WO2005046724A1 - 血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005046724A1
WO2005046724A1 PCT/JP2004/016761 JP2004016761W WO2005046724A1 WO 2005046724 A1 WO2005046724 A1 WO 2005046724A1 JP 2004016761 W JP2004016761 W JP 2004016761W WO 2005046724 A1 WO2005046724 A1 WO 2005046724A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
uric acid
urat1
hypertension
uptake
disorders
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/016761
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hitoshi Endou
Yoshikatsu Kanai
Richard J. Johnson
Karen Leigh Price
Original Assignee
Human Cell Systems, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Human Cell Systems, Inc. filed Critical Human Cell Systems, Inc.
Priority to EP04799622A priority Critical patent/EP1698348A4/en
Priority to US10/579,173 priority patent/US8236488B2/en
Priority to JP2005515447A priority patent/JP4660376B2/ja
Publication of WO2005046724A1 publication Critical patent/WO2005046724A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/103332—Bilirubin or uric acid standard or control

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating, preventing or treating vascular disorders, hypertension and renal disorders, comprising a drug having an inhibitory action on the uptake of uric acid by URAT1, and a pharmaceutically acceptable carrier. It relates to a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a method of using a URAT1-expressing cell line in the presence or absence of a test compound to measure the amount of uric acid uptake, the proliferative capacity of cells, and the chemotactic activity of Z or cells.
  • the present invention relates to a method for screening an active substance for treating, preventing or treating vascular disorders or hypertension / nephropathy, which comprises measuring the amount of sexual factor produced.
  • Hyperuricemia an increase in serum uric acid concentration
  • People are well-known for cardiovascular disease and / or have risk factors, so these collateral signs are believed to be related to both.
  • Epidemiological studies, such as multivariate analysis, have been conducted to clarify that uric acid is associated with risk factors for hypertension-renal disease and cardiovascular disorders.
  • the present inventors have developed a model that causes mild hyperuricemia in rats by administering a pericase inhibitor such as oxonic acid. Interestingly, these hyperuricemia model rats develop hypertension, glomerular vascular disorder, and renal disorder (see Non-patent Documents 16). This mechanism is mediated by the precipitation of crystals inside the kidney V, rather than the renin-angiotensin-based active dendrite compact plaque (densely aggregated in the distal tubule epidermis, It is a group of cells that stains densely and is in direct contact with paraglomerular cells.) It was thought that inhibition of nitric oxide nitrogen synthase was related (see Non-Patent Documents 1-2). The present inventors have reported that this vascular disorder occurs independently of blood pressure (see Non-Patent Document 2).
  • uric acid causes vascular disorders independent of blood pressure, and therefore vascular smooth muscle cells
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • Non-Patent Document 7 The present inventors further concluded that this pathway is characterized by specific mitogen-activated protein kinases (MAP kinases) (ERKs), cyclooxygenase-2 (COX-2), the A and B chains of PDGF, In addition, it has been identified that the expression of PDGF- ⁇ receptor mRNA is involved (see Non-Patent Documents 2-4).
  • MAP kinases mitogen-activated protein kinases
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • uric acid promotes the expression of monocyte chemotactic factor (MCP-1) in VSMCs, and that hyperuricemia stimulates vascular smooth muscle to stimulate cell proliferation. Stimulating, and furthermore, it has been shown to cause the production of inflammatory cytotoxicity (see Non-Patent Document 8).
  • MCP-1 monocyte chemotactic factor
  • uric acid enters VSMC and causes such a phenomenon.
  • Uric acid receptors have been known until now. Since uric acid is a water-soluble substance, it is necessary to involve some kind of transport carrier in order to pass through the cell membrane and enter smooth muscle cells.
  • Non-Patent Document 9 Studies on kidney cells have shown that the uric acid transporter is such that it contains both the organo-on transporter Z exchanger (OAT family) and voltage-sensitive channels (Non-Patent Document 9). 11). Some members of the OAT family, particularly OAT1 and OAT3 (via the basolateral membrane) and URA T1 (via the luminal membrane), mediate urate uptake in kidney cells. It has been clarified (see Non-Patent Documents 12-15). The mechanism of the voltage-sensitive channel Z transporter was also shown, and a putative transporter (UAT) was also identified (see Non-Patent Documents 16-18). In the rat VSMC, which of these channel Z transporters were expressed, whether they functioned, and whether or not they were! In VSMC, it was not known what substance functions as a uric acid transporter!
  • URT1 novel clone
  • the urate transporter URT1 (urate transporterl) has the ability to transport uric acid and its analogous substances from one to the other via the cell membrane, and further uses an exchange transporter using the other anion of the cell membrane as an exchange substrate ( urate / anion exchanger) (see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 JP-A-2003-93067
  • Non-patent document l Mazzali M, Hughes J, et al., Hypertension, 2001; 38, 1101-1106
  • Non-patent document 2 Mazzali M, Kanellis J, et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol, 2002; 282, F991-997
  • Non-patent document 3 Watanabe S, Kang DH, et al, Hypertension, 2002; 40, 355-360
  • Non-patent document 4 Kang DH, Nakagawa T, et al., J. Am. Soc. Nephrol, 2002; 13, 2888-2897
  • Non-patent document 5 Nakagawa T, Mazzali M, et al "Am. J. Nephrol, 2003; 23, 2-7
  • Non-patent document 6 Sanchez-Lozada LG, Tapia E, et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol.,
  • Non-Patent Document 7 Rao GN, Corson MA, et al., J. Biol. Chem., 1991; 266, 8604-8608
  • Non-Patent Document 8 Kanellis J, Watanabe S, et al., Hypertension, 2003; 41, 1287-1293
  • Non-Patent Document 9 Roch-Ramel F, Guisan B, et al., J. Pharm.Exp.Ther., 1997; 280, 839-845
  • Non-Patent Document 10 Roch-Ramel F, Werner D, et al., Am. J. Physiol.Renal Physiol, 1994; 266, F797-F805.
  • Non-patent literature ll Knorr BA, Beck JC, et al., Kidney Int., 1994; 45, 727-736
  • Non-patent literature 12 Sekine T, Cha SH, et al "Eur. J. Physiol, 2000; 440, 337-350
  • Non-patent document 13 Cha SH, Sekine T, et al "Mol. Pharmacol, 2001; 59, 1277-1286
  • Non-patent document 14 Kimura H, Chairoungdua A, et al., Nature, 2002; 417, 447 -452
  • Non-Patent Document 15 Motohashi H, Sakurai Y, et al "J. Am. Soc. Nephrol, 2002; 13, 866-874
  • Non-Patent Document 16 Lea Pinto E, Cohen BE, et al "J. Membrane. Biol, 1999; 169, 13-27
  • Non-Patent Document 17 Lea Pinto E, Tao W, et al "J. Biol. Chem., 1997; 272, 617-625
  • Non-Patent Document 18 Lipkowitz MS, Leal-Pinto E, et al, J. Clin.Invest., 2001; 107, 1103-1115
  • the present invention elucidates the mechanism of uptake of uric acid in vascular smooth muscle cells (VSMC), clarifies the transport system involved in the uptake of uric acid, and uses drugs involved in the transport system. It aims to provide therapeutic, preventive and therapeutic agents for new vascular disorders and hypertension and renal disorders. Another object of the present invention is to provide a new screening system for treating, preventing, and treating vascular disorders and hypertension / nephropathy using these transport systems.
  • VSMC vascular smooth muscle cells
  • URAT1 the uric acid transporter URAT1 which was conventionally thought to be expressed only in the kidney, is also expressed in vascular smooth muscle cells at both the RNA level and the protein level. In addition, it was proved experimentally.
  • URAT1 plays an important role as a transporter of uric acid in the same area, that is, it exists on the luminal side of the renal proximal tubule and regenerates uric acid.
  • URAT1 is also present in vascular smooth muscle cells, and is involved in the transfer of uric acid from blood to smooth muscle cells.
  • the present invention relates to the action of URAT1 to take up uric acid, such as a URAT1 inhibitor or blocker.
  • uric acid such as a URAT1 inhibitor or blocker.
  • Vasculopathy or hypertension ⁇ renal disorder more specifically vasculopathy or hypertension induced by hyperuricemia ⁇ treatment of renal disorder , A pharmaceutical composition for prevention or treatment.
  • the present invention measures the uptake of uric acid using a URAT1-expressing cell line, such as a cell line that stably expresses the URAT1 gene, in the presence or absence of a test compound.
  • a URAT1-expressing cell line such as a cell line that stably expresses the URAT1 gene
  • the present invention relates to a method for screening an effective substance for treating, preventing or treating a vascular disorder or hypertension / renal disorder.
  • the present invention measures the proliferation ability of a cell using a cell line that expresses URAT1, such as a cell line that stably expresses the URAT1 gene, in the presence or absence of a test compound, using the cell line.
  • the present invention relates to a method for screening an effective substance for treating, preventing or treating vascular disorder or hypertension / renal disorder.
  • the present invention provides a method for monocyte chemotaxis of cells using a cell line that expresses URAT1, such as a cell line that stably expresses a URAT1 gene, in the presence or absence of a test compound.
  • the present invention relates to a method for screening an effective substance for treating, preventing or treating vascular disorders or hypertension / nephropathy, which comprises measuring the production amount of a dangling factor.
  • the present inventors first examined the uptake of urate in vascular smooth muscle cells (VSMC).
  • VSMC vascular smooth muscle cells
  • vascular smooth muscle cells Urate uptake in vascular smooth muscle cells (VSMC) was tested under polarized or non-polarized conditions.
  • the uptake of 20 M 14 C urate in VSMC was measured for 120 minutes in either uptake solution under polarized conditions (HE PES saline solution) or under unpolarized conditions (100 mM KC1 uptake solution).
  • the uptake of C-urate was measured at each time (minutes). The measurement results are shown as the standard deviation of the mean of three pairs. The results are shown in FIG. 1.
  • the vertical axis of FIG. Indicates the amount of 14 C urate uptake (CPM), the horizontal axis indicates time (minutes), and the open squares (ports) in FIG.
  • the ratio (%) of the uptake amount of 14 C-urate when the uptake amount of 14 C-urate in the absence of is defined as 100%, and the horizontal axis shows the concentration of cold urate (mgZdL).
  • the asterisk (*) in 2 indicates a significant difference (p ⁇ 0.05), indicating that the concentration of cold urate was As it rose, it was found that 14 C urate uptake in 5 minutes was effectively competing, which was due at least in part to the uptake of urate in VSMC by the transport system. Show me! /
  • Non-Patent Document 9-11 This increased uptake in non-polarized cells (see Figure 1) indicates the presence of a voltage-sensitive transporter.
  • Figure 3 shows the inhibition of incorporation of 14 C urate by Purobe Neshido shows inhibition of uptake of 14 C urate according to FIG Habe Nzuburomaron.
  • the vertical axis in FIGS. 3 and 4 indicates the “C-urate concentration” when the uptake of 14 C-urate in the absence of probenecid (FIG. 3) or ventsbromalone (FIG. 4) is defined as 100%.
  • the horizontal axis in Fig. 3 shows the concentration of probenecid (mM), and the horizontal axis in Fig. 4 shows the concentration of Benzbromarone ( ⁇ ).
  • An asterisk (*) indicates that there is a significant difference (0.05).
  • FIG. 6 shows the competition of 14 C urate uptake by lactate.
  • PAH Fig. 5
  • FOG. 6 when the lactate (FIG. 6) is defined as 100% uptake of 14 C urine salts in the absence, of 14 c urate uptake
  • M concentration of PAH
  • M concentration of lactate
  • An asterisk (*) in FIGS. 5 and 6 indicates that there is a significant difference (p ⁇ 0.05).
  • the uptake of uric acid in VSMC is well known as an inhibitor of the organic A-on transporter (OAT) family, and is reduced in a concentration-dependent manner by probenecid or venzbromalone.
  • OAT organic A-on transporter
  • its uptake is inhibited by the presence of PAH. It is weakly inhibited by the presence of lactate. Therefore, the uric acid transport system in VSMC is considered to have affinity for substrates such as PAH and lactate.
  • VSMCs are also electronegative for extracellular fluids. This membrane potential favors the transport of uric acid in voltage sensitive transporters.
  • the actual degree of electrochemical motive force in the uptake of uric acid is significant because the concentration of uric acid in cells has not been measured.
  • the measurement results are shown as the mean standard deviation (CPM) of three pairs.
  • the results are shown in FIG. 7 (for probenside) and FIG. 8 (for benzbromarone), respectively.
  • the vertical axis in FIGS. 7 and 8 indicates the incorporation amount of 3 H-thymidine (CPM), and the horizontal axis indicates the concentrations of uric acid and each inhibitor.
  • the two asterisks (**) in FIG. 7 and FIG. 8 indicate that there is nothing, and that there is a significant difference (P ⁇ 0.05) with respect to the time (unstimulated) case.
  • (*) Indicates that there is a significant difference (p ⁇ 0.05) from the presence of 3 mg ZdL of uric acid.
  • uric acid increased 3 H-thymidine uptake in rat VSMC, and this increase in 3 H-thymidine uptake by uric acid was concentration-dependent due to the presence of probenecid. Was inhibited. The presence of probenecid alone, in the absence of uric acid, exerted little effect on cell growth. Similar observations were made with benzbromarone (see Figure 8).
  • FIG. 9 shows the results when the inhibitor was probenecid.
  • Figure The vertical axis of 9 shows the growth inhibition rate (%) of VSMC, and the horizontal axis shows the inhibition rate (%) of uric acid uptake.
  • uric acid induces the production of MCP-1 (see Non-Patent Document 8).
  • the production of MCP-1 in VSMC was tested.
  • MCP-1 appearing in the culture supernatant when rat VSMC was cultured for 24 hours was measured by ELISA.
  • the measurement was performed for the case where uric acid (UA) was present at 3 mg / dL, the case where probenecid ImM was present in addition to uric acid 3 mgZdL, and the case where only probenecid was present.
  • Figure 10 shows the results. The vertical axis in FIG.
  • RT-PCR RT-PCR method was used to examine what kind of organic iron-on transporter was present in VSMC.
  • rat organic transporter 11-1 OAT1
  • organic transporter 11-2 OAT2
  • organic union transporter 11-3 OAT3
  • RT-PCR was performed using, as primers, a partial sequence of rat homolog (RST1) of uric acid-on transporter 11-1 (URAT-1).
  • RST1 a partial sequence of rat homolog of uric acid-on transporter 11-1
  • Rat kidney and liver cells were used as a positive control.
  • RT PCR products The results of thidium bromide staining are shown in FIGS.
  • Figure 11A shows the 434 bp PCR product for OAT1
  • Figure 11B shows the 462 bp PCR product for OAT2
  • Figure 11C shows the 483 bp PCR product for OAT3
  • D in FIG. 11 shows a 460 bp PCR product for RST1.
  • the lane at the left end of each drawing shows a ladder of 10 Obp (manufactured by Invitrogen), and the right side shows a kidney (kidney), liver (liver) and VSMC, respectively.
  • FIG. 11A PCR products were confirmed only in the kidney.
  • FIG. 11B a 462 bp PCR product band was confirmed only in the kidney and liver, and in addition, a 320 bp band was observed in all bands. It was something.
  • FIG. 11C PCR products were confirmed only in the kidney and liver.
  • FIG. 11D a 460 bp PCR product band was observed only in the kidney, and in addition, a 21 bp band was observed in all bands. This band was non-specific as a result of sequence analysis. As a result, it was not possible to confirm the expression of these transporters in VSMC.
  • RT-PCR reverse transcription PCR
  • RT PCR was performed in the same manner using total RNA obtained from VSMCs derived from human renal imported arterioles.
  • the result is shown in FIG. 14 by a photograph replacing the drawing.
  • Lane M at the left end and right end of FIG. 14 shows a DNA ladder of lOObp
  • lane + K shows a case using kidney cDNA
  • lane K shows a case without kidney cDNA.
  • Lane 0 shows that VSMC was not added to the VSMC
  • lanes 3, 6, 9, and 12 show that VSMC was produced by uric acid at concentrations of 3 mg Zdl, 6 mg Zdl, 9 mg Zdl, and 12 mg Zdl, respectively.
  • the result of the stimulation is shown.
  • RT-PCR was performed in the same manner using total RNA obtained from human umbilical vein epithelial cells (HUVEC).
  • the result is shown in FIG. 15 by a photograph replacing the drawing.
  • Lane M at the left end and right end of FIG. 15 shows a DNA ladder of lOObp
  • lane + K shows a result using cDNA of kidney
  • lane + Endo shows a result using cDNA synthesized from HUVEC.
  • URAT1 was confirmed by the PCR method in the cDNA obtained from HUVEC.
  • a cell lysate obtained by homogenizing human vascular smooth muscle cells (VSMC)
  • Western blotting was performed with an anti-URAT1 antibody.
  • the result is shown in Fig. 16 as a photograph replacing the drawing.
  • Lane 0 in FIG. 16 shows VSMC without any addition
  • lanes 3, 6, 9, and 12 show VSMC with uric acid at concentrations of 3 mg Zdl, 6 mg Zdl, 9 mg / dl, and 12 mg Zdl, respectively.
  • the result when stimulating is shown.
  • GAPDH in FIG. 16 indicates a positive control.
  • the URAT1 protein was detected by the anti-URAT1 antibody in the cell lysate from which VSMC was obtained, regardless of the presence and concentration of uric acid to be added.
  • vascular smooth muscle cells vascular smooth muscle cells
  • URAT1 a kind of uric acid transporter.
  • Uptake of uric acid in muscle cells causes vascular disorders and hypertension ⁇ renal injury, especially vasculopathy and hypertension induced by hyperuricemia ⁇ renal disorder is uric acid in vascular smooth muscle cells (VSMC)
  • VSMC vascular smooth muscle cells
  • the present invention relates to a method for treating, preventing or treating vascular disorders or hypertension / nephropathy, comprising a drug having an inhibitory action on URAT1 uptake of uric acid and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • Preferred vascular disorders and hypertension ⁇ renal disorders of the present invention include diseases induced by hyperuricemia.
  • Uric acid is present in blood as a final degradation product of purine, Presence Because it is involved in uric acid uptake in vascular smooth muscle cells (VSMC), it is not limited to this.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used as a prophylactic agent, it also provides a pharmaceutical composition as a blood vessel protective agent.
  • any substance may be used as long as it has an action capable of reducing the amount of URAT1 uptake of uric acid by the presence of these substances, such as a URAT1 antagonist, a URAT1 inhibitor, and a URAT1 blocker.
  • a URAT1 antagonist e.g., a URAT1 antagonist
  • a URAT1 inhibitor e.g., a URAT1 inhibitor
  • a URAT1 blocker e.g., probenecid, venzbromarone and the like can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered by either oral administration or parenteral administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated into an administrable form, for example, into a known formulation such as tablets, granules, solutions, and injections.
  • known pharmaceutical additives such as excipients, disintegrants, stabilizers and the like can be appropriately compounded.
  • the effective dose of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately determined depending on the disease state and the patient's condition, but is usually administered in an amount sufficient for uric acid excretion. For example, it can be administered in a range of about L gZkg to 50 mg Zkg per day.
  • the present invention also provides a patient in need of treatment, prevention or treatment of vascular disorder, hypertension, or renal disorder, for administering an effective amount of a drug having an action of inhibiting URAT1 uptake of uric acid.
  • the present invention provides a method for treating, preventing or treating vascular disorders or hypertension / renal disorders.
  • the present invention provides the use of a drug having an inhibitory effect on the uric acid uptake effect of URAT1 for producing a pharmaceutical composition for treating, preventing or treating vascular disorders, hypertension and renal disorders. I do.
  • the present invention provides a method for measuring urea uptake in a URAT1-expressing cell line, in the presence or absence of a test compound, in the presence or absence of a test compound.
  • a method of screening for an effective substance for the treatment, prevention or treatment of a disease may be a cell of the kidney or a natural cell such as VSMC, but it also has the ability to stably express the gene into which the URAT1 gene has been introduced. You may. More specifically, the screening method of the present invention involves, for example, measuring the amount of uric acid uptake when a test compound is present in a uric acid uptake solution of a cell line expressing URAT1.
  • a method for screening an effective substance for treating, preventing or treating vascular disorder or hypertension / renal disorder As a method for measuring the amount of uric acid uptake in the present invention, for example, radiation There is a method using uric acid labeled with a sex isotope, for example, 14 c uric acid.
  • the uric acid in this method may be uric acid itself, or may be a urate such as sodium.
  • the present invention provides a method for measuring vascular disorders or hypertension, which comprises measuring the proliferative ability of cells using a URAT1-expressing cell line in the presence or absence of a test compound.
  • a method for screening an effective substance for treating, preventing or treating renal disorder is provided.
  • a cell line expressing URAT1 is preferably one in which cells are proliferated by uric acid or urate.
  • the screening method of the present invention measures, for example, the amount of thymidine uptake when thymidine and a test compound are present in a uric acid uptake solution of a cell line expressing URAT1.
  • Examples of the method for measuring the amount of thymidine uptake in the present invention include a method using thymidine labeled with a radioisotope, for example, -thymidine.
  • the uric acid in this method may be uric acid itself, or may be a urate such as sodium.
  • the present invention provides a method for measuring the amount of monocyte chemotactic factor produced by a cell using a cell line expressing URAT1 in the presence or absence of a test compound.
  • a cell line expressing URAT1 is preferably one in which cells produce monocyte chemotactic factors such as MCP-1 by uric acid or urate.
  • the screening method of the present invention includes, for example, monocytes such as MCP-1 when a test compound is present in a uric acid uptake solution of a cell line expressing URAT1.
  • a method for screening an effective substance for treating, preventing or treating vascular disorders, hypertension, and renal disorders which comprises measuring the production amount of a chemotactic factor.
  • Examples of the method for measuring the amount of monocyte chemotactic factor such as MCP-1 in the present invention include an ELISA method.
  • the uric acid in this method may be uric acid itself, or may be a urate such as sodium.
  • the activity of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention can also be confirmed using, for example, a hypertensive model animal such as a spontaneously hypertensive model rat (SHR).
  • a hypertensive model animal such as a spontaneously hypertensive model rat (SHR).
  • SHR spontaneously hypertensive model rat
  • the present invention clarifies, for the first time, the conditions for uric acid uptake in vascular smooth muscle cells (VSMC) and the mechanism thereof.
  • VSMC vascular smooth muscle cells
  • URAT1 plays an important role as a transporter of uric acid in the urine when uric acid in blood moves to smooth muscle cells, and URAT1 is also present in vascular smooth muscle cells. It has been shown to be involved in the transfer of uric acid from the blood to smooth muscle cells, and through this effect it has an important role in the pathogenesis of hypertension and vascular lesions in hyperuricemia. It is to be.
  • uric acid uptake is mediated by the present invention, and according to the present invention, it comprises a drug having an action of inhibiting URAT1 uptake action of uric acid, and a pharmaceutically acceptable carrier, and has a vascular disorder, a hypertension, and a renal disorder. It has been possible to provide a pharmaceutical composition for therapy, prevention or treatment.
  • the amount of uric acid uptake and the amount of cells of urate are measured using a cell line expressing URAT1, such as a cell line stably expressing the gene for URAT1, in the presence or absence of a test compound.
  • a new method for screening for effective substances for the treatment, prevention or treatment of vascular disorders and hypertension ⁇ renal disorders which consists of measuring the proliferative capacity and the amount of monocyte chemotactic factor produced by Z or cells Is provided. According to the method of the present invention, it is possible to develop a new antihypertensive drug or a new drug having a protective action by inhibiting vascular degeneration.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of testing the uptake of urate in vascular smooth muscle cells (VSMC) under polarized or non-polarized conditions.
  • the vertical axis in FIG. 1 shows the uptake amount (CPM) of 14 C urate, and the horizontal axis shows time (minutes).
  • CPM uptake amount
  • a white square mark (mouth) indicates the case under non-polarization conditions
  • a black diamond mark ( ⁇ ) indicates the case under polarization conditions.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a test of competition with cold urate in the uptake of 14 C urate in rat VSMC.
  • the vertical axis in FIG. 2 shows the percentage of “C-urate uptake (%) when the amount of 14 C-urate uptake in the absence of cold urate is 100%.
  • the horizontal axis is cold uric acid. Shows the salt concentration (mgZdL).
  • FIG. 3 is a graph showing the results of testing the inhibition of 14 C-urate uptake by probenecid in rat VSMC.
  • the vertical axis in FIG. 3 shows the percentage of the incorporation of C-urate (%), assuming that the uptake of 14 C-urate in the absence of probenecid is 100%, and the horizontal axis is that of probenecid. Indicates the concentration (mM).
  • FIG. 4 is a graph showing the results of testing the inhibition of 14 C-uric acid uptake by benzbromarone in rat VSMC.
  • the vertical axis in FIG. 4 indicates the ratio (%) of the uptake amount of C-urate when the uptake amount of 14 C-urate in the absence of benzbromarone is 100%.
  • the horizontal axis shows the concentration of Benzbromarone ( ⁇ ).
  • Fig. 5 is a graph showing the results of a test of competition of 14C urate uptake by para-aminohippurate (PAH) in rat VSMC.
  • the vertical axis of FIG. 5 shows the percentage of the uptake amount of C-urate (%) when the amount of uptake of 14 C-urate in the absence of PAH is defined as 100%, and the horizontal axis shows the amount of uptake of PAH. Indicates the concentration ( ⁇ ).
  • FIG. 6 is a graph showing the results of a test of competition of lactate uptake of 14 C urate in rat VSMC.
  • the vertical axis in FIG. 6 shows the percentage (%) of 14 c urate uptake when the amount of 14 C urate uptake in the absence of lactate is defined as 100%, and the horizontal axis shows lactate uptake. Indicates the concentration ( ⁇ ).
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the proliferation of VSMC when VSMC was cultured for 24 hours, based on the amount of 3 H-thymidine incorporated.
  • the vertical axis in Fig. 7 shows the amount of thymidine uptake (CPM), and the horizontal axis shows the absence of uric acid! (No UA), the presence of 3 mg ZdL of uric acid (UA), and the addition of 3 mg ZdL of uric acid.
  • CPM thymidine uptake
  • UAM absence of uric acid!
  • U 3 mg ZdL of uric acid
  • the cases where probenecid is present at 0.1, 0.5 and ImM respectively (UA + 0.1 etc.) and the case where probenecid is present alone (1) are shown.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of measuring the proliferation of VSMC when VSMC was cultured for 24 hours, based on the amount of 3 H-thymidine incorporated.
  • the abscissa indicates uric acid not present !, no urine (no UA), uric acid present at 3 mg ZdL (UA), uric acid 3 mg ZdL plus 0.5, 1, and 10 of vanesbromalone M
  • the case where each exists (UA + 0.5 etc.) and the case where Venzbromarone is present alone (10) are shown.
  • Fig. 9 compares the inhibition rate (%) of probe proliferation of organic ion transport in 24-hour culture with probenecid and the inhibition rate (%) of uric acid uptake by probenecid in 5 minutes. It is a graph which shows the result. The vertical axis in FIG. 9 indicates the growth inhibition rate (%) of VSMC, and the horizontal axis indicates the inhibition rate (%) of uric acid uptake.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of ELISA measurement of MCP-1 appearing in the culture supernatant when rat VSMC was cultured for 24 hours.
  • the vertical axis in FIG. 10 indicates the amount of MCP-1 (pg / 1000 cells), and the horizontal axis indicates the case where nothing is present (No UA), the case where 3 mg ZdL of uric acid is present (UA), and the case where 3 mg ZdL of uric acid is present.
  • the case where the probenecid ImM exists and the case where only probenecid exists (Prob) are shown, respectively.
  • Fig. 11 shows the results obtained by using rat VSMC total RNA, using rat organic-on transporter 11 (OAT1), organic-on transporter 11-2 (OAT2), and organic RT-PCR using the partial distribution sequence of on-transporter 11-3 (OAT3) and uric acid-on-transporter 11-1 (URAT1) as primers, and the results of ethidium bromide staining of the PCR product Is a photograph replacing a drawing.
  • Rat kidney and liver cells were used as a positive control.
  • 11A shows the case of OAT1
  • FIG. 11B shows the case of OAT2
  • FIG. 11C shows the case of OAT3
  • FIG. 11D shows the case of URAT1, respectively.
  • the lane at the left end of each drawing shows a lOObp ladder (manufactured by Invitrogen), and the right side shows a kidney (kidney), liver (liver), and VSMC, respectively.
  • FIG. 12 is a photograph instead of a drawing showing the result of performing RNase protection assay to evaluate the expression of UAT (Genebank, accession number: NM 012977).
  • the leftmost lane in FIG. 12 shows the probe, the middle four lanes show VSMC, and the rightmost lane shows the liver.
  • FIG. 13 is a photograph instead of a drawing showing the result of detection of the uric acid transporter URAT-1 in human aorta-derived vascular smooth muscle cells (VSMC) by RT-PCR.
  • FIG. 14 is a photograph instead of a drawing showing the results of detection of the uric acid transporter URAT-1 in cultured smooth muscle cells (VS MC) derived from human renal arterioles by RT-PCR.
  • FIG. 15 is a photograph instead of a drawing showing the result of detection of the uric acid transporter URAT-1 in human umbilical vein epithelial cells (HUVEC) by RT-PCR.
  • FIG. 16 is a photograph instead of a drawing showing the result of detection of uric acid transporter URAT-1 in human vascular smooth muscle cells (VSMC) by Western blotting.
  • vascular smooth muscle cells used in the following experiments were prepared from rat aortic power (Zhang S, Yang Y, et al, Circulation., 2003; 107, 1539-44). The cells were transformed with Darbecco containing 10% fetal calf serum (FBS), 1% glutamine, and 1% penicillin Z-streptomycin solution (100 units Zml penicillin, 100 ⁇ g Zml streptomycin; GIBCO). The cells were cultured in the prepared Eagle medium (DMEM, GIBCO). The VSMCs were transferred to a 35 mm 6-well culture plate (NUNC) and stored at 37 ° C. in a humidified tissue culture incubator under an atmosphere of 5% carbon dioxide and 95% air. The medium was changed every two days. The VSMC used in the experiment was of 5-12 generations.
  • FBS fetal calf serum
  • glutamine 1%
  • penicillin Z-streptomycin solution 100 units Zml penicillin, 100 ⁇ g Zml strepto
  • VSMC (4 ⁇ 10 5 cells) were transferred to a 6-well culture plate with 10% FBS-DMEM. One day later, growth was stopped by placing overnight in serum-free DMEM medium. During each experiment, cells and all solutions were maintained at 37 ° C.
  • uptake experiments with radioactively labeled urate were performed in the presence of other organic anions, such as cold urate, lactate, para-aminohippurate (PAH), or organic-on-trans.
  • the test was performed in the presence of a porter inhibitor (probenecid or benzbromarone).
  • the uptake was stopped by rapidly aspirating the media and immediately washing three times with ice-cold PBS.
  • the total force blank of the rapidly aspirated, harvested culture solution and cells washed as described above was subtracted.
  • the cells were then lysed with 1 ml of IN NaOH for 15 minutes.
  • the amount of accumulated 8- 14 C urate in cells was measured example mosquitoes ⁇ cell lysates of 0.
  • uric acid uptake experiments were performed in polarized or non-polarized conditions to determine whether urate uptake was voltage sensitive.
  • the experimental conditions were the same as those described above, except that the culture solution was different under non-polarized or polarized conditions. Specifically, after starvation for 12 hours, the serum-free medium was removed and replaced with 140 mM NaCl, 4 mM KC1, 2 mM CaCl and ImM
  • VSMC (4 ⁇ 10 5 cells) were transferred to a 6-well culture plate with 10% FBS-DMEM and cultured for 24 hours. The cells were then starved in 0.5% FBS-DMEM for 48 hours. To measure DNA synthesis, quiescent VSMCs were stimulated with 3 mg ZdL uric acid containing 1 ⁇ Ci of thymidine for 48 hours. Two hours before harvesting cells, an additional 2 / z CiZm L of 3 H-thymidine was added to each well. Cells were washed three times with ice-cold PBS and lysed with 1 mL of IN NaOH.
  • the amount of 3 H-thymidine incorporated into the cells was determined by adding 0.5 ml of cell lysate to 5 ml of scintillation solution. The incorporation of 3 H-thymidine, indicated by CPMZ, was recorded on a solution scintillation counter. In some experiments, experiments were performed in the presence of various concentrations of probenecid or ventsbromalone (organo-on transporter inhibitor). The results are shown in FIGS. In a similar manner, the growth of VSMCs was evaluated using organic ions (lactate and PAH).
  • Total RNA was also prepared from rat VSMCs using the RNeasy RNA purification kit (Qiagen, Valencia, CA).
  • Poly (A) + RNA was isolated using an Oligotex mRNA purification system (Qiagen) and reverse transcribed using random primers in a one-step RT reaction.
  • Kidney and liver poly (A) + RNA sold by Clontech (Palo Alto, Calif.) was used as a positive control. Negative control reactions were performed with reverse transcriptase heat inactivation before adding primers to test for DNA contamination.
  • a PCR reaction was performed using the following nucleotide sets.
  • RST1 (a homolog of a mouse of URAT-1):
  • the RT-PCR reaction was performed using Ready-To-Go RT-PCR beads (manufactured by Amersham).
  • the first strand cDNA synthesis reaction was performed using pd (N) at 42 ° C for 15 minutes.
  • PCR is a cycle of initial denaturation at 95 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 ° C for 30 seconds, elution at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute. For 32 cycles. Samples were stored at 4 ° C. The PCR product was subjected to electrophoresis on a 1.5% agarose gel, and a band having an appropriate molecular weight in the gel was purified using a QIAquick gel extraction kit (Qiagen). These bands were subcloned into a TOPO TA closing vector (Invitrogen).
  • the test was performed by the G ADPH-mRNA method using a primer combination consisting of 5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-3 ′. The result is shown in FIG.
  • RNase Protection Atsushi RNase Protection Atsushi (RPA).
  • RNase protection assay was performed on 2-4 g of RNA using an RPAsI kit (Trepines Biolabs, Houston, TX). 325 bp of nucleotides up to the 325th position of the rat UAT (Genebank, accession number: NM012977) were subcloned into pcDNA-UAT-EGFP. This plasmid was digested with BamHI and EcoRI, ligated to the plasmid pBluescript, and this plasmid was named pBS-UAT-325. This plasmid was digested with BamHI to form a chain, and a riboprobe (RNA probe) was synthesized using T7 RNA polymerase in the presence of a 32 P [UTP].
  • RNA obtained from vascular smooth muscle cells (VSMC) derived from human aorta was reverse-transcribed to synthesize cDNA.
  • cDNA PCR was performed using the partial sequence of the urate transporter URAT-1 as a primer.
  • Fig. 13 shows the results.
  • lanes M on the left and right ends show a lOObp DNA ladder
  • lane + K shows a case using kidney cDNA
  • lane K shows a case without kidney cDNA.
  • Lane 0 shows that VSMC was not added
  • lanes 3, 6, 9, and 12 show uric acid at concentrations of 3 mg / dl, 6 mg / dl, 9 mg / dl, and 12 mg Zdl, respectively. Shows the results when VSMC was stimulated.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 6 using total RNA obtained from VSMCs derived from human renal imported arterioles.
  • Lane M at the left end and right end of FIG. 14 shows a DNA ladder of lOObp
  • lane + K shows a case using kidney cDNA
  • lane K shows a case without kidney cDNA.
  • Lane 0 shows that VSMC was not added
  • lanes 3, 6, 9, and 12 show uric acid at concentrations of 3 mg / dl, 6 mg / dl, 9 mg / dl, and 12 mg Zdl, respectively. Shows the results when VSMC was stimulated.
  • expression of URAT-1 was confirmed by PCR in cDNA obtained from VSMC.
  • RNA obtained from human umbilical vein epithelial cells (HUVEC) was PCR performed in the same manner as in Example 6.
  • lane M on the left and right ends shows a DNA ladder of lOObp
  • lane + K shows a sample using kidney cDNA
  • lane + Endo shows a sample using cDNA synthesized from HUVEC.
  • URAT-1 expression was confirmed by PCR in cDNA obtained from HUVEC.
  • FIG. Lane 0 in FIG. 16 shows the case where nothing was added to the VSMC. The result is shown.
  • GAPDH in FIG. 16 shows a positive control.
  • the present invention provides a new pharmaceutical composition for treatment, prevention, and treatment of various vascular disorders and hypertension caused by uric acid, and provides a new pharmaceutical composition. It has industrial utility.
  • the present invention also provides a method for screening an active ingredient for a new pharmaceutical composition for therapy, prevention and treatment, focusing on the function of URAT1, one of uric acid transporters. According to the method of the present invention, a new antihypertensive drug and a new drug having a protective action by inhibiting vascular degeneration can be developed, thereby increasing industrial applicability.
  • SEQ ID NO: 1 is a forward primer for detecting OAT1.
  • SEQ ID NO: 2 is a reverse primer for detecting OAT1.
  • SEQ ID NO: 3 is a forward primer for detecting OAT2.
  • SEQ ID NO: 4 is a reverse primer for detecting OAT2.
  • SEQ ID NO: 5 is a forward primer for detecting OAT3.
  • SEQ ID NO: 6 is a reverse primer for detecting OAT3.
  • SEQ ID NO: 7 is a forward primer for detecting RST1.
  • SEQ ID NO: 8 is a reverse primer for detecting RST1.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

　本発明は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸の取り込みに関与している輸送系を明らかにし、当該輸送系に関与する薬物を用いた新たな血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防、処置剤を提供する。また、本発明は、これらの輸送系を利用した血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防、処置剤のための新たなスクリーニング系を提供する。 　本発明は、尿酸トランスポーターＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物、及び製薬上許容される担体からなる、血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための医薬組成物に関する。また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込み量、細胞の増殖能、又は細胞の単球走化性因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。

Description

明 細 書
血管障害や高血圧症の治療 ·予防剤、及びそのスクリーニング方法 技術分野
[0001] 本発明は、 URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物、及び製 薬上許容される担体からなる、血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処 置のための医薬組成物に関する。また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存 在下において、 URAT1を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込み量、細胞 の増殖能、及び Z又は細胞の単球走化性因子の産生量を測定することからなる血 管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリー二 ングする方法に関する。
背景技術
[0002] 高尿酸血症 (血清中の尿酸濃度の上昇）は、高血圧症ゃ腎疾患や心臓血管障害 などど深く関連して ヽると考えられて 、た。尿酸値が高!ヽ人は心臓血管〖こ対するよく 知られて!/、る危険因子を有して 、たので、このような付帯徴候にぉ 、て両者に関連 性があると考えられていた。高血圧症ゃ腎疾患や心臓血管障害に対する危険因子 が尿酸と関連していることを明らかにするために、他の危険因子を対照とした多変量 解析などの疫学的研究が行われてきた。
本発明者らは、ォキソ酸 (oxonic acid)などのゥリカーゼ阻害剤を投与することにより ラットに温和な高尿酸血症を発症させるモデルを開発してきた。興味深いことに、これ らの高尿酸血症モデルラットは、高血圧、糸球体血管障害、及び腎障害を発症する（ 非特許文献 1一 6参照)。このメカニズムとしては、腎内部での結晶の析出が介在して V、るのではなぐむしろレニンアンジォテンシン系の活性ィ匕ゃ緻密斑 (遠位尿細管上 皮にある密に集合して、濃厚に染色される細胞群で、傍糸球体細胞に直接接する。 ) の一酸ィ匕窒素合成酵素の阻害が関連していると考えられた (非特許文献 1一 2参照） 。そして、本発明者らは、この血管障害が血圧とは独立して起こることを報告してきた (非特許文献 2参照)。
[0003] 高尿酸血症が血圧とは独立して血管障害を引き起こすことから、血管平滑筋の細 胞 (VSMC)における尿酸の作用が検討されてきた。レオらは、尿酸が血小板由来増 殖因子 (PDGF)の A鎖の発現を促進し、ラットの VSMCの細胞増殖を促進すること を報告してきた (非特許文献 7参照)。本発明者らは、さらにこの経路が、特異的なマ イトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）（ERK)、シクロォキシゲナー ゼ— 2 (COX— 2)、 PDGFの A鎖及び B鎖、並びに PDGF— α受容体 mRNAの発現 の活性ィ匕を包含していることを同定してきた (非特許文献 2— 4参照)。さらに、本発明 者らは、尿酸が VSMCにお 、て単球走ィヒ性因子 (MCP— 1)の発現を促進すること、 及び高尿酸血症が血管平滑筋を刺激して細胞増殖を促すこと、さらに炎症性サイト 力インの産生を引き起こすことを明らかにした (非特許文献 8参照)。
[0004] ここに大きな問題が生じた。それは、尿酸がどのようにして VSMCに入り込み、この ような現象を引き起こすかと 、うことである。尿酸の受容体は今まで知られて ヽな 、。 そして、尿酸は水溶性物質であるために、細胞膜を通過して平滑筋細胞の中に入る ためには、何らかの輸送担体の関与が不可欠である。
腎臓の細胞における研究により、尿酸トランスポーターは、有機ァ-オントランスポ 一ター Zエクスチェンジヤー（OATファミリー）及び電位感受性チャンネルの両者を 含むようなものであることが示されてきた (非特許文献 9一 11参照)。 OATファミリー のいくつかのもの、特に OAT1及び OAT3 (基底外側の膜を経由する）並びに URA T1 (管腔の膜を経由する）が、腎臓の細胞において尿酸塩の取り込みに介在してい ることが明らかにされてきた (非特許文献 12— 15参照)。電位感受性チャンネル Zト ランスポーターのメカニズムも示され、推定されるトランスポーター（UAT)も同定され た（非特許文献 16— 18参照）。し力し、ラットの VSMCにおいて、これらのチャンネル Zトランスポーターのどれが発現し、これらが機能して 、るのかどうかと 、うことにつ!ヽ ては、全く研究されていな力つた。 VSMCにおいて、どのような物質が尿酸の輸送担 体として機能して 、るのかと!/、うことは知られて 、なかった。
[0005] また、本発明者らは、ヒト腎臓細胞の mRNAを用いた 3'— RACE法により、新規ク ローン（URT1)を同定してきている。この尿酸トランスポーター URT1 (urate transporterl)は、尿酸およびその類似物質を細胞膜を介して一方より他方に輸送す る能力を有し、さらに細胞膜の他方の陰イオンを交換基質とする交換輸送体（ urate/ anion exchanger)であった (特許文献 1参照)。
本願の発明に関連する先行技術文献としては次のものがあり、これは参照して本明 細書中に取り込まれる。
特許文献 1：特開 2003— 93067号
非特許文献 l : Mazzali M, Hughes J, et al.， Hypertension, 2001; 38, 1101-1106 非特許文献 2 : Mazzali M, Kanellis J, et al.， Am. J. Physiol. Renal Physiol, 2002; 282, F991-997
非特許文献 3 :Watanabe S, Kang DH, et al, Hypertension, 2002; 40, 355-360 非特許文献 4 : Kang DH, Nakagawa T, et al., J. Am. Soc. Nephrol, 2002; 13, 2888-2897
非特許文献 5 : Nakagawa T, Mazzali M, et al" Am. J. Nephrol, 2003; 23, 2-7 非特許文献 6 : Sanchez- Lozada LG, Tapia E, et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol.,
2002; 283, F1105- F1110
非特許文献 7 : Rao GN, Corson MA, et al., J. Biol. Chem., 1991; 266, 8604-8608 非特許文献 8 : Kanellis J, Watanabe S, et al., Hypertension, 2003; 41, 1287-1293 非特許文献 9 : Roch- Ramel F, Guisan B, et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1997; 280, 839-845
非特許文献 10 : Roch- Ramel F, Werner D, et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol, 1994; 266, F797-F805.
非特許文献 l l : Knorr BA, Beck JC, et al., Kidney Int., 1994; 45, 727-736 非特許文献 12 : Sekine T, Cha SH, et al" Eur. J. Physiol, 2000; 440, 337-350 非特許文献 13 : Cha SH, Sekine T, et al" Mol. Pharmacol, 2001; 59, 1277-1286 非特許文献 14 : Kimura H, Chairoungdua A, et al., Nature, 2002; 417, 447-452 非特許文献 15 : Motohashi H, Sakurai Y, et al" J. Am. Soc. Nephrol, 2002; 13, 866-874
非特許文献 16 : Lea卜 Pinto E, Cohen BE, et al" J. Membrane. Biol, 1999; 169, 13-27
非特許文献 17 : Lea卜 Pinto E, Tao W, et al" J. Biol. Chem., 1997; 272, 617—625 非特許文献 18 : Lipkowitz MS, Leal-Pinto E, et al, J. Clin. Invest., 2001; 107, 1103-1115
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、血管平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸の取り込みのメカニズムを解明 し、尿酸の取り込みに関与している輸送系を明らかにすると共に、当該輸送系に関 与する薬物を用いた新たな血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防、処置剤を 提供することを目的としている。また、本発明は、これらの輸送系を利用した血管障害 や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防、処置剤のための新たなスクリーニング系を提供 することを目的としている。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、従来まで腎臓のみに発現していると考えられていた尿酸トランスポ 一ター URAT1が、血管平滑筋細胞にも発現していることを RNAレベル、およびタン パクレベルの両方にお 、て実験的に証明した。血液中の尿酸が平滑筋細胞へと移 動する際、 URAT1が同部における尿酸の輸送担体として重要な役割を果しており、 すなわち、腎臓近位尿細管の管腔側に存在し、尿酸の再吸収を行うことにより血中 尿酸レベルを制御するというこれまでの働きに加え、 URAT1は血管平滑筋細胞に お ヽても存在し、血中から平滑筋細胞への尿酸の移動に関与して 、ることが明らかと なり、この作用を通して高尿酸血症における高血圧や血管病変の病態形成に重要な 役割を果たしていることを明らかにした。このことは、血管障害や高血圧症ゃ腎障害、 より詳細には高尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療 や予防.処置に、 URAT1の阻害剤やブロッカーなどの URAT1の尿酸の取り込み 作用を阻害する作用を有する薬物が有効であることを明らかにした。また、これらの 高尿酸血症による血管病変の形成力 URAT1を介して行われることが明らかにされ たことから、 URAT1の遺伝子安定発現細胞系を用いることにより目標とする新しい 抗高血圧薬や血管変性阻害による血管保護作用を有する新薬の開発が可能となる
[0009] 本発明は、 URAT1の阻害剤やブロッカーなどの URAT1の尿酸の取り込み作用 を阻害する作用を有する薬物、及び製薬上許容される担体からなる、血管障害や高 血圧症ゃ腎障害、より詳細には高尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧 症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための医薬糸且成物に関する。
また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1の遺伝 子の安定発現細胞系などの URAT1を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込 み量を測定することからなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置 のための有効物質をスクリ一ユングする方法に関する。
また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1の遺伝 子の安定発現細胞系などの URAT1を発現して 、る細胞系を用いて、当該細胞の 増殖能を測定することからなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処 置のための有効物質をスクリ一ユングする方法に関する。
さらに、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1の遺 伝子の安定発現細胞系などの URAT1を発現して 、る細胞系を用いて、当該細胞 の単球走ィ匕性因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害 の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。
本発明者らは、まず血管平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸塩の取り込みを検討 した。
血管平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸塩の取り込みを、分極又は非分極条件下 で試験した。 VSMCにおける 20 Mの14 C 尿酸塩の取り込み量を、分極条件（HE PES 生理食塩水溶液）、又は非分極条件（lOOmM KC1取り込み溶液）のそれぞ れの取り込み溶液において、 120分間測定した。 "C 尿酸塩の取り込み量は、各時 間 (分)毎に測定した。測定結果は、 3個のゥエルの平均士標準偏差で示す。その結 果を図 1に示す。図 1の縦軸は14 C 尿酸塩の取り込み量 (CPM)を示し、横軸は時 間 (分)を示す。図 1中の白四角印（口）は非分極条件の場合を示し、黒菱形印（♦) は分極条件の場合を示す。図 1中のアスタリスク（* )は有意差 (pく 0. 05)があること を示す。この結果、尿酸塩はラット VSMCに急速に取り込まれ、非分極条件では約 1 5分で安定状態に達し、分極条件では約 30分で安定状態に達することがわかる。ま た、全ての点で、非分極条件のほうが取り込み量が多いことが分かる。この結果は、 V SMCが導電的な経路で尿酸塩を取り込んで 、ることを示して 、る。
