BRPI0312818B1

BRPI0312818B1 - Uso de uma medida do nível do polipeptídeo sflt-1 em uma amostra de uma paciente e uso de uma medida dos níveis de pelo menos dois dos peptídeos sflt1, vegf livre ou polipeptídio pigf livre em uma amostra de um paciente usando um métrico

Info

Publication number: BRPI0312818B1
Application number: BRPI0312818-0A
Authority: BR
Inventors: S. Ananth Karumanchi; Sharon Maynard; Vikas P. Sukhatme
Original assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center
Priority date: 2002-07-19
Filing date: 2003-07-21
Publication date: 2019-08-20
Also published as: PT2305301E; BR0312818A; CA2496253C; IL166393A; AU2009202176A1; KR20060002008A; WO2004008946A2; IL233205B; EP1575416A4; EP1575416B1; CA2922031A1; JP2006511615A; DK2308507T3; IL166393A0; IL233205A0; ES2534294T3; PT2308507E; BRPI0312818B8; US7407659B2; HK1156233A1

Abstract

patente de invenção: uso de um composto capaz de ligar ao receptor flt-1 solúvel (sflt-1), kit para diagnosticar pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, método para identificar esse composto e respectiva composição farmacêutica. são revelados neste relatório métodos para diagnosticar pré-eclâmpsia e eclâmpsia. também são revelados neste relatório métodos para tratar pré-eclâmpsia e eclâmpsia usando compostos que aumentam os níveis de vegf ou pigf ou compostos que reduzem os níveis de sfit-1. também são revelados compostos que inibem a ligação de vegf ou pigf a sfit-1 para o tratamento de pré-eclâmpsia e eclâmpsia.

Description

A presente invenção refere-se à detecção e ao tratamento de pacientes tendo pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

Antecedentes da Invenção

Pré-eclâmpsia é uma síndrome de hipertensão, edema, e proteinúria que afeta 5 a 10% das gravidezes e resulta em substancial morbidez e mortalidade materna e fetal. A pré-eclâmpsia é responsável por no mínimo 200.000 mortes maternas mundialmente por ano. Os sintomas da préeclâmpsia aparecem tipicamente depois da 20^a semana de gravidez e são geralmente detectados pela monitoração de rotina da pressão sanguínea e da urina da mulher. No entanto, estes métodos de monitoração são ineficazes para o diagnóstico da síndrome em um estágio inicial, o que poderia reduzir o risco para a paciente ou para o feto em desenvolvimento, caso estivesse disponível um tratamento eficaz.

Atualmente não há curas conhecidas para a pré-eclâmpsia. A pré-eclâmpsia pode variar de gravidade de branda até apresentando risco de vida. Uma forma branda de pré-eclâmpsia pode ser tratada com repouso no leito e monitoração frequente. Para casos moderados a graves, se recomenda hospitalização e é prescrita medicação para pressão sangüínea ou medicações anticonvulsivas para evitar ataques. Se a condição vier a apresentar risco para a vida da mãe ou do bebê, a gravidez é terminada e o parto do bebê é realizado antes do termo.

O desenvolvimento adequado do feto e da placenta é mediado por vários fatores de crescimento. Um destes fatores de crescimento é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). O VEGF é um mitógeno específico das células endoteliais, um indutor angiogênico, e um mediador da permeabilidade vascular. Também foi demonstrado que o VEGF é importanSegue-se folha 1a

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1a te para restauração capilar glomerular. O VEGF liga como um homodímero a um de dois receptores homólogos da tirosina quinase estendendo

Petição 870180167861, de 27/12/2018, pág. 5/12 /4» glês, fms-like tyrosine kinase) e o receptor do domínio quinase (KDR, N.T., em inglês, kinase domain receptor), os quais são expressos diferencialmente em células endoteliais obtidas de muitos tecidos diferentes. Flt-1, mas não KDR, é altamente expressa por células de trofoblastos as quais contri5 buem para a formação placentária. O fator de crescimento placentário (PIGF) é um membro da família de VEGF que também está envolvido no desenvolvimento placentário. O PIGF é expresso por citotrofoblastos e sincitiotrofoblastos e é capaz de induzir a proliferação, migração, e ativação de células endoteliais. O PIGF liga como um homodímero ao receptor Flt-1, b 10 mas não o receptor KDR. Tanto PIGF quanto VEGF contribuem para a atividade mitogênica e a angiogênese que são cruciais para a placenta ém desenvolvimento.

Uma forma solúvel do receptor Flt-1 (sFlt-1) foi recentemente identificada em um meio de cultura de células endoteliais da veia umbilical humana e a expressão in vivo foi em seguida demonstrada em tecido placentário. sFlt-1 é uma variante de união do receptor Flt-1 a qual carece dos domínios transmembrana e citoplásmico. sFlt-1 liga a VEGF com uma alta afinidade mas não estimula a mitogênese de células endoteliais. Acredita-se

que sFlt-1 atue como um dissipador fisiológico para regular para baixo os caminhos de sinalização de VEGF. A regulação dos níveis de sFlt-1 portanto funciona modulando VEGF e a sinalização de VEGF. A cuidadosa regulação dos caminhos de sinalização VEGF e PIGF é crucial para a manutenção de proliferação, migração, e angiogênese apropriadas por células de trofoblastos na placenta em desenvolvimento. Há a necessidade de métodos para diagnosticar de modo preciso pacientes em risco para ou tendo préeclâmpsia, particularmente antes do início dos sintomas mais graves. Tam bém é necessário um tratamento.

Sumário da Invenção

Foi descoberto um meio para diagnosticar e tratar de modo efi30 caz pré-eclâmpsia e eclâmpsia antes do desenvolvimento de sintomas.

Usando análise da expressão genética, foi descoberto que os níveis de sFlt-1 estão acentuadamente elevados em amostras de tecido pia-

centário de mulheres grávidas que estejam sofrendo de pré-eclâmpsia. Sabe-se que a sFlt-1 antagoniza VEGF e PIGF atuando como um dissipador fisiológico e, em mulheres pré-eclâmpticas ou eclâmpticas, sFlt-1 pode estar esgotando a placenta das quantidades necessárias destes fatores es5 senciais angiogênicos e mitogênicos. O excesso de sFlt-1 também pode levar a eclâmpsia por romper as células endoteliais que mantêm a barreira sanguínea do cérebro e/ou células endoteliais que revestem o plexo coróide do cérebro deste modo levando a edema cerebral e aos ataques vistos na pclâmpsia. Na presente invenção, compostos que aumentam os níveis de 10 VEGF e PIGF são administrados a uma paciente para tratar ou prevenir préeclâmpsia ou eclâmpsia opondo-se aos efeitos de elevada sFlt-1. Além disso anticorpos orientