JP4660376B2 - 血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

血管障害や高血圧症の治療・予防剤、及びそのスクリーニング方法 Download PDF

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Description

本発明は、ＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物、及び製薬上許容される担体からなる、血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための医薬組成物に関する。また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込み量、細胞の増殖能、及び／又は細胞の単球走化性因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。
高尿酸血症（血清中の尿酸濃度の上昇）は、高血圧症や腎疾患や心臓血管障害などと深く関連していると考えられていた。尿酸値が高い人は心臓血管に対するよく知られている危険因子を有していたので、このような付帯徴候において両者に関連性があると考えられていた。高血圧症や腎疾患や心臓血管障害に対する危険因子が尿酸と関連していることを明らかにするために、他の危険因子を対照とした多変量解析などの疫学的研究が行われてきた。
本発明者らは、オキソ酸（ｏｘｏｎｉｃ ａｃｉｄ）などのウリカーゼ阻害剤を投与することによりラットに温和な高尿酸血症を発症させるモデルを開発してきた。興味深いことに、これらの高尿酸血症モデルラットは、高血圧、糸球体血管障害、及び腎障害を発症する（非特許文献１〜６参照）。このメカニズムとしては、腎内部での結晶の析出が介在しているのではなく、むしろレニンアンジオテンシン系の活性化や緻密斑（遠位尿細管上皮にある密に集合して、濃厚に染色される細胞群で、傍糸球体細胞に直接接する。）の一酸化窒素合成酵素の阻害が関連していると考えられた（非特許文献１〜２参照）。そして、本発明者らは、この血管障害が血圧とは独立して起こることを報告してきた（非特許文献２参照）。
高尿酸血症が血圧とは独立して血管障害を引き起こすことから、血管平滑筋の細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸の作用が検討されてきた。レオらは、尿酸が血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のＡ鎖の発現を促進し、ラットのＶＳＭＣの細胞増殖を促進することを報告してきた（非特許文献７参照）。本発明者らは、さらにこの経路が、特異的なマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）（ＥＲＫ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、ＰＤＧＦのＡ鎖及びＢ鎖、並びにＰＤＧＦ−α受容体ｍＲＮＡの発現の活性化を包含していることを同定してきた（非特許文献２〜４参照）。さらに、本発明者らは、尿酸がＶＳＭＣにおいて単球走化性因子（ＭＣＰ−１）の発現を促進すること、及び高尿酸血症が血管平滑筋を刺激して細胞増殖を促すこと、さらに炎症性サイトカインの産生を引き起こすことを明らかにした（非特許文献８参照）。
ここに大きな問題が生じた。それは、尿酸がどのようにしてＶＳＭＣに入り込み、このような現象を引き起こすかということである。尿酸の受容体は今まで知られていない。そして、尿酸は水溶性物質であるために、細胞膜を通過して平滑筋細胞の中に入るためには、何らかの輸送担体の関与が不可欠である。
腎臓の細胞における研究により、尿酸トランスポーターは、有機アニオントランスポーター／エクスチェンジャー（ＯＡＴファミリー）及び電位感受性チャンネルの両者を含むようなものであることが示されてきた（非特許文献９〜１１参照）。ＯＡＴファミリーのいくつかのもの、特にＯＡＴ１及びＯＡＴ３（基底外側の膜を経由する）並びにＵＲＡＴ１（管腔の膜を経由する）が、腎臓の細胞において尿酸塩の取り込みに介在していることが明らかにされてきた（非特許文献１２〜１５参照）。電位感受性チャンネル／トランスポーターのメカニズムも示され、推定されるトランスポーター（ＵＡＴ）も同定された（非特許文献１６〜１８参照）。しかし、ラットのＶＳＭＣにおいて、これらのチャンネル／トランスポーターのどれが発現し、これらが機能しているのかどうかということについては、全く研究されていなかった。ＶＳＭＣにおいて、どのような物質が尿酸の輸送担体として機能しているのかということは知られていなかった。
また、本発明者らは、ヒト腎臓細胞のｍＲＮＡを用いた３’−ＲＡＣＥ法により、新規クローン（ＵＲＴ１）を同定してきている。この尿酸トランスポーターＵＲＴ１（ｕｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）は、尿酸およびその類似物質を細胞膜を介して一方より他方に輸送する能力を有し、さらに細胞膜の他方の陰イオンを交換基質とする交換輸送体（ｕｒａｔｅ／ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）であった（特許文献１参照）。
本願の発明に関連する先行技術文献としては次のものがあり、これは参照して本明細書中に取り込まれる。
特開２００３−９３０６７号 Ｍａｚｚａｌｉ Ｍ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２００１；３８，１１０１−１１０６ Ｍａｚｚａｌｉ Ｍ，Ｋａｎｅｌｌｉｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００２；２８２，Ｆ９９１−９９７ Ｗａｔａｎａｂｅ Ｓ，Ｋａｎｇ ＤＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２００２；４０，３５５−３６０ Ｋａｎｇ ＤＨ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２００２；１３，２８８８−２８９７ Ｎａｋａｇａｗａ Ｔ，Ｍａｚｚａｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２００３；２３，２−７ Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｌｏｚａｄａ ＬＧ，Ｔａｐｉａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００２；２８３，Ｆ１１０５−Ｆ１１１０ Ｒａｏ ＧＮ，Ｃｏｒｓｏｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１；２６６，８６０４−８６０８ Ｋａｎｅｌｌｉｓ Ｊ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２００３；４１，１２８７−１２９３ Ｒｏｃｈ−Ｒａｍｅｌ Ｆ，Ｇｕｉｓａｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９７；２８０，８３９−８４５ Ｒｏｃｈ−Ｒａｍｅｌ Ｆ，Ｗｅｒｎｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９４；２６６，Ｆ７９７−Ｆ８０５． Ｋｎｏｒｒ ＢＡ，Ｂｅｃｋ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，１９９４；４５，７２７−７３６ Ｓｅｋｉｎｅ Ｔ，Ｃｈａ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０００；４４０，３３７−３５０ Ｃｈａ ＳＨ，Ｓｅｋｉｎｅ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００１；５９，１２７７−１２８６ Ｋｉｍｕｒａ Ｈ，Ｃｈａｉｒｏｕｎｇｄｕａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２；４１７，４４７−４５２ Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ Ｈ，Ｓａｋｕｒａｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２００２；１３，８６６−８７４ Ｌｅａｌ−Ｐｉｎｔｏ Ｅ，Ｃｏｈｅｎ ＢＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｂｉｏｌ．，１９９９；１６９，１３−２７ Ｌｅａｌ−Ｐｉｎｔｏ Ｅ，Ｔａｏ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７；２７２，６１７−６２５ Ｌｉｐｋｏｗｉｔｚ ＭＳ，Ｌｅａｌ−Ｐｉｎｔｏ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００１；１０７，１１０３−１１１５
本発明は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸の取り込みのメカニズムを解明し、尿酸の取り込みに関与している輸送系を明らかにすると共に、当該輸送系に関与する薬物を用いた新たな血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防、処置剤を提供することを目的としている。また、本発明は、これらの輸送系を利用した血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防、処置剤のための新たなスクリーニング系を提供することを目的としている。
本発明者らは、従来まで腎臓のみに発現していると考えられていた尿酸トランスポーターＵＲＡＴ１が、血管平滑筋細胞にも発現していることをＲＮＡレベル、およびタンパクレベルの両方において実験的に証明した。血液中の尿酸が平滑筋細胞へと移動する際、ＵＲＡＴ１が同部における尿酸の輸送担体として重要な役割を果しており、すなわち、腎臓近位尿細管の管腔側に存在し、尿酸の再吸収を行うことにより血中尿酸レベルを制御するというこれまでの働きに加え、ＵＲＡＴ１は血管平滑筋細胞においても存在し、血中から平滑筋細胞への尿酸の移動に関与していることが明らかとなり、この作用を通して高尿酸血症における高血圧や血管病変の病態形成に重要な役割を果たしていることを明らかにした。このことは、血管障害や高血圧症や腎障害、より詳細には高尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧症や腎障害の治療や予防・処置に、ＵＲＡＴ１の阻害剤やブロッカーなどのＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物が有効であることを明らかにした。また、これらの高尿酸血症による血管病変の形成が、ＵＲＡＴ１を介して行われることが明らかにされたことから、ＵＲＡＴ１の遺伝子安定発現細胞系を用いることにより目標とする新しい抗高血圧薬や血管変性阻害による血管保護作用を有する新薬の開発が可能となる。
本発明は、ＵＲＡＴ１の阻害剤やブロッカーなどのＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物、及び製薬上許容される担体からなる、血管障害や高血圧症や腎障害、より詳細には高尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための医薬組成物に関する。
また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１の遺伝子の安定発現細胞系などのＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込み量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１の遺伝子の安定発現細胞系などのＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、当該細胞の増殖能を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。
さらに、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１の遺伝子の安定発現細胞系などのＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、当該細胞の単球走化性因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法に関する。
本発明者らは、まず血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸塩の取り込みを検討した。
血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸塩の取り込みを、分極又は非分極条件下で試験した。ＶＳＭＣにおける２０μＭの１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を、分極条件（ＨＥＰＥＳ−生理食塩水溶液）、又は非分極条件（１００ｍＭ ＫＣｌ取り込み溶液）のそれぞれの取り込み溶液において、１２０分間測定した。１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量は、各時間（分）毎に測定した。測定結果は、３個のウエルの平均±標準偏差で示す。その結果を図１に示す。図１の縦軸は１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量（ＣＰＭ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１中の白四角印（□）は非分極条件の場合を示し、黒菱形印（◆）は分極条件の場合を示す。図１中のアスタリスク（＊）は有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。この結果、尿酸塩はラットＶＳＭＣに急速に取り込まれ、非分極条件では約１５分で安定状態に達し、分極条件では約３０分で安定状態に達することがわかる。また、全ての点で、非分極条件のほうが取り込み量が多いことが分かる。この結果は、ＶＳＭＣが導電的な経路で尿酸塩を取り込んでいることを示している。
さらに、生理学的条件（分極条件）での尿酸塩の取り込みのメカニズムを検討した。まず、１４Ｃ−尿酸塩の取り込みが、寒冷尿酸塩と競争するかどうかを検討した。２０μＭの１４Ｃ−尿酸塩を含有し、寒冷尿酸塩を含有しない場合、０．１、１、５、１０、及び５０ｍｇ／ｄＬの寒冷尿酸塩を含有する場合の、それぞれの取り込み溶液における、３７℃で５分間の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を測定した。測定結果は、３個のウエルの平均±標準偏差で示す。この結果を図２に示す。図２はラットＶＳＭＣにおける１４Ｃ−尿酸塩の取り込みにおける、寒冷尿酸塩との競合を試験した結果を示す。図２の縦軸は、寒冷尿酸塩が存在しない場合の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を１００％としたときの、１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量の割合（％）を示す。横軸は寒冷尿酸塩の濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。図２中のアスタリスク（＊）は有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。この結果、寒冷尿酸塩の濃度が上昇するに応じて、５分間での１４Ｃ−尿酸塩の取り込みが、効果的に競合していることがわかった。これは、ＶＳＭＣにおける尿酸塩の取り込みが、少なくとも部分的に、輸送システムによって行なわれていることを示している。
尿酸に対する特定の受容体は知られていない。したがって、尿酸の取り込みは何らかのトランスポーターを介して行われていると考えられる。尿酸のトランスポーターは、腎臓において何種類か存在していることが、既に報告されている。それらは、電位感受性の経路、及び有機アニオンの交換のにより介在されていることも報告されている（非特許文献９〜１１参照）。この取り込みが非分極細胞により多くなることから（図１参照）、電位感受性トランスポーターの存在が示されている。
尿細管上皮細胞における尿酸塩の取り込みには、有機アニオン輸送システムを経由する輸送が介在していることが証明されている。例えば、管腔の膜におけるＵＲＡＴ１の介在（非特許文献１３参照）や、基底外側の膜におけるＯＡＴ１及びＯＡＴ３の介在（非特許文献１４参照）が報告されている。これらのタンパク質を経由する輸送は、プロベネシドやベンズブロマロンにより阻害することができる。
有機アニオントランスポーターの存在を確認するために、ラットＶＳＭＣにおける１４Ｃ−尿酸塩の取り込みが、トランスポーターによる尿酸塩の取り込みの阻害剤であるプロベネシドやベンズブロマロンにより、その濃度依存的に阻害されるかどうかを試験した。２０μＭの１４Ｃ−尿酸塩を含有し、阻害剤を含有しない場合、０．１、０．５、及び１ｍＭのプロベネシドを含有する場合、又は０．５、１、及び１０μＭのベンズブロマロンを含有する場合の、それぞれの取り込み溶液における、３７℃で５分間の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を測定した。測定結果は、３個のウエルの平均±標準偏差で示す。その結果を図３及び図４にそれぞれ示す。図３はプロベネシドによる１４Ｃ−尿酸塩の取り込みの阻害を示し、図４はベンズブロマロンによる１４Ｃ−尿酸塩の取り込みの阻害を示す。図３及び図４の縦軸は、プロベネシド（図３）又はベンズブロマロン（図４）が存在しない場合の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を１００％としたときの、１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量の割合（％）を示す。図３の横軸はプロベネシドの濃度（ｍＭ）を示し、図４の横軸はベンズブロマロンの濃度（μＭ）を示す。図３及び図４中のアスタリスク（＊）は有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
さらに、パラ−アミノ馬尿酸塩（ＰＡＨ）や乳酸塩などの有機アニオンの存在が、１４Ｃ−尿酸塩の取り込みと競合するかどうかを試験した。２０μＭの１４Ｃ−尿酸塩を含有し、有機アニオンを含有しない場合、１００、２５０、及び５００μＭのＰＡＨを含有する場合、又は１００、２５０及び５００μＭの乳酸塩を含有する場合の、それぞれの取り込み溶液における、３７℃で５分間の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を測定した。尿酸（ＵＡ）２５０μＭを含有する場合も併せて測定した。測定結果は、３個のウエルの平均±標準偏差で示す。この結果を図５及び図６にそれぞれ示す。図５はＰＡＨによる１４Ｃ−尿酸塩の取り込みの競合を示し、図６は乳酸塩による１４Ｃ−尿酸塩の取り込みの競合を示す。図５及び図６の縦軸は、ＰＡＨ（図５）又は乳酸塩（図６）が存在しない場合の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を１００％としたときの、１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量の割合（％）を示す。図５の横軸はＰＡＨの濃度（μＭ）を示し、図６の横軸は乳酸塩の濃度（μＭ）を示す。図５及び図６中のアスタリスク（＊）は有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
これらの結果は、ＶＳＭＣには、尿酸塩、乳酸塩やＰＡＨに親和性を有する有機アニオントランスポーターが存在していることを示している。
このように、ＶＳＭＣにおける尿酸の取り込みは、有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）ファミリーの阻害剤としてよく知られているプロベネシド又はベンズブロマロンにより濃度依存的に減少させられる。また、その取り込みはＰＡＨの存在により阻害され、より弱くではあるが乳酸塩の存在により阻害される。したがって、ＶＳＭＣにおける尿酸の輸送システムは、ＰＡＨや乳酸塩などの基質に対する親和性を有するものであると考えられる。タンパク質の細胞のようにＶＳＭＣもまた、細胞外の液体に関しては電気陰性である。この膜電位は、電位感受性トランスポーターにおける尿酸の移動に好都合である。しかし、尿酸の取り込みにおける実際の電気化学的な原動力の程度は、細胞内における尿酸の濃度が測定されていないのでわからない。
次に、有機アニオンの輸送の阻害剤が、ＶＳＭＣの増殖の応答を阻害するかどうかを検討した。ＶＳＭＣを２４時間培養したときのＶＳＭＣの増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込み量により測定した。尿酸（ＵＡ）が存在しない場合、尿酸（ＵＡ）が３ｍｇ／ｄＬ存在する場合、尿酸（ＵＡ）３ｍｇ／ｄＬにさらにプロベネシドが０．１、０．５、及び１ｍＭそれぞれ存在する場合、並びに尿酸（ＵＡ）３ｍｇ／ｄＬにさらにベンズブロマロンが０．５、１、及び１０μＭそれぞれ存在する場合について、それぞれ測定した。併せて、プロベネシド又はベンズブロマロンが単独で存在する場合も測定した。測定結果は、３個のウエルの平均±標準偏差（ＣＰＭ）で示す。この結果を、図７（プロベンシドの場合）及び図８（ベンズブロマロンの場合）にそれぞれ示す。図７及び図８の縦軸は、３Ｈ−チミジンの取り込み量（ＣＰＭ）を示し、横軸は尿酸及び各阻害剤の濃度を示す。図７及び図８中の２個のアスタリスク（＊＊）はなにも存在しないとき（無刺激）の場合に対する有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、アスタリスク（＊）は尿酸３ｍｇ／ｄＬが存在した場合に対する有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
図７に示されるように、尿酸（ＵＡ）はラットＶＳＭＣにおける３Ｈ−チミジンの取り込み量を増加させ、そしてこの尿酸による３Ｈ−チミジンの取り込み量の増加は、プロベネシドの存在により濃度依存的に阻害された。尿酸の非存在下における、プロベネシド単独の存在では、細胞の増殖にほとんど影響を与えなかった。同様のことは、ベンズブロマロンについても観測された（図８参照）。
２４時間培養における、有機アニオン輸送の阻害剤による細胞増殖の阻害率（％）と、５分間における尿酸の取り込みの阻害率（％）を比較した。各阻害率（％）は、阻害剤が無い場合を１００％とした。同じ濃度の阻害剤を使用した場合について、両者をプロットしたグラフを作成した。阻害剤がプロベネシドの場合の結果を図９に示す。図９の縦軸はＶＳＭＣの増殖阻害率（％）を示し、横軸は尿酸の取り込み阻害率（％）を示す。この結果、両者に相関があることがわかった。その相関係数はプロベネシドの場合は、ｒ＝０．９５であり（図９参照）、ベンズブロマロンの場合にはｒ＝０．９８であった。
本発明者らは、尿酸がＭＣＰ−１の産生を誘導することを報告してきた（非特許文献８参照）。ＶＳＭＣにおけるＭＣＰ−１の産生を試験した。ラットＶＳＭＣを２４時間培養したときの培養上澄液に出現するＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡで測定した。尿酸（ＵＡ）３ｍｇ／ｄＬが存在する場合、尿酸３ｍｇ／ｄＬに加えてプロベネシド１ｍＭが存在する場合、及びプロベネシドのみが存在する場合について、それぞれ測定した。この結果を図１０に示す。図１０の縦軸はＭＣＰ−１の量（ｐｇ／１０００細胞）であり、横軸はなにも存在しない場合（Ｎｏ ＵＡ）、尿酸３ｍｇ／ｄＬが存在する場合（ＵＡ）、尿酸３ｍｇ／ｄＬに加えてプロベネシド１ｍＭが存在する場合（ＵＡ＋Ｐｒｏｂ）、及びプロベネシドのみが存在する場合（Ｐｒｏｂ）を、それぞれ示す。図１０中の２個のアスタリスク（＊＊）は、コントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。この結果、尿酸によるＭＣＰ−１産生の増加は、阻害剤プロベネシドにより阻害されるが、阻害剤プロベネシド単独ではＭＣＰ−１産生を阻害しないことがわかる。
これらの結果から、ＶＳＭＣにおける有機アニオン輸送システムを阻害することにより、尿酸により誘導される増殖やＭＣＰ−１の産生をブロックすることができることが示された。プロベネシドやベンズブロマロンなどの阻害剤は、単独で腎臓において尿酸排出剤として作用すると考えられていることから、これらの結果は注目される。しかし、これらの阻害剤は、ＶＳＭＣにおいては、尿酸の直接的な作用のブロッカーとなるという、興味深い可能性が示されたことになる。
次に、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＶＳＭＣにどのような有機アニオントランスポーターが存在しているのかを検討した。ラットのＶＳＭＣの全ＲＮＡを用いて、ラットの有機アニオントランスポーター−１（ＯＡＴ１）、有機アニオントランスポーター−２（ＯＡＴ２）、有機アニオントランスポーター−３（ＯＡＴ３）、及び尿酸アニオントランスポーター−１（ＵＲＡＴ−１）のラットのホモローグ（ＲＳＴ１）の部分配列をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行った。陽性コントロールとして、ラット腎臓及び肝臓細胞を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド染色した結果を図１１のＡ〜Ｄに、図面に代わる写真で示す。図１１のＡはＯＡＴ１の場合の４３４ｂｐのＰＣＲ産物を示し、図１１のＢはＯＡＴ２の場合の４６２ｂｐのＰＣＲ産物を示し、図１１のＣはＯＡＴ３の場合の４８３ｂｐのＰＣＲ産物を示し、図１１のＤはＲＳＴ１の場合の４６０ｂｐのＰＣＲ産物を示す。各図面の左端のレーンは、１００ｂｐのラダー（インビトロジェン社製）を示し、その右側は順に、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、及びＶＳＭＣをそれぞれ示す。
図１１のＡでは、腎臓のみにＰＣＲ産物が確認された。図１１のＢでは、４６２ｂｐのＰＣＲ産物のバンドが腎臓と肝臓のみに確認され、加えて３２０ｂｐのバンドが全てに見られるが、このバンドはブラストを用いた配列検索の結果、非特異的なものであった。図１１のＣでは腎臓と肝臓のみにＰＣＲ産物が確認された。図１１のＤでは、４６０ｂｐのＰＣＲ産物のバンドが腎臓のみに確認され、加えて２１１ｂｐのバンドが全てに見られるが、このバンドは配列分析の結果、非特異的なものであった。この結果、ＶＳＭＣにおいては、これらのトランスポーターの発現を確認することができなかった。
次に、電位感受性のチャンネル／トランスポーターであるＵＡＴ（ジーンバンク、アクセッション番号：ＮＭ ０１２９７７）の発現を評価するために、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを行った。結果を図１２に図面に代わる写真で示す。図１２の左端のレーンはプローブを示し、中の４レーンはＶＳＭＣを示し、右端のレーンは肝臓を示す。この結果、ＵＡＴのｍＲＮＡがラットのＶＳＭＣ及び肝臓で発現していることが示された。ハウスキーピング遺伝子Ｌ３２の発現も同時に示された。なお、図１２において、プローブの大きさが相違しているのは、このプローブがプローブ構築のためのポリリンカー領域を有しているためである。
次に本発明者らは、ヒトのＶＳＭＣについて検討した。
ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）による、ヒト大動脈由来の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸トランスポーターＵＲＡＴ１の検出実験を行った。この結果を図１３に図面に代わる写真で示す。図１３の左端及び右端のレーンＭは１００ｂｐのＤＮＡラダーを示し、レーン＋Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いたものを示し、レーン−Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いなかったものを示している。また、レーン０はＶＳＭＣに何も付加しなかったものを示し、レーン３、６、９、及び１２はそれぞれ、３ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌの各濃度の尿酸によりＶＳＭＣを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、ＶＳＭＣから得られたｃＤＮＡにおいて、ＰＣＲ法によりＵＲＡＴ１の発現が認められた。
また、ヒト腎臓輸入細動脈由来ＶＳＭＣより得られた全ＲＮＡを用いて、同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行った。この結果を図１４に図面に代わる写真で示す。図１４の左端及び右端のレーンＭは１００ｂｐのＤＮＡラダーを示し、レーン＋Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いたものを示し、レーン−Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いなかったものを示している。また、レーン０はＶＳＭＣに何も付加しなかったものを示し、レーン３、６、９、及び１２はそれぞれ、３ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌの各濃度の尿酸によりＶＳＭＣを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、ＶＳＭＣから得られたｃＤＮＡにおいて、ＰＣＲ法によりＵＲＡＴ１の発現が認められた。
さらに、ヒト臍帯静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）より得られた全ＲＮＡを用いて、同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行った。この結果を図１５に図面に代わる写真で示す。図１５の左端及び右端のレーンＭは１００ｂｐのＤＮＡラダーを示し、レーン＋Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いたものを示し、レーン＋ＥｎｄｏはＨＵＶＥＣから合成したｃＤＮＡを用いたものを示している。この結果、腎臓同様、ＨＵＶＥＣから得られたｃＤＮＡにおいても、ＰＣＲ法によりＵＲＡＴ１の発現が認められた。
次に、ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）をホモジナイズして得られた細胞溶解液を用いて、抗ＵＲＡＴ１抗体により、ウエスタンブロット法を行った。この結果を図１６に図面に代わる写真で示す。図１６のレーン０はＶＳＭＣに何も付加しなかったものを示し、レーン３、６、９、及び１２はそれぞれ、３ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌの各濃度の尿酸によりＶＳＭＣを刺激した時の結果を示している。図１６のＧＡＰＤＨは陽性コントロールを示す。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、ＶＳＭＣから得られた細胞溶解液において、抗ＵＲＡＴ１抗体によりＵＲＡＴ１タンパク質が検出された。
これらの結果から、ラットのＶＳＭＣにおける尿酸の取り込みを介在するトランスポーターを特定することはできなかったが、ヒトのＶＳＭＣにおける尿酸の取り込みに介在するトランスポーターがＵＲＡＴ１であることがＲＴ−ＰＣＲなどにより判明した。ＯＡＴ１やＯＡＴ３は、近位管（近位尿細管）の基底側において尿酸の取り込みに介在していることが報告されており、ＵＲＡＴ１は、管腔側での尿酸の取り込みにおいて重要であることが報告されている。また、高尿酸血症モデルラットは、塩感受性の高血圧症、糸球体血管障害、及び腎障害を発症することが報告されており（非特許文献１〜６参照）、今回の結果はこれらの血管障害や高血圧症、とりわけ高尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧症の治療や予防・処置においてＵＲＡＴ１の阻害剤やブロッカーが有効であることが示されたことになる。特に、プロベネシドなどの尿酸排出剤は、腎臓におけるこのような作用に加えて、ＶＳＭＣにおいてはさらに他の作用を有していることが示されたことになる。
このように、本発明は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸の取り込みが尿酸トランスポーターの１種であるＵＲＡＴ１を介して行われていることを明らかにしたものであり、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸の取り込みにより血管障害や高血圧症や腎障害が発生する、特に高尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧症や腎障害が血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸の取り込みに起因しているという近年の研究結果に基づけば、血管障害や高血圧症や腎障害、より詳細には高尿酸血症によって誘導される血管障害や高血圧症や腎障害の治療や予防・処置にＵＲＡＴ１の阻害剤やブロッカーが有効であることを本発明が初めて明らかにしたのである。