[0011] さらに、生理学的条件 (分極条件)での尿酸塩の取り込みのメカニズムを検討した。
まず、 "C 尿酸塩の取り込みが、寒冷尿酸塩と競争するかどうかを検討した。 20 μ Μの14 C 尿酸塩を含有し、寒冷尿酸塩を含有しない場合、 0. 1、 1、 5、 10、及び 50 mgZdLの寒冷尿酸塩を含有する場合の、それぞれの取り込み溶液における、 37°C で 5分間の14 C 尿酸塩の取り込み量を測定した。測定結果は、 3個のゥエルの平均 士標準偏差で示す。この結果を図 2に示す。図 2はラット VSMCにおける14 C 尿酸 塩の取り込みにおける、寒冷尿酸塩との競合を試験した結果を示す。図 2の縦軸は、 寒冷尿酸塩が存在しない場合の14 C 尿酸塩の取り込み量を 100%としたときの、 14 C 尿酸塩の取り込み量の割合（％)を示す。横軸は寒冷尿酸塩の濃度 (mgZdL)を 示す。図 2中のアスタリスク（* )は有意差 (p < 0. 05)があることを示す。この結果、寒 冷尿酸塩の濃度が上昇するに応じて、 5分間での14 C 尿酸塩の取り込み力 効果的 に競合していることがわかった。これは、 VSMCにおける尿酸塩の取り込み力 少な くとも部分的に、輸送システムによって行なわれて 、ることを示して！/、る。
尿酸に対する特定の受容体は知られていない。したがって、尿酸の取り込みは何ら かのトランスポーターを介して行われて 、ると考えられる。尿酸のトランスポーターは、 腎臓において何種類か存在していることが、既に報告されている。それらは、電位感 受性の経路、及び有機ァ-オンの交換のにより介在されていることも報告されている (非特許文献 9一 1 1参照)。この取り込みが非分極細胞により多くなることから（図 1参 照）、電位感受性トランスポーターの存在が示されている。
[0012] 尿細管上皮細胞における尿酸塩の取り込みには、有機ァ-オン輸送システムを経 由する輸送が介在していることが証明されている。例えば、管腔の膜における URAT 1の介在 (非特許文献 13参照）や、基底外側の膜における OAT1及び OAT3の介 在 (非特許文献 14参照）が報告されている。これらのタンパク質を経由する輸送は、 プロべネシドやべンズブロマロンにより阻害することができる。
[0013] 有機ァ-オントランスポーターの存在を確認するために、ラット VSMCにおける14 C 尿酸塩の取り込みが、トランスポーターによる尿酸塩の取り込みの阻害剤であるプ 口べネシドやべンズブロマロンにより、その濃度依存的に阻害されるかどうかを試験し た。 20 Mの14 C 尿酸塩を含有し、阻害剤を含有しない場合、 0. 1、 0. 5、及び 1 mMのプロベネシドを含有する場合、又は 0. 5、 1、及び 10 Mのべンズブロマロン を含有する場合の、それぞれの取り込み溶液における、 37°Cで 5分間の14 C 尿酸塩 の取り込み量を測定した。測定結果は、 3個のゥエルの平均士標準偏差で示す。そ の結果を図 3及び図 4にそれぞれ示す。図 3はプロべネシドによる14 C 尿酸塩の取り 込みの阻害を示し、図 4はべンズブロマロンによる14 C 尿酸塩の取り込みの阻害を 示す。図 3及び図 4の縦軸は、プロべネシド（図 3)又はべンズブロマロン（図 4)が存 在しない場合の14 C 尿酸塩の取り込み量を 100%としたときの、 "C 尿酸塩の取り 込み量の割合（％)を示す。図 3の横軸はプロベネシドの濃度 (mM)を示し、図 4の横 軸はべンズブロマロンの濃度（ μ Μ)を示す。図 3及び図 4中のアスタリスク（ * )は有 意差 (Ρく 0. 05)があることを示す。
[0014] さらに、パラーアミノ馬尿酸塩 (ΡΑΗ)や乳酸塩などの有機ァ-オンの存在力 14C 尿酸塩の取り込みと競合するかどうかを試験した。 20 Mの14 C 尿酸塩を含有し、 有機ァ-オンを含有しない場合、 100、 250、及び 500 Mの PAHを含有する場合 、又は 100、 250及び 500 Mの乳酸塩を含有する場合の、それぞれの取り込み溶 液における、 37°Cで 5分間の14 C 尿酸塩の取り込み量を測定した。尿酸 (UA) 250 Mを含有する場合も併せて測定した。測定結果は、 3個のゥエルの平均士標準偏 差で示す。この結果を図 5及び図 6にそれぞれ示す。図 5は PAHによる14 C 尿酸塩 の取り込みの競合を示し、図 6は乳酸塩による14 C 尿酸塩の取り込みの競合を示す 。図 5及び図 6の縦軸は、 PAH (図 5)又は乳酸塩（図 6)が存在しない場合の14 C 尿 酸塩の取り込み量を 100%としたときの、 14c 尿酸塩の取り込み量の割合（％)を示 す。図 5の横軸は PAHの濃度 M)を示し、図 6の横軸は乳酸塩の濃度 M)を 示す。図 5及び図 6中のアスタリスク（* )は有意差 (pく 0. 05)があることを示す。 これらの結果は、 VSMCには、尿酸塩、乳酸塩や PAHに親和性を有する有機ァ- オントランスポーターが存在して 、ることを示して 、る。
[0015] このように、 VSMCにおける尿酸の取り込みは、有機ァ-オントランスポーター（OA T)ファミリーの阻害剤としてよく知られて 、るプロべネシド又はべンズブロマロンにより 濃度依存的に減少させられる。また、その取り込みは PAHの存在により阻害され、よ り弱くではあるが乳酸塩の存在により阻害される。したがって、 VSMCにおける尿酸 の輸送システムは、 PAHや乳酸塩などの基質に対する親和性を有するものであると 考えられる。タンパク質の細胞のように VSMCもまた、細胞外の液体に関しては電気 陰性である。この膜電位は、電位感受性トランスポーターにおける尿酸の移動に好都 合である。しかし、尿酸の取り込みにおける実際の電気化学的な原動力の程度は、 細胞内における尿酸の濃度が測定されて ヽな 、のでわ力 な 、。
[0016] 次に、有機ァ-オンの輸送の阻害剤が、 VSMCの増殖の応答を阻害するかどうか を検討した。 VSMCを 24時間培養したときの VSMCの増殖を、 3H—チミジンの取り 込み量により測定した。尿酸 (UA)が存在しない場合、尿酸 (UA)が 3mgZdL存在 する場合、尿酸 (UA) 3mgZdLにさらにプロベネシドが 0. 1、 0. 5、及び ImMそれ ぞれ存在する場合、並びに尿酸（UA) 3mgZdLにさらにべンズブロマロンが 0. 5、 1 、及び 10 Mそれぞれ存在する場合について、それぞれ測定した。併せて、プロべ ネシド又はべンズブロマロンが単独で存在する場合も測定した。測定結果は、 3個の ゥエルの平均士標準偏差 (CPM)で示す。この結果を、図 7 (プロベンシドの場合)及 び図 8 (ベンズブロマロンの場合）にそれぞれ示す。図 7及び図 8の縦軸は、 3H—チミ ジンの取り込み量 (CPM)を示し、横軸は尿酸及び各阻害剤の濃度を示す。図 7及 び図 8中の 2個のアスタリスク（ * * )はなにも存在しな 、とき (無刺激)の場合に対す る有意差 (Pく 0. 05)があることを示し、アスタリスク（* )は尿酸 3mgZdLが存在した 場合に対する有意差 (p< 0. 05)があることを示す。
図 7に示されるように、尿酸 (UA)はラット VSMCにおける3 H—チミジンの取り込み 量を増加させ、そしてこの尿酸による3 H—チミジンの取り込み量の増加は、プロベネ シドの存在により濃度依存的に阻害された。尿酸の非存在下における、プロべネシド 単独の存在では、細胞の増殖にほとんど影響を与えな力つた。同様のことは、ベンズ ブロマロンにっ 、ても観測された（図 8参照）。
[0017] 24時間培養における、有機ァ-オン輸送の阻害剤による細胞増殖の阻害率 (％)と 、 5分間における尿酸の取り込みの阻害率 (％)を比較した。各阻害率 (％)は、阻害 剤が無い場合を 100%とした。同じ濃度の阻害剤を使用した場合について、両者を プロットしたグラフを作成した。阻害剤がプロベネシドの場合の結果を図 9に示す。図 9の縦軸は VSMCの増殖阻害率（％)を示し、横軸は尿酸の取り込み阻害率（％)を 示す。この結果、両者に相関があることがわ力つた。その相関係数はプロベネシドの 場合は、 r=0. 95であり（図 9参照）、ベンズブロマロンの場合には r=0. 98であった
[0018] 本発明者らは、尿酸が MCP— 1の産生を誘導することを報告してきた (非特許文献 8参照）。 VSMCにおける MCP—1の産生を試験した。ラット VSMCを 24時間培養し たときの培養上澄液に出現する MCP— 1を ELISAで測定した。尿酸 (UA) 3mg/d Lが存在する場合、尿酸 3mgZdLに加えてプロべネシド ImMが存在する場合、及 びプロべネシドのみが存在する場合について、それぞれ測定した。この結果を図 10 に示す。図 10の縦軸は MCP— 1の量 (pgZlOOO細胞）であり、横軸はなにも存在し な 、場合 (No UA)、尿酸 3mgZdLが存在する場合 (UA)、尿酸 3mgZdLに加え てプロべネシド ImMが存在する場合（UA+Prob)、及びプロべネシドのみが存在 する場合（Prob)を、それぞれ示す。図 10中の 2個のアスタリスク（* * )は、コント口 ールに対する有意差 (p< 0. 05)があることを示す。この結果、尿酸による MCP—1 産生の増加は、阻害剤プロべネシドにより阻害されるが、阻害剤プロべネシド単独で は MCP-1産生を阻害しな 、ことがわかる。
これらの結果から、 VSMCにおける有機ァ-オン輸送システムを阻害することにより 、尿酸により誘導される増殖や MCP— 1の産生をブロックすることができることが示さ れた。プロべネシドやべンズブロマロンなどの阻害剤は、単独で腎臓において尿酸排 出剤として作用すると考えられていることから、これらの結果は注目される。しかし、こ れらの阻害剤は、 VSMCにおいては、尿酸の直接的な作用のブロッカーとなるという 、興味深い可能性が示されたことになる。
[0019] 次に、 RT— PCR法により、 VSMCにどのような有機ァ-オントランスポーターが存 在しているのかを検討した。ラットの VSMCの全 RNAを用いて、ラットの有機ァ-ォ ントランスポータ一一 1 (OAT1)、有機ァ-オントランスポータ一一 2 (OAT2)、有機ァ ユオントランスポータ一一 3 (OAT3)、及び尿酸ァ-オントランスポータ一一 1 (URAT -1)のラットのホモローグ (RST1)の部分配列をプライマーとして、 RT— PCRを行つ た。陽性コントロールとして、ラット腎臓及び肝臓細胞を用いた。 RT— PCR産物をェ チジゥムブロマイド染色した結果を図 11の A— Dに、図面に代わる写真で示す。図 1 1の Aは OAT1の場合の 434bpの PCR産物を示し、図 11の Bは OAT2の場合の 46 2bpの PCR産物を示し、図 11の Cは OAT3の場合の 483bpの PCR産物を示し、図 11の Dは RST1の場合の 460bpの PCR産物を示す。各図面の左端のレーンは、 10 Obpのラダー (インビトロジェン社製)を示し、その右側は順に、腎臓 (kidney)、肝臓（ liver)、及び VSMCをそれぞれ示す。
図 11の Aでは、腎臓のみに PCR産物が確認された。図 11の Bでは、 462bpの PC R産物のバンドが腎臓と肝臓のみに確認され、加えて 320bpのバンドが全てに見ら れるが、このバンドはブラストを用いた配列検索の結果、非特異的なものであった。図 11の Cでは腎臓と肝臓のみに PCR産物が確認された。図 11の Dでは、 460bpの PC R産物のバンドが腎臓のみに確認され、加えて 21 lbpのバンドが全てに見られるが、 このバンドは配列分析の結果、非特異的なものであった。この結果、 VSMCにおい ては、これらのトランスポーターの発現を確認することができな力つた。
[0020] 次に、電位感受性のチャンネル Zトランスポーターである UAT (ジーンバンク、ァク セッション番号： NM 012977)の発現を評価するために、 RNaseプロテクションアツ セィを行った。結果を図 12に図面に代わる写真で示す。図 12の左端のレーンはプロ ーブを示し、中の 4レーンは VSMCを示し、右端のレーンは肝臓を示す。この結果、 UATの mRNAがラットの VSMC及び肝臓で発現して!/、ることが示された。ハウスキ 一ビング遺伝子 L32の発現も同時に示された。なお、図 12において、プローブの大 きさが相違しているのは、このプローブがプローブ構築のためのポリリンカ一領域を 有しているためである。
[0021] 次に本発明者らは、ヒトの VSMCについて検討した。
RT— PCR (逆転写 PCR)による、ヒト大動脈由来の血管平滑筋細胞 (VSMC)にお ける尿酸トランスポーター URAT1の検出実験を行った。この結果を図 13に図面に 代わる写真で示す。図 13の左端及び右端のレーン Mは lOObpの DNAラダーを示し 、レーン +Kは腎臓の cDNAを用いたものを示し、レーン Kは腎臓の cDNAを用い なかったものを示している。また、レーン 0は VSMCに何も付カ卩しなかったものを示し 、レーン 3、 6、 9、及び 12はそれぞれ、 3mg/dl、 6mg/dl、 9mg/dl、 12mg/dl の各濃度の尿酸により VSMCを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、 VSMC力 得られた cD NAにおいて、 PCR法により URAT1の発現が認められた。
[0022] また、ヒト腎臓輸入細動脈由来 VSMCより得られた全 RNAを用いて、同様にして R T PCRを行った。この結果を図 14に図面に代わる写真で示す。図 14の左端及び 右端のレーン Mは lOObpの DNAラダーを示し、レーン +Kは腎臓の cDNAを用い たものを示し、レーン Kは腎臓の cDNAを用いなかったものを示している。また、レ ーン 0は VSMCに何も付カ卩しなかったものを示し、レーン 3、 6、 9、及び 12はそれぞ れ、 3mgZdl、 6mgZdl、 9mgZdl、 12mgZdlの各濃度の尿酸により VSMCを刺 激した時の結果を示して 、る。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、 VSMC力 得られた cD NAにおいて、 PCR法により URAT1の発現が認められた。
[0023] さらに、ヒト臍帯静脈上皮細胞 (HUVEC)より得られた全 RNAを用いて、同様にし て RT— PCRを行った。この結果を図 15に図面に代わる写真で示す。図 15の左端及 び右端のレーン Mは lOObpの DNAラダーを示し、レーン +Kは腎臓の cDNAを用 いたものを示し、レーン + Endoは HUVECから合成した cDNAを用いたものを示して いる。この結果、腎臓同様、 HUVEC力 得られた cDNAにおいても、 PCR法により URAT1の発現が認められた。
[0024] 次に、ヒト血管平滑筋細胞 (VSMC)をホモジナイズして得られた細胞溶解液を用 いて、抗 URAT1抗体により、ウェスタンブロット法を行った。この結果を図 16に図面 に代わる写真で示す。図 16のレーン 0は VSMCに何も付カ卩しなかったものを示し、レ ーン 3、 6、 9、及び 12はそれぞれ、 3mgZdl、 6mgZdl、 9mg/dl, 12mgZdlの各 濃度の尿酸により VSMCを刺激した時の結果を示している。図 16の GAPDHは陽 性コントロールを示す。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、 VSMC力 得られた細 胞溶解液において、抗 URAT1抗体により URAT1タンパク質が検出された。
