicular cancer. Mammal. Genome 12, 89-94.
18. McBurney M.W. (1993) P19 embryonal carcinoma cells. Int J Dev Biol. Mar; 37(1), 135-140.
19. Matsui, Y., Zsebo, K. and Hogan, B. L. (1992) Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell; 70, 841- 847.
20. Labosky P.A., Barlow D.P., Hogan B.L. (1994a) Embryonic germ cell lines and their derivation from mouse primordial germ cells. Ciba Found Symp.;182,157-68; discussion 168-178.
21. Labosky P.A., Barlow D.P., Hogan B.L. (1994) Mouse embryonic germ (EG) cell lines: transmission through the germline and differences in the methylation imprint of insulin-like growth factor 2 receptor (Igf2r) gene compared with embryonic stem (ES) cell lines.Development; 120(11), 3197-3204.
22. Resnick JL, Bixler LS, Cheng L, Donovan PJ. (1992) Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. Nature; 359(6395), 550-551.
23. Bradley A., Evans M., Kaufman M.H., and Robertson E. (1984) Formation of germ-line chimeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature; 309, 255-256.
24. Stewart C.L., Gadi L, and Bhatt H. (1994) Stem cells from primordial germ cells can reenter the germ line. Dev. Biol.; 161, 626-628.
25. Brinster, R.L. (1974) The effect of cells transferred into the mouse blastocyst on subsequent development. J. Exp. Med. 140, 1049-1056.
26. Illmensee K., and Mintz B. (1976) Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocysts. Proc. Natl Acad. Sci. USA; 73, 549-553.
27. Papaioannou V.E., Gardner R.L., McBurney M.W., Babinet, C. and Evans MJ. (1978) Participation of cultured teratocarcinoma cells in mouse embryogenesis. J. Embryol. Exp. MorphoL; 44, 93-104.
28. Martin G.R. (1980) Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis. Science 209, 768-776.
29. McNeish J. (2004) Embryonic stem cells in drug discovery. Nat Rev Drug Discov.; 3(1), 70-80.
30. Seiler A., Visan A., Buesen R., Genschow E. and Spielmann H.(2004) Improvement of an in vitro Stem Cell Assay for developmental toxicity: the use of molecular endpoints in the embryonic stem cell test. Reproductive Toxicology, 18, 231-240.
31. Genschow E., Spielmann H., Scholz G., Seiler A., Brown N., Piersma A., Brady M., Clemann N., Huuskonen H., Paillard F., Bremer S., and Becker K. (2002) The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: results of the definitive phase and evaluation of prediction models. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Altern tab Anim.; 30(2), 151-76.
32. Genschow E., Spielmann H., Scholz G., Pohl L, Seiler A., Clemann N., Bremer S., and Becker K. (2004) Validation of the embryonic stem cell test in the international ECVAM validation study on three in vitro embryotoxicity tests. Altern Lab Anim.; 32(3), 209-244.
33. Kendall J.M., and Badminton M.N. (1998) Aequorea victoria bioluminescence moves into an exciting new era. Trends Biotechnology; 16(5), 216- 224.
34. Campbell A.K., Hallet, R.A., Daw, M.E., Ryall, R.C., Hart, and Herring PJ. (1981) Application of the photoprotein obelin to the measurement of free Ca+ in cells. In Bioluminescence and Chemiluminescence, basic Chemistry and Analytical applications (Edited by M. A. deLuca and W.D. McElroy), pp. 601-607. Academy Press, New York.
35. Herring PJ. (1979) Some features of the bioluminescence of the radiolarian Thalassicola sp. Mar. Biol.; 53, 213-216.
36. Shimomura O., Johnson F.H., and Saiga Y. (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol.; 59, 223-239.
37. Shimomura O., Johnson F.H., and Saiga, Y (1963) Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol.; 62, 1-8.
38. Morin J. G. and Hastings J. W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol.; 77, 305-311.
39. Shimomura O., Johnson F. H. and Saiga, Y. (1963) Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan Halistaura. J. Cell. Physiol.; 62, 9-15.
40. Shimomura O., and Shimomura A. (1985) Halistaurin, phialidin and modified forms of aequorin as Ca indicator in biological systems. Biochem. J.; 228, 745- 749.
41. Levine L.D., and Ward W.W. (1982) Isolation and characterization of a photoprotein "phialidin" and a spectrally unique green-fluorescent protein from the bio luminescent jellyfish Phialidium gregarium. C'omp. Biochem. Physiol.; 72B, 77- 85.
42. Morin J. G. and Hastings J. W. (1971) Energy transfer in a bioluminescent system. J. Cell. Physiol. 77, 313-318.
43. Campbell A.K. (1974) Extraction, partial purification and properties of obelin the calcium-activated protein from the hydroid Obelia geniculata. Biochem. J.; 143, 411-418.
44. Ward W.W. and Selinger H.H. (1974) Extraction and purification of calcium- activated photoprotein from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Bern ovata. Biochemistry; 13, 1491-1499.
45. Ward W.W. and Seliger H.H. (1974) Properties of mnemiopsin, and berovin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata. Biochemistry 13, 1500-1510.
46. Johnson F.H. and Shimomura O. (1978) Introduction to the bioluminescence of medusae, with special reference to the photoprotein aequorin. Methods Enzymol.; 57, 271-291.
47. Illarionov B.A., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. (1995) Sequence of the cDNA encoding the Ca++-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene; 14;153(2), 213-21 A.
48. Blinks J.R., Weir W.G., Hess P. and Prendergast F.G. (1982) Measurement of Ca++ concentrations in living cells. Prog. Biophys. MoI. Biol.; 40,1-114.
49. Markova S.V., Vysotski E.S., Blinks J.R., Burakova L.P., Wang B.C., Lee J., (2002) Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins. Biochemistry; 41(7),2227-36.
50. Inouye S., Tsuji F.I. (1993) Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-activated photoprotein, clytin. FEBS Lett.;.315(3), 343-346.
51. Tsuji F.I., Ohmiya Y., Fagan T.F., Toh H., Inouye S. (1995) Molecular evolution of the C a(2+) -binding photoproteins of the Hydrozoa. Photochem PhotobioL; 62(4), 657-661.
52. Rizzuto R., Simpson A.W.M., Brini M. and Pozzan T. (1992) Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature; 358, 325-328.
53. Rizzuto R., Brini M., Murgia M. and Pozzan T. (1993) Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighbouring mitochondria. Science; 262, 744-747.
54. Rizzuto R., Bastianutto C, Brini M., Murgia M. and Pozzan T. (1994) Mitochondrial Ca2+ homeostasis in intact cells. J. Cell Biol.; 126, 1183-1194.
55. Nagy A., Gertsenstein M., Vinterstein K., Behringer R. (2003) Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
56. Turksen K.(2002) Embryonic Stem Cells. Methods and protocols. Methods in Molecular Biology. VoI 185. Humana Press.
57. Boheler K.R. (2003) ES cell differentiation to the cardiac lineage. Methods in enzymology; 365, 228-241.
58. Bloemers S.M., Leurs R., Smit M.J., Verheule S., Tertoolen L.G.J., Timmerman H., and de Laat S. W. (1993) Mouse P19 embryonal carcinoma cells express functional Histamine H^receptors. Biochemical and Biophysical Research Communications; 191, 118-125.
59. Sambrook J., and Russel D. W. (2001) Molecular cloning. A laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
60. Ramakers C, Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. (2003) Assumption- free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters; 339, 62-66.
61. Rudnicki M.A. and McBurney M.W. (1987) Cell culture methods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell lines. In: EJ. Robertson (Ed.), Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, pp. 19-49.
62. J. Paquin B. Danalache M. Jankowski S.M., McCann J., Gutkowska J. (2002) Oxytocin induces differentiation of P19 embryonic stem cells to cardiomyocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA; 99, 9550-9555.