したがって、本発明は、ＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物、及び製薬上許容される担体からなる、血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための医薬組成物を提供する。本発明の好ましい血管障害や高血圧症や腎障害としては、高尿酸血症によって誘導される疾患が挙げられるが、尿酸はプリンの最終分解産物として血中に存在しており、血中における尿酸の存在が、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸の取り込みに関与することから、これに限定されるものではない。また、本発明の医薬組成物は、予防剤として使用されることから、血管保護剤としての医薬組成物を提供するものでもある。
また、本発明のＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物としては、ＵＲＡＴ１の拮抗剤、ＵＲＡＴ１の阻害剤、ＵＲＡＴ１のブロッカーなどのＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み量を、これらの物質の存在により減少させることができる作用を有する物質であればよい。具体的には、例えば、プロベネシドやベンズブロマロンなどが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、経口投与、又は非経口投与のいずれかにより投与される。本発明の医薬組成物は、投与可能な形態に製剤化、例えば、錠剤、顆粒剤、液剤、注射剤などの公知の製剤形態に製剤化される。製剤化にあたっては、公知の医薬用添加剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、安定化剤などを適宜配合することができる。
本発明の医薬組成物における有効成分の有効投与量は、疾患の状態や患者の状態により適宜判断されるが、通常は尿酸排出に十分な量が投与される。例えば、１日当たり１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲で投与することもできる。
また、本発明は、血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置を必要としている患者に、ＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物の有効量を投与することからなる血管障害や高血圧症や腎障害を治療、予防又は処置する方法を提供するものである。
さらに、本発明は、ＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物の、血管障害や高血圧症や腎障害を治療、予防又は処置するための医薬組成物を製造するための使用を提供する。
本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込み量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明のＵＲＡＴ１を発現している細胞系としては、腎臓の細胞やＶＳＭＣなどの天然の細胞であってもよいが、ＵＲＡＴ１の遺伝子を導入した当該遺伝子の安定発現細胞からなるものであってもよい。本発明のこのスクリーニング方法としては、より具体的には、例えば、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系の尿酸取り込み溶液中に、被検化合物を存在させたときの尿酸の取り込み量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法が挙げられる。本発明における尿酸の取り込み量の測定方法としては、例えば、放射性同位元素で標識化された尿酸、例えば、１４Ｃ−尿酸を使用する方法などが挙げられる。
この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であってもよい。
また、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、当該細胞の増殖能を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法における、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系としては、尿酸又は尿酸塩により細胞が増殖するものが好ましい。本発明のこのスクリーニング方法としては、より具体的には、例えば、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系の尿酸取り込み溶液中に、チミジン及び被検化合物を存在させたときのチミジンの取り込み量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法が挙げられる。本発明におけるチミジンの取り込み量の測定方法としては、例えば、放射性同位元素で標識化されたチミジン、例えば、３Ｈ−チミジンを使用する方法などが挙げられる。
この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であってもよい。
さらに、本発明は、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、当該細胞の単球走化性因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法における、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系としては、尿酸又は尿酸塩により細胞がＭＣＰ−１などの単球走化性因子を産生するものが好ましい。本発明のこのスクリーニング方法としては、より具体的には、例えば、ＵＲＡＴ１を発現している細胞系の尿酸取り込み溶液中に、被検化合物を存在させたときのＭＣＰ−１などの単球走化性因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法が挙げられる。本発明におけるＭＣＰ−１などの単球走化性因子の産生量の測定方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
この方法における尿酸としては、尿酸自体でもよいが、ナトリウムなどの尿酸塩であってもよい。
また、本発明の医薬組成物の有効成分の活性は、例えば、自然発症高血圧モデルラット（ＳＨＲ）などの高血圧発症モデル動物を使用して確認することもできる。
本発明は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸の取り込みの条件、及びそのメカニズムを初めて明らかにするものである。本発明によれば、血液中の尿酸が平滑筋細胞へと移動する際、ＵＲＡＴ１が同部における尿酸の輸送担体として重要な役割を果していることを明らかにし、ＵＲＡＴ１が血管平滑筋細胞においても存在し、血中から平滑筋細胞への尿酸の移動に関与していることが明らかにし、この作用を通して高尿酸血症における高血圧や血管病変の病態形成に重要な役割を示していることを明らかにするものである。これにより、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の尿酸に起因する作用に基づく、各種の血管障害、各種の器官、例えば腎臓、肝臓などの器官の障害、高血圧症などの疾患が、ＵＲＡＴ１を介した尿酸の取り込みであることが明らかにされ、本発明により、ＵＲＡＴ１の尿酸の取り込み作用を阻害する作用を有する薬物、及び製薬上許容される担体からなる、血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための医薬組成物を提供することできた。
また、本発明によれば、被検化合物の存在下、又は非存在下において、ＵＲＡＴ１の遺伝子の安定発現細胞系などのＵＲＡＴ１を発現している細胞系を用いて、尿酸の取り込み量、細胞の増殖能、及び／又は細胞の単球走化因子の産生量を測定することからなる血管障害や高血圧症や腎障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングするための新たな方法が提供される。本発明の方法によれば、新しい抗高血圧薬や血管変性阻害による保護作用を有する新薬の開発が可能となる。
