DE69535744T2

DE69535744T2 - Mutierte luziferasen

Info

Publication number: DE69535744T2
Application number: DE69535744T
Authority: DE
Inventors: Keith V. Madison WOOD; Monika G. Madison GRUBER
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1994-01-03
Filing date: 1995-01-03
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2015-01-04
Also published as: EP1978092A1; US20030166905A1; AU698424B2; US6552179B1; AU1830395A; ATE391769T1; EP1978091A1; EP0689587A4; JP2009039129A; CA2157476A1; CA2157476C; WO1995018853A1; DE69535744D1; ES2301160T3; EP0689587B1; JPH08510387A; AU698424C; JP5090304B2; EP0689587A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Luciferaseenzyme, die Lumineszenz produzieren, wie die von Leuchtkäfern. Insbesondere betrifft die Erfindung mutierte Luciferasen von Käfern. Die erfindungsgemäßen mutierten Luciferasen werden durch Genmanipulation erzeugt, kommen in der Natur nicht vor und enthalten in jedem Fall Modifikationen, die eine Änderung der Farbe der erzeugten Lumineszenz verursachen. Die erfindungsgemäßen Luciferasen können wie ihre natürlich vorkommenden Gegenstücke verwendet werden, um Lumineszenzsignale in Tests oder Assays für verschiedene Substanzen oder Phänomene zur Verfügung zu stellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Gebrauch von Reportermolekülen oder Labels zur qualitativen oder quantitativen Verfolgung molekularer Ereignisse ist bekannt. Sie finden sich in Assays für die medizinische Diagnose, für den Nachweis von Toxinen und anderen Substanzen in Industrieumgebungen und für Grundlagenforschung und angewandte Forschung in der Biologie, Biomedizin und Biochemie. Solche Assays schließen Immunoassays, Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassays und Assays ein, in denen ein Reporterenzym oder ein anderes Protein durch Expression unter der Kontrolle eines bestimmten Promotors produziert wird. Reportermoleküle oder Label in solchen Assaysystemen haben radioaktive Isotope, fluoreszierende Agenzien, Enzyme und chemolumineszente Agenzien mit eingeschlossen.
Zu den Assaysystemen, die Chemolumineszenz zur Verfolgung oder zur Messung von Ereignissen von Interesse einsetzen, zählen auch Assays, welche die Aktivität eines biolumineszenten Enzyms, Luciferase, messen.
Lichtemittierende Systeme sind bekannt und aus vielen lumineszierenden Organismen einschließlich Bakterien, Protozoen, Coelenteraten, Mollusken, Fischen, Tausendfüßern, Fliegen, Pilzen, Würmern, Krebstieren und Käfern, insbesondere Schnellkäfern der Klasse Pyrophorus und den Leuchtkäfern der Klassen Photinus, Photuris und Luciola isoliert worden. In vielen dieser Organismen katalysieren Enzyme Monooxidationen und nutzen die resultierende freie Energie, um ein Molekül in einen Zustand hoher Energie anzuregen. Sichtbares Licht wird abgestrahlt, wenn das angeregte Molekül spontan in den Grundzustand zurückfällt. Dieses abgestrahlte Licht wird "Biolumineszenz" genannt. Im Folgenden wird es manchmal auch einfach als "Lumineszenz" bezeichnet werden.
Das begrenzte Auftreten natürlicher Biolumineszenz ist ein Vorteil der Verwendung von Luciferaseenzymen als Reportergruppen, um molekulare Ereignisse zu verfolgen. Weil natürliche Biolumineszenz so selten ist, ist es unwahrscheinlich, dass Lichtproduktion durch andere biologische Prozesse die Aktivität einer Luciferase überdeckt, die in ein biologisches System eingeführt wurde. Folglich wird sogar in einem komplexen Umfeld die Detektion von Licht ein sicheres Anzeichen für Luciferaseaktivität zur Verfügung stellen.
Luciferasen besitzen zusätzliche Eigenschaften, die sie besonders nützlich als Reportermoleküle für das Biosensing machen (die Verwendung eines Reportersystems, um Eigenschaften eines biologischen Systems aufzudecken). Signalübertragung in Biosensoren (Sensoren, die eine biologische Komponente enthalten), beruht im Allgemeinen auf einem zweistufigen Prozeß: Signalerzeugung durch eine biologische Komponente und Signalübertragung und -verstärkung durch eine elektrische Komponente. Die Signalerzeugung wird gewöhnlich durch Ausbildung von Bindungen oder durch Katalyse erreicht. Die Umwandlung dieser biochemischen Ereignisse in ein elektrisches Signal beruht üblicherweise auf elektrochemischen oder Wärmedetektionsmethoden, die durch die Änderung der freien Energie in den biochemischen Reaktionen begrenzt sind. Für die meisten Reaktionen ist diese kleiner als die bei der Hydrolyse von zwei Molekülen ATP frei werdende Energie oder ungefähr 70 kJ/mol. Jedoch trägt die durch Luciferasen ausgelöste Lumineszenz einen viel höheren Energieinhalt. Die Photonen, die aus der durch Leuchtkäfer-Luciferase katalysierten Reaktion abgestrahlt werden (560 nm), weisen 214 kJ/Einstein auf. Außerdem ist die durch Luciferase katalysierte Reaktion eine der effizientesten unter den bekannten biolumineszenten Reaktionen und weist eine Quantenausbeute von fast 0,9 auf. Dieses Enzym ist folglich ein extrem leistungsfähiger Wandler chemischer Energie.
Seit den frühesten Studien haben Käfer-Luciferasen, insbesondere die aus der verbreiteten nordamerikanischen Leuchtkäfersorte Photinus pyralis, als Paradigmen zum Verständnis von Biolumineszenz gedient. Das grundlegende Wissen und die Anwendungen von Luciferase beruhten auf einem einzelnen Enzym, das "Leuchtkäfer-Luciferase" genannt wird und aus Photinus pyralis gewonnen wird. Jedoch gibt es weltweit ungefähr 1800 Sorten lumineszierender Käfer. Somit ist die Lu ciferase von Photinus pyralis ein einzelnes Beispiel einer großen und facettenreichen Gruppe von Käfer-Luciferasen. Es ist bekannt, dass alle Käfer-Luciferasen eine Reaktion des gleichen Substrates katalysieren, einer polyheterocyclischen organischen Säure D-(–)-2-(6'-hydroxy-2'-benzothiazolyl)-Δ²-thiazolin-4-carbonsäure (im Folgenden als "Luciferin" bezeichnet, wenn nichts anderes angegeben ist), die in ein Molekül hoher Energie umgewandelt wird. Es ist wahrscheinlich, dass die katalysierte Reaktion in jedem Fall den gleichen Mechanismus mit sich bringt.
Das allgemeine Ablaufschema, das bei der Biolumineszenz von Käfern involviert ist, scheint eines zu sein, bei dem die Produktion von Licht nach der oxidativen Decarboxylierung des Luciferins durch Wechselwirkung des oxidierten Luciferins mit dem Enzym erfolgt. Die Farbe des Lichtes wird anscheinend durch die räumliche Anordnung der Aminosäuren des Enzyms bestimmt, die mit dem oxidierten Luciferin wechselwirken.
Die durch Luciferase katalysierte Reaktion, die Biolumineszenz erzeugt (im Folgenden einfach als "die Luciferase-Luciferin-Reaktion" bezeichnet) ist als ein zweistufiger Prozess beschrieben worden, der Luciferin, Adenosintriphosphat (ATP) und molekularen Sauerstoff mit einbezieht. In der ersten Reaktionsstufe reagieren das Luciferin und das ATP und bilden Luciferyladenylat unter Abspaltung von anorganischem Pyrophosphat, wie in der folgenden Reaktionsgleichung gezeigt ist: E + LH₂ + ATP → E·LH-AMP + PP_i worin E die Luciferase ist, LH₂ Luciferin ist, und PP_i Pyrophosphat ist. Das Luciferyladenylat LH₂-AMP bleibt fest an das katalytische Zentrum von Luciferase gebunden. Wenn diese Form des Enzyms molekularem Sauerstoff ausgesetzt wird, wird das enzymgebundene Luciferyladenylat oxidiert und ergibt Oxyluciferin (L=0) in einem elektronisch angeregten Zustand. Das angeregte oxidierte Luciferin strahlt bei der Rückkehr in den Grundzustand Licht ab, wie in der folgenden Reaktionsgleichung gezeigt ist:
Für jedes oxidierte Molekül Luciferin wird ein Lichtquant abgestrahlt. Der elektronisch angeregte Zustand des oxidierten Luciferins ist ein charakteristischer Zustand der Luciferase-Luciferin-Reaktion einer Käfer-Luciferase; die Farbe (und folglich die Energie) des Lichtes, das bei der Rückkehr des oxidierten Luciferins in den Grundzustand abgestrahlt wird, wird durch das Enzym festgelegt, wie durch die Tatsache bewiesen wird, dass verschiedene Sorten von Käfern, die das gleiche Luciferin aufweisen, Licht von unterschiedlicher Farbe abstrahlen.
Luciferasen sind aus verschiedenen Quellen direkt isoliert worden. Über die cDNAs, die Luciferasen von verschiedenen Käferarten kodieren, ist berichtet worden. (siehe de Wet et al., Molec. Cell. Biol. 7, 725–737 (1987); Masuda et al., Gene 77, 265–270 (1989); Wood et al., Science 244, 700–702 (1989)). Hat man die cDNA, die eine Käfer-Luciferase kodiert, zur Verfügung, ist es für den Fachmann völlig unkompliziert, große Mengen der Luciferase durch Isolieren aus Bakterien (z. B. E. Coli), Hefe, Säugetierzellen in Kultur oder dergleichen mehr herzustellen, die transformiert worden sind, um die cDNA zu exprimieren. Alternativ kann die cDNA, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors und anderer Signale zur Steuerung der Expression, in solch einer Zelle eingesetzt werden, um Luciferase und schlußendlich durch sie katalysierte Biolumineszenz zur Verfügung zu stellen, als ein Signal, das die Aktivität des Promotors anzeigt. Die Aktivität des Promotors kann wiederum einen anderen Faktor widerspiegeln, der überwacht werden soll, wie beispielsweise die Konzentration einer Substanz, welche die Aktivität des Promotors hervorruft oder unterdrückt. Verschiedene ohne Zellen auskommende Systeme, die in letzter Zeit verfügbar geworden sind, um Proteine aus den sie kodierenden Nukleinsäuren zu erzeugen, können ebenfalls verwendet werden, um Käfer-Luciferasen herzustellen.
Weiterhin erlauben die Verfügbarkeit von cDNAs, die Käfer-Luciferasen kodieren, und die Möglichkeit, durch Reihenuntersuchungen schnell cDNAs auszusortieren, die Enzyme kodieren, welche die Luciferase-Luciferin-Reaktion katalysieren (siehe de Wet et al., supra und Wood et al., supra) dem Fachmann, andere Luciferasen herzustellen und in großen Mengen zu erhalten, die ihre Aktivität bewahren, wenn sie die Produktion von Biolumineszenz durch die Luciferase-Luciferin-Reaktion katalysieren. Diese anderen Luciferasen können ebenfalls hergestellt werden, und die cDNAs, die sie kodieren, können ebenfalls benutzt werden, wie es im vorhergehenden Abschnitt beschrieben worden ist. In der vorliegenden Offenbarung bedeutet die Bezeichnung "Käfer-Luciferase" oder "Luciferase" ein Enzym, das dazu fähig ist, die Oxidation von Luciferin zu katalysieren, um Biolumineszenz zu erzeugen, wie oben skizziert worden ist.
Die leichte Verfügbarkeit von cDNAs, die Käfer-Luciferasen kodieren, ermöglicht die Verwendung der Luciferasen als Reporter in Assays, die eingesetzt werden, um genetische Ereignisse im Zusammenhang mit Transkription und Translation anzuzeigen, zu verfolgen oder zu messen, indem die Expres sion solch einer cDNA und in der Folge die Produktion des Enzyms an derartige genetische Ereignisse gekoppelt wird.
Leuchtkäfer-Luciferase ist in großem Umfang benutzt worden, um Promotoraktivität in Eukaryoten zu ermitteln. Obwohl dieses Enzym auch in Prokaryoten eingesetzt worden ist, ist die Verwendbarkeit von Leuchtkäfer-Luciferase als genetischer Reporter in Bakterien nicht allgemein anerkannt. Als genetische Reporter sind Käfer-Luciferasen besonders nützlich, da sie monomere Produkte eines einzelnen Gens sind. Außerdem sind für die enzymatische Aktivität keine posttranslationalen Veränderungen erforderlich, und das Enzym enthält keine prosthetischen Gruppen, gebundenen Cofaktoren oder Disulfidbindungen. Lumineszenz aus E. Coli, die das Gen für Leuchtkäfer-Luciferase enthalten, kann ausgelöst werden, indem man das Substrat Luciferin dem Wachstumsmedium zusetzt. Luciferin durchdringt bereitwillig biologische Membranen und kann von E. Coli nicht als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle verwendet werden. Die anderen für die biolumineszente Reaktion erforderlichen Substrate, Sauerstoff und ATP, sind innerhalb lebender Zellen verfügbar. Jedoch wären messbare Veränderungen der Farbe der Lumineszenz der Luciferasen für Systeme erforderlich, die zwei oder mehr unterschiedliche Luciferasen als Reporter (Signalerzeuger ) verwenden.
Klone von unterschiedlichen Käfer-Luciferasen, insbesondere einer einzelnen Klasse oder Sorte, können zusammen in biolumineszenten Reportersystemen verwendet werden. Die Expression der einzelnen Luciferasen in exogenen Wirten sollte sich wegen der großen Ähnlichkeit ihrer Sequenzen nur wenig unterscheiden. So könnten insbesondere die Schnellkäfer-Luciferasen ein System mit mehreren Reportern zur Verfügung stellen, das es ermöglicht, die Aktivität von zwei oder mehr unterschiedlichen Promotoren innerhalb eines einzelnen Wirtes zu überwachen, oder von unterschiedlichen Zellpopulationen gleichzeitig zu beobachten. Die Möglichkeit, jede der Luciferasen in einer Mischung von den anderen zu unterscheiden, ist jedoch durch die Breite ihrer Emissionsspektren begrenzt.
Eines der großartigsten Beispiele der Variation der Lumineszenzfarbe tritt bei Pyrophorus plagiophthalamus auf, einem großen Schnellkäfer, der in der Karibik heimisch ist. Dieser Käfer hat zwei Sätze von Leuchtorganen, ein Paar auf der dorsalen Oberfläche des Prothorax, und ein einzelnes Organ in einer ventralen Spalte des Abdomens. Vier verschiedene Luciferaseklone sind aus dem ventralen Organ isoliert worden. Die von diesen Enzymen katalysierten Luciferin-Luciferase-Reaktionen produzieren Licht, das von grün bis zu orange reicht.
Spektroskopische Daten aus der Luciferase-Luciferin-Reaktion, die durch diese vier Luciferasen katalysiert wird, zeigen vier überlappende Maxima mit annähernd gleichem Abstand, die grünes (höchste Signalstärke: 546 Nanometer), gelbgrünes (höchste Signalstärke: 560 Nanometer), gelbes (höchste Signalstärke: 578 Nanometer) und orangefarbenes (höchste Signalstärke: 593 Nanometer) Licht emittieren. Die jeweiligen Proteine werden als LucPpGR, LucPplYG, LucPplYE und LucPplOR bezeichnet. Obwohl sich die Wellenlängen der höchsten Signalstärke des Lichtes, das von diesen Luciferasen abgestrahlt wird, über fast 50 Nanometer erstrecken, tritt zwischen den Spektren noch beträchtliche Überlappung auf, sogar zwischen den Maxima bei 546 und 593 Nanometer. Die Vergrößerung der Wellenlängendifferenz der Intensitätsmaxima wäre folglich nützlich, um größere Messgenauigkeit in Systemen zu erhalten, die zwei oder mehr Luciferasen verwenden.
Die Aminosäuresequenzen der vier Luciferasen aus dem ventralen Organ sind in hohem Grade ähnlich. Vergleiche der Sequenzen zeigen, dass sie zu 95 bis 99% identisch sind.
Es wäre wünschenswert, die Verwendbarkeit von Käfer-Luciferasen für einen Gebrauch in Systemen mit mehreren Reportern zu verbessern, um Mutationen in Luciferase kodierenden cDNAs zu bewirken, um mutierte Luciferasen zu erzeugen, die in der Luciferase-Luciferin-Reaktion Licht mit größeren Wellenlängendifferenzen der Intensitätsmaxima zu produzieren, als dies unter Verwendung der zur Zeit verfügbaren Luciferasen möglich ist.
Käfer-Luciferasen sind besonders geeignet zur Herstellung dieser mutierten Luciferasen, da die Veränderung der Farbe ein direktes Resultat der Veränderungen in der Aminosäuresequenz ist.
Mutierte Luciferasen von Leuchtkäfern der Klasse Luciola sind dem Fachmann bekannt. Kajiyama et al., U.S. Patente Nr. 5,219,737 und 5,229,285 . Mutierte Luciferasen von Schnellkäfern sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. In einer Reihe von Veröffentlichungen beschreiben Woods et al. (Journal of Bioluminescence and Chemoluminescence, 1989, Vol. 4, 31–39; 1990, Vol. 5, 107–114; und 1989, Vol. 4, 289–301) solche mutierten Schnellkäfer-Luciferasen, die Verschiebungen der Farbe der Emission zeigen.
Bei der Verwendung der Expression von Luciferase in eukaryotischen Zellen für das Biosensing wäre es wünschenswert, den Transport der Luciferase in Peroxisomen zu verringern. Sommer et al., Mol. Biol. Cell 3, 749–759 (1992), haben Mutationen in den drei C-terminalen Aminosäuren der Luciferase von P. pyralis beschrieben, die den Transport des Enzyms in die Peroxisomen ("peroxisomales Targeting") erheblich verringern.

Die Sequenzen von cDNAs, die verschiedene Schnellkäfer- und Leuchtkäfer-Luciferasen kodieren, und die Aminosäuresequenzen, die von den cDNA Sequenzen abgeleitet sind, sind bekannt, wie in Tabelle I gezeigt ist. Tabelle I Literaturstellen für cDNA- und Aminosäure-Sequenzen verschiedener Wildtypen von Käfer-Luciferasen

Luciferase	Literaturstelle
LucPplGR	K. Wood, Dissertation, Universität von Kalifornien, San Diego (1989), siehe auch SEQ ID Nr.: 1; Wood et al., Science 244, 700–702 (1989)
LucPplYG	K. Wood, Dissertation, Universität von Kalifornien, San Diego (1989); Wood et al., Science 244, 700–702 (1989)
LucPplYE	K. Wood, Dissertation, Universität von Kalifornien, San Diego (1989); Wood et al., Science 244, 700–702 (1989)
LucPplOR	K. Wood, Dissertation, Universität von Kalifornien, San Diego (1989); Wood et al., Science 244, 700–702 (1989)
Photinus pyralis	de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7, 725–737 (1987); K. Wood, Dissertation, Universität von Kalifornien, San Diego (1989); Wood et al., 8Science 2 44, 700–70 2 (199)
Luciola cruciata	Kajiyama et al., U. S. Patent Nr. 5,229,285 ; Masuda et al., U.S. Patent Nr. 4,968,613
Luciola lateralis	Kajiyama et al., U.S. Patent Nr. 5,229,285
Luciola mingrelica	Devine et al., Biochim. et Biophys. Acta 1173, 121–132 (1993)

Die cDNA- und Aminosäure-Sequenzen von LucPplGR, der grün emittierenden Luciferase des Schnellkäfers Pyrophorus plagiophthalamus, sind in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt mutierte Luciferasen von Schnellkäfern zur Verfügung und DNAs, welche die mutierten Luciferasen, wie sie in Anspruch 1 und 18 definiert sind, kodieren. Die mutierten Luciferasen produzieren ein Licht, das eine andere Farbe hat als das von der entsprechenden Wildtyp-Luciferase produzierte und dieser Farbunterschied ist so beschaffen, dass die Wellenlänge der höchsten Signalstärke der Lumineszenz der Mutante sich um mindestens 1 nm von der des Wildtyp-Enzyms unterscheidet.
Die erfindungsgemäßen mutierten Luciferasen unterscheiden sich von den entsprechenden Wildtyp-Enzymen durch eine oder mehrere, aber üblicherweise weniger als drei, Aminosäuresubstitutionen. Die erfindungsgemäßen Luciferasen können zusätzlich auch Veränderungen in einer oder mehreren der drei C-terminalen Aminosäuren mit sich bringen, um einen Transport in Peroxisomen (peroxisomales Targeting) zu verringern.
In einem überraschenden Aspekt der Erfindung wurde gefunden, dass die Kombination von zwei Aminosäuresubstitutionen, von denen jede selbst eine Veränderung der Farbe (Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke) der Biolumineszenz verursacht, in einer einzelnen Mutante bewirkt, dass die Mutante eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke aufweist, die größer ist als jede einzelne der beiden Verschiebungen, die durch die einzelnen Aminosäuresubstitutionen verursacht wird.
cDNAs, welche die erfindungsgemäßen mutierten Luciferasen kodieren, können problemlos durch jedes beliebige Standardverfahren für ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden, das mit einer cDNA durchgeführt wird, welche das entsprechende Wildtyp-Enzym oder eine andere Mutante kodiert. Die erfindungsgemäßen mutierten Luciferasen können durch Standardverfahren für die Expression der sie kodierenden cDNAs in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen hergestellt werden.
Eine umfassenderes Verständnis der Erfindung wird durch Auseinandersetzung mit der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung erlangt werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der nachfolgenden Beschreibung und in den Beispielen werden die Verfahrensschritte bei Raumtemperatur (ungefähr 20°C bis 25°C) und atmosphärischem Druck durchgeführt und Konzentrationen werden bei Raumtemperatur (ungefähr 20°C bis 25°C) und atmosphärischem Druck gemessen, sofern nichts anderes angegeben ist.
Alle Aminosäuren, auf die in der Beschreibung Bezug genommen wird, mit Ausnahme des nicht enantiomorphen Glycins, sind L-Aminosäuren, sofern nichts anderes angegeben ist.

Auf eine Aminosäure kann Bezug genommen werden unter Verwendung der Einbuchstaben- oder der Dreibuchstabenbezeichnung wie in der folgenden Tabelle II gezeigt ist. Tabelle II Bezeichnungen für Aminosäuren

Aminosäure	Dreibuchstabenbezeichnung	Einbuchstabenbezeichnung
L-Alanin	Ala	A
L-Arginin	Arg	R
L-Asparagin	Asn	N
L-Asparaginsäure	Asp	D
L-Cystein	Cys	C
L-Glutaminsäure	Glu	E
L-Glutamin	Gln	Q
Glycin	Gly	G
L-Histidin	His	H
L-Isoleucin	Ile	I
L-Leucin	Leu	L
L-Lysin	Lys	K
L-Methionin	Met	M
L-Phenylalanin	Phe	F
L-Prolin	Pro	P
L-Serin	Ser	S
L-Threonin	Thr	T
L-Tryptophan	Trp	W
L-Tyrosin	Tyr	Y
L-Valin	Val	V

"X" bedeutet irgendeine der in Tabelle II verzeichneten zwanzig Aminosäuren.
Peptid- oder Polypeptidsequenzen werden, beginnend bei dem einleitenden Methionin, das mit "1" nummeriert wird, zur C-terminalen Aminosäure hin aufgeschrieben und nummeriert.
Eine Substitution in einer Position in einem Polypeptid wird durch [Bezeichnung der ursprünglichen Aminosäure]_{[Positionsnummer]} [Bezeichnung der ersetzenden Aminosäure] bezeichnet. Zum Beispiel würde die Substitution eines Alanins in Position 100 in einem Polypeptid durch eine Glutaminsäure durch Ala₁₀₀Glu oder A₁₀₀E bezeichnet. Gewöhnlich wird der Substitution eine Bezeichnung für das Polypeptid vorangestellt, in dem die Substitution auftritt. Wenn zum Beispiel der Ersatz A₁₀₀E in einem hypothetischen Protein mit der Bezeichnung "Glück" auftritt, würde die Substitution als Glück-Ala₁₀₀Glu oder Glück-A₁₀₀E bezeichnet. Wenn mehr als eine Substitution in einem Polypeptid vorliegt, werden die Bezeichnungen der Substitutionen durch Schrägstriche getrennt. Wenn zum Beispiel das hypothetische Protein "Glück" eine Substitution von Glutaminsäure für Alanin in Position 100 und eine Substitution von Asparagin für Lysin in Position 150 aufweist, würde das Polypeptid mit den Substitutionen als Glück-Ala₁₀₀Glu/Lys₁₅₀Asn oder Glück-A₁₀₀E/^K150^N bezeichnet. Um unterschiedliche Substitutionen in einer Position in einem Polypeptid anzuzeigen, werden die Kennzeichnungen für die ersetzenden Aminosäuren durch Kommas getrennt. Wenn zum Beispiel das hypothetische "Glück" Substitutionen durch Glutaminsäure, Glycin oder Lysin für Alanin in Position 100 aufweist, würde die Bezeichnung Glück-Ala₁₀₀/Glu, Gly, Lys oder Glück-A₁₀₀/E, G, K lauten.
Die Standard-Einbuchstabencodes "A", "C", "G" und "T" werden hierin jeweils für die Nukleotide Adenylat, Cytidylat, Guanylat bzw. Thymidylat verwendet. Der Fachmann weiß, dass in DNAs die Nukleotide 2'-Desoxyribonucleotid-5'-phosphate (bzw. am 5'-Ende Triphosphate) sind, während in RNAs die Nukleotide Ribonucleotid-5'-phosphate (bzw. am 5'-Ende Triphosphate) sind und Uridylat (U) anstelle von T auftritt. "N" bedeutet irgendeines der vier Nukleotide.
Oligonukleotid- oder Polynukleotidsequenzen werden in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende geschrieben.
Die Bezeichnung "mutierte Luciferase" wird hierin verwendet, um eine Luciferase zu bezeichnen, die nicht natürlich vorkommt und eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von denen der natürlich vorkommenden Luciferasen unterscheidet.
In einem ihrer Aspekte ist die vorliegende Erfindung eine mutierte Käfer-Luciferase, die Biolumineszenz erzeugt (d. h. die Oxidation von Luciferin katalysiert und dadurch Biolumineszenz erzeugt), die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 nm gegenüber der Wellenlänge der höchsten Signalstärke der von der entsprechenden Wildtyp-Luciferase erzeugten Biolumineszenz aufweist und eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der der entsprechenden Wildtyp-Luciferase durch eine Substitution in einer Position oder durch Substitutionen in zwei Positionen unterscheidet; mit der Maßgabe, dass, wenn eine Substitution in einer Position vorliegt, die Position einer Position in der Aminosäuresequenz von LucPplGR entspricht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 232, 236, 237, 242, 244, 245, 248 und 348; mit der weiteren Maßgabe, dass, wenn Substitutionen in zwei Positionen vorliegen, mindestens eine der Positionen einer Position in der Aminosäuresequenz von LucPplGR entspricht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 232, 236, 237, 242, 244, 245, 248 und 348; und mit der Maßgabe, dass die Mutante optional eine Sequenz an ihrem C-Terminus aufweist, die peroxisomales Targeting vermeidet.
Beispielhafte erfindungsgemäße mutierte Luciferasen sind die der Gruppe, die aus LucPplGR-V₂₃₂E, -V₂₃₆H, -V₂₃₆W, -Y₂₃₇S, -Y₂₃₇C, -H₂₄₂A, -F₂₄₄L, -G₂₄₅S, -G₂₄₅E, -I₂₄₈R, -I₂₄₈V, -I₂₄₈F, -I₂₄₈T, -I₂₄₈S, -I₂₄₈N, -H₃₄₈N, -H₃₄₈Q, -H₃₄₈E, -Y₃₄₈C, -S₂₄₇F/I₂₄₈C, S₂₄₇F/I₂₄₈T besteht.

Die folgende Tabelle III zeigt spektroskopische Eigenschaften dieser und anderer mutierter Schnellkäfer-Luciferasen. TABELLE III

Protein	spektroskopische Eigenschaften
LucPplGR-	Maximum	Verschiebung	Breite
Wildtyp	545	0	72
V₂₁₄S	*
Q	*
Y	*
K	*
L	*
G	*
C	*
E	*
F	*
P	*
H	*
R	*
R₂₁₅H	562	17	82
Q	567	22	81
G	576	31	82
T	576	31	84
M	582	37	83
P	588	43	91
S	*
Y	*
K	*
L	*
R₂₁₅C	*
E	*
F	*
R₂₂₃L	549	4	75
Q	549	4	73
M	549	4	75
H	551	6	75
S	*
Y	*
K	*
G	*
C	*
E	*
F	*
P	*
V₂₂₄I	546	1	75
S	556	11	70
F	561	16	84
Y	565	20	87
L	578	33	94
H	584	39	69
G	584	39	70
V₂₃₂E	554	9	83
V₂₃₆H	554	9	74
W	554	9	74
Y₂₃₇S	553	8	73
C	554	9	74
L₂₃₈R	544	–1	72
M	555	10	75
Q	557	12	76
L₂₃₈S	559	14	73
D	568	23	76
H₂₄₂A	559	14	75
S	561	16	74
F₂₄₄L	555	10	73
G₂₄₅S	558	13	75
E	574	29	79
S₂₄₇H	564	19	72
Y	566	21	79
F	569	24	84
I₂₄₈R	544	–1	72
V	546	1	72
F	548	3	74
T	554	9	75
S	558	13	80
N	577	32	90
H₃₄₈A	592	47	67
C	593	48	66
N	597	52	67
Q	605	60	72
V₂₁₄C/V₂₂₄A	559	14	72
S₂₄₇F/F₂₄₆L	567	22	79
S₂₄₇F/I₂₄₈C	586	41	84
S₂₄₇F/I₂₄₈T	596	51	80
T₂₃₃A/L₂₃₈M	555	10	75
V₂₈₂I/I₂₈₃V	563	3	73
V₂₂₄F/R₂₁₅G	584	39	80
V₂₂₄F/R₂₁₅T	587	42	80
V₂₂₄F/R₂₁₅V	589	44	80
V₂₂₄F/R₂₁₅P	597	52	81
V₂₂₄F/P₂₂₂S	564	3	86
V₂₂₄F/Q₂₂₇E	583	38	85
V₂₂₄F/L₂₃₈V	575	30	85
V₂₂₄F/L₂₃₈M	576	31	87
V₂₂₄F/S₂₄₇G	581	36	84
V₂₂₄F/S₂₄₇H	581	36	79
V₂₂₄F/S₂₄₇Y	595	50	88
V₂₂₄F/S₂₄₇F	597	52	85

* Spektrale Verschiebung (≥ 2 nm) durch Augenmaß bestimmt

"Entsprechende Positionen" in anderen Luciferasen als LucPplGR können entweder durch Alignments auf der Ebene der Aminosäuren, die bereits dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. Wood et al., Science 244, 700–702 (1989); Devine et al., Biochim. et Biophys. Acta 1173, 121–132 (1993)) ermittelt werden oder einfach durch Abgleichen auf der Ebene der Aminosäuren, um das Alignment von identischen oder konservativ substituierten Resten zu maximieren, wobei man insbesondere die Tatsache berücksichtigt, dass die Aminosäuren 195–205 in der LucPplGR Sequenz in allen Käfer-Luciferasen in sehr hohem Grade beibehalten werden und dass nach diesem in hohem Grade erhalten bleibenden 11-mer über mehr als 300 Positionen in keiner Aminosäuresequenz irgendeiner Käfer-Luciferase Lücken auftreten.
Eine "peroxisomales Targeting vermeidende Sequenz an ihrem C-Terminus" bedeutet, dass (1) die drei C-terminalen Aminosäuren der entsprechenden Wildtyp-Luciferase in der Mutante völlig fehlen; oder (2) die drei C-terminalen Aminosäuren der entsprechenden Wildtyp-Luciferase durch eine Sequenz, von einer, zwei oder drei Aminosäuren ersetzt werden, die, in Übereinstimmung mit Sommer et al., supra, das peroxisomale Targeting um mindestens 50% verringert. Wenn die drei C-terminalen Aminosäuren der Wildtyp-Luciferase in der Mutante durch eine drei Aminosäuren aufweisende peroxisomales Targeting vermeidende Sequenz ersetzt werden, und wenn die Sequenz in der Mutante X₁X₂X₃ ist, worin X₃ C-terminal ist, dann ist X₁ irgendeine der zwanzig Aminosäuren mit Ausnahme von A, C, G, H, N, P, Q, T und S, X₂ ist irgendeine der zwanzig Aminosäuren mit Ausnahme von H, M, N, Q, R, S und K, und X₃ ist irgendeine der zwanzig Aminosäuren mit Ausnahme von I, M, Y und L. Außerdem können der Mutante irgendeine der drei Aminosäuren X₁, X₂ und X₃ oder zwei beliebige davon oder alle drei fehlen (d. h. keine der Position entsprechende Aminosäure). Die am meisten bevorzugte peroxisomales Targeting vermeidende Sequenz ist IAV, wobei V sich am C-Terminus befindet.
In einem anderen ihrer Aspekte bringt die Erfindung eine Kombination von Luciferasen in einer Zelle (eukaryotisch oder prokaryotisch), einer Lösung (frei oder als Reporter mit einem Antikörper, Antikörperfragment, einer Nukleinsäuresonde oder dergleichen verknüpft) oder an einer festen Oberfläche haftend, optional über einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder eine Nukleinsäure, und einer Lösung ausgesetzt, mit sich, mit der Maßgabe, dass mindestens eine der Luciferasen eine Mutante ist, beide Luciferasen in der Produktion von Biolumineszenz aktiv bleiben, und die Wellenlängen der höchsten Intensität der Biolumineszenz der Luciferasen sich unterscheiden, weil die Aminosäuresequen zen der Luciferasen sich an mindestens einer der Positionen unterscheiden, die den Positionen 232, 236, 237, 242, 244, 245, 248 und 348 in der Aminosäuresequenz von LucPplGR entsprechen, mit der Maßgabe, dass eine der beiden Luciferasen oder beide optional peroxisomales Targeting vermeidende Sequenzen aufweisen.
In einem anderen ihrer Aspekte bringt die Erfindung ein DNA Molekül mit sich, das ein eukaryotischer oder prokaryotischer Expressionsvektor sein kann, der ein Segment enthält, das eine Sequenz aufweist, die eine erfindungsgemäße mutierte Käfer-Luciferase kodiert.
Unter den erfindungsgemäßen DNAs am meisten bevorzugt sind solche mit Segmenten, die eine bevorzugte erfindungsgemäße mutierte Luciferase kodieren. SEQUENZLISTE

ANHANG SEQUENZLISTE

Claims

Mutierte Schnellkäfer-Luziferase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der des Wildtyps der Schnellkäfer-Luziferase LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 unterscheidet; wobei die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Aminosäurensubstitution in einer Position umfasst, die einer Position in der Aminosäurensequenz von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Position 232, 236, 237, 242, 244, 245, 248 und 348; und wobei die Aminosäurensubstitution damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist im Vergleich zu der Lumineszenz, die von dem entsprechenden Wildtyp der Schnellkäfer-Luziferase erzeugt wird.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die Position der Aminosäurensubstitution der Position 232 von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die an Position 232 substituierte Aminosäure, die damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist, E ist.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die Position der Aminosäurensubstitution der Position 236 von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die an Position 236 substituierte Aminosäure, die damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist, H oder W ist.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die Position der Aminosäurensubstitution der Position 237 von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die an Position 237 substituierte Aminosäure, die damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist, S oder C ist.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die Position der Aminosäurensubstitution der Position 242 von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die an Position 242 substituierte Aminosäure, die damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist, A oder S ist.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die Position der Aminosäurensubstitution der Position 244 von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die an Position 244 substituierte Aminosäure, die damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist, L ist.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die Position der Aminosäurensubstitution der Position 245 von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die an Position 245 substituierte Aminosäure, die damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist, S oder E ist.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die Position der Aminosäurensubstitution der Position 248 von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die an Position 248 substituierte Aminosäure, die damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist, R, V, F, T, S oder N ist.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die Position der Aminosäurensubstitution der Position 348 von LucPplGR der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mutierte Schnellkäfer-Luziferase gemäß Anspruch 1, worin die an Position 348 substituierte Aminosäure, die damit in Verbindung steht, dass die mutierte Schnellkäfer-Luziferase eine Lumineszenz erzeugt, die eine Verschiebung der Wellenlänge der höchsten Signalstärke von mindestens 1 Nanometer aufweist, N, Q, A oder C ist.
Isoliertes DNA Molekül, das ein Segment umfasst, welches eine Sequenz aufweist, welche die mutierte Käfer-Luziferase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 kodiert.