MXPA05004148A - Fotoproteina con bioluminiscencia mejorada. - Google Patents

Abstract

Se describe un fotoproteina con actividad luminiscente mejorada, el uso de la misma como indicador de calcio y en pruebas a base de celulas para la deteccion y medicion de calcio intracelular.

Description

FOTOPROTEIÑA CON BIOLUMINISCENCIA MEJORADA La presente invención provee una fotoproteína quimérica con actividad luminiscente mejorada, el uso de la misma como indicador de calcio en sistemas de genes reporteros y en pruebas a base de células para la detección y medición de calcio ¡ntracelular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La bioluminiscencia es la capacidad de organismos vivientes para emitir luz visible a través de una variedad de sistemas de reacción quimioluminiscente. Las reacciones de bioluminiscencia requieren tres componentes principales: una luciferina, una luciferasa y oxígeno molecular. Sin embargo, también se pueden requerir otros componentes en algunas reacciones, que incluyen cationes (Ca++ y Mg++) y cofactores (ATP, NAD(P)H). Las luciferasas son enzimas que catalizan la oxidación de un substrato, luciferina, y producen un intermediario inestable. La luz es emitida cuando el intermediario inestable se descompone hasta su estado base, generando oxiluciferina. Existen muchos tipos diferentes no relacionados de luciferina, aunque muchas especies de al menos siete filos utilizan la misma luciferina, conocida como celenterazina, la cual contiene un anillo formado con tres aminoácidos (2 tirosinas y una fenilalanina). En algunos animales (por ejemplo medusas) el sistema de luciferina/luciferasa puede ser extraído en forma de una "fotoproteína" estable que emite luz después de unión a calcio. Las fotoproteínas difieren de las luciferasas en que son complejos intermediarios oxigenados estabilizados de luciferasa y luciferina. Las fotoproteínas están presentes en muchos celenterados marinos y permiten que estos organismos emitan luz para una variedad de propósitos que incluyen procreación, alimentación, y defensa (1 ). Aunque las bacterias emiten luz de manera continua, en muchos otros organismos la luminiscencia ocurre como ráfagas, típicamente con una duración de 0.1-1 segundo. Esto requiere un rápido encendido/apagado de la reacción enzimática y la presencia de reactivos debidamente secuestrados y listos para movilización rápida. En celenterados, las ráfagas son ocasionadas por entrada de calcio. Los sitios de unión a calcio de fotoproteínas son homólogos a caimodulina. En presencia de calcio, las fotoproteínas emiten luz visible a través de una reacción intramolecular. Existen muchos organismos luminiscentes, pero solamente siete fotoproteínas, especialmente Thalassicolina (2,3), Aequorina (4-6), Mitrocromina (sin. Halistaurina) (7,8), Clitina (sin. con Fialidina) (8,9) Obelina (2, 6, 10, 11 ), Mnemiopsina (12, 13), y Berovina (12,13), han sido aisladas hasta la fecha. Todas esta proteínas son complejos de una apoproteína, un cromóforo de imidazopirazina (celenterazina) y oxígeno. Sus estructuras son altamente conservadas, especialmente en la región que contienen los tres sitios de unión a calcio (estructuras EF-hand). Estas estructuras EF-hand son características de la familia de proteínas de unión a calcio. La fotoproteína emite luz tras la reacción con calcio el cual se une de manera apretada al receptáculo EF-hand. La reacción es un evento de rotación sencillo y da como resultado la liberación de C02 y emisión de luz en la región azul (Xmax = 470 nm). El término "fotoproteína" identifica el polipéptido unido a luciferina, el cual es capaz de luminiscencia, mientras que "apofotoproteína" se utiliza para indicar la proteína sin luciferina. Las fotoproteínas más estudiadas son Aequorina, aislada de Aequorea victoria (14) y Obelina, aislada de Obelia longissima (15). Tras unirse a Ca++, Aequorina experimenta un cambio conformacional que la convierte en una oxigenasa (luciferasa), que posteriormente cataliza la oxidación de celenterazina mediante el oxígeno molecular unido. La proteína fluorescente azul está conformada de celenteramida que es un producto de oxidación de celenterazina, no covalentemente unido a apofotoproteína. La fotoproteína puede ser regenerada a partir de la apofotoproteína mediante incubación con celenterazina, oxígeno molecular, EDTA y 2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Debido a que la celenterazina es el substrato luminiscente común utilizado por las fotoproteínas Aequorina, Mitrocomina, Clitina y Obelina, probablemente la reacción de emisión de luz es la misma en estas cuatro fotoproteínas (16). La reciente adquisición de la estructura primaria y de los datos cristalográficos de Aequorina y Obelina dio origen a información adicional acerca de su función. La Obelina pura a partir del hidroide Obelia longissima es una proteína de una sola cadena de 195 residuos de aminoácidos (aa) con una masa molecular aproximada de 20 kDa que contienen el grupo cromóforo no covalentemente unido, celenterazina. El análisis de las estructuras primarias de Clitina muestra que contiene 189 aa y pertenece a la familia de fotoproteínas. Sin embargo, la fotoproteína de hidrozoario de unión a Ca++, difiere de otras proteínas de unión a Ca++ tal como calmodulina y troponina C por un contenido relativamente alto de residuos de cisteína, histidina, triptofano, prolina y tirosina. Los estudios de la estructura y función de Obelina se reportan en Bondar VS et al., Biochemistry (2001 ), 66(9): 1014-8, Vysotski ES et al., (2003), 42(20): 6013-24 y Deng L. et al., FEBS Lett. (2001 ), 506 (3): 281 -5. Los dos últimos, en particular, describen propiedades de bioluminiscencia y emisión de un mutante de obelina W92F. Las fotoproteínas son ampliamente utilizadas en tecnología de genes reporteros para monitorear los eventos celulares asociados con transducción de señal y expresión génica. El estudio de eventos celulares y su regulación requiere métodos analíticos sensibles, no invasivos. Las fotoproteínas y en general la bioluminiscencia, son excelentes sistemas reporteros ya que virtualmente no tienen fondo en contraste con sistemas de fluorescencia. Las fotoproteínas han sido expresadas en células de mamíferos para monitorear cambios de calcio en respuesta a diferentes estímulos. La concentración de calcio intracelular se puede medir al agregar el cofactor de celenterazina a células de mamífero que expresan la fotoproteína y detectar la emisión de fotones, lo cual indica la concentración de calcio intracelular.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Ahora se ha encontrado que mediante quimerízación de la proteína obelina (apobelina) a través del reemplazo de una región de la misma comprendida entre los dos primeros sitios de unión a calcio, con una región correspondiente de una fotoproteína seleccionada de Clitina, Aequorina, Thalassicolina, Mitocromina, Mnemiopsoina y Berovina, se obtiene una novedosa fotoproteína con bioluminiscencia mejorada. Como se utiliza en la presente, Obelina se puede referir a cualquiera de las fotoproteínas aisladas a partir de diferentes especies de Obelina, que incluyen Obelia longissima y Obelia geniculata (17). Las secuencias de referencia de aminoácidos y nucleótidos de obelina se mencionan en SEQ ID N. 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de referencia de aminoácidos y nucleótidos de Clitina, Mitocromina y Aequorina están depositadas en los números de acceso de GenBank Q08121 , P39047, AAA27720 y, respectivamente, L13427, L31623, L29571 , mientras que las secuencias para Thalassicolina, Mnemiopsina y Berovina se describen en las referencias 2, 3, 12 y 13. Una "región o fragmento correspondiente", como se utiliza en la presente, significa cualquier secuencia de aminoácidos, dentro de la fotoproteína seleccionada, que se aparea con la secuencia de obelina en alineaciones de secuencia respectivas con excepción de al menos 1 , de preferencia al menos 5, preferiblemente al menos 10 residuos de aminoácidos, los cuales no están conservados en las proteínas relevantes (obelina y fotoproteína seleccionada), dicha región o fragmento de preferencia abarcando los residuos 42-122, preferiblemente los residuos 50-95, según lo referido para la secuencia de obelina. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la proteína quimérica se obtiene al reemplazar los residuos 50 a 94 de la secuencia de aminoácidos de obelina con un fragmento de la secuencia de Clitina que se extiende desde el residuo 53 al 97. La fotoproteína así obtenida, la cual ha sido denominada "Fotina", tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. 3. Las proteínas quiméricas de la invención pueden ser adicionalmente modificadas mediante supresión, adición o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos, siempre que el perfil de actividad de la fotoproteína, en términos de emisión de luz y respuesta al calcio, se mantenga o se incremente. Son particularmente preferidas las sustituciones en las posiciones 55, 66, 67, 73, 74, 75, 78, 83, 84, 87, 89 y 94, según lo referido para la secuencia de obelina. Como se muestra a través de estudios in vitro, la fotina produce una bioluminiscencia intensa en respuesta a estimulación de calcio que generalmente es superior a la observada con fotoproteínas naturales. Para la preparación de las fotoproteínas quiméricas, se prepara una construcción de ADN recombinante que porta porciones de las secuencias codificadoras de obelina y de una fotoproteína seleccionada diferente a obeiina, utilizando ingeniería genética convencional, el producto quimérico resultante se inserta en un vector, se expresa en un hospedero adecuado y posteriormente se aisla y purifica. Por ejemplo, los ADNc que codifican para obeiina y para una fotoproteína diferente pueden ser amplificados mediante PCR o construidos in vitro con oligonucleótidos sintéticos y los productos pueden ser recombinados haciendo uso de sitios de restricción adecuados, naturales o artificialmente introducidos en los oligonucleótidos utilizados para amplificación o para construcción in vitro. El vector de expresión puede contener, además de la construcción recombinante, un promotor, un sitio de unión a ribosoma, un codón de iniciación, un codón de detención o un sitio de consenso para intensificadores de transcripción. El vector también puede comprender un marcador de selección para aislar las células hospederas que contienen la construcción de ADN. Los vectores adecuados son por ejemplo plásmidos de bacterias o levadura, bacteriófagos, virus, retrovirus o ADN. Los vectores que portan la construcción recombinante pueden ser introducidos en el hospedero por medio de técnicas convencionales. Las células hospederas pueden ser procaríóticas o eucarióticas, tales como bacterias, levaduras o células de mamífero. Los hospederos preferidos para expresión/producción de fotoproteínas son células de mamíferos, incluyendo células de origen epitelial o linfoblástico tales como Hek-293, CHO-K1 , HepG2 y HL-60. Estas células pueden expresar la apofotoproteína en el citoplasma (18), en la mitocondria, mediante la adición de una secuencia de señalización mitocondrial a la fotoproteína, o en cualquier otro compartimiento celular (19-21 ). Alternativamente, se pueden emplear células que no son de mamífero, tales como bacterias u hongos. Una vez que el tipo de célula hospedera ha sido seleccionado, las construcciones genéticas se pueden introducir mediante precipitación de fosfato de calcio, electroporación u otras técnicas convencionales. Después de la transfección, las células crecen en medios adecuados y son analizadas para actividades adecuadas. La fotoproteína de la invención puede ser aislada y purificada con procedimientos convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis. Se pueden introducir mutaciones de punto en el producto quimérico por medio de PCR de extensión de traslape. Para producir fotina, el fragmento Ndel/Munl del gen obelina se reemplazó con un fragmento de 135 nucleótidos que corresponde a la secuencia codificadora de Clitina que va del nucleótido 156 a 291. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica las proteínas quiméricas aquí descritas. Las secuencias codificadoras de ADN se pueden modificar en virtud de degeneración del código genético, por ejemplo cambiando el uso del codón para mejorar la expresión en sistemas heterólogos. En una modalidad preferida de la invención, la secuencia de ADN que codifica para la proteína fotina se selecciona de SEQ ID No. 4 y 5.

Para analizar si el producto quimérico es funcional, se realizaron experimentos de transcripción y traducción in vitro en un sistema de traducción de germen de trigo libre de células en presencia de celenterazina. En estos experimentos, se registra la formación de fotoproteína al probar la luminiscencia a partir de la mezcla de traducción, después de la adición de iones calcio. Para correlacionar la luminiscencia medida con la cantidad de proteína producida, se llevó a cabo una reacción de traducción en presencia de 35S-Metionina. La cantidad del polipéptido recién sintetizado se determinó a través de medición de la incorporación de 35S-Metionina en la fracción insoluble tricloroacética. Los resultados de estos experimentos demuestran la sensibilidad y efectividad de fotina para generar bioluminiscencia en respuesta a estimulación con iones calcio. En una modalidad adicional de la invención, las proteínas quiméricas aquí provistas se utilizan como indicadores de calcio, especialmente para la medición de concentración de calcio intracelular. En un análisis típico, se añade un cofactor tal como celenterazina a células de mamífero que expresan la fotoproteína y la emisión de luz es registrada a través de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando un luminímetro comercialmente disponible. Las células que expresan la fotoproteína y un receptor involucrado en movilización de calcio intracelular se pueden utilizar para analizar moléculas candidato para sus efectos en modulación de receptor. La fotoproteína quimérica de la invención puede ser utilizada en una variedad de pruebas funcionales a base de células que utilizan medición de calcio intracelular para evaluar la actividad de proteínas, particularmente receptores acoplados a proteína G (GPCR) y canales iónicos de membrana plasmática. Aunque se puede detectar el incremento importante y rápido en concentración de calcio intracelular después de GPCR y estimulación de los canales iónicos a través de diversos reporteros tales como colorantes fluorescentes sensibles a calcio, se prefiere el uso de fotoproteínas bioluminiscentes (22) ya que su fondo está virtualmente ausente en contraste con colorantes fluorescentes; más aún, la medición del calcio con fotoproteínas, además de producir señales rápidas, genera una relación elevada de señal a ruido con una amplia escala de sensibilidad de detección (22, 23). Las pruebas funcionales a base de células por lo regular comprenden añadir un agonista adecuado a un cultivo de células que expresan GPCR o canales iónicos y la fotoproteína, y luego determinar cualquier variación de concentración de calcio, por ejemplo un incremento de calcio inducido ya sea por influjo rápido desde sitios extracelulares o liberación de almacenes intracelulares (18), a través de mediciones de la actividad de la fotoproteína. El uso de células que expresan fotina y un receptor involucrado en la modulación de concentración de calcio intracelular provee un sistema válido para el análisis de compuestos para sus efectos en la liberación de calcio intracelular. También se pueden diseñar pruebas de análisis de alto rendimiento utilizando una fotoproteína de acuerdo con la invención como sistema reportero. La sensibilidad del sistema así como su alta relación de señal a ruido permiten el uso de volúmenes de prueba pequeños. En una modalidad adicional, una fotoproteína de acuerdo con la invención se conjuga con una molécula de interés analítico, de diagnóstico o terapéutico y el producto de conjugación se utiliza en un inmunoensayo de fase sólida competitivo para determinar la cantidad de esa molécula en muestras biológicas. Por ejemplo, la fotoproteína puede ser químicamente conjugada a una proteína hormonal y utilizada en un inmunoensayo de fase sólida con anticuerpos específicos de hormona para determinar los niveles salivales de la hormona (24). Incluso en una modalidad adicional, se crea un producto de fusión entre una fotoproteína de acuerdo con la invención y un polipéptido diferente, tal como una hormona, un péptido antigénico, inmunoglobulina de cadena ligera o pesada, avidina, estreptavidina o proteína A, con técnicas conocidas de ingeniería genética, como se describe en el documento US6087476 (el cual se incorpora a la presente como referencia), y se utiliza en procedimientos de inmunodiagnóstico o de formación de imágenes. Los siguientes ejemplos ilustran la invención con más detalle.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la bioluminiscencia inducida por calcio de fotoproteínas recién sintetizadas. Las fotoproteínas se tradujeron en un sistema de germen de trigo libre de células en presencia de celenterazina. Todas las alícuotas de la mezcla de traducción se incubaron durante 2 horas en la oscuridad a 30°C. La reacción se cargó con CaCfe 50 mM y se registró la luminiscencia durante 10 segundos. La figura 2 es la traducción de ADN de fotoproteínas en presencia de celenterazina, midiendo la luminiscencia al diluir la mezcla de reacción. AQ: Aequorina, PH:Fotina, OB:Obelina. La figura 3(A) muestra la emisión de luz dependiente de la dosis de ATP después de estimulación del receptor de ATP endógeno expresado mediante célula CHO-K1 transfectada con ADN de fotina. La transfección celular, cosecha y expresión de fotina se realizaron como se describe en el ejemplo 1. Las células fueron tratadas con dos concentraciones diferentes de ATP. La figura 3(B) muestra las células CHO-K1 transfectadas con ADN de obelina que se utilizaron como control positivo. La luminiscencia está expresada en RLU (unidades de luz relativa). La figura 4 es la curva dependiente de dosis de la actividad de fotina en células CHO-K1 transfectadas con el receptor de endotelina A y fotina. El receptor se activó mediante inyección de endotelina a una concentración de 100 y 50 nM. La figura 5 es la curva dependiente de dosis obtenida a partir de células que expresan la fotoproteína fotina y el receptor vaniloide 1 de rata (VR1). El agonista específico, capsaicina, se utilizó a una concentración de 10 y 50 µ?.

EJEMPLOS 1. Transcripción/traducción in vitro de ADN de fotoproteína La traducción de las fotoproteinas se llevó a cabo en el sistema libre de células de germen de trigo (equipo TNT, Promega), siguiendo las instrucciones generales del proveedor. Aproximadamente se utilizaron 2 µg de ADN para cada mezcla de reacción de transcripción/traducción in vitro. El volumen de traducción (50 µ?) incluía 25 µ? del extracto de germen de trigo, 2 µ? del regulador de pH de reacción, una mezcla de aminoácidos excepto para metionina, Rnasina y celenterazina (40 µ?), T7 polimerasa. La mezcla también contenía 35S-metionina (actividad específica 1000 Ci/mmol). Se utilizó 35S-metionina para determinar la cantidad de fotoproteína sintetizada in vitro. Para este propósito, 5 µ? de cada muestra de la mezcla de traducción se precipitó en TCA en hielo durante 30 minutos, se filtró, se lavó con TCA frío al 5%, metanol, se secó y se colocó en frascos contadores. Las cantidades de fotina y obelina producidas en el sistema libre de células se muestran en el cuadro I.

CUADRO I Inclusión de marca radioactiva en productos de traducción de las fotoproteínas ADN agregado Obelina (1 g) Fotina (^ µQ) Aequorina (1 µ?) Conteo de 35S después de 90 8169 8290 13049 min. de traducción de (cpm) 2. Prueba de fotoproteína 5 y 10 µ? de la mezcla de traducción se mezclaron directamente con 95-90 µ? de solución de PBS en una placa de 96 pozos la cual se montó en el luminímetro (Berthold). Para desencadenar la emisión de luz de la fotoproteína, se inyectaron 50 µ? de solución (50 mM CaCI2) en el pozo y se registró la luminiscencia durante 10 segundos. Los resultados de la traducción in vitro de ADN de Fotina, Obelina y Aequorina se muestran en la figura 1. Las mediciones de luminiscencia obtenidas al diluir la fotoproteína en reacciones de traducción in vitro se muestran en la figura 2. La comparación de datos de luminiscencia con conteos de TCA obtenidos durante transducción con diferentes cantidades de ADN de fotina y obelina se muestra en el cuadro II (la luminiscencia medida es proporcional a la cantidad de fotoproteína recién sintetizada).

CUADRO II Contenido de fotoproteína radiomarcada v su luminiscencia en la mezcla de traducción Obelina Fotina ADN Conteos de TCA Luminiscencia Conteos de Luminiscencia (ng) (Cpm/µ?) (RLU/µ?) TCA (RLU/µ?) (cpm/µ?) 250 2722 358944 2927 990308 125 2396 271952 2094 858046 63 1030 139241 807 339348 31 579 41970 502 88326 16 265 13482 196 30167 3. Ejemplos de pruebas funcionales a base de células 3.1 Los clones que expresan fotina han sido obtenidos mediante transfección de células CHO-K1 (materiales y métodos). Dos días después de la transfección, las células fueron tripsinizadas y diluidas 10 o 100 veces. Una vez que las células crecieron hasta ser colonias bien aisladas, las colonias fueron transferidas a nuevas placas y se seleccionaron sobre la base de su respuesta funcional (señal luminiscente) a diferentes concentraciones de ATP, lo cual se sabe que estimula el receptor endógeno de CHO y elevar la concentración de Ca++ citoplásmica. Al final de cada experimento, las células fueron Usadas mediante perfusión de una solución que contiene TritonX-100 y CaC . La fotoproteína activa fue reconstituida incubando las células con 10 µ de celenterazina diluida en PBS que contiene 2 mM de calcio, en la obscuridad a 37°C en una atmósfera de C02 al 5% durante 3 horas. Para la medición de emisión de luz, las células fueron lisadas en presencia de calcio y se registró la luminiscencia emitida. El número de protones emitidos durante los primeros 10 segundos se integró a través del luminímetro y se visualizó en la pantalla. Las células transfectadas con un plásmido vacío o no transfectado (datos no mostrados) no incrementó la emisión de fotones. Para detectar cambios en concentraciones de calcio, se inyectaron 10, 50 y 100 µ? ATP y se determinó la cinética de la respuesta de calcio. La curva obtenida se muestra en la figura 3(A). Se utilizó una linea celular que expresa la fotoproteína obelina como control positivo en la figura 3(B). 3.2 Se estableció una línea celular de CHO que expresa el receptor de endotelina A y fotina después de estimulación con un agonista, este receptor induce un incremento en concentración de calcio intracelular el cual es medido a través de luminiscencia de fotina. Las células se cultivaron como una monocapa en un medio de DMEM/F12 que contiene suero fetal de bovino (FBS) al 10% en una placa de 96 pozos. En el día del experimento, el medio de cultivo se removió y las células se incubaron con 10 µ? de celenterazina en PBS durante al menos 3 horas. Se diluyó el péptído de endotelina en PBS a una concentración de 100 y 500 nM. Aproximadamente 50 µ? de endotelina se inyectaron en cada pozo y se midió la respuesta. La luz emitida se registró inmediatamente durante un período de 30 segundos. La respuesta a endotelina dependiente de dosis se reporta en la figura 4. 3.3 Las líneas de células de CHO que expresan apofotina y el receptor de capsaicina VR1 de rata - un canal iónico permeable a calcio -crecieron hasta 30-95% de confluencia en matraces de cultivo de tejido y se cosecharon mediante tripsinización. Las células se surtieron a 10,000 células/pozo en placas blancas de 96 pozos en medio de crecimiento y se incubaron durante la noche a 37°C en una incubadora humidificada con C02 al 5%. Para experimentos de luminiscencia, las células se cargaron con celenterazina 10 µ? durante 3 horas a 37°C, C02 al 5%. La respuesta de calcio se estimuló mediante la adición de 10 y 50 µ? de capsaicina a cada pozo. Se siguió la cinética de luminiscencia instantánea utilizando Labsystem Luminoskan Ascent, que inyecta reactivos y registra la emisión de luz a partir de cada pozo individual. La adición de capsaicina ocasionó una señal rápida y transitoria de luminiscencia en 30 segundos, presentando un nivel pico en aproximadamente 10 segundos (figura 5).

Materiales v métodos Reactivos La enzimas de restricción se adquirieron de New England Biolabs y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. La Rnasina y el equipo de TNT para transcripción y traducción in vitro eran de Promega (Madison, Wl). Pfu Turbo polimerasa, reactivos para PCR, y células competentes de las cepas de E. coli XL-1 Blue y BI21 , eran de Stratagene (La Jolla, CA). Los oligonucleótidos se adquirieron de Primm (Milán). La celenterazina era de Prolume Ltd. (Pittsburgh, PA). Todos los demás químicos eran de fuentes estándares y eran de grado de reactivo o mejor.