[0025] これらの結果から、ラットの VSMCにおける尿酸の取り込みを介在するトランスポー ターを特定することはできなかった力 ヒトの VSMCにおける尿酸の取り込みに介在 するトランスポーターが URAT1であることが RT— PCRなどにより判明した。 OAT1や OAT3は、近位管（近位尿細管）の基底側にお!、て尿酸の取り込みに介在して!/、る ことが報告されており、 URAT1は、管腔側での尿酸の取り込みにおいて重要である ことが報告されている。また、高尿酸血症モデルラットは、塩感受性の高血圧症、糸 球体血管障害、及び腎障害を発症することが報告されており（非特許文献 1一 6参照 )、今回の結果はこれらの血管障害や高血圧症、とりわけ高尿酸血症によって誘導さ れる血管障害や高血圧症の治療や予防 *処置において URAT1の阻害剤やブロッ カーが有効であることが示されたことになる。特に、プロべネシドなどの尿酸排出剤は 、腎臓におけるこのような作用にカ卩えて、 VSMCにおいてはさらに他の作用を有して いることが示されたことになる。
[0026] このように、本発明は、血管平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸の取り込みが尿酸 トランスポーターの 1種である URAT1を介して行われていることを明らかにしたもの であり、血管平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸の取り込みにより血管障害や高血 圧症ゃ腎障害が発生する、特に高尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧 症ゃ腎障害が血管平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸の取り込みに起因していると いう近年の研究結果に基づけば、血管障害や高血圧症ゃ腎障害、より詳細には高 尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療や予防，処置に URAT1の阻害剤やブロッカーが有効であることを本発明が初めて明らかにしたので める。
[0027] したがって、本発明は、 URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬 物、及び製薬上許容される担体からなる、血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予 防又は処置のための医薬組成物を提供する。本発明の好ましい血管障害や高血圧 症ゃ腎障害としては、高尿酸血症によって誘導される疾患が挙げられるが、尿酸は プリンの最終分解産物として血中に存在しており、血中における尿酸の存在力 血管 平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸の取り込みに関与することから、これに限定され るものではない。また、本発明の医薬組成物は、予防剤として使用されることから、血 管保護剤としての医薬組成物を提供するものでもある。
また、本発明の URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物として は、 URAT1の拮抗剤、 URAT1の阻害剤、 URAT1のブロッカーなどの URAT1の 尿酸の取り込み量を、これらの物質の存在により減少させることができる作用を有す る物質であればよい。具体的には、例えば、プロべネシドやべンズブロマロンなどが 挙げられる。
[0028] 本発明の医薬組成物は、経口投与、又は非経口投与のいずれかにより投与される 。本発明の医薬組成物は、投与可能な形態に製剤化、例えば、錠剤、顆粒剤、液剤 、注射剤などの公知の製剤形態に製剤化される。製剤化にあたっては、公知の医薬 用添加剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、安定化剤などを適宜配合することができる。 本発明の医薬組成物における有効成分の有効投与量は、疾患の状態や患者の状 態により適宜判断されるが、通常は尿酸排出に十分な量が投与される。例えば、 1日 当たり: L gZkg— 50mgZkg程度の範囲で投与することもできる。
[0029] また、本発明は、血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置を必要とし ている患者に、 URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物の有効 量を投与することからなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害を治療、予防又は処置する 方法を提供するものである。
さらに、本発明は、 URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物の 、血管障害や高血圧症ゃ腎障害を治療、予防又は処置するための医薬組成物を製 造するための使用を提供する。
[0030] 本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1を発現してい る細胞系を用いて、尿酸の取り込み量を測定することからなる血管障害や高血圧症 ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法を提供 する。本発明の URAT1を発現している細胞系としては、腎臓の細胞や VSMCなど の天然の細胞であってもよ ヽが、 URAT1の遺伝子を導入した当該遺伝子の安定発 現細胞力もなるものであってもよい。本発明のこのスクリーニング方法としては、より具 体的には、例えば、 URAT1を発現している細胞系の尿酸取り込み溶液中に、被検 化合物を存在させたときの尿酸の取り込み量を測定することからなる血管障害や高 血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法 が挙げられる。本発明における尿酸の取り込み量の測定方法としては、例えば、放射 性同位元素で標識化された尿酸、例えば、 14c 尿酸を使用する方法などが挙げら れる。
この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であ つてもよい。
[0031] また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1を発現 している細胞系を用いて、当該細胞の増殖能を測定することからなる血管障害や高 血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法 を提供する。この方法における、 URAT1を発現している細胞系としては、尿酸又は 尿酸塩により細胞が増殖するものが好ましい。本発明のこのスクリーニング方法として は、より具体的には、例えば、 URAT1を発現している細胞系の尿酸取り込み溶液中 に、チミジン及び被検化合物を存在させたときのチミジンの取り込み量を測定すること からなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質を スクリーニングする方法が挙げられる。本発明におけるチミジンの取り込み量の測定 方法としては、例えば、放射性同位元素で標識ィ匕されたチミジン、例えば、 -チミ ジンを使用する方法などが挙げられる。
この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であ つてもよい。
[0032] さらに、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1を発 現している細胞系を用いて、当該細胞の単球走化性因子の産生量を測定することか らなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をス クリーニングする方法を提供する。この方法における、 URAT1を発現している細胞 系としては、尿酸又は尿酸塩により細胞が MCP— 1などの単球走ィ匕性因子を産生す るものが好ましい。本発明のこのスクリーニング方法としては、より具体的には、例え ば、 URAT1を発現している細胞系の尿酸取り込み溶液中に、被検化合物を存在さ せたときの MCP— 1などの単球走ィ匕性因子の産生量を測定することからなる血管障 害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニング する方法が挙げられる。本発明における MCP— 1などの単球走ィヒ性因子の産生量の 測定方法としては、例えば、 ELISA法などが挙げられる。 この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であ つてもよい。
[0033] また、本発明の医薬組成物の有効成分の活性は、例えば、自然発症高血圧モデ ルラット（SHR)などの高血圧発症モデル動物を使用して確認することもできる。 発明の効果
[0034] 本発明は、血管平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸の取り込みの条件、及びそのメ 力-ズムを初めて明らかにするものである。本発明によれば、血液中の尿酸が平滑 筋細胞へと移動する際、 URAT1が同部における尿酸の輸送担体として重要な役割 を果していることを明らかにし、 URAT1が血管平滑筋細胞においても存在し、血中 から平滑筋細胞への尿酸の移動に関与して 、ることが明らかにし、この作用を通して 高尿酸血症における高血圧や血管病変の病態形成に重要な役割を示していること を明らかにするものである。これにより、血管平滑筋細胞 (VSMC)の尿酸に起因す る作用に基づぐ各種の血管障害、各種の器官、例えば腎臓、肝臓などの器官の障 害、高血圧症などの疾患が、 URAT1を介した尿酸の取り込みであることが明らかに され、本発明により、 URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物、 及び製薬上許容される担体からなる、血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防 又は処置のための医薬組成物を提供することできた。
また、本発明によれば、被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1 の遺伝子の安定発現細胞系などの URAT1を発現している細胞系を用いて、尿酸の 取り込み量、細胞の増殖能、及び Z又は細胞の単球走化因子の産生量を測定する ことからなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物 質をスクリーニングするための新たな方法が提供される。本発明の方法によれば、新 しい抗高血圧薬や血管変性阻害による保護作用を有する新薬の開発が可能となる。 図面の簡単な説明
[0035] [図 1]図 1は、血管平滑筋細胞 (VSMC)における尿酸塩の取り込みを、分極又は非 分極条件下で試験した結果を示すグラフである。図 1の縦軸は14 C 尿酸塩の取り込 み量 (CPM)を示し、横軸は時間 (分)を示す。図 1中の白四角印（口）は非分極条件 の場合を示し、黒菱形印（♦)は分極条件の場合を示す。 [図 2]図 2は、ラット VSMCにおける14 C 尿酸塩の取り込みにおける、寒冷尿酸塩と の競合を試験した結果を示すグラフである。図 2の縦軸は、寒冷尿酸塩が存在しない 場合の14 C 尿酸塩の取り込み量を 100%としたときの、 "C 尿酸塩の取り込み量の 割合 (％)を示す。横軸は寒冷尿酸塩の濃度 (mgZdL)を示す。
[図 3]図 3は、ラット VSMCにおける、プロべネシドによる14 C-尿酸塩の取り込みの阻 害を試験した結果を示すグラフである。図 3の縦軸は、プロベネシドが存在しない場 合の14 C 尿酸塩の取り込み量を 100%としたときの、 "C 尿酸塩の取り込み量の割 合（％)を示し、横軸はプロベネシドの濃度 (mM)を示す。
[図 4]図 4は、ラット VSMCにおける、ベンズブロマロンによる14 C-尿酸塩の取り込み の阻害を試験した結果を示すグラフである。図 4の縦軸は、ベンズブロマロンが存在 しない場合の14 C 尿酸塩の取り込み量を 100%としたときの、 "C 尿酸塩の取り込 み量の割合（％)を示す。図 4の横軸はべンズブロマロンの濃度（ μ Μ)を示す。
[図 5]図 5は、ラット VSMCにおける、パラーアミノ馬尿酸塩 (PAH)〖こよる14 C 尿酸塩 の取り込みの競合を試験した結果を示すグラフである。図 5の縦軸は、 PAHが存在 しない場合の14 C 尿酸塩の取り込み量を 100%としたときの、 "C 尿酸塩の取り込 み量の割合（％)を示し、横軸は PAHの濃度（ μ Μ)を示す。
[図 6]図 6は、ラット VSMCにおける、乳酸塩による14 C 尿酸塩の取り込みの競合を 試験した結果を示すグラフである。図 6の縦軸は、乳酸塩が存在しない場合の14 C 尿酸塩の取り込み量を 100%としたときの、 14c 尿酸塩の取り込み量の割合（％)を 示し、横軸は乳酸塩の濃度（ μ Μ)を示す。
[図 7]図 7は、 VSMCを 24時間培養したときの VSMCの増殖を、 3H チミジンの取り 込み量により測定した結果を示すグラフである。図 7の縦軸は、 チミジンの取り込 み量 (CPM)を示し、横軸は尿酸が存在しな!、場合 (no UA)、尿酸が 3mgZdL存 在する場合 (UA)、尿酸 3mgZdLにさらにプロベネシドが 0. 1、 0. 5、及び ImMそ れぞれ存在する場合 (UA+0. 1等）、並びにプロベネシドが単独で存在する場合（ 1)を示す。
[図 8]図 8は、 VSMCを 24時間培養したときの VSMCの増殖を、 3H チミジンの取り 込み量により測定した結果を示すグラフである。図 8の縦軸は、 3H チミジンの取り込 み量 (CPM)を示し、横軸は尿酸が存在しな!、場合 (no UA)、尿酸が 3mgZdL存 在する場合（UA)、尿酸 3mgZdLにさらにべンズブロマロンが 0. 5、 1、及び 10 M それぞれ存在する場合 (UA+0. 5等）、並びにべンズブロマロンが単独で存在する 場合 (10)を示す。
[図 9]図 9は、 24時間培養における有機ァ-オン輸送のプロべネシドによる細胞増殖 の阻害率（％)と、 5分間における尿酸の取り込みのプロべネシドによる阻害率（％)を 比較した結果を示すグラフである。図 9の縦軸は VSMCの増殖阻害率（％)を示し、 横軸は尿酸の取り込み阻害率 (％)を示す。
[図 10]図 10は、ラット VSMCを 24時間培養したときの培養上澄液に出現する MCP— 1を ELISAで測定した結果を示すグラフである。図 10の縦軸は MCP— 1の量 (pg/ 1000細胞）を示し、横軸はなにも存在しな 、場合 (No UA)、尿酸 3mgZdLが存 在する場合 (UA)、尿酸 3mgZdLにカ卩えてプロべネシド ImMが存在する場合 (UA + Prob)、及びプロべネシドのみが存在する場合（Prob)を、それぞれ示す。
[図 11]図 11は、ラットの VSMCの全 RNAを用いて、ラットの有機ァ-オントランスポ ータ一一 1 (OAT1)、有機ァ-オントランスポータ一一 2 (OAT2)、有機ァ-オントラン スポータ一一 3 (OAT3)、及び尿酸ァ-オントランスポータ一一 1 (URAT1)の部分配 列をプライマーとして、 RT— PCRを行った結果の PCR産物をェチジゥムブロマイド染 色した結果を示す、図面に代わる写真である。陽性コントロールとして、ラット腎臓及 び肝臓細胞を用いた。図 11の Aは OAT1の場合を示し、図 11の Bは OAT2の場合 を示し、図 11の Cは OAT3の場合を示し、図 11の Dは URAT1の場合を、それぞれ 示す。各図面の左端のレーンは、 lOObpのラダー（インビトロジェン社製）を示し、そ の右側は順に、腎臓 (kidney)、肝臓 (liver)、及び VSMCをそれぞれ示す。