63. Bolino A., Bolis A., Previtali S. C, Dina G., Bussini S., Dati G., Amadio S., Del.Carro U., Mruk D.D., Feltri M.L., Cheng C.Y., Quattrini A., Wrabetz L. (2004). Disruption of Mtmr2 produces CMT4Bl-like neuropathy with myelin outfolding and impaired spermatogenesis. J Cell Biol; 167, 711-721.
64. Bain G., Kitchens D., Yao M., Huettner J.E., Gottlieb D.I. (1995). Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol; 168, 342-357.
65. Okada Y., Shimazaki T., Sobue G., Okano H. (2004). Retinoic-acid- concentration dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol 275: 124-142.
66. Bhaumik S., Gambhir S. S. (2002). Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. PNAS; 8;99(l):377-82.
67. Maltais D., Desroches D., Aouffen M., Mateescu M. A., Wang R., Paquin J. (2003). The blue copper ceruloplasmin induces aggregation of newly differentiated neurons: a potential modulator of nervous system organization. Neuroscience;121(l):73-82.
68. Davies J. Q., Gordon S. (2005). Isolation and culture of murine macrophages Meth. in MoI. Biol. VoI 290: Basic Cell Culture Protocols, Third Edition; 91- 103.
<110> AXXAM s.r.l.
<120> LUMINESCENT TRANSGENIC NON HUMAN ANIMALS, PROGENY, CELL DERIVATIVES AND USES THEREOF
<130> PCT 96693
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 195
<212> PRT
<213> chimeric protein
<400> 1
Met Ser Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp Asn Pro
1 5 10 15
Arg Trp Ile Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu Asp Ile Asn
20 25 30
Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Lys Ala Ser Asp
35 40 45
Asp Ile Cys Ala Lys Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Thr Lys Arg His
50 55 60
Gln Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Lys Lys Ile Gly Met Asp Tyr Gly
65 70 75 80
Lys Glu Val Glu Phe Pro Ala Phe Val Asp Gly Trp Lys Glu Leu Ala
85 90 95
Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala Arg Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg
100 105 110
Glu Trp Gly Asp Ala Val Phe Asp Ile Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Lys Ile Ser Gly Ile
130 135 140
Ser Pro Ser Gln Glu Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu
145 150 155 160
Asp Asn Ser Gly Asp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu
165 170 175
Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn
180 185 190
Gly Val Pro
195
<210> 2
<211> 99
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgtccgtcc tgacgccgct gctgctgcgg ggcttgacag gctcggcccg gcggctccca 60
gtgccgcgcg ccaagatcca ttcgttggga tccgccacc 99
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> synthetic primer
<400> 3
caccaagtgt gcgtggagg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> synthetic primer
<400> 4
gcgatctcct tgccgtactc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> synthetic primer
<400> 5
cacgtactcg gatggaagcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> synthetic primer
<400> 6
ccctgatgct cttcgtccag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> synthetic primer
<400> 7
ggaggtgatt cagccacagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> synthetic primer
<400> 8
tcggcttctg atgcgtctta 20
Claims (31)
- 세포내 칼슘 농도 변화에 대한 반응으로 생물발광 신호(bioluminescent signal)를 생성시킬 수 있고 아포광단백질 유전자(apophotoprotein gene)를 발현시킬 수 있는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 1 항에 있어서,세포내 칼슘 농도 변화에 대한 반응인 생물발광 신호 생성 및/또는 아포광단백질 유전자 발현은 편재하는(ubiquitous) 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 1 항에 있어서,세포내 칼슘 농도 변화에 대한 반응인 생물발광 신호 생성 및/또는 아포광단백질 유전자 발현은 유도성이고/유도성이거나, 기관-특이적, 조직-특이적, 세포-특이적 또는 발육 단계(development stage)-특이적인 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 있어서,비인간 포유동물(non human mammal)인 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 4 항에 있어서,설치류(rodent)인 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 5 항에 있어서,마우스(mouse)인 것을 특징으로 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 항에 있어서,아포광단백질 유전자는 천연, 재조합 또는 합성 기원의 아포광단백질 유전자인 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 7 항에 있어서,아포광단백질 유전자는 향상된 발광 활성(luminescent activity) 및/또는 칼슘 감수성(calcium sensibility)를 갖는 천연 돌연변이 또는 돌연변이 유발된 돌연변이인 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 8 항에 있어서,아포광단백질 유전자는 포유동물 코돈 사용(mammalian codon usage)에 최적화되고/최적화되거나 미토콘드리아 표적 서열들에 융합된 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 1 항에 있어서,아포광단백질 서열은 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 1 항에 있어서,아포광단백질 서열은 142번 위치에서 Gly142→Cys으로 돌연변이 유발된 클라이틴(Clytin) 서열(GenBank 접수 번호 Q08121)인 것을 특징으로 하는 비인간 형질 전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 1 항에 있어서,아포광단백질 서열은 다음과 같은 12개의 위치에서 돌연변이 유발된 클라이틴(Clytin) 서열(GenBank 접수 번호 Q08121)인 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들: Gly58→Glu, Asp69→Val, Ala70→Cys, Lys76→Arg, Lys77→Gly, Ile78→Cys, Asp81→Glu, Val86→Ile, Glu87→Ala, Ala90→Gln, Val92→Leu, 및 Glu97→Gln.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 있어서,특이 세포계(specific cell lineage)로 분화될 수 있거나 분화되어, 특이 표적 유전자의 발현을 얻는 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 제 13 항에 있어서,특이 세포계는 심장 근육 세포계, 뉴론계, 간엽 세포계 또는 조혈 세포계인 것을 특징으로 하는 비인간 형질전환 동물(non human transgenic animal)과 그 자손(progeny) 및 이들의 세포 유도체(cell derivative)들.
- 다양한 세포내 Ca++가 수득되도록 특이 표적(specific target)을 자극할 수 있는 리간드를 동정하는 방법으로서, 다음과 같은 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a) 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 세포 유도체(cell derivative)를 제공하는 단계;b) 상기 표적의 발현을 얻는 단계;c) 상기 세포들에 기질로서 적당한 발색단(chromophore)을 적재(loading)하는 단계;d) 상기 표적에 대한 리간드들로 추정되는 리간드들을 포함하는 화합물 라이브러리(compound library)와 상기 세포들을 접촉시키는 단계; 및e) 광단백질의 생물발광(bioluminescence)을 검출하는 단계.
- 제 15 항에 있어서,특이 세포계는 심장 근육 세포계 또는 뉴론계인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,고성능 스크리닝에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다양한 세포내 Ca++가 수득되도록 표적에 대한 길항제를 동정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a) 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 세포 유도체를 제공하는 단계;b) 상기 표적의 발현을 얻는 단계;c) 상기 세포들에 기질로서 적당한 발색단(chromophore)을 적재(loading)하는 단계;d) 상기 표적에 대한 길항제들로 추정되는 길항제들을 포함하는 화합물 라이브러리와 접촉시키는 단계;e) 상기 표적을 자극할 수 있는 리간드와 상기 세포들을 접촉시키는 단계; 및f) 광단백질의 생물발광 변화를 검출하는 단계.
- 제 18 항에 있어서,상기 특이 세포계는 심장 근육 세포계, 뉴론계, 간엽 세포계 또는 조혈 세포계인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,고성능 스크리닝에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 세포 유도체들의 특이 세포계로의 분화를 자극하는 제제를 동정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a) 미분화된 상태에서 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 따른 비인간 형질전환 동물의 줄기 세포 유도체를 제공하는 단계;b) 분화를 유도하는 제제들로 추정되는 제제들을 포함하는 화합물 라이브러리에 상기 줄기 세포 유도체를 노출시키는 단계;c) 적어도 하나의 특이 세포계 표적의 발현을 얻는 단계;d) 상기 세포들에 기질로서 적당한 발색단을 적재하는 단계;e) 다양한 Ca++ 가 수득되도록 리간드에 의해 상기 특이 세포계 표적을 자극하는 단계; 및f) 광단백질의 생물발광을 검출하는 단계.