PCR de ensamble para síntesis de un solo paso de secuencias de ADN de obelina Se requieren cuatro pasos para ensamble de PCR: síntesis de oligo, ensamble génico, amplificación génica y clonación. Se sintetizaron 30 oligos, 40 nucleótidos de longitud, los cuales colectivamente codifican ambas cepas de la secuencia génica de obelina. El traslape de oligos complementarios es de 20 nucleótidos. Se combinaron volúmenes iguales extraídos de cada una de las soluciones de 30 oligos a una concentración final de aproximadamente 250 µ? de oligos mezclados, antes de una dilución de 250 veces en 20 µ? de mezcla de Geneamp XL PCR (Perkin Elmer). El procedimiento de amplificación ha sido realizado en tres etapas. El primer paso se llevó a cabo con oligos mezclados de la siguiente manera: 40°C durante 2 minutos, luego adición de polimerasa, 72°C durante 10 segundos, luego 40 ciclos (94°C durante 15 segundos, 40°C durante 30 segundos y 72°C durante 10 segundos). La mezcla de reacción se diluyó tres veces con mezcla fresca de PCR y polimerasa. La segunda etapa fue: 25 ciclos (94°C durante 15 segundos, 40°C durante 30 segundos y 72°C durante 45 segundos). La reacción se diluyó nuevamente tres veces en mezcla de PCR completa. Las condiciones para la tercera etapa fueron: 20 ciclos (94°C durante 15 segundos, 40°C durante 30 segundos y 72°C durante 70 segundos). Los productos de reacción fueron analizados mediante electroforesis de agarosa-gel al 1 %, y el fragmento específico se clonó en el vector pcrBIunt para pasos de clonación posteriores. El plásmido ha sido llamado pcr-OB. Se confirmó la fidelidad de las reacciones de PCR mediante secuenciación didesoxi.

Construcción de la proteína quimérica Se han diseñado cuatro pares de oligos a partir de la secuencia génica de Clitina. La región entre EF-hand I y EF-hand II ha sido seleccionada para quimerización génica. Los iniciadores de oligonucleótidos fueron los siguientes: Clit-4 5'- AATTCTTTCCATCCATCAACAAAAGCTGGGAATTCGACTTCTTTACCATAA TCCATACCAATC-3' Clit 3 5'- AAAGATTGGTATGGATTATGGTAAAGAAGTCGAATTCCCAGCTTTTGTTGA TGGATGGAAAG-3' Clit 2 5 - TTTTTGAAGAAAGCTTCGACAGCATCCTGGTGACGTTTGGTCTGTTCTGG TGTTGCTCCAAGTTTGGCGCA-3' Clit 1 5'- TATGCGCCAAACTTGGAGCAACACCAGAACAGACCAAACGTCACCAGGA TGCTGTCGAAGCTTTCTTCAA-3' Los oligos alineados han sido clonados en los sitios únicos de Ndel/Munl en el vector pcr-OB. El plásmido que contiene el producto génico quimérico se denomina pcr-Fotina. El ADN de fotina ha sido posteriormente subclonado en el vector pcADN3 que contiene el promotor 17.

Cambio de uso de codón a base de PCR Se empleó la técnica de PCR de extensión de traslape para producir el mutante de obelina. Se diseñaron seis pares de iniciadores con diez diferentes mutaciones de punto que producen diez diferentes cambios de uso de codón. Para amplificar los fragmentos de ADN utilizado para extensión de traslape, las reacciones de PCR se llevaron a cabo con 2.5 unidades de Pfu polimerasa, 50 ng de molde de ADN, 250 µ? cada uno de dNTP, y 50 pmol de cada iniciador en un volumen total de 100 µ?. Los parámetros de ciclación empleados fueron 94°C durante 1 minuto, 45° durante 1 minuto, y 72°C durante 1 minuto 30 segundos para los primeros 10 ciclos, seguido de 20 ciclos con una temperatura de alineación de 50°C. Las mutaciones específicas de sitio se confirmaron a través de secuenciación de ADN realizada en Primm (Milán). Todos los procedimientos moleculares se llevaron a cabo utilizando protocolos estándares.

Cultivo de células CHO Todas la células se cultivaron bajo condiciones humidificadas estándares a 37°C y C02 al 5%. Las células CHO se mantuvieron en DMEM/F12 + FBS 10% + Pen/strep + G418 0.5 mg/ml + piruvato 1.6 mM + NaHCO3 0.2%, todos los reactivos eran de Life Technologies. La transfección de ADN se realizó cuando estas células crecieron a una confluencia de 70% a 80% en las placas.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> Axxam <120> Fotoproteína con actividad bioluminiscente mejorada <130> 1191EUR <160> 9 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 662 <212> ADN <213> Obelia longissima <400> 1 acgatcgaac caaacaactc agctcacagc tactgaacaa ctcttgttgt gtacaatcaa 60 aatgtcttca aaatacgcag ttaaactcaa gactgacttt gataatccac gatggatcaa 120 aagacacaag cacatgtttg atttcctcga catcaatgga aatggaaaaa tcaccctcga 180 tgaaattgtg tccaaggcat ctgatgacat atgtgccaag ctcgaagcca caccagaaca 240 aacaaaacgc catcaagttt gtgttgaagc tttctttaga ggatgtggaa tggaatatgg 300 taaagaaatt gccttcccac aattcctcga tggatggaaa caattggcga cttcagaact 360 caagaaatgg gcaagaaacg aacctactct cattcgtgaa tggggagatg ctgtctttga 420 tattttcgac aaagatggaa gtggtacaat cactttggac gaatggaaag cttatggaaa 480 aatctctggt atctctccat cacaagaaga ttgtgaagcg acatttcgac attgcgattt 540 ggacaacagt ggtgaccttg atgttgacga gatgacaaga caacatcttg gattctggta 600 cactttggac ccagaagctg atggtctcta tggcaacgga gttccctaag ctttttttcg 660 aa 662 <210> 2 <211> 195 <212> PRT <213> Obelia longissima <400> 2 Met Ser Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp Asn Pro 1 5 10 15 Arg Trp lie Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu Asp lie Asn 20 25 30 Gly Asn Gly Lys lie Thr Leu Asp Glu lie Val Ser Lys Ala Ser Asp 35 40 45 Asp lie Cys Ala Lys Leu Glu Ala Thr Pro Glu Gln Thr Lys Arg His 50 55 60 Val Cys Val Glu Ala Phe Phe Arg Gly Cys Gly Met Glu Tyr Gly 70 75 80 Lys Glu lie Ala Phe Pro Gln Phe Leu Asp Gly Trp Lys Gln Leu Ala 85 90 95 Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala Arg Asn Glu Pro Thr Leu lie Arg 100 105 110 Trp Gly Asp Ala Val Phe Asp lie Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly 115 120 125 Thr lie Thr Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Lys lie Ser Gly lie 130 135 140 Ser Pro Ser Gln Glu Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu 145 150 155 160 Asp Asn Ser Gly Asp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu 165 170 175 Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn 180 185 190 Gly Val Pro 195 <210> 3 <211> 195 <212> PRT <213> proteína quimérica <400> 3 Met Ser Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp Asn Pro 1 5 10 15 Arg Trp lie Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu Asp lie Asn 20 25 30 Gly Asn Gly Lys lie Thr Leu Asp Glu lie Val Ser Lys Ala Ser Asp 35 40 45 Asp lie Cys Ala Lys Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Thr Lys Arg His 50 55 60 Gln Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Lys Lys lie Gly Met Asp Tyr Gly 65 70 75 80 Lys Glu Val Glu Phe Pro Ala Phe Val Asp Gly Trp Lys Glu Leu Ala 85 90 95 Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala Arg Asn Glu Pro Thr Leu lie Arg 100 105 110 Glu Trp Gly Asp Ala Val Phe Asp lie Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly 115 120 125 Thr lie Thr Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Lys lie Ser Gly lie 130 135 140 Pro Ser Gln Glu Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu 150 155 160 Asp Asn Ser Gly Asp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu 165 170 175 Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn 180 185 190 Gly Val Pro 195 <210> 4 <211> 600 <212> ADN <213> gen quimérico <400> 4 ggatccgccg ccatgtcttc aaaatacgca gttaaactca agactgactt tgataatcca 60 cgatggatca aaagacacaa gcacatgttt gatttcctcg acatcaatgg aaatggaaaa 120 atcaccctcg atgaaattgt gtccaaggca tctgatgaca tatgcgccaa acttggagca 180 acaccagaac agaccaaacg tcaccaggat gctgtcgaag ctttcttcaa aaagattggt 240 atggattatg gtaaagaagt cgaattccca gcttttgttg atggatggaa agaattggcg 300 acttcagaac tcaagaaatg ggcaagaaac gaacctactc tcattcgtga atggggagat 360 gctgtctttg atattttcga caaagatgga agtggtacaa tcactttgga cgaatggaaa 420 gcttatggaa aaatctctgg tatctctcca tcacaagaag attgtgaagc gacatttcga 480 cattgcgatt tggacaacag tggtgacctt gatgttgacg agatgacaag acaacatctt 540 ggattctggt acactttgga cccagaagct gatggtctct atggcaacgg agttccctaa 600 <210> 5 <211> 607 <212> ADN <213> gen quimérico <400> 5 ggatccgccg ccatgtcttc aaaatacgca gttaaactca agactgactt tgataatcca 60 cgatggatca aaagacacaa gcacatgttt gatttcctcg acatcaatgg aaatggaaaa 120 atcaccctcg atgaaattgt gtccaaggca tctgatgaca tctgcgccaa actgggagca 180 acaccagaac agaccaaacg gcaccaggat gctgtcgaag ctttcttcaa aaagattggt 240 atggattatg gtaaagaagt cgaattccca gcttttgttg atggatggaa agaattggcg 300 acttcagaac tcaagaaatg ggcaagaaac gaacctactc tcattcgtga atggggagat 360 gctgtctttg atattttcga caaagatgga agtggtacaa tcactttgga cgaatggaaa 420 gcttatggaa aaatctctgg tatctctcca tcacaagaag attgtgaagc gacatttcga 480 cattgcgatc tggacaacag tggcgacctg gatgttgacg agatgacaag acaacatctt 540 ggattctggt acactttgga cccagaagct gatggcctct atggcaacgg agttccctaa 600 gaattcc 607 <210> 6 <211> 70 <212> ADN <213> iniciador de oligonucleótido <400> 6 tatgcgccaa acttggagca acaccagaac agaccaaacg tcaccaggat gctgtcgaag 60 ctttcttcaa 70 <210> 7 <211> 71 <212> ADN <213> iniciador de oligonucleótido <400> 7 tttttgaaga aagcttcgac agcatcctgg tgacgtttgg tctgttctgg tgttgctcca 60 agtttggcgc a 71 <210> 8 <211> 62 <212> ADN <213> iniciador de oligonucleótido <400> 8 aaagattggt atggattatg gtaaagaagt cgaattccca gcttttgttg atggatggaa 60 ag 62 <210> 9 <211> 63 <212> ADN <213> iniciador de oligonucleótido <400> 9 aattctttcc atccatcaac aaaagctggg aattcgactt ctttaccata atccatacca 60 ate 63

Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una fotoproteína quimérica obtenida al reemplazar una región de proteína Obelina comprendida entre el primer y el segundo sitios de unión a calcio con una región correspondiente de una fotoproteína seleccionada de Clitina, Aequorina, Thalassicolina, Mitocromina, Mnemiopsina y Berovina.

2. - La fotoproteína quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha región correspondiente dentro de la fotoproteína seleccionada se aparea con la secuencia de Obelina en alineaciones de secuencia respectivas con excepción de al menos 1 residuo de aminoácidos.

3. - La fotoproteína quimérica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha región correspondiente dentro de la fotoproteína seleccionada se aparea con la secuencia de Obelina en alineaciones de secuencia respectivas con excepción de al menos 5 residuos de aminoácidos.

4. - La fotoproteína quimérica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicha región correspondiente dentro de la fotoproteína seleccionada se aparea con la secuencia de Obelina en alineaciones de secuencia respectivas con excepción de al menos 10 residuos de aminoácidos.

5. - La fotoproteina quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha región es del residuo 42 a 122 de la secuencia de la proteína Obelina.

6. - La fotoproteina quimérica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha región se extiende a partir del residuo 50 a 94 de la secuencia de la proteína Obelina.

7. - La fotoproteina quimérica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque los residuos 50 a 94 de la proteína Obelina son reemplazados con un fragmento de la secuencia de Clitina que se extiende a partir del residuo 53 a 97.

8. - La fotoproteina quimérica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. 3.

9. - La fotoproteina quimérica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque comprende adicionalmente una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 55, 66, 67, 73, 74, 75, 78, 83, 84, 87, 89 y 94 de la secuencia de Obelina.

10. - Una proteína de fusión que contiene la fotoproteina de las reivindicaciones 1 -9.

11.- Un producto de conjugación entre una fotoproteina de las reivindicaciones 1-6 y una molécula para uso analítico, de diagnóstico o terapéutico.

12. - Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una fotoproteína quimérica de las reivindicaciones 1-9.

13. - La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque codifica la proteína de la reivindicación 8, que tiene una secuencia seleccionada a partir de SEQ. ID N. 4 y SEQ ID N. 5.

14. - El uso de una fotoproteína quimérica de las reivindicaciones 1-9, en combinación con un substrato de luciferina, para la detección de iones calcio.

15.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho substrato de luciferina es celenterazina.

16. - El uso como el que se reclama en las reivindicaciones 14-15, para la determinación cuantitativa de iones calcio.

17. - El uso como el que se reclama en las reivindicaciones 14- 5, para la determinación de concentración de calcio intracelular.

18. - Una célula hospedera que porta una molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 12-13.

19. - El hospedero celular de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque se selecciona a partir de células bacterianas, de levadura, fúngicas, vegetales, de insectos y animales.

20. - Un método para producir una fotoproteína, el cual comprende cultivar la célula hospedera de las reivindicaciones 18-19 en condiciones adecuadas para expresión de fotoproteína, y recuperar la proteína expresada.

21. - Un método para el análisis de moléculas biológicamente activas, el cual comprende exponer un hospedero celular de las reivindicaciones 18-19 a una cantidad definida de dichas moléculas y detectar cualquier variación de concentración de calcio intracelular.

22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la célula hospedera es transfectada con un receptor heterólogo acoplado a la proteína G o canal iónico.

23.- El uso de un producto de conjugación de la reivindicación 1 1 en un inmunoensayo de fase sólida competitivo para determinar la cantidad de dicha molécula en muestras biológicas.

24.- Un sistema de transferencia de energía en resonancia de bioluminiscencia (BRET), que comprende una proteína fluorescente y la fotoproteína de la reivindicación 8.