[図 12]図 12は、 UAT (ジーンバンク、ァクセッション番号： NM 012977)の発現を 評価するために、 RNaseプロテクションアツセィを行った結果を示す図面に代わる写 真である。図 12の左端のレーンはプローブを示し、中の 4レーンは VSMCを示し、右 端のレーンは肝臓を示す。
[図 13]図 13は、 RT— PCRによる、ヒト大動脈由来の血管平滑筋細胞 (VSMC)にお ける尿酸トランスポーター URAT— 1の検出結果を示した図面に代わる写真である。 [図 14]図 14は、 RT— PCRによる、ヒト腎臓輸入細動脈由来の平滑筋培養細胞 (VS MC)における尿酸トランスポーター URAT— 1の検出結果を示した図面に代わる写 真である。
[図 15]図 15は、 RT-PCRによる、ヒト臍帯静脈上皮細胞 (HUVEC)における尿酸ト ランスポーター URAT— 1の検出結果を示した図面に代わる写真である。
[図 16]図 16は、ウェスタンプロット法による、ヒト血管平滑筋細胞 (VSMC)における 尿酸トランスポーター URAT— 1の検出結果を示した図面に代わる写真である。
[0036] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によ り何ら限定されるものではない。
以下の実験で使用した血管平滑筋細胞 (VSMC)は、ラットの大動脈力 調製した (Zhang S, Yang Y, et al, Circulation., 2003; 107, 1539-44)。この細胞を、 10%子 牛胎児血清 (FBS)、 1%グルタミン、及び 1%ペニシリン Zストレプトマイシン溶液（1 00ユニット Zmlペニシリン、 100 μ gZmlストレプトマイシン； GIBCO)を含有するダ ルべッコの修飾をしたイーグル培地（DMEM, GIBCO)で培養した。 VSMCを 35m mの 6穴培養プレート（NUNC)に移し、湿式培養器（humidified tissue culture incubator)中で、 5%炭酸ガス 95%空気の雰囲気下で 37°Cで保存した。培地を 2 日毎に交換した。実験に用いた VSMCは、 5— 12世代のものであった。
[0037] なお、特願 2003— 384863明細書に記載された内容を、本明細書に全て取り込む 実施例 1
[0038] "C 尿酸塩の取り込み
VSMC (4 X 105細胞）を、 10%FBS— DMEMと共に 6穴培養プレートに移した。 1 日後に、血清の無い DMEM培地に終夜置いて成長を停止させた。各実験中は、細 胞及び全ての溶液を 37°Cに維持した。 VSMCを、 8—14 C 尿酸塩 (比活性は 50 C i/mmol；アメリカンラディオラべルドィ匕学社製 (セントルイス、 MO) )と共に培養し、 尿酸塩の最終濃度を 20 Mにし、種々の阻害剤の存在下又は非存在下で培養した 。取り込みの過程としては少し早いが、培養を 5分間で停止した。この結果を図 3及び 図 4に示す。 いくつかの実験では、放射性元素で標識ィ匕した尿酸塩の取り込み実験を、冷たい 尿酸塩、乳酸塩、パラーアミノ馬尿酸塩 (PAH)などの他の有機ァニオンの存在下、 又は有機ァ-オントランスポーター阻害剤（プロべネシド又はべンズブロマロン）の存 在下で行った。媒体 (media)を急速に吸い取ることにより、取り込みを停止させ、すぐ に氷冷した PBSで 3回洗浄した。急速に吸!、取られた培養溶液及び前記したように 洗浄された細胞の全値力 ブランクが差し引かれた。次いで、細胞を、 IN NaOH の lmlで 15分間で溶解した。細胞に蓄積された 8—14 C 尿酸塩の量を、 BCSシンチ レーシヨン溶液（アマ一シャム社製）の 5ml中へ 0. 5mlの細胞溶解液をカ卩えて測定し た。放射能を、溶液シンチレーシヨンカウンターで測定した。取り込み量は、全 cpmZ ゥエル、又は対照に対する百分率（％)で示される。この結果を図 2、図 5、及び図 6に 示す。
[0039] 他の実験では、尿酸塩の取り込みが電位感受性であるかどうかを決定するために、 尿酸の取り込み実験を分極化条件、又は非分極化条件で行った。実験条件は、分 極化、又は分極ィ匕されていない条件において培養溶液が相違している点を除き、前 記した条件と同様であった。詳細には、 12時間の飢餓状態の後、血清の無い培地を 取り除き、これに代えて、 140mM NaCl、 4mM KC1、 2mM CaCl及び ImM
2
MgCl、 5mM グルコース、並びに 16mM HEPES—トリス（pH 7. 4)を含有する
2
HEPES 生理食塩水溶液 (PSS) (この場合は、分極ィ匕用として）、又は 44mM Na
Cl、 lOOmM KC1、 2mM CaCl及び ImM MgCl、 5mM グルコース、並びに
2 2
16mM HEPES—トリス（pH 7. 4)を含有する lOOmM— KC1取り込み溶液（この場 合は、非分極ィ匕用として）の 0. 45mLを添カ卩した。
この結果を図 1に示す。
実施例 2
[0040] VSMCの増殖試験
VSMC (4 X 105細胞）を、 10%FBS— DMEMと共に 6穴培養プレートに移し、 24 時間培養した。次いで、 0. 5%FBS— DMEM中で 48時間、細胞を飢餓状態にした 。 DNA合成を測定するために、静止状態の VSMCに、 チミジンの 1 μ Ciを含む 3mgZdLの尿酸で 48時間刺激した。細胞を採取する 2時間前に、さらに 2 /z CiZm Lの3 H—チミジンを各ゥエルに添カ卩した。細胞を氷冷した PBSで 3回洗浄し、 lmLの IN NaOHで溶解した。細胞に取り込まれた3 H—チミジンの量を、 5mLのシンチレ ーシヨン溶液中へ 0. 5mlの細胞溶解液を加えて測定した。 CPMZゥエルで示され る3 H—チミジンの取り込み量は、溶液シンチレーシヨンカウンターで記録された。いく つかの実験では、種々の濃度のプロべネシド又はべンズブロマロン（有機ァ-オント ランスポーター阻害剤）の存在下で実験を行った。この結果を図 7及び図 8に示す。 同様の方法で、 VSMCの増殖を、有機ァ-オン (乳酸塩や PAH)を用いて評価し た。
実施例 3
[0041] MCP—1タンパク質についての ELISA。
24穴プレートに細胞を取り（5 X 104細胞 Zゥエル）を、 70%コンフルエンスの状態 になったときに血清を取り除いた。次いで、 ImMのプロベネシドの存在下、又は非存 在下に、 3mgZdLの尿酸を含有、又は含有していない培地を 24時間加えた。上澄 みの MCP— 1タンパク質を ELISA(OptEIA MCP—1セット、 BDファーミンゲン社） で計測し、細胞数で補正した。実験は各々 3回行った。この結果を、図 10に示す。 実施例 4
[0042] RT— PCRによる OATトランスポーターの検出。
RNeasy RNA精製キット（キアゲン社、バレンシア、 CA)を用いてラットの VSMC 力も全 RNAを調製した。オリゴテックス mRNA精製システム (キアゲン社)を用いてポ リ（A) +RNAを単離し、ワンステップ RT反応におけるランダムプライマーを用いて逆 転写した。クロンテック社 (パロアルト、 CA)カゝら販売されている腎臓及び肝臓のポリ（ A) +RNAを陽性コントロールとして使用した。陰性コントロール反応を、 DNAによる 汚染をテストするためにプライマーを添加する前に逆転写酵素の熱不活性ィ匕により 行った。以下のヌクレオチドセットを用いて PCR反応を行った。
[0043] OAT1：
784-810 5し CTGTGCAGCCTATGCACCCAACTATAC- 3 ' アンチセンス鎖の 1218-1190
5 '― CCTTTGCTTAGAGTCAGTTCCTTCTGCAG— 3 ' [0044] OAT2 :
642-672
5し CCATCAACTACATCATGTTCGTAGTCACCCG- 3'
アンチセンス鎖の 1105-1076
5 -GATATGTCGGAGCTGAGATGTTCGGAACAG-3'
[0045] OAT3 :
437-465 5 '-GAGACACCATTGTGATAGAGTGGGACTTG-3 ' アンチセンス鎖の 920-889
5 -GATAGAACCAGCCAGCGTATGGACTCTGGTAC-3'
[0046] RST1 (URAT— 1のマウスのホモローグ）：
377-405 5 -CATCTTATGCTTATCCGGGACAAGTCCTC-3' アンチセンス鎖の 768-739
5 ' - GAGTCTGTTGAAGAGGGTAGAGC AGTCTAC- 3 '
[0047] RT— PCR反応は、 Ready- To- Go RT- PCRビーズ（アマ一シャム社製）を用いて行 つた。最初の鎖の cDNA合成反応は、 pd (N) を用いて 42°Cで 15分間で行われた。
6
PCRは、 95°C、 5分間で最初の変性を行い、次いで 95°C、 30秒で変性し、 55°C、 3 0秒でァ-リーングさせ、 72°C、 1分間で伸長させるサイクルを 32サイクル行った。サ ンプルを 4°Cで保存した。この PCR産物を、 1. 5%のァガロースゲル上で電気泳動し 、ゲル中の適当な分子量のバンドを QIAquickゲル抽出キット（キアゲン社製）を用い て精製した。これらのバンドを、 TOPO TAクローユングベクター（インビトロジェン社 製）にサブクローンした。これらを制限酵素 EcoRIで消化して評価し、ダイターミネ一 ター法によるアプライドバイオシステムシークェンサ一（ABI3730)を用いて、その配 列を解析した。ポリ AmRNAが完全であるかどうかを確認するために、センスプライマ 一： 5し ACCCCCAATGTATCCGTTGT- 3'、アンチセンスプライマー：
5'- TACTCCTTGGAGGCCATGTA- 3'からなるプライマーの組み合わせを用いて G ADPH— mRNA法により試験した。この結果を図 11に示す。
実施例 5
[0048] RNaseプロテクションアツセィ（RPA)。 RNaseプロテクションアツセィ（RPA)を、 RPAsIキット（トレィピネスバイオラボ社、ヒ ユーストン、 TX)を用いて、 2— 4 gの RNAについて行った。ラット UAT (ジーンバ ンク、ァクセッション番号： NM 012977)の 5，末端力ら 325番目までの 325bp塩基 力もなるヌクレオチドを、 pcDNA— UAT— EGFPにサブクローンした。このプラスミド を BamHI及び EcoRIで消化し、これをプラスミド pBluescriptにライゲートし、このプ ラスミドを pBS— UAT— 325と命名した。このプラスミドを BamHIで消化して鎖状にし 、 a 32 P [UTP]の存在下で T7RNAポリメラーゼを用いてリボプローブ (RNAプロ ーブ)を合成した。
この結果を図 12に示す。
実施例 6
[0049] ヒト大動脈由来の血管平滑筋細胞 (VSMC)より得られた全 RNAを逆転写して cD NAを合成した。その cDNAを用いて、尿酸トランスポーター URAT— 1の部分配列 をプライマーとして用いて PCRを行った。
結果を図 13に示す。図 13の、左端及び右端のレーン Mは lOObpの DNAラダーを 示し、レーン +Kは腎臓の cDNAを用いたものを示し、レーン Kは腎臓の cDNAを 用いなかったものを示している。また、レーン 0は VSMCに何も付カ卩しなかったものを 示し、レーン 3、 6、 9、及び 12はそれぞれ、 3mg/dl、 6mg/dl、 9mg/dl、 12mg Zdlの各濃度の尿酸により VSMCを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、 VSMC力 得られた cD NAにおいて、 PCR法により URAT— 1の発現が認められた。
実施例 7
[0050] ヒト腎臓輸入細動脈由来 VSMCより得られた全 RNAを用いて、実施例 6と同様に して PCRを行った。
結果を図 14に示す。図 14の左端及び右端のレーン Mは lOObpの DNAラダーを 示し、レーン +Kは腎臓の cDNAを用いたものを示し、レーン Kは腎臓の cDNAを 用いなかったものを示している。また、レーン 0は VSMCに何も付カ卩しなかったものを 示し、レーン 3、 6、 9、及び 12はそれぞれ、 3mg/dl、 6mg/dl、 9mg/dl、 12mg Zdlの各濃度の尿酸により VSMCを刺激した時の結果を示している。 この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、 VSMC力 得られた cD NAにおいて、 PCR法により URAT— 1の発現が認められた。
実施例 8
[0051] ヒト臍帯静脈上皮細胞 (HUVEC)より得られた全 RNAを用いて、実施例 6と同様 にして PCRを行った。
結果を図 15に示す。図 15の左端及び右端のレーン Mは lOObpの DNAラダーを 示し、レーン +Kは腎臓の cDNAを用いたものを示し、レーン + Endoは HUVECか ら合成した cDNAを用いたものを示している。腎臓同様、 HUVEC力 得られた cD NAにおいても、 PCR法により URAT— 1の発現が認められた。
実施例 9
[0052] ヒト血管平滑筋細胞 (VSMC)をホモジナイズして得られた細胞溶解液を用いて、 抗 URAT— 1抗体により、ウェスタンブロット法を行った。陽性コントロールとして GAP DHを用いた。
結果を図 16に示す。図 16のレーン 0は VSMCに何も付カ卩しなかったものを示し、 レーン 3、 6、 9、及び 12はそれぞれ、 3mgZdl、 6mgZdl、 9mgZdl、 12mgZdlの 各濃度の尿酸により VSMCを刺激した時の結果を示している。図 16の GAPDHは 陽性コントロールを示す。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、 VSMC力 得られた細 胞溶解液において、抗 URAT— 1抗体により URAT— 1タンパクが検出された。 産業上の利用可能性
[0053] 本発明は、尿酸に起因する各種の血管障害や高血圧症に対する新たな治療、予 防、処置のための医薬組成物を提供するものであり、新たな医薬組成物を提供する ものとして産業上の利用性を有するものである。また、本発明は、尿酸トランスポータ 一の 1種である URAT1の機能に着目した新たな治療、予防、処置のための医薬組 成物のための有効成分をスクリーニングする方法を提供するものであり、本発明の方 法により、新しい抗高血圧薬や血管変性阻害による保護作用を有する新薬の開発が 可能となり、産業上の利用性をゆうするものである。
[0054] 配列表フリーテキスト 配列番号 1は、 OAT1検出用のフォーワードプライマーである。 配列番号 2は、 OAT1検出用のリバースプライマーである。 配列番号 3は、 OAT2検出用のフォーワードプライマーである。 配列番号 4は、 OAT2検出用のリバースプライマーである。 配列番号 5は、 OAT3検出用のフォーワードプライマーである。 配列番号 6は、 OAT3検出用のリバースプライマーである。 配列番号 7は、 RST1検出用のフォーワードプライマーである。 配列番号 8は、 RST1検出用のリバースプライマーである。

Claims

請求の範囲
[I] URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物、及び製薬上許容さ れる担体からなる、血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための 医薬組成物。
[2] 血管障害や高血圧症ゃ腎障害が、高尿酸血症によって誘導される疾患である請求 項 1に記載の医薬組成物。
[3] URAT1の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物力 URAT1の阻害 剤又はブロッカーである請求項 1又は 2に記載の医薬組成物。
[4] 血管障害や高血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための医薬組成物が、血 管保護剤である請求項 1一 3のいずれかに記載の医薬組成物。
[5] 被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1を発現している細胞系を 用いて、尿酸の取り込み量を測定することからなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害の 治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法。
[6] URAT1を発現している細胞系力 URAT1の遺伝子の安定発現細胞系である請 求項 4に記載の方法。
[7] URAT1を発現している細胞系の尿酸取り込み溶液中に、被検化合物を存在させ たときの尿酸の取り込み量を測定することからなる請求項 5又は 6に記載の方法。
[8] 被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1を発現している細胞系を 用いて、当該細胞の増殖能を測定することからなる血管障害や高血圧症ゃ腎障害の 治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法。
[9] 細胞の増殖能の測定が、チミジンの取り込み量を測定することからなる請求項 8に 記載の方法。
[10] 被検化合物の存在下、又は非存在下において、 URAT1を発現している細胞系を 用いて、当該細胞の単球走ィ匕性因子の産生量を測定することからなる血管障害や高 血圧症ゃ腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法
[II] 単球走ィ匕性因子力 MCP— 1である請求項 10に記載の方法。
PCT/JP2004/016761 2003-11-14 2004-11-11 血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法 WO2005046724A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04799622A EP1698348A4 (en) 2003-11-14 2004-11-11 CURATIVE OR PREVENTIVE REMEDY FOR VASCULAR DISORDERS AND HYPERTENSION AND SCREENING METHOD THEREOF
US10/579,173 US8236488B2 (en) 2003-11-14 2004-11-11 Method of screening for therapeutic compounds for vascular disorders and hypertension based on URAT1 activity modulation
JP2005515447A JP4660376B2 (ja) 2003-11-14 2004-11-11 血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-384863 2003-11-14
JP2003384863 2003-11-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005046724A1 true WO2005046724A1 (ja) 2005-05-26

Family

ID=34587338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/016761 WO2005046724A1 (ja) 2003-11-14 2004-11-11 血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8236488B2 (ja)
EP (1) EP1698348A4 (ja)
JP (1) JP4660376B2 (ja)
WO (1) WO2005046724A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009294057A (ja) * 2008-06-04 2009-12-17 J-Pharma Co Ltd 腎臓尿酸トランスポーター
WO2015098474A1 (ja) * 2013-12-24 2015-07-02 亀田製菓株式会社 米タンパク質を有効成分とする血清尿酸低下剤
JPWO2016108282A1 (ja) * 2014-12-29 2017-10-19 日本ケミファ株式会社 Ｕｒａｔ１阻害剤

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2217577T3 (pl) 2007-11-27 2015-01-30 Ardea Biosciences Inc Nowe związki, kompozycje i sposoby stosowania
US8242154B2 (en) 2008-09-04 2012-08-14 Ardea Biosciences, Inc. Compounds, compositions and methods of using same for modulating uric acid levels
CN115029351B (zh) * 2022-06-29 2023-12-08 江南大学 一种shRNA或BACH1缺失巨噬细胞来源的EVs在制备治疗高血压的药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000210A2 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Merck & Co., Inc. Use of agents capable of reducing uric acid levels for the treatment of cardiovascular disease
JP2003093067A (ja) * 2001-09-21 2003-04-02 Hitoshi Endo 腎臓及び胎盤型尿酸トランスポーターとその遺伝子

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2555609A1 (de) * 1975-12-10 1977-06-30 Henning Berlin Gmbh Pharmazeutisches praeparat zur therapie der hyperurikaemie
JP2003094067A (ja) 2001-09-21 2003-04-02 Yukie Matsuo 高架水槽、給水塔の自動維持装置の製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000210A2 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Merck & Co., Inc. Use of agents capable of reducing uric acid levels for the treatment of cardiovascular disease
JP2003093067A (ja) * 2001-09-21 2003-04-02 Hitoshi Endo 腎臓及び胎盤型尿酸トランスポーターとその遺伝子

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMONOTO A. ET AL.: "Nyosan transporter to jinsei teinyosan kessho", THE JAPANSES JOURNAL OF CLINICAL PATHOLOGY, vol. 51, no. 9, 20 September 2003 (2003-09-20), pages 892 - 897, XP002989330 *
ENDO H. ET AL.: "Transporter to shikkan", PHARMACIA, vol. 39, no. 5, 1 May 2003 (2003-05-01), pages 431 - 435, XP002989331 *
ENOMOTO A. ET AL.: "Molecular identification of a renal urate-anion exchanger that regulates blood urate levels", NATURE, vol. 417, no. 6887, 23 May 2002 (2002-05-23), pages 447 - 452, XP002314925 *
See also references of EP1698348A4 *
YOKOYAMA H. ET AL.: "Nyosan transporter to toppatsusei jinsei teinyosan kessho", MOLECULAR MEDICINE, vol. 40, no. 7, 25 June 2003 (2003-06-25), pages 762 - 767, XP002989329 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009294057A (ja) * 2008-06-04 2009-12-17 J-Pharma Co Ltd 腎臓尿酸トランスポーター
WO2015098474A1 (ja) * 2013-12-24 2015-07-02 亀田製菓株式会社 米タンパク質を有効成分とする血清尿酸低下剤
JPWO2016108282A1 (ja) * 2014-12-29 2017-10-19 日本ケミファ株式会社 Ｕｒａｔ１阻害剤

Also Published As

Publication number Publication date
EP1698348A1 (en) 2006-09-06
US8236488B2 (en) 2012-08-07
JPWO2005046724A1 (ja) 2007-11-29
JP4660376B2 (ja) 2011-03-30
US20090312415A1 (en) 2009-12-17
EP1698348A4 (en) 2008-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dubocovich et al. Selective MT2 melatonin receptor antagonists block melatonin‐mediated phase advances of circadian rhythms
Cheng et al. Expression of organic anion transporter 2 in the human kidney and its potential role in the tubular secretion of guanine-containing antiviral drugs
US8183225B2 (en) Inhibition of bone resorption using medical implants containing adenosine receptor antagonists
Rossi et al. Hepatic G i signaling regulates whole-body glucose homeostasis
EP2217223A2 (en) Methods and compositions for measuring wnt activation and for treating wnt-related cancers
CN108272782A (zh) 用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病
WO2012061537A2 (en) Methods for treating hair loss disorders
Chi et al. Safety, tolerability, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of fimasartan following single and repeated oral administration in the fasted and fed states in healthy subjects
MX2012009318A (es) Metodos y compuestos para el crecimiento muscular.
WO2020234781A1 (en) Methods of treating sjögren&#39;s syndrome using a bruton&#39;s tyrosine kinase inhibitor
Cui et al. HSF1-dependent autophagy activation contributes to the survival of melanocytes under oxidative stress in vitiligo
WO2005046724A1 (ja) 血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法
CA2985791A1 (en) Macropinocytosis in cancer
WO2019246317A9 (en) Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
SG194909A1 (en) Compounds and methods for treating insulin resistance syndrome
US20140378388A1 (en) Treatment of uterine leiomyomata
JP5665739B2 (ja) 炎症性疾患を治療するためのｃｄ９５インヒビターの使用
CA3174740A1 (en) Axl inhibitors for antiviral therapy
WO2024135719A1 (ja) ＰＧＡＭ－Ｃｈｋ１結合阻害剤を含む肺疾患、肝疾患又は腎疾患の治療剤
EP4098263A1 (en) Treatment for chondrodystrophia
Fakih et al. Activated factor X stimulates atrial endothelial cells and tissues to promote remodelling responses through AT1R/NADPH oxidases/SGLT1/2
WO2015028673A1 (en) Cav3 CHANNEL BLOCKING AGENT FOR PAIN TREATMENT
Guo et al. Calcitriol ameliorates the progression of hepatic fibrosis through autophagy-related gene 16-like 1-mediated autophagy
Jiao et al. Functional cross-talk between cAMP and ERK1/2 pathway promotes proliferation of somatotropinomas in a B-Raf and C-Raf dependent manner
KR20200112069A (ko) 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Ｊｍｊｄ２ｂ 억제제의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005515447

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004799622

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004799622

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10579173

Country of ref document: US