- 제 21 항에 있어서,고성능 스크리닝에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 줄기 세포 유도체들의 특이 세포계로의 분화 를 저해하는 제제를 동정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a) 미분화된 단계에서 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 따른 비인간 형질전환 동물의 줄기 세포 유도체들을 제공하는 단계;b) 분화를 저해하는 제제들로 추정되는 제제들을 포함하는 화합물 라이브러리에 상기 줄기 세포 유도체들을 노출시키는 단계;c) 분화를 유도하는 제제로 공지된 제제에 상기 줄기 세포 유도체들을 노출시켜, 적어도 하나의 특이 세포계 표적의 발현을 얻는 단계;d) 세포들에 기질로서 적당한 발색단을 적재하는 단계;e) 다양한 Ca++가 수득되도록, 리간드에 의해 상기 특이 세포계 표적을 자극하는 단계; 및f) 광단백질의 생물발광을 검출하는 단계.
- 제 23 항에 있어서,고성능 스크리닝에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- ES/광단백질 세포들의 분화 후에 수득되는 "1차-유사(primary-like)" 세포들에 대한 양성 대조군으로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 따른 비인간 형질전환 동물의 세포 유도체의 용도.
- 리포터 시스템(reporter system)으로서의 광단백질을 함유하는 세포 유도체가 화합물들의 스크리닝에 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 따른 비인간 형질전환 동물의 세포 유도체의 용도.
- 동물 모델들에서 약물학적 생체외(ex-vivo) 연구들 또는 이식 실험들에 사용되는 것을 특징으로 하는, 리포터 시스템으로서의 광단백질을 함유하는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 따른 비인간 형질전환 동물의 조직 또는 기관 유도체들의 용도.
- 생체이미징(bio-imaging) 연구들에 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 따른 비인간 형질전환 동물과 그 자손의 용도.
- 약물학적으로 관련성 있는 동물 모델들과의 교배에 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 따른 비인간 형질전환 동물과 그 자손의 용도.
- 제 28 항에 있어서,동물 모델은 리포터 유전자들을 운반하는 형질전환 동물이거나, 또는 KO(KnockOut, 녹아웃) 또는 KI(KnockIn, 녹인) 돌연변이 동물 모델들인 것을 특징 으로 하는 용도.
- 물질의 독성(toxicity) 및/또는 기형(teratology)의 생체외(in vivo) 시험에 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 따른 비인간 형질전환 동물의 용도.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06000452A EP1808441A1 (en) | 2006-01-11 | 2006-01-11 | Luminescent stem cells, transgenic mammals and uses thereof |
| EP06000452.0 | 2006-01-11 | ||
| EP06022458.1 | 2006-10-27 | ||
| EP06022458 | 2006-10-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20080107353A true KR20080107353A (ko) | 2008-12-10 |
Family
ID=37963683
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020087016720A KR20080107353A (ko) | 2006-01-11 | 2007-01-10 | 발광성의 비인간 형질전환 동물들과 그 자손 및 세포유도체들, 및 이들의 용도 |
| KR1020087016717A KR20080100420A (ko) | 2006-01-11 | 2007-01-10 | 발광성 줄기 세포들 및 이들의 용도 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020087016717A KR20080100420A (ko) | 2006-01-11 | 2007-01-10 | 발광성 줄기 세포들 및 이들의 용도 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090286695A1 (ko) |
| EP (2) | EP1973937B1 (ko) |
| JP (2) | JP2009523025A (ko) |
| KR (2) | KR20080107353A (ko) |
| AT (2) | ATE504597T1 (ko) |
| AU (2) | AU2007205659A1 (ko) |
| CA (2) | CA2636891A1 (ko) |
| DE (1) | DE602007013695D1 (ko) |
| IL (2) | IL192445A0 (ko) |
| RU (2) | RU2008132859A (ko) |
| WO (2) | WO2007080622A2 (ko) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5374840B2 (ja) | 2006-07-20 | 2013-12-25 | Ｊｎｃ株式会社 | カルシウム結合発光蛋白質、それをコードする遺伝子およびその用途 |
| JP5304275B2 (ja) * | 2009-01-29 | 2013-10-02 | Ｊｎｃ株式会社 | アポクライティン−ｉｉをコードするコドン最適化核酸およびその使用方法 |
| CN102822333A (zh) | 2010-03-23 | 2012-12-12 | 奥林巴斯株式会社 | 监控干细胞的分化状态的方法 |
| CN102816854A (zh) * | 2012-08-31 | 2012-12-12 | 北京天辰空间生物医药研发有限公司 | 一种空间诱变机制的研究方法及其所使用生物遗传突变分子报告模型 |