図１は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸塩の取り込みを、分極又は非分極条件下で試験した結果を示すグラフである。図１の縦軸は１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量（ＣＰＭ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１中の白四角印（□）は非分極条件の場合を示し、黒菱形印（◆）は分極条件の場合を示す。 図２は、ラットＶＳＭＣにおける１４Ｃ−尿酸塩の取り込みにおける、寒冷尿酸塩との競合を試験した結果を示すグラフである。図２の縦軸は、寒冷尿酸塩が存在しない場合の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を１００％としたときの、１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量の割合（％）を示す。横軸は寒冷尿酸塩の濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。 図３は、ラットＶＳＭＣにおける、プロベネシドによる１４Ｃ−尿酸塩の取り込みの阻害を試験した結果を示すグラフである。図３の縦軸は、プロベネシドが存在しない場合の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を１００％としたときの、１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量の割合（％）を示し、横軸はプロベネシドの濃度（ｍＭ）を示す。 図４は、ラットＶＳＭＣにおける、ベンズブロマロンによる１４Ｃ−尿酸塩の取り込みの阻害を試験した結果を示すグラフである。図４の縦軸は、ベンズブロマロンが存在しない場合の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を１００％としたときの、１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量の割合（％）を示す。図４の横軸はベンズブロマロンの濃度（μＭ）を示す。 図５は、ラットＶＳＭＣにおける、パラ−アミノ馬尿酸塩（ＰＡＨ）による１４Ｃ−尿酸塩の取り込みの競合を試験した結果を示すグラフである。図５の縦軸は、ＰＡＨが存在しない場合の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を１００％としたときの、１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量の割合（％）を示し、横軸はＰＡＨの濃度（μＭ）を示す。 図６は、ラットＶＳＭＣにおける、乳酸塩による１４Ｃ−尿酸塩の取り込みの競合を試験した結果を示すグラフである。図６の縦軸は、乳酸塩が存在しない場合の１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量を１００％としたときの、１４Ｃ−尿酸塩の取り込み量の割合（％）を示し、横軸は乳酸塩の濃度（μＭ）を示す。 図７は、ＶＳＭＣを２４時間培養したときのＶＳＭＣの増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込み量により測定した結果を示すグラフである。図７の縦軸は、３Ｈ−チミジンの取り込み量（ＣＰＭ）を示し、横軸は尿酸が存在しない場合（ｎｏ ＵＡ）、尿酸が３ｍｇ／ｄＬ存在する場合（ＵＡ）、尿酸３ｍｇ／ｄＬにさらにプロベネシドが０．１、０．５、及び１ｍＭそれぞれ存在する場合（ＵＡ＋０．１等）、並びにプロベネシドが単独で存在する場合（１）を示す。 図８は、ＶＳＭＣを２４時間培養したときのＶＳＭＣの増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込み量により測定した結果を示すグラフである。図８の縦軸は、３Ｈ−チミジンの取り込み量（ＣＰＭ）を示し、横軸は尿酸が存在しない場合（ｎｏ ＵＡ）、尿酸が３ｍｇ／ｄＬ存在する場合（ＵＡ）、尿酸３ｍｇ／ｄＬにさらにベンズブロマロンが０．５、１、及び１０μＭそれぞれ存在する場合（ＵＡ＋０．５等）、並びにベンズブロマロンが単独で存在する場合（１０）を示す。 図９は、２４時間培養における有機アニオン輸送のプロベネシドによる細胞増殖の阻害率（％）と、５分間における尿酸の取り込みのプロベネシドによる阻害率（％）を比較した結果を示すグラフである。図９の縦軸はＶＳＭＣの増殖阻害率（％）を示し、横軸は尿酸の取り込み阻害率（％）を示す。 図１０は、ラットＶＳＭＣを２４時間培養したときの培養上澄液に出現するＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。図１０の縦軸はＭＣＰ−１の量（ｐｇ／１０００細胞）を示し、横軸はなにも存在しない場合（Ｎｏ ＵＡ）、尿酸３ｍｇ／ｄＬが存在する場合（ＵＡ）、尿酸３ｍｇ／ｄＬに加えてプロベネシド１ｍＭが存在する場合（ＵＡ＋Ｐｒｏｂ）、及びプロベネシドのみが存在する場合（Ｐｒｏｂ）を、それぞれ示す。 図１１は、ラットのＶＳＭＣの全ＲＮＡを用いて、ラットの有機アニオントランスポーター−１（ＯＡＴ１）、有機アニオントランスポーター−２（ＯＡＴ２）、有機アニオントランスポーター−３（ＯＡＴ３）、及び尿酸アニオントランスポーター−１（ＵＲＡＴ１）の部分配列をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果のＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド染色した結果を示す、図面に代わる写真である。陽性コントロールとして、ラット腎臓及び肝臓細胞を用いた。図１１のＡはＯＡＴ１の場合を示し、図１１のＢはＯＡＴ２の場合を示し、図１１のＣはＯＡＴ３の場合を示し、図１１のＤはＵＲＡＴ１の場合を、それぞれ示す。各図面の左端のレーンは、１００ｂｐのラダー（インビトロジェン社製）を示し、その右側は順に、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、及びＶＳＭＣをそれぞれ示す。 図１２は、ＵＡＴ（ジーンバンク、アクセッション番号：ＮＭ ０１２９７７）の発現を評価するために、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを行った結果を示す図面に代わる写真である。図１２の左端のレーンはプローブを示し、中の４レーンはＶＳＭＣを示し、右端のレーンは肝臓を示す。 図１３は、ＲＴ−ＰＣＲによる、ヒト大動脈由来の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸トランスポーターＵＲＡＴ−１の検出結果を示した図面に代わる写真である。 図１４は、ＲＴ−ＰＣＲによる、ヒト腎臓輸入細動脈由来の平滑筋培養細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸トランスポーターＵＲＡＴ−１の検出結果を示した図面に代わる写真である。 図１５は、ＲＴ−ＰＣＲによる、ヒト臍帯静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における尿酸トランスポーターＵＲＡＴ−１の検出結果を示した図面に代わる写真である。 図１６は、ウエスタンブロット法による、ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）における尿酸トランスポーターＵＲＡＴ−１の検出結果を示した図面に代わる写真である。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
以下の実験で使用した血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）は、ラットの大動脈から調製した（Ｚｈａｎｇ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．，２００３；１０７，１５３９−４４）。この細胞を、１０％子牛胎児血清（ＦＢＳ）、１％グルタミン、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン；ＧＩＢＣＯ）を含有するダルベッコの修飾をしたイーグル培地（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ）で培養した。ＶＳＭＣを３５ｍｍの６穴培養プレート（ＮＵＮＣ）に移し、湿式培養器（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）中で、５％炭酸ガス−９５％空気の雰囲気下で３７℃で保存した。培地を２日毎に交換した。実験に用いたＶＳＭＣは、５〜１２世代のものであった。
なお、特願２００３−３８４８６３明細書に記載された内容を、本明細書に全て取り込む。
１４Ｃ−尿酸塩の取り込み
ＶＳＭＣ（４×１０５細胞）を、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭと共に６穴培養プレートに移した。１日後に、血清の無いＤＭＥＭ培地に終夜置いて成長を停止させた。各実験中は、細胞及び全ての溶液を３７℃に維持した。ＶＳＭＣを、８−１４Ｃ−尿酸塩（比活性は５０μＣｉ／ｍｍｏｌ；アメリカンラディオラベルド化学社製（セントルイス、ＭＯ））と共に培養し、尿酸塩の最終濃度を２０μＭにし、種々の阻害剤の存在下又は非存在下で培養した。取り込みの過程としては少し早いが、培養を５分間で停止した。この結果を図３及び図４に示す。
いくつかの実験では、放射性元素で標識化した尿酸塩の取り込み実験を、冷たい尿酸塩、乳酸塩、パラ−アミノ馬尿酸塩（ＰＡＨ）などの他の有機アニオンの存在下、又は有機アニオントランスポーター阻害剤（プロベネシド又はベンズブロマロン）の存在下で行った。媒体（ｍｅｄｉａ）を急速に吸い取ることにより、取り込みを停止させ、すぐに氷冷したＰＢＳで３回洗浄した。急速に吸い取られた培養溶液及び前記したように洗浄された細胞の全値からブランクが差し引かれた。次いで、細胞を、１Ｎ ＮａＯＨの１ｍｌで１５分間で溶解した。細胞に蓄積された８−１４Ｃ−尿酸塩の量を、ＢＣＳシンチレーション溶液（アマーシャム社製）の５ｍｌ中へ０．５ｍｌの細胞溶解液を加えて測定した。放射能を、溶液シンチレーションカウンターで測定した。取り込み量は、全ｃｐｍ／ウエル、又は対照に対する百分率（％）で示される。この結果を図２、図５、及び図６に示す。
他の実験では、尿酸塩の取り込みが電位感受性であるかどうかを決定するために、尿酸の取り込み実験を分極化条件、又は非分極化条件で行った。実験条件は、分極化、又は分極化されていない条件において培養溶液が相違している点を除き、前記した条件と同様であった。詳細には、１２時間の飢餓状態の後、血清の無い培地を取り除き、これに代えて、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ グルコース、並びに１６ｍＭ ＨＥＰＥＳ−トリス（ｐＨ７．４）を含有するＨＥＰＥＳ−生理食塩水溶液（ＰＳＳ）（この場合は、分極化用として）、又は４４ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ グルコース、並びに１６ｍＭ ＨＥＰＥＳ−トリス（ｐＨ７．４）を含有する１００ｍＭ−ＫＣｌ取り込み溶液（この場合は、非分極化用として）の０．４５ｍＬを添加した。
この結果を図１に示す。
ＶＳＭＣの増殖試験
ＶＳＭＣ（４×１０５細胞）を、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭと共に６穴培養プレートに移し、２４時間培養した。次いで、０．５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で４８時間、細胞を飢餓状態にした。ＤＮＡ合成を測定するために、静止状態のＶＳＭＣに、３Ｈ−チミジンの１μＣｉを含む３ｍｇ／ｄＬの尿酸で４８時間刺激した。細胞を採取する２時間前に、さらに２μＣｉ／ｍＬの３Ｈ−チミジンを各ウエルに添加した。細胞を氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、１ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨで溶解した。細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジンの量を、５ｍＬのシンチレーション溶液中へ０．５ｍｌの細胞溶解液を加えて測定した。ＣＰＭ／ウエルで示される３Ｈ−チミジンの取り込み量は、溶液シンチレーションカウンターで記録された。いくつかの実験では、種々の濃度のプロベネシド又はベンズブロマロン（有機アニオントランスポーター阻害剤）の存在下で実験を行った。この結果を図７及び図８に示す。
同様の方法で、ＶＳＭＣの増殖を、有機アニオン（乳酸塩やＰＡＨ）を用いて評価した。
ＭＣＰ−１タンパク質についてのＥＬＩＳＡ。
２４穴プレートに細胞を取り（５×１０４細胞／ウエル）を、７０％コンフルエンスの状態になったときに血清を取り除いた。次いで、１ｍＭのプロベネシドの存在下、又は非存在下に、３ｍｇ／ｄＬの尿酸を含有、又は含有していない培地を２４時間加えた。上澄みのＭＣＰ−１タンパク質をＥＬＩＳＡ（ＯｐｔＥＩＡ ＭＣＰ−１セット、ＢＤファーミンゲン社）で計測し、細胞数で補正した。実験は各々３回行った。この結果を、図１０に示す。
ＲＴ−ＰＣＲによるＯＡＴトランスポーターの検出。
ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ精製キット（キアゲン社、バレンシア、ＣＡ）を用いてラットのＶＳＭＣから全ＲＮＡを調製した。オリゴテックスｍＲＮＡ精製システム（キアゲン社）を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離し、ワンステップＲＴ反応におけるランダムプライマーを用いて逆転写した。クロンテック社（パロアルト、ＣＡ）から販売されている腎臓及び肝臓のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを陽性コントロールとして使用した。陰性コントロール反応を、ＤＮＡによる汚染をテストするためにプライマーを添加する前に逆転写酵素の熱不活性化により行った。以下のヌクレオチドセットを用いてＰＣＲ反応を行った。
ＯＡＴ１：
７８４−８１０ ５’−ＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＡＴＡＣ−３’
アンチセンス鎖の１２１８−１１９０
５’−ＣＣＴＴＴＧＣＴＴＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧ−３’
ＯＡＴ２：
６４２−６７２
５’−ＣＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＡＴＧＴＴＣＧＴＡＧＴＣＡＣＣＣＧ−３’
アンチセンス鎖の１１０５−１０７６
５’−ＧＡＴＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＣＧＧＡＡＣＡＧ−３’
ＯＡＴ３：
４３７−４６５ ５’−ＧＡＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＴＧ−３’
アンチセンス鎖の９２０−８８９
５’−ＧＡＴＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＣ−３’
ＲＳＴ１（ＵＲＡＴ−１のマウスのホモローグ）：
３７７−４０５ ５’−ＣＡＴＣＴＴＡＴＧＣＴＴＡＴＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＴＣ−３’
アンチセンス鎖の７６８−７３９
５’−ＧＡＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＴＣＴＡＣ−３’
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＲＴ−ＰＣＲビーズ（アマーシャム社製）を用いて行った。最初の鎖のｃＤＮＡ合成反応は、ｐｄ（Ｎ）６を用いて４２℃で１５分間で行われた。ＰＣＲは、９５℃、５分間で最初の変性を行い、次いで９５℃、３０秒で変性し、５５℃、３０秒でアニリーングさせ、７２℃、１分間で伸長させるサイクルを３２サイクル行った。サンプルを４℃で保存した。このＰＣＲ産物を、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動し、ゲル中の適当な分子量のバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いて精製した。これらのバンドを、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社製）にサブクローンした。これらを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して評価し、ダイターミネーター法によるアプライドバイオシステムシークエンサー（ＡＢＩ３７３０）を用いて、その配列を解析した。ポリＡｍＲＮＡが完全であるかどうかを確認するために、センスプライマー：５’−ＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＡＴＣＣＧＴＴＧＴ−３’、アンチセンスプライマー：５’−ＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＡ−３’からなるプライマーの組み合わせを用いてＧＡＤＰＨ−ｍＲＮＡ法により試験した。この結果を図１１に示す。
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）。
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）を、ＲＰＡｓＩキット（トレイピネスバイオラボ社、ヒューストン、ＴＸ）を用いて、２〜４μｇのＲＮＡについて行った。ラットＵＡＴ（ジーンバンク、アクセッション番号：ＮＭ ０１２９７７）の５’末端から３２５番目までの３２５ｂｐ塩基からなるヌクレオチドを、ｐｃＤＮＡ−ＵＡＴ−ＥＧＦＰにサブクローンした。このプラスミドをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、これをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにライゲートし、このプラスミドをｐＢＳ−ＵＡＴ−３２５と命名した。このプラスミドをＢａｍＨＩで消化して鎖状にし、α−３２Ｐ［ＵＴＰ］の存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてリボプローブ（ＲＮＡプローブ）を合成した。
この結果を図１２に示す。
ヒト大動脈由来の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）より得られた全ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを用いて、尿酸トランスポーターＵＲＡＴ−１の部分配列をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。
結果を図１３に示す。図１３の、左端及び右端のレーンＭは１００ｂｐのＤＮＡラダーを示し、レーン＋Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いたものを示し、レーン−Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いなかったものを示している。また、レーン０はＶＳＭＣに何も付加しなかったものを示し、レーン３、６、９、及び１２はそれぞれ、３ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌの各濃度の尿酸によりＶＳＭＣを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、ＶＳＭＣから得られたｃＤＮＡにおいて、ＰＣＲ法によりＵＲＡＴ−１の発現が認められた。
ヒト腎臓輸入細動脈由来ＶＳＭＣより得られた全ＲＮＡを用いて、実施例６と同様にしてＰＣＲを行った。
結果を図１４に示す。図１４の左端及び右端のレーンＭは１００ｂｐのＤＮＡラダーを示し、レーン＋Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いたものを示し、レーン−Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いなかったものを示している。また、レーン０はＶＳＭＣに何も付加しなかったものを示し、レーン３、６、９、及び１２はそれぞれ、３ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌの各濃度の尿酸によりＶＳＭＣを刺激した時の結果を示している。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、ＶＳＭＣから得られたｃＤＮＡにおいて、ＰＣＲ法によりＵＲＡＴ−１の発現が認められた。
ヒト臍帯静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）より得られた全ＲＮＡを用いて、実施例６と同様にしてＰＣＲを行った。
結果を図１５に示す。図１５の左端及び右端のレーンＭは１００ｂｐのＤＮＡラダーを示し、レーン＋Ｋは腎臓のｃＤＮＡを用いたものを示し、レーン＋ＥｎｄｏはＨＵＶＥＣから合成したｃＤＮＡを用いたものを示している。腎臓同様、ＨＵＶＥＣから得られたｃＤＮＡにおいても、ＰＣＲ法によりＵＲＡＴ−１の発現が認められた。
ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）をホモジナイズして得られた細胞溶解液を用いて、抗ＵＲＡＴ−１抗体により、ウエスタンブロット法を行った。陽性コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。
結果を図１６に示す。図１６のレーン０はＶＳＭＣに何も付加しなかったものを示し、レーン３、６、９、及び１２はそれぞれ、３ｍｇ／ｄｌ、６ｍｇ／ｄｌ、９ｍｇ／ｄｌ、１２ｍｇ／ｄｌの各濃度の尿酸によりＶＳＭＣを刺激した時の結果を示している。図１６のＧＡＰＤＨは陽性コントロールを示す。
この結果、付加する尿酸の有無、および濃度に関わらず、ＶＳＭＣから得られた細胞溶解液において、抗ＵＲＡＴ−１抗体によりＵＲＡＴ−１タンパクが検出された。
本発明は、尿酸に起因する各種の血管障害や高血圧症に対する新たな治療、予防、処置のための医薬組成物を提供するものであり、新たな医薬組成物を提供するものとして産業上の利用性を有するものである。また、本発明は、尿酸トランスポーターの１種であるＵＲＡＴ１の機能に着目した新たな治療、予防、処置のための医薬組成物のための有効成分をスクリーニングする方法を提供するものであり、本発明の方法により、新しい抗高血圧薬や血管変性阻害による保護作用を有する新薬の開発が可能となり、産業上の利用性をゆうするものである。
配列番号１は、ＯＡＴ１検出用のフォーワードプライマーである。
配列番号２は、ＯＡＴ１検出用のリバースプライマーである。
配列番号３は、ＯＡＴ２検出用のフォーワードプライマーである。
配列番号４は、ＯＡＴ２検出用のリバースプライマーである。
配列番号５は、ＯＡＴ３検出用のフォーワードプライマーである。
配列番号６は、ＯＡＴ３検出用のリバースプライマーである。
配列番号７は、ＲＳＴ１検出用のフォーワードプライマーである。
配列番号８は、ＲＳＴ１検出用のリバースプライマーである。

Claims (9)

  1. 被検化合物の存在下、又は非存在下において、血管平滑筋細胞系を用いて、ＵＲＡＴ１を介した尿酸の取り込み量を測定することからなる、血管平滑筋細胞におけるＵＲＡＴ１を介した尿酸の取り込みに起因する血管障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法。
  2. 前記細胞系が、臍帯静脈上皮細胞系である請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞系の尿酸取り込み溶液中に、被検化合物を存在させたときのＵＲＡＴ１を介した尿酸の取り込み量を測定することからなる請求項１又は２に記載の方法。
  4. 血管平滑筋細胞系を用いて、尿酸塩の存在下での当該細胞の増殖能を測定し、被検化合物を添加した場合に、当該細胞の増殖能が低下する化合物をスクリーニングすることからなる、血管平滑筋細胞におけるＵＲＡＴ１を介した尿酸の取り込みに起因する血管障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法。
  5. 前記細胞系が、臍帯静脈上皮細胞系である請求項４に記載の方法。
  6. 細胞の増殖能の測定が、チミジンの取り込み量を測定することからなる請求項４又は５に記載の方法。
  7. 血管平滑筋細胞系を用いて、尿酸塩の存在下での当該細胞の単球走化性因子の産生量を測定し、被検化合物を添加した場合に、当該細胞の単球走化性因子の産生量が低下する化合物をスクリーニングすることからなる、血管平滑筋細胞におけるＵＲＡＴ１を介した尿酸の取り込みに起因する血管障害の治療、予防又は処置のための有効物質をスクリーニングする方法。
  8. 前記細胞系が、臍帯静脈上皮細胞系である請求項６に記載の方法。
  9. 単球走化性因子が、ＭＣＰ−１である請求項７又は８に記載の方法。
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