JP2003093067A

JP2003093067A - 腎臓及び胎盤型尿酸トランスポーターとその遺伝子

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Publication number: JP2003093067A
Application number: JP2001290291A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Endo; 仁遠藤; Yoshikatsu Kanai; 好克金井; Atsushi Enomoto; 篤榎本
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2003-04-02
Anticipated expiration: 2021-09-21
Also published as: US7510847B2; CA2456172A1; DE60225699T2; EP1428880B1; CA2456172C; JP3824899B2; AU2002325545B2; WO2003027287A1; ATE389720T1; HK1066241A1; EP1428880A1; EP1428880A4; US20070117162A1; DE60225699D1; US20040265819A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】腎臓および胎盤における尿酸輸送に関する新
規な尿酸トランスポーター遺伝子及びその遺伝子がコー
ドするポリペプチドである尿酸トランスポーターを同定
し、提供する。【解決手段】本発明は、特定のアミノ酸配列又は該ア
ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、尿酸及
びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質、及
びタンパク質をコードする遺伝子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は腎臓及び胎盤におけ
る尿酸及びその類似物質の輸送、もしくは尿酸と他の陰
イオンの交換輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコ
ードするポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】人類と霊長類において、有機酸である尿
酸は細胞内におけるプリン代謝の最終代謝産物であり、
主に腎臓から排泄される。人類と霊長類以外の種では、
肝臓の尿酸酸化酵素（ユリケース）の働きによりさらに
アラントインまで代謝されて腎臓より排泄される。した
がって他の哺乳類にとっては、中間代謝産物である尿酸
の腎臓における動態異常の生体に及ぼす影響は少ないと
考えられる。人類が古代より、高尿酸血症による痛風を
患ってきたのはユリケースの働きを、その進化の過程の
なかで失ったことが原因と考えられる。

【０００３】ヒトにおいて、腎臓における尿酸の排泄低
下により高尿酸血症をきたすと、痛風を高率に発症し、
心血管系疾患や高血圧の危険因子となる。一方、腎性低
尿酸血症は、腎臓における尿酸排泄亢進が成因であるこ
とが知られている。これらの疾患の尿酸動態の異常は明
らかではないが、腎臓における尿酸の輸送体（トランス
ポーター）が深く関わっていることが、これまで推測さ
れてきた。腎臓における尿酸の動態については、これま
で摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験
系により研究されてきた。ヒトにおいて、尿酸は腎臓糸
球体を自由に通過し、その後近位尿細管において再吸収
及び分泌の機構が存在することが明らかにされている。
しかし従来の手法では、細胞膜を介した尿酸輸送系につ
いて詳細に解析することは困難であり、トランスポータ
ーそのものを単離して解析することが望まれてきた。

【０００４】尿酸の腎臓における輸送には、著しい種差
が存在し、ブタやウサギのような分泌優位の種と、ヒ
ト、ラットやイヌのような再吸収優位の種が存在するこ
とが知られている。分泌優位の種であるブタは、単位ネ
フロンあたり２００〜３００％の尿酸排泄を行うが、尿
酸再吸収優位の種であるヒトは、単位ネフロンあたり１
０％程度の尿酸排泄しか行わない。また同じ尿酸再吸収
優位の種間でも、尿酸排泄促進薬や尿酸排泄抑制薬に対
する反応が異なることが知られている。このように、種
により腎臓における尿酸の動態や薬物に対する反応が異
なり、また両方向性の輸送が行われているため、その存
在が想定されているにも関わらず、尿酸輸送体の分子的
実体の単離は容易ではなかった。

【０００５】腎臓における尿酸輸送体のなかでも、尿細
管管腔より尿酸を再吸収する輸送体は古くより単離細胞
膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。現
在、高尿酸血症及び痛風の患者に対して用いられている
種々の薬剤は、腎臓において尿酸を再吸収する輸送体を
抑制することが想定されている。またこの輸送体の遺伝
子異常により、腎性低尿酸血症が発症することが予想さ
れている。近年、尿酸の再吸収を司る輸送体は、尿酸と
種々の陰イオンの交換輸送体であることが、様々な実験
において明らかにされてきた。抗結核薬として現在も第
一選択薬として用いられているピラジナミドは、その代
謝産物であるピラジンカルボン酸が、この交換輸送体の
交換基質となり、尿酸再吸収を促進することが明らかに
なっている。抗結核薬を投与されている患者に高率にみ
られる高尿酸血症の原因と考えられている。

【０００６】このように、腎臓における尿酸の再吸収を
担う輸送体は、尿酸の体内動態に関して重要な役割を担
っていると考えられ、その分子的実体を解明すること
で、尿酸排泄促進薬の作用機序、腎性低尿酸血症の原因
解明及び新たな痛風治療薬の開発に広がるものと期待さ
れてきた。

【０００７】我々は、以前に腎臓、肝臓、脳、胎盤など
における薬物輸送において中心的な役割を果たしている
有機アニオントランスポーターＯＡＴ（ｏｒｇａｎｉｃ
ａｎｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）１（Ｓｅｋｉ
ｎｅ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，第２７２巻，１８５２６−１８５２９頁、１
９９７年）、ＯＡＴ２（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．ｅｔａ
ｌ．，ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒ，第４２９巻、１７９−
１８２頁、１９９８年）、ＯＡＴ３（Ｋｕｓｕｈａｒ
ａ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第
２７４巻、１３６７５−１３６８０頁、１９９９年）、
及びＯＡＴ４（Ｃｈａ，Ｓ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７５巻、４５０７−４５１２
頁、２０００年）を単離し報告してきた。ＯＡＴファミ
リーに属するこれらのトランスポーターは化学構造の異
なる多くの有機アニオンを輸送することの出来るトラン
スポーターであり、種々のアニオン性薬物の輸送も行っ
ている。

【０００８】尿酸の輸送体については、既知のトランス
ポーターファミリーに属するかは明らかではなかった
が、尿酸はピリミジン構造とイミダゾール構造を併せ持
つ２塩基酸であり、有機アニオンの一つであることより
尿酸トランスポーターは発生学的にＯＡＴファミリーに
属する可能性が予想された。ＯＡＴファミリーのうちＯ
ＡＴ４は腎臓の尿細管管腔側に存在しており、尿酸の再
吸収を担う輸送体も管腔側にその存在が想定されている
ことより、発生学的にＯＡＴ４に近いものであることも
予想された。これらの事実から、我々は、腎臓における
尿酸トランスポーターが有機イオントランスポーターフ
ァミリーに属するものであることを予測した。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、腎臓
における尿酸輸送に関与する新規な尿酸トランスポータ
ー遺伝子およびその遺伝子がコードするポリペプチドで
ある尿酸トランスポーターを同定し、提供することにあ
る。その他の目的については以下の記載より明白であ
る。

【００１０】

【問題を解決するための手段】本発明者らは既に述べた
ように、４つの有機アニオントランスポーターＯＡＴ
１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３およびＯＡＴ４を単離した。こ
れらは相互に４０％前後のアミノ酸配列の相同性を有し
ている。これらの配列をもとに、ヒトゲノム計画の公開
情報を検索し、ＯＡＴ１、２、３および４と相同性を有
する新規遺伝子断片を複数同定した。このうちＯＡＴ４
の遺伝子座位にきわめて近い新規遺伝子断片の１つを解
析し、その中に開始コドンと思われる部位を同定した。
この開始コドンの３’上流に特異的プライマーを作製
し、ヒトの様々な組織由来のメッセンジャーＲＮＡを用
いた３’−ＲＡＣＥ（３’−ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）法によ
り、この新規遺伝子の単離を試みた。その結果、ヒト腎
臓メッセンジャーＲＮＡを用いた３’−ＲＡＣＥ法によ
りこれまでに報告のない新規クローン（ＵＲＴ１）を同
定した。

【００１１】本発明の尿酸トランスポーターＵＲＴ１
（ｕｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）は、尿酸
およびその類似物質を細胞膜を介して一方より他方に輸
送する能力を有し、さらに細胞膜の他方の陰イオンを交
換基質とする交換輸送体（ｕｒａｔｅ／ａｎｉｏｎｅ
ｘｃｈａｎｇｅｒ）である。本発明のタンパク質として
は、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するものの
ほか、例えば、配列番号１で示されたアミノ酸配列にお
いて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミ
ノ酸の欠失、置換もしくは付加は、尿酸輸送活性が失わ
れない程度であればよく、通常１?約１１０個、好まし
くは１?約５５個である。このようなタンパク質は、配
列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、?７５％、好
ましくは?９０％のアミノ酸配列の相同性を有する。

【００１２】本発明において、３’−ＲＡＣＥ法による
遺伝子の単離は、通常、遺伝子開始コドンの３’側上流
にグアニンあるいはシトシンに富む遺伝子特異的プライ
マーを３０塩基ほどで作製し、アダプター配列のついた
オリゴｄＴプライマーで組織由来のメッセンジャーＲ
ＮＡより逆転写反応を行った後、アダプター配列と遺伝
子特異的プライマーでＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
を行うことにより実施できる。ＰＣＲの正確性をより高
めるためには、よりｆｉｄｅｌｉｔｙの高い耐熱性ポリ
メラーゼを用いることにより実施できる。

【００１３】本発明の尿酸トランスポーター遺伝子は、
適当な哺乳動物の腎臓もしくは胎盤の組織や細胞を遺伝
子源として用いて作製したｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより単離取得できる。哺乳動物と
しては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブ
タ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物のほか、
ヒトが挙げられる。遺伝子のスクリーニングおよび単離
は、ホモロジースクリーニングおよびＰＣＲ法などによ
り好適に実施できる。得られたｃＤＮＡについては、常
法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これ
にコードされるタンパク質、即ちＵＲＴ１のアミノ酸配
列を決定することができる。

【００１４】得られたｃＤＮＡが尿酸トランスポーター
のｃＤＮＡであること、即ちはｃＤＮＡにコードされた
遺伝子産物が尿酸トランスポーターであることは、例え
ば次のようにして検証することができる。得られたＵＲ
Ｔ１ｃＤＮＡから調製したｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）
を卵母細胞に導入して発現させ、尿酸を細胞内に輸送す
る（取り込む）能力を、尿酸を基質とする通常の取り込
み実験（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，第２５１巻、５８６−５９１頁、１９９８年）
により、細胞内への基質取り込みを測定することにより
確認できる。また、発現細胞に同様の取り込み実験を応
用して、ＵＲＴ１の輸送特性や基質特異性などを調べる
ことができる。また、発現細胞について、同様の取り込
み実験を応用して、ＵＲＴ１の特性、例えば、ＵＲＴ１
が時間依存性の輸送を行っているという特性や、ＵＲＴ
１の基質選択性、ｐＨ依存性などを調べることができ
る。

【００１５】得られたＵＲＴ１遺伝子のｃＤＮＡを用い
て、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブ
ラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相
同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。ま
た、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号
１）に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に
基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣ
Ｒ法によりｃＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離する
ことが出来る。

【００１６】ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤ
ＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは例えば、
「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓより
１９８９年に発刊」に記載の方法により調製することが
できる。あるいは、市販のライブラリーがある場合には
これを用いてもよい。

【００１７】ＵＲＴ１遺伝子のヒトゲノム上における構
造を得るには、得られたＣＴ２遺伝子のｃＤＮＡを用い
て、ゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、得られたクローンを解析する。あるいは公開されて
いるヒトゲノム解析結果の情報をもとにホモロジー検索
プログラムを用いてこれを探索してもよい。

【００１８】本発明の尿酸トランスポーター（ＵＲＴ
１）は、例えば、尿酸トランスポーターをコードするｃ
ＤＮＡを用い、遺伝子組み換え技術により生産すること
ができる。例えば、尿酸トランスポーターをコードする
ＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込
み、得られた組み換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入す
ることができる。ポリペプチドを生産するための発現系
（宿主ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆
虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。こ
のうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞および
哺乳動物細胞を用いることが望ましい。

【００１９】例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現さ
せる場合には、尿酸トランスポーターをコードするＤＮ
Ａを、適当な発現ベクター（例えば、レトロウイルス系
ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウ
イルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプ
ロモーター（例えばＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロ
モーター、エロンゲーション１αプロモーター等）の下
流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた
発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換して、形質転
換体を適当な培地で培養することによって、目的とする
ポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞と
しては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター
ＣＨＯ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞または、腎臓組織由来の
初代培養細胞やフ゛タ腎由来ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、フクロ
ネズミ腎由来ＯＫ細胞、マウス由来近位尿細管Ｓ１、同
Ｓ２、同Ｓ３細胞等の細胞株が挙げられる。

【００２０】尿酸トランスポーターＵＲＴ１をコードす
るｃＤＮＡとしては、例えば、配列１に示される塩基配
列を有するｃＤＮＡを用いることが出来るほか、前記の
ｃＤＮＡに限定されることなく、アミノ酸配列に対応す
るＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡを
用いることもできる。この場合、一つのアミノ酸をコー
ドするコドンは各々１?６種類知られており、用いるコ
ドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主
のコドン使用頻度を考慮して、より発現の高い配列を設
計することができる。設計した塩基配列をもつＤＮＡは
ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基
配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配
列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合
成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部
位変異導入法（ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）「Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら、Ｐｒｏ
ｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ第１８巻、５
６６２−５６６６頁、１９８４年」等により実施でき
る。

【００２１】本発明の尿酸トランスポーター遺伝子にス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオ
チド（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド）
は、尿酸トランスポーター遺伝子を検出するためのプロ
ーブとして使用できるほか、尿酸トランスポーターの発
現を変調させるために、例えばアンチセンスオリゴヌク
レオチド、やリボザイム、デコイとして使用することも
できる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配
列番号１で示される塩基配列の中の通常、連続する１４
塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌ
クレオチドを用いることができ、ハイブリダイズをより
特異的とするためには、部分配列としてより長い配列、
例えば２０塩基以上あるいは３０塩基以上の配列を用い
ても良い。

【００２２】また、本発明の尿酸トランスポーターまた
は、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用い
て、その抗体を取得することが出来、抗体は、尿酸トラ
ンスポーター検出や精製などに利用できる。抗体は、本
発明の尿酸トランスポーター、その断片、またはその部
分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて製造
できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（たとえば、
ラットやウサギ）に抗原を接種し、免疫血清を回収する
通常の方法により製造することができ、モノクロナール
抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造
できる。

【００２３】さらに、本発明は尿酸排泄促進作用を有す
る物質のスクリーニング方法を提供するものである。本
発明のタンパク質は、尿酸を細胞内に輸送するためのも
のであり、尿酸の再吸収に深くかかわっている。また、
図６、図８、９及び図１０に示されるように本発明のタ
ンパク質の発現している系に尿酸を添加し、さらにスク
リーニング物質を添加して尿酸の取り込み量をスクリー
ニング物質の無添加の場合と比較することにより、その
系におけるスクリーニング物質の尿酸の取り込みについ
ての促進作用又は阻害作用を定量化することができる。
図6及び図8に示されるように、臨床において尿酸排泄促
進剤として使用されている物質が顕著に前記実験系にお
いて尿酸の取り込みを阻害していることから、この系に
おいてスクリーニング物質における尿酸排泄促進作用を
スクリーニングすることが可能となることがわかる。こ
のスクリーニング系において使用される細胞としては、
下記の実験において使用されている卵母細胞に限定され
るものではなく、本発明のタンパク質を発現し得る細胞
であれば各種の生体細胞を使用することができる。

【００２４】したがって、本発明は、本発明のタンパク
質を用いて尿酸排泄調整作用を有する物質をスクリーニ
ングする方法を提供するものである。本発明の尿酸排泄
調整作用としては、尿酸の排泄促進作用又は尿酸の排泄
阻害作用があり、高尿酸症や痛風などの治療、予防には
尿酸排泄促進作用を有するものが好ましいことから、好
ましい尿酸排泄調整作用としては、尿酸排泄促進作用が
挙げられる。さらに、本発明は前記したスクリーニング
方法によりスクリーニングされた尿酸排泄調整剤を提供
するものである。好ましい尿酸排泄調整剤としては、尿
酸排泄促進剤が挙げられる。本発明の方法によりスクリ
ーニングされた尿酸排泄調整剤は、腎臓などにおける尿
酸輸送に関与する尿酸トランスポーターによる尿酸の取
り込みを調整することができることから、高尿酸症や痛
風などの尿酸の再吸収に関連する各種疾患の治療、予防
の医薬の有効成分として使用することができる。このよ
うにして得られた有効成分を製薬上許容される担体を用
いて医薬組成物とすることができる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例をもって本説明をさらに詳しく
説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもので
はない。なお下記実施例において、各操作は特に断りが
ない限り、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．
およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅ
ｓｓより１９８９年に発刊」に記載の方法により行う
か、または、市販のキットを用いる場合には市販品の指
示書に従って使用した。

【００２６】実施例１腎臓及び胎盤特異的尿酸トラ
ンスポーター（ＵＲＴ１）ｃＤＮＡの単離とその解
析既に我々が単離したＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、及
びＯＡＴ４の塩基配列情報をもとに、公開されているヒ
トゲノム計画の解析結果をホモロジー探索プログラムを
用いて探索した。この結果、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡ
Ｔ３、ＯＡＴ４と相同性を有する新規遺伝子断片を複数
得た。この中で、ＯＡＴ４の遺伝子座位にきわめて近い
新規遺伝子断片の１つを解析し、その中に開始コドンと
思われる部位を同定した。この開始コドンの同定は新規
遺伝子断片をＯＡＴ１及びＯＡＴ４の遺伝子配列と比較
することにより得られた。予測された開始コドンの３’
側上流に特異的プライマーを２８塩基を用いて作製し、
ヒトの様々な組織由来のメッセンジャーＲＮＡを用いた
３’−ＲＡＣＥ（３’−ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）法により、こ
の新規遺伝子の単離を試みた。その結果、ヒト腎臓メッ
センジャーＲＮＡを用いた３’−ＲＡＣＥ法により単一
のクローン（ＵＲＴ１）を得た。ＰＣＲ法により得ら
れた単一のバンドをＴＡクローニング法を用いて、ｐＣ
ＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにサブクローン化したのち、
さらに発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベ
クターにサブクローン化した。この結果、尿酸輸送活性
を持つ新規ｃＤＮＡ（ＵＲＴ１ｃＤＮＡ）が得られた
（輸送機能解析については以下参照）。上記により得ら
れたｃＤＮＡ（ＵＲＴ１ｃＤＮＡ）の塩基配列の決定
は、特異的プライマーを用いて、自動シークエンサー
（アプライドバイオシステム社製）によりおこなった。
（配列番号１に記載）ヒトの各組織におけるＵＡＥ１遺伝子の発現（ノーザン
ブロッティング）の解析を行った（図１）。ＵＲＴ１
ｃＤＮＡの全長を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これ
をプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出し
たＲＮＡをブロッティングしたフィルター（クロンテッ
ク社製）を用いてハイブリダイゼーションを行った。標
識後のＵＡＥ１ｃＤＮＡ全長を含んだハイブリダイゼ
ーション液で一晩ハイブリダイセーションを行い、フィ
ルターを６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳ
ＳＣで洗浄した。ノーザンブロットの結果、腎臓に加え
て胎盤組織において、強いバンドが検出された。ヒト胎
児組織では腎臓においてバンドが検出された。ＵＲＴ１
ｃＤＮＡを含むプラスミドから、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いて、ｉｎｖｉｔｒｏでｃＲＮＡ（ｃＤＮ
Ａに相補的なＲＮＡ）を調製した（Ｓｅｋｉｎｅ，
Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，第２７２巻、１８５２６−１８５２９頁、１
９９７年参照）。

【００２７】実施例２尿酸トランスポーター機能の解
析得られたｃＲＮＡを、既に報告されている方法に従い
（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７２巻、１８５２６−１８５
２９頁、１９９７年）、アフリカツメガエルの卵母細胞
に注入し、この卵母細胞について放射能標識された尿酸
による取り込み実験を行った。この結果、図２に示すよ
うにＵＲＴ１を発現させた卵母細胞は［１４Ｃ］尿酸の
取り込みを示すことが判明した。ＵＲＴ１を発現させた
卵母細胞は［１４Ｃ］尿酸の取り込みの時間依存性を示
した。このことから、ＵＲＴ１は単に尿酸と結合するだ
けではなく、細胞内に輸送するトランスポーターである
ことが示された。有機イオントランスポーターファミリ
ーの代表的な基質である［１４Ｃ］ＰＡＨ（パラアミノ
馬尿酸）及び［１４Ｃ］ＴＥＡ（テトラエチルアンモニ
ウム）の取り込みは認められなかった（図には示さ
ず）。ＵＲＴ１の尿酸輸送のミカエリスーメンテン動力
学試験をおこなった。種々の濃度の尿酸のＵＲＴ１によ
る取り込み量の変化を調べることにより、尿酸のＵＲＴ
１による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識され
た尿酸の取り込み実験は、ＵＲＴ１ｃＲＮＡを注入し
た卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。こ
の結果（図３）、尿酸の取り込みのＫｍ値（ミカエリス
定数）は約３７２±２５mＭであった。ＵＲＴ１の尿酸
輸送における各種電解質の影響を検討した（図４）。細
胞外ナトリウムをリチウム、コリン及びＮ−メチル−Ｄ
−グルカミン（ＮＭＤＧ）に置換した場合、ＵＲＴ１を
介した尿酸の輸送は変化せず、ＵＲＴ１が細胞外ナトリ
ウム非依存性の尿酸トランスポーターであることが明ら
かとなった。細胞外のカリウムイオンをすべてナトリウ
ムで置換した場合（図４，０−Ｋ＋）、およびナトリ
ウムをすべてカリウムイオンで置換した場合（９６ｍＭ
ＫＣｌ）も尿酸の輸送は変化せず、ＵＲＴ１細胞膜
電位に非依存性であることが明らかとなった。細胞外の
クロライドイオンをグルコン酸で置換した場合、尿酸の
取り込みは有意に増加した。単離細胞膜小胞系などを用
いた実験系により、ヒト腎臓の尿細管管腔側に、尿酸と
クロライドイオンの交換輸送体の存在が示されており、
本実験結果もクロライドが尿酸との交換基質となること
を示唆するものといえる。ＵＲＴ１の尿酸輸送における
ｐＨ依存性を検討した。図５に示すように、細胞外のｐ
Ｈをより酸性にしたところ、ＵＲＴ１ｃＲＮＡを注入
した卵母細胞の尿酸輸送は増加したが、これは水を注入
した卵母細胞（対照）における尿酸の非特異的吸着が原
因と考えられた。実質の尿酸輸送（ＵＲＴ１−対照）
はｐＨによって変化しなかった。

【００２８】実施例３尿酸トランスポーターにおける
尿酸の交換基質の検討単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により、ヒト腎臓
の尿酸／陰イオン交換輸送体は乳酸、ニコチン酸などの
モノカルボン酸が尿酸との交換基質となりうることが示
唆されている。ＵＲＴ１の尿酸の交換基質を検討するた
め、これらのモノカルボン酸（１ｍＭ）、パラアミノ馬
尿酸、及びケトグルタル酸で卵母細胞をプレインキュベ
ートしたのちに尿酸の輸送を測定した（図６）。１ｍＭ
のピラジンカルボン酸及びニコチン酸（３−ピリジンカ
ルボン酸）でプレインキュベートした場合、ＵＲＴ１
ｃＲＮＡを注入した卵母細胞では尿酸の取り込みが有意
に増加した。一方、モノカルボン酸ではないパラアミノ
馬尿酸やケトグルタル酸でプレインキュベートした場合
は尿酸の取り込みを促進しなかった。以上の結果は、ピ
ラジンカルボン酸やニコチン酸などのモノカルボン酸が
尿酸との交換基質となっていることを示している。図６
において、モノカルボン酸である乳酸でプレインキュベ
ートした場合は尿酸の取り込みを促進しなかった。卵母
細胞は内因性の乳酸トランスポーターを豊富に発現して
いるため、取り込まれた乳酸がＵＲＴ１以外の経路で細
胞外に輸送されてしまうためと考えられた。また後に示
すようにＵＲＴ１に対する乳酸の親和性が低いことも原
因と予想された。そこで、あらかじめ１００ｍＭの放射
能非標識のＬ−乳酸を１００ｎｌ注入したのち、放射能
標識された尿酸の取り込みを観察した（図７）。乳酸を
あらかじめ注入した場合、水を注入した場合と比べて有
意に高い尿酸の取り込みが観察された。パラアミノ馬尿
酸、及びケトグルタル酸を注入しても尿酸の取り込み
は、水を注入した場合と変化がみられなかった（図には
示さず）。図６及び図７の結果より、ＵＲＴ１は尿酸と
モノカルボン酸との交換輸送体（ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）
である。抗結核薬であるピラジナミドは代謝されてピラ
ジンカルボン酸となり尿中に排泄されるが、一方腎臓で
の尿酸の再吸収を促進するといわれている。以上の結果
はＵＲＴ１において尿酸とピラジンカルボン酸が交換輸
送される結果、尿酸の取り込みが促進されることを示し
ており、抗結核薬であるピラジナミドの副作用とされる
高尿酸血症を引き起こす機序が明らかにされた。

【００２９】実施例４尿酸トランスポーターの阻害物
質のスクリーニングＵＲＴ１の基質選択性をさらに検討するために、ＵＲＴ
１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による［１４Ｃ］尿酸
の取り込み実験系において、系へ各種物質を添加し、そ
の影響を調べた（阻害実験）。［１４Ｃ］尿酸の取り込
み実験は、ＵＲＴ１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用
い、前記記載方法に準じて実施した（図８，９，１
０）。図８に示した濃度の各種化合物（非標識）の存在
下および非存在下で、５０mＭ［１４Ｃ］尿酸の取り
込みをｐＨ７．４の条件下で測定した。その結果、種
々のモノカルボン酸（Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、ニコチン
酸、ピラジンカルボン酸）はＵＲＴ１による［１４Ｃ］
尿酸の輸送を有意に阻害した（図８）。ジカルボン酸で
あり、ＯＡＴ１の交換基質となりうるケトグルタル酸は
ｐＨ７．４の条件下では阻害しなかった。ピラジンカル
ボン酸と似た構造をもつピラジンジカルボン酸はやや弱
い阻害効果を示した。パラアミノ馬尿酸やテトラエチル
アンモニウムのようなアニオン性物質及びカチオン性物
質は阻害作用を示さなかった（図８）。高尿酸血症の治
療に用いられているプロベネシド、ベンズブロマロン、
スルフィンピラゾン、フェニルブタゾンなどの薬剤は、
ＵＲＴ１における尿酸の取り込みを有意に阻害した。ま
た高血圧治療薬であるロサルタンは、尿酸排泄促進作用
があることが知られているが、ロサルタンもその代謝産
物であるＥＸＰ−３１７４と同様にＵＲＴ１の尿酸の取
り込みを有意に阻害した。以上の結果から、ＵＲＴ１は
現在臨床で用いられている代表的な尿酸排泄促進薬の作
用点である。プロベネシドとロサルタンの様々な濃度を
用いて、ＵＲＴ１における尿酸取り込み作用に対する阻
害効果を調べた（図９及び図１０）。ＩＣ５０値はそれ
ぞれ約５０mＭ、２０mＭであった。

【００３０】実施例５ＵＲＴ１遺伝子の構造解析ＵＲＴ１遺伝子のヒトゲノムにおける構造を解析した。
ホモロジー検索プログラムを利用して公開されているヒ
トゲノム解析結果の情報を探索したところ、ＵＲＴ１遺
伝子のエクソン・イントロン構造が明らかになった。図
１１に示すように

【００３１】ＵＲＴ１遺伝子は１０のエクソンからな
り、開始コドンは第１エクソンに存在した。

【００３２】

【発明の効果】本発明の尿酸を選択的に輸送する腎臓お
よび胎盤特異的尿酸トランスポーター及びその遺伝子は
当該トランスポーターの発現箇所での尿酸及び尿酸類似
物質の輸送のインビトロでの検討や、それを基にした化
合物の体内動態の予測を可能とする。尿酸は高尿酸血症
や通風と深い関わりのある因子であり、当該トランスポ
ーターの発明は将来高尿酸血症及び痛風の病因解明に寄
与するものと考えられる。当該トランスポーターは腎臓
において尿酸を再吸収する働きを有しており、尿酸再吸
収機構の欠損した腎性低尿酸血症の原因遺伝子解明に寄
与すると考えられる。さらに、当該トランスポーターの
機能を抑制する新規化合物、及び発現を変調する制御因
子を解明することにより、高尿酸血症及び痛風の新たな
治療法の開発に寄与することができる。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Endou Hitoshi,Kyorin University,School of Medicine <120> kidnial and placental urate transporter and gene threof <130> urate transporter <140> 000 <141> 2001-09-21 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (148)..(1809) <300> <400> 1 gccccgagtc tgtgaagcct agccgctggg ctggagaagc cactgtgggc accaccgtgg 60 gggaaacagg cccgttgccc tggcctcttt gccctgggcc agcctttgtg aagtgggccc 120 ctcttctggg ccccttgagt aggttcc atg gca ttt tct gaa ctc ctg gac ctc 174 Met Ala Phe Ser Glu Leu Leu Asp Leu 1 5 gtg ggt ggc ctg ggc agg ttc cag gtt ctc cag acg atg gct ctg atg 222 Val Gly Gly Leu Gly Arg Phe Gln Val Leu Gln Thr Met Ala Leu Met 10 15 20 25 gtc tcc atc atg tgg ctg tgt acc cag agc atg ctg gag aac ttc tcg 270 Val Ser Ile Met Trp Leu Cys Thr Gln Ser Met Leu Glu Asn Phe Ser 30 35 40 gcc gcc gtg ccc agc cac cgc tgc tgg gca ccc ctc ctg gac aac agc 318 Ala Ala Val Pro Ser His Arg Cys Trp Ala Pro Leu Leu Asp Asn Ser 45 50 55 acg gct cag gcc agc atc cta ggg agc ttg agt cct gag gcc ctc ctg 366 Thr Ala Gln Ala Ser Ile Leu Gly Ser Leu Ser Pro Glu Ala Leu Leu 60 65 70 gct att tcc atc ccg ccg ggc ccc aac cag agg ccc cat cag tgc cgc 414 Ala Ile Ser Ile Pro Pro Gly Pro Asn Gln Arg Pro His Gln Cys Arg 75 80 85 cgc ttc cgc cag cca cag tgg cag ctc ttg gac ccc aat gcc acg gcc 462 Arg Phe Arg Gln Pro Gln Trp Gln Leu Leu Asp Pro Asn Ala Thr Ala 90 95 100 105 acc agc tgg agc gag gcc gac acg gag ccg tgt gtg gat ggc tgg gtc 510 Thr Ser Trp Ser Glu Ala Asp Thr Glu Pro Cys Val Asp Gly Trp Val 110 115 120 tat gac cgc agc atc ttc acc tcc aca atc gtg gcc aag tgg aac ctc 558 Tyr Asp Arg Ser Ile Phe Thr Ser Thr Ile Val Ala Lys Trp Asn Leu 125 130 135 gtg tgt gac tct cac gct ctg aag ccc atg gcc cag tcc atc tac ctg 606 Val Cys Asp Ser His Ala Leu Lys Pro Met Ala Gln Ser Ile Tyr Leu 140 145 150 gct ggg att ctg gtg gga gct gct gcg tgc ggc cct gcc tca gac agg 654 Ala Gly Ile Leu Val Gly Ala Ala Ala Cys Gly Pro Ala Ser Asp Arg 155 160 165 ttt ggg cgc agg ctg gtg cta acc tgg agc tac ctt cag atg gct gtg 702 Phe Gly Arg Arg Leu Val Leu Thr Trp Ser Tyr Leu Gln Met Ala Val 170 175 180 185 atg ggt acg gca gct gcc ttc gcc cct gcc ttc ccc gtg tac tgc ctg 750 Met Gly Thr Ala Ala Ala Phe Ala Pro Ala Phe Pro Val Tyr Cys Leu 190 195 200 ttc cgc ttc ctg ttg gcc ttt gcc gtg gca ggc gtc atg atg aac acg 798 Phe Arg Phe Leu Leu Ala Phe Ala Val Ala Gly Val Met Met Asn Thr 205 210 215 ggc act ctc ctg atg gag tgg acg gcg gca cgg gcc cga ccc ttg gtg 846 Gly Thr Leu Leu Met Glu Trp Thr Ala Ala Arg Ala Arg Pro Leu Val 220 225 230 atg acc ttg aac tct ctg ggc ttc agc ttc ggc cat ggc ctg aca gct 894 Met Thr Leu Asn Ser Leu Gly Phe Ser Phe Gly His Gly Leu Thr Ala 235 240 245 gca gtg gcc tac ggt gtg cgg gac tgg aca ctg ctg cag ctg gtg gtc 942 Ala Val Ala Tyr Gly Val Arg Asp Trp Thr Leu Leu Gln Leu Val Val 250 255 260 265 tcg gtc ccc ttc ttc ctc tgc ttt ttg tac tcc tgg tgg ctg gca gag 990 Ser Val Pro Phe Phe Leu Cys Phe Leu Tyr Ser Trp Trp Leu Ala Glu 270 275 280 tcg gca cga tgg ctc ctc acc aca ggc agg ctg gat tgg ggc ctg cag 1038 Ser Ala Arg Trp Leu Leu Thr Thr Gly Arg Leu Asp Trp Gly Leu Gln 285 290 295 gag ctg tgg agg gtg gct gcc atc aac gga aag ggg gca gtg cag gac 1086 Glu Leu Trp Arg Val Ala Ala Ile Asn Gly Lys Gly Ala Val Gln Asp 300 305 310 acc ctg acc cct gag gtc ttg ctt tca gcc atg cgg gag gag ctg agc 1134 Thr Leu Thr Pro Glu Val Leu Leu Ser Ala Met Arg Glu Glu Leu Ser 315 320 325 atg ggc cag cct cct gcc agc ctg ggc acc ctg ctc cgc atg ccc gga 1182 Met Gly Gln Pro Pro Ala Ser Leu Gly Thr Leu Leu Arg Met Pro Gly 330 335 340 345 ctg cgc ttc cgg acc tgt atc tcc acg ttg tgc tgg ttc gcc ttt ggc 1230 Leu Arg Phe Arg Thr Cys Ile Ser Thr Leu Cys Trp Phe Ala Phe Gly 350 355 360 ttc acc ttc ttc ggc ctg gcc ctg gac ctg cag gcc ctg ggc agc aac 1278 Phe Thr Phe Phe Gly Leu Ala Leu Asp Leu Gln Ala Leu Gly Ser Asn 365 370 375 atc ttc ctg ctc caa atg ttc att ggt gtc gtg gac atc cca gcc aag 1326 Ile Phe Leu Leu Gln Met Phe Ile Gly Val Val Asp Ile Pro Ala Lys 380 385 390 atg ggc gcc ctg ctg ctg ctg agc cac ctg ggc cgc cgc ccc acg ctg 1374 Met Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser His Leu Gly Arg Arg Pro Thr Leu 395 400 405 gcc gca tcc ctg ttg ctg gcg ggg ctc tgc att ctg gcc aac acg ctg 1422 Ala Ala Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys Ile Leu Ala Asn Thr Leu 410 415 420 425 gtg ccc cac gaa atg ggg gct ctg cgc tca gcc ttg gcc gtg ctg ggg 1470 Val Pro His Glu Met Gly Ala Leu Arg Ser Ala Leu Ala Val Leu Gly 430 435 440 ctg ggc ggg gtg ggg gct gcc ttc acc tgc atc acc atc tac agc agc 1518 Leu Gly Gly Val Gly Ala Ala Phe Thr Cys Ile Thr Ile Tyr Ser Ser 445 450 455 gag ctc ttc ccc act gtg ctc agg atg acg gca gtg ggc ttg ggc cag 1566 Glu Leu Phe Pro Thr Val Leu Arg Met Thr Ala Val Gly Leu Gly Gln 460 465 470 atg gca gcc cgt gga gga gcc atc ctg ggg cct ctg gtc cgg ctg ctg 1614 Met Ala Ala Arg Gly Gly Ala Ile Leu Gly Pro Leu Val Arg Leu Leu 475 480 485 ggt gtc cat ggc ccc tgg ctg ccc ttg ctg gtg tat ggg acg gtg cca 1662 Gly Val His Gly Pro Trp Leu Pro Leu Leu Val Tyr Gly Thr Val Pro 490 495 500 505 gtg ctg agt ggc ctg gcc gca ctg ctt ctg ccc gag acc cag agc ttg 1710 Val Leu Ser Gly Leu Ala Ala Leu Leu Leu Pro Glu Thr Gln Ser Leu 510 515 520 ccg ctg ccc gac acc atc caa gat gtg cag aac cag gca gta aag aag 1758 Pro Leu Pro Asp Thr Ile Gln Asp Val Gln Asn Gln Ala Val Lys Lys 525 530 535 gca aca cat ggc acg ctg ggg aac tct gtc cta aaa tcc aca cag ttt 1806 Ala Thr His Gly Thr Leu Gly Asn Ser Val Leu Lys Ser Thr Gln Phe 540 545 550 tag cctcctgagg aacctgcgat gggacggtca gaggaagaga cttcttctgt 1859 tctctggaga aggcaggagg aaagcaaaga cctccatttc cagaggccca gaggctgccc 1919 tctgaggtcc ccactctccc ccagggctgc ccctccaggt gagccctgcc cctctcacag 1979 tccaaggggc ccccttcaat actgaagggg aaaaggacag tttgattggc aggaggtgac 2039 ccagtgcacc atcaccctgc cctgccctcg tggcttcgga gagcagaggg gtcaggccca 2099 ggggaacgag ctggccttgc caaccctctg cttgactccg cactgccact tgtcccccca 2159 cacccgtcca cctgcccaga gctcagagct aaccaccatc catggtcaag acctctccta 2219 gctccacaca agcagtagag tctcagctcc acagctttac ccagaagccc tgtaagcctg 2279 gcccctggcc cctccccatg tccctccagg cctcagccac ctgcccgcca catcctctgc 2339 ctgctgtccc cttcccaccc tcatccctga ccgactccac ttaaccccca aacccagccc 2399 cccttccagg ggtccagggc cagcctgaga tgcccgtgaa actcctaccc acagttacag 2459 ccacaagcct gcctcctccc accctgccag cctatgagtt cccagagggt tggggcagtc 2519 ccatgacccc atgtcccagc tccccacaca gcgctgggcc agagaggcat tggtgcgagg 2579 gattgaataa agaaacaaat gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2639 aaa 2642 <210> 2 <211> 553 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Phe Ser Glu Leu Leu Asp Leu Val Gly Gly Leu Gly Arg Phe 1 5 10 15 Gln Val Leu Gln Thr Met Ala Leu Met Val Ser Ile Met Trp Leu Cys 20 25 30 Thr Gln Ser Met Leu Glu Asn Phe Ser Ala Ala Val Pro Ser His Arg 35 40 45 Cys Trp Ala Pro Leu Leu Asp Asn Ser Thr Ala Gln Ala Ser Ile Leu 50 55 60 Gly Ser Leu Ser Pro Glu Ala Leu Leu Ala Ile Ser Ile Pro Pro Gly 65 70 75 80 Pro Asn Gln Arg Pro His Gln Cys Arg Arg Phe Arg Gln Pro Gln Trp 85 90 95 Gln Leu Leu Asp Pro Asn Ala Thr Ala Thr Ser Trp Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Thr Glu Pro Cys Val Asp Gly Trp Val Tyr Asp Arg Ser Ile Phe Thr 115 120 125 Ser Thr Ile Val Ala Lys Trp Asn Leu Val Cys Asp Ser His Ala Leu 130 135 140 Lys Pro Met Ala Gln Ser Ile Tyr Leu Ala Gly Ile Leu Val Gly Ala 145 150 155 160 Ala Ala Cys Gly Pro Ala Ser Asp Arg Phe Gly Arg Arg Leu Val Leu 165 170 175 Thr Trp Ser Tyr Leu Gln Met Ala Val Met Gly Thr Ala Ala Ala Phe 180 185 190 Ala Pro Ala Phe Pro Val Tyr Cys Leu Phe Arg Phe Leu Leu Ala Phe 195 200 205 Ala Val Ala Gly Val Met Met Asn Thr Gly Thr Leu Leu Met Glu Trp 210 215 220 Thr Ala Ala Arg Ala Arg Pro Leu Val Met Thr Leu Asn Ser Leu Gly 225 230 235 240 Phe Ser Phe Gly His Gly Leu Thr Ala Ala Val Ala Tyr Gly Val Arg 245 250 255 Asp Trp Thr Leu Leu Gln Leu Val Val Ser Val Pro Phe Phe Leu Cys 260 265 270 Phe Leu Tyr Ser Trp Trp Leu Ala Glu Ser Ala Arg Trp Leu Leu Thr 275 280 285 Thr Gly Arg Leu Asp Trp Gly Leu Gln Glu Leu Trp Arg Val Ala Ala 290 295 300 Ile Asn Gly Lys Gly Ala Val Gln Asp Thr Leu Thr Pro Glu Val Leu 305 310 315 320 Leu Ser Ala Met Arg Glu Glu Leu Ser Met Gly Gln Pro Pro Ala Ser 325 330 335 Leu Gly Thr Leu Leu Arg Met Pro Gly Leu Arg Phe Arg Thr Cys Ile 340 345 350 Ser Thr Leu Cys Trp Phe Ala Phe Gly Phe Thr Phe Phe Gly Leu Ala 355 360 365 Leu Asp Leu Gln Ala Leu Gly Ser Asn Ile Phe Leu Leu Gln Met Phe 370 375 380 Ile Gly Val Val Asp Ile Pro Ala Lys Met Gly Ala Leu Leu Leu Leu 385 390 395 400 Ser His Leu Gly Arg Arg Pro Thr Leu Ala Ala Ser Leu Leu Leu Ala 405 410 415 Gly Leu Cys Ile Leu Ala Asn Thr Leu Val Pro His Glu Met Gly Ala 420 425 430 Leu Arg Ser Ala Leu Ala Val Leu Gly Leu Gly Gly Val Gly Ala Ala 435 440 445 Phe Thr Cys Ile Thr Ile Tyr Ser Ser Glu Leu Phe Pro Thr Val Leu 450 455 460 Arg Met Thr Ala Val Gly Leu Gly Gln Met Ala Ala Arg Gly Gly Ala 465 470 475 480 Ile Leu Gly Pro Leu Val Arg Leu Leu Gly Val His Gly Pro Trp Leu 485 490 495 Pro Leu Leu Val Tyr Gly Thr Val Pro Val Leu Ser Gly Leu Ala Ala 500 505 510 Leu Leu Leu Pro Glu Thr Gln Ser Leu Pro Leu Pro Asp Thr Ile Gln 515 520 525 Asp Val Gln Asn Gln Ala Val Lys Lys Ala Thr His Gly Thr Leu Gly 530 535 540 Asn Ser Val Leu Lys Ser Thr Gln Phe 545 550

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト成人及び胎児の各臓器組織におけるＵＲ
Ｔ１遺伝子メッセンジャーＲＮＡの発現をノーザンブロ
ッティングにより解析した結果を示す図。

【図２】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞
による尿酸取り込み実験の時間依存性の結果を示す図。

【図３】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞
による尿酸取り込み実験の濃度依存性の結果を示す図。

【図４】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞
による尿酸取り込み実験において、添加する塩の影響を
調べた結果を示す図。

【図５】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞
による尿酸取り込み実験のｐＨ依存性の結果を示す図。

【図６】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞
による尿酸取り込み実験において各有機酸でプレインキ
ュベーションした結果を示す図。

【図７】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞
による尿酸取り込み実験において、非標識の乳酸（１０
０ｍＭ，１００ｎｌ）をあらかじめ注入した影響を調
べた結果を示す図。

【図８】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞
による尿酸取り込み実験において、系への各種有機酸も
しくはその類似化合物添加の影響を調べた結果を示す
図。

【図９】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞
による尿酸取り込み実験において、系への各種濃度のプ
ロベネシド添加の影響を調べた結果を示す図。

【図１０】ＵＲＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細
胞による尿酸取り込み実験において、系への各種濃度の
ロサルタン添加の影響を調べた結果を示す図。

【表１】ヒトゲノムにおけるＵＲＴ１遺伝子のエクソン
−イントロン構造を示す図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年９月２８日（２００１．９．２
８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】本発明の尿酸トランスポーターＵＲＴ１
（ｕｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）は、尿酸お
よびその類似物質を細胞膜を介して一方より他方に輸送
する能力を有し、さらに細胞膜の他方の陰イオンを交換
基質とする交換輸送体（ｕｒａｔｅ／ａｎｉｏｎｅｘ
ｃｈａｎｇｅｒ）である。本発明のタンパク質として
は、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するものの
ほか、例えば、配列番号１で示されたアミノ酸配列にお
いて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミ
ノ酸の欠失、置換もしくは付加は、尿酸輸送活性が失わ
れない程度であればよく、通常１〜約１１０個、好まし
くは１〜約５５個である。このようなタンパク質は、配
列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、〜７５％、好
ましくは〜９０％のアミノ酸配列の相同性を有する。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２０】尿酸トランスポーターＵＲＴ１をコードす
るｃＤＮＡとしては、例えば、配列１に示される塩基配
列を有するｃＤＮＡを用いることが出来るほか、前記の
ｃＤＮＡに限定されることなく、アミノ酸配列に対応す
るＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡを
用いることもできる。この場合、一つのアミノ酸をコー
ドするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコ
ドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主
のコドン使用頻度を考慮して、より発現の高い配列を設
計することができる。設計した塩基配列をもつＤＮＡは
ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基
配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配
列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合
成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部
位変異導入法（ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）「Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら、Ｐｒｏ
ｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ第１８巻、５
６６２−５６６６頁、１９８４年」等により実施でき
る。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】実施例１腎臓及び胎盤特異的尿酸トラ
ンスポーター（ＵＲＴ１）ｃＤＮＡの単離とその解
析既に我々が単離したＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、及
びＯＡＴ４の塩基配列情報をもとに、公開されているヒ
トゲノム計画の解析結果をホモロジー探索プログラムを
用いて探索した。この結果、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡ
Ｔ３、ＯＡＴ４と相同性を有する新規遺伝子断片を複数
得た。この中で、ＯＡＴ４の遺伝子座位にきわめて近い
新規遺伝子断片の１つを解析し、その中に開始コドンと
思われる部位を同定した。この開始コドンの同定は新規
遺伝子断片をＯＡＴ１及びＯＡＴ４の遺伝子配列と比較
することにより得られた。予測された開始コドンの３’
側上流に特異的プライマーを２８塩基を用いて作製し、
ヒトの様々な組織由来のメッセンジャーＲＮＡを用いた
３’−ＲＡＣＥ（３’−ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）法により、こ
の新規遺伝子の単離を試みた。その結果、ヒト腎臓メッ
センジャーＲＮＡを用いた３’−ＲＡＣＥ法により単一
のクローン（ＵＲＴ１）を得た。ＰＣＲ法により得ら
れた単一のバンドをＴＡクローニング法を用いて、ｐＣ
ＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにサブクローン化したのち、
さらに発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベ
クターにサブクローン化した。この結果、尿酸輸送活性
を持つ新規ｃＤＮＡ（ＵＲＴ１ｃＤＮＡ）が得られた
（輸送機能解析については以下参照）。上記により得ら
れたｃＤＮＡ（ＵＲＴ１ｃＤＮＡ）の塩基配列の決定
は、特異的プライマーを用いて、自動シークエンサー
（アプライドバイオシステム社製）によりおこなった。
（配列番号１に記載）ヒトの各組織におけるＵＡＥ１遺伝子の発現（ノーザン
ブロッティング）の解析を行った（図１）。ＵＲＴ１
ｃＤＮＡの全長を^３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これ
をプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出し
たＲＮＡをブロッティングしたフィルター（クロンテッ
ク社製）を用いてハイブリダイゼーションを行った。標
識後のＵＡＥ１ｃＤＮＡ全長を含んだハイブリダイゼ
ーション液で一晩ハイブリダイセーションを行い、フィ
ルターを６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳ
ＳＣで洗浄した。ノーザンブロットの結果、腎臓に加え
て胎盤組織において、強いバンドが検出された。ヒト胎
児組織では腎臓においてバンドが検出された。
（削除）

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２７】実施例２尿酸トランスポーター機能の解
析ＵＲＴ１ｃＤＮＡを含むプラスミドから、Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて、ｉｎｖｉｔｒｏでｃＲＮＡ
（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した（Ｓｅｋｉｎ
ｅ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，第２７２巻、１８５２６−１８５２９
頁、１９９７年参照）。得られたｃＲＮＡを、既に報告
されている方法に従い（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７２
巻、１８５２６−１８５２９頁、１９９７年）、アフリ
カツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞につい
て放射能標識された尿酸による取り込み実験を行った。
この結果、図２に示すようにＵＲＴ１を発現させた卵母
細胞は［^１４Ｃ］尿酸の取り込みを示すことが判明し
た。ＵＲＴ１を発現させた卵母細胞は［^１４Ｃ］尿酸の
取り込みの時間依存性を示した。このことから、ＵＲＴ
１は単に尿酸と結合するだけではなく、細胞内に輸送す
るトランスポーターであることが示された。有機イオン
トランスポーターファミリーの代表的な基質である［
^１４Ｃ］ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）及び［^１４Ｃ］Ｔ
ＥＡ（テトラエチルアンモニウム）の取り込みは認めら
れなかった（図には示さず）。ＵＲＴ１の尿酸輸送のミ
カエリスーメンテン動力学試験をおこなった。種々の濃
度の尿酸のＵＲＴ１による取り込み量の変化を調べるこ
とにより、尿酸のＵＲＴ１による輸送の濃度依存性を検
討した。放射能標識された尿酸の取り込み実験は、ＵＲ
Ｔ１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載方
法に準じて実施した。この結果（図３）、尿酸の取り込
みのＫｍ値（ミカエリス定数）は約３７２±２５mＭで
あった。ＵＲＴ１の尿酸輸送における各種電解質の影響
を検討した（図４）。細胞外ナトリウムをリチウム、コ
リン及びＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）に置
換した場合、ＵＲＴ１を介した尿酸の輸送は変化せず、
ＵＲＴ１が細胞外ナトリウム非依存性の尿酸トランスポ
ーターであることが明らかとなった。細胞外のカリウム
イオンをすべてナトリウムで置換した場合（図４，０
−Ｋ＋）、およびナトリウムをすべてカリウムイオンで
置換した場合（９６ｍＭＫＣｌ）も尿酸の輸送は変化
せず、ＵＲＴ１細胞膜電位に非依存性であることが明
らかとなった。細胞外のクロライドイオンをグルコン酸
で置換した場合、尿酸の取り込みは有意に増加した。単
離細胞膜小胞系などを用いた実験系により、ヒト腎臓の
尿細管管腔側に、尿酸とクロライドイオンの交換輸送体
の存在が示されており、本実験結果もクロライドが尿酸
との交換基質となることを示唆するものといえる。ＵＲ
Ｔ１の尿酸輸送におけるｐＨ依存性を検討した。図５に
示すように、細胞外のｐＨをより酸性にしたところ、Ｕ
ＲＴ１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞の尿酸輸送は増加
したが、これは水を注入した卵母細胞（対照）における
尿酸の非特異的吸着が原因と考えられた。実質の尿酸輸
送（ＵＲＴ１−対照）はｐＨによって変化しなかっ
た。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２９】実施例４尿酸トランスポーターの阻害物
質のスクリーニングＵＲＴ１の基質選択性をさらに検討するために、ＵＲＴ
１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞による［^１４Ｃ］尿酸
の取り込み実験系において、系へ各種物質を添加し、そ
の影響を調べた（阻害実験）。［^１４Ｃ］尿酸の取り込
み実験は、ＵＲＴ１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用
い、前記記載方法に準じて実施した（図８，９，１
０）。図８に示した濃度の各種化合物（非標識）の存在
下および非存在下で、５０mＭ［^１４Ｃ］尿酸の取り
込みをｐＨ７．４の条件下で測定した。その結果、種
々のモノカルボン酸（Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、ニコチン
酸、ピラジンカルボン酸）はＵＲＴ１による［^１４Ｃ］
尿酸の輸送を有意に阻害した（図８）。ジカルボン酸で
あり、ＯＡＴ１の交換基質となりうるケトグルタル酸は
ｐＨ７．４の条件下では阻害しなかった。ピラジンカル
ボン酸と似た構造をもつピラジンジカルボン酸はやや弱
い阻害効果を示した。パラアミノ馬尿酸やテトラエチル
アンモニウムのようなアニオン性物質及びカチオン性物
質は阻害作用を示さなかった（図８）。高尿酸血症の治
療に用いられているプロベネシド、ベンズブロマロン、
スルフィンピラゾン、フェニルブタゾンなどの薬剤は、
ＵＲＴ１における尿酸の取り込みを有意に阻害した。ま
た高血圧治療薬であるロサルタンは、尿酸排泄促進作用
があることが知られているが、ロサルタンもその代謝産
物であるＥＸＰ−３１７４と同様にＵＲＴ１の尿酸の取
り込みを有意に阻害した。以上の結果から、ＵＲＴ１は
現在臨床で用いられている代表的な尿酸排泄促進薬の作
用点である。プロベネシドとロサルタンの様々な濃度を
用いて、ＵＲＴ１における尿酸取り込み作用に対する阻
害効果を調べた（図９及び図１０）。ＩＣ５０値はそれ
ぞれ約５０mＭ、２０mＭであった。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１１】ヒトゲノムにおけるＵＲＴ１遺伝子のエクソ
ン−イントロン構造を示す図。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１０月３０日（２００１．１０．
３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト成人及び胎児の各臓器組織におけるＵＲＴ
１遺伝子メッセンジャーＲＮＡの発現をノーザンブロッ
ティングにより解析した結果を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/06 Ｃ０７Ｋ 16/18 ４Ｃ０８５Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/21 33/50 Ｚ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB20 CB01 CB26 DA01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB04 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA09 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QR32 QR33 QR55 QS34 QX01 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 CA18 CA25 CA53 NA14 ZC312 4C085 AA13 AA14 BB11 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１に記載されたアミノ酸配列又
は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
尿酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク
質。
【請求項２】ヒト由来である請求項１に記載のタンパク
質。
【請求項３】臓器、組織、もしくは培養細胞由来である
請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】請求項１記載のタンパク質をコードする遺
伝子。
【請求項５】配列番号：１に記載された塩基配列からな
るＤＮＡ、又は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし、尿酸及びその類似物質を輸送、もし
くは尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】ヒト由来である請求項５記載の遺伝子。
【請求項７】臓器、組織、もしくは培養細胞由来である
請求項５又は６に記載の遺伝子。
【請求項８】請求項４〜７のいずれかの項に記載の遺伝
子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝
子を含むプラスミド。
【請求項９】プラスミドが発現プラスミドである請求項
８記載のプラスミド。
【請求項１０】請求項８又は９に記載のプラスミドで形
質転換された宿主細胞。
【請求項１１】配列番号１で示される塩基配列の中の連
続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配
列を含むヌクレオチド。
【請求項１２】尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは
尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとし
て使用するものである請求項１１記載のヌクレオチド。
【請求項１３】尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは
尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用
するものである請求項１１記載のヌクレオチド。
【請求項１４】請求項１〜３のいずれかの項に記載する
タンパク質に対する抗体。
【請求項１５】請求項１〜３のいずれかの項に記載のタ
ンパク質を用いて、該タンパク質の有する尿酸及びその
類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換輸
送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出
する方法。
【請求項１６】請求項１〜３のいずれかに記載のタンパ
ク質を用いて、尿酸排泄調整作用を有する物質をスクリ
ーニングする方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法によりスクリー
ニングされ得る尿酸排泄調整剤。
【請求項１８】請求項１〜３のいずれかの項に記載のタ
ンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機
能抑制物質を用いて、該タンパク質の有する尿酸及びそ
の類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換
輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質に
よって輸送される尿酸及びその類似物質の腎臓及び胎盤
での動態を変更する方法。
【請求項１９】請求項１〜３のいずれかの項に記載のタ
ンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機
能抑制物質を用いて、該タンパク質の有する尿酸及びそ
の類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換
輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質に
よって輸送される尿酸及びその類似物質の腎臓及び胎盤
での動態に与える影響を変更する方法。
【請求項２０】請求項１〜３のいずれかの項に記載のタ
ンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機
能抑制物質を用いて、該タンパク質の有する尿酸及びそ
の類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換
輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質に
よって輸送される尿酸及びその類似物質の全身血中濃度
に与える影響を変更する方法。
【請求項２１】請求項１〜３のいずれかの項に記載のタ
ンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機
能抑制物質、それをコードするｃＤＮＡ（相補的ＤＮ
Ａ）を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現さ
せるか、あるいはすでに細胞に存在する該タンパク質の
有する尿酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させ
ることにより、該タンパク質によって輸送される尿酸及
びその類似物質の腎臓、あるいは胎盤における動態に与
える影響を検出および変更する方法。