| US9412006B1 (en) * | 2013-02-25 | 2016-08-09 | Flagship Biosciences, Inc. | Continuous tissue analysis scoring scheme based on cell classifications |
| US9424459B1 (en) * | 2013-02-25 | 2016-08-23 | Flagship Biosciences, Inc. | Computerized methods for cell-based pattern recognition |
| JP6454478B2 (ja) | 2013-09-12 | 2019-01-16 | オリンパス株式会社 | 心筋細胞への分化をモニタリングする方法 |
| JP6824594B2 (ja) * | 2014-09-11 | 2021-02-03 | Jnc株式会社 | 合成遺伝子の設計方法 |
| JP2019500849A (ja) * | 2015-10-30 | 2019-01-17 | サーントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シャーンティフィク （セエンエールエス） | 特別なカルシウム感受性及び向上した生物発光強度を有する遺伝子変異イクオリンベースのバイオセンサ |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714666A (en) * | 1993-02-09 | 1998-02-03 | Children's Hospital Of Philadelphia | Measurement of intracellular calcium using bioluminescent apoaequorin expressed in mammalian cells |
| US6117679A (en) * | 1994-02-17 | 2000-09-12 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
| WO1998035022A1 (en) * | 1997-02-06 | 1998-08-13 | Osiris Therapeutics, Inc. | p21?CIP1 OR p27KIP1¿ EFFECTS ON THE REGULATION OF DIFFERENTIATION OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS |
| GB9824357D0 (en) * | 1998-11-07 | 1998-12-30 | Univ Wales Medicine | Protein and DNA coding therefor |
| AU2589500A (en) * | 1999-09-03 | 2001-04-10 | Xenogen Corporation | Targeting constructs and transgenic animals produced therewith |
| EP1226752A4 (en) * | 1999-11-05 | 2004-05-06 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | NON-HUMAN TRANSGENIC MAMMALS FOR CONTROLLING CHANGE IN CALCIUM ION CONCENTRATION IN CELLS |
| ES2237643T3 (es) * | 2002-10-21 | 2005-08-01 | Axxam S.R.L. | Fotoproteina con bioluminiscencia mejorada. |
| EP1700865A1 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-13 | AXXAM S.r.l. | Photoproteins with enhanced bioluminescence and their use as intracellular calcium indicators |
-
2007
- 2007-01-10 AU AU2007205659A patent/AU2007205659A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-10 KR KR1020087016720A patent/KR20080107353A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-01-10 DE DE602007013695T patent/DE602007013695D1/de active Active
- 2007-01-10 RU RU2008132859/13A patent/RU2008132859A/ru not_active Application Discontinuation
- 2007-01-10 JP JP2008549994A patent/JP2009523025A/ja active Pending
- 2007-01-10 KR KR1020087016717A patent/KR20080100420A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-01-10 RU RU2008132865/13A patent/RU2008132865A/ru not_active Application Discontinuation
- 2007-01-10 EP EP07706220A patent/EP1973937B1/en not_active Not-in-force
- 2007-01-10 WO PCT/IT2007/000021 patent/WO2007080622A2/en active Application Filing
- 2007-01-10 JP JP2008549993A patent/JP2009523024A/ja active Pending
- 2007-01-10 AU AU2007205658A patent/AU2007205658A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-10 CA CA002636891A patent/CA2636891A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-10 US US12/160,426 patent/US20090286695A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-10 WO PCT/IT2007/000020 patent/WO2007080621A1/en active Application Filing
- 2007-01-10 CA CA002636888A patent/CA2636888A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-10 AT AT07713411T patent/ATE504597T1/de not_active IP Right Cessation
- 2007-01-10 EP EP07713411A patent/EP1973938B1/en not_active Not-in-force
- 2007-01-10 AT AT07706220T patent/ATE510849T1/de not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-06-25 IL IL192445A patent/IL192445A0/en unknown
- 2008-06-26 IL IL192484A patent/IL192484A0/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1973937B1 (en) | 2011-05-25 |
| CA2636888A1 (en) | 2007-07-19 |
| DE602007013695D1 (de) | 2011-05-19 |
| AU2007205658A1 (en) | 2007-07-19 |
| CA2636891A1 (en) | 2007-07-19 |
| WO2007080621A8 (en) | 2007-10-25 |
| ATE510849T1 (de) | 2011-06-15 |
| EP1973937A1 (en) | 2008-10-01 |
| WO2007080622A8 (en) | 2009-07-23 |
| WO2007080622A3 (en) | 2007-09-27 |
| RU2008132865A (ru) | 2010-02-20 |
| ATE504597T1 (de) | 2011-04-15 |
| US20090286695A1 (en) | 2009-11-19 |
| KR20080100420A (ko) | 2008-11-18 |
| WO2007080622A2 (en) | 2007-07-19 |
| JP2009523025A (ja) | 2009-06-18 |
| JP2009523024A (ja) | 2009-06-18 |
| IL192484A0 (en) | 2009-02-11 |
| EP1973938A2 (en) | 2008-10-01 |
| RU2008132859A (ru) | 2010-02-20 |
| EP1973938B1 (en) | 2011-04-06 |
| IL192445A0 (en) | 2008-12-29 |
| AU2007205659A1 (en) | 2007-07-19 |
| WO2007080621A1 (en) | 2007-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1973937B1 (en) | Luminescent transgenic non human animals, progeny, cell derivatives and uses thereof | |
| CA2827654C (en) | Method for generating an animal homozygous for a genetic modification | |
| US9700023B2 (en) | Rat embryonic stem cell | |
| JPWO2005080598A1 (ja) | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 | |
| JP2000516463A (ja) | 特定の遺伝的特性を有する哺乳動物を作製する方法 | |
| JP2015126729A (ja) | 魚類の生殖細胞の性決定方法、性判別方法、被検物質の性分化の攪乱作用の評価方法、雌雄同体の作製方法、早期成熟個体の作製方法、生殖細胞、魚類個体、配偶子、及び培養細胞 | |
| Cainarca et al. | A photoprotein in mouse embryonic stem cells measures Ca2+ mobilization in cells and in animals | |
| JP4851041B2 (ja) | 細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をモニターするトランスジェニック非ヒト哺乳動物 | |
| EP1808441A1 (en) | Luminescent stem cells, transgenic mammals and uses thereof | |
| JP7203367B2 (ja) | 哺乳動物細胞用遺伝子導入ベクター | |
| US20050144659A1 (en) | Animals and cells containing a mutated alpha2delta gene | |
| US7332647B2 (en) | Fish produced by nuclear transfer from cultured cells | |
| JP2007505640A (ja) | 排出可能なレポーターシステム | |
| Lee et al. | Esrrb‐Cre excises loxP‐flanked alleles in early four‐cell embryos | |
| US20030208785A1 (en) | Transgenic pig containing heat shock protein 70 transgene | |
| Leerberg | Genetic Analysis of Fibroblast Growth Factor Signaling During Embryogenesis and Early Gonad Development in Zebrafish | |
| Meng et al. | Tissue-specific expression of GFP reporter gene in germline driven by GATA-2 promoter and enhancers in zebrafish | |
| Miller | Articles in PresS. Am J Physiol Renal Physiol (November 10, 2010). doi: 10.1152/ajprenal. 00082.2010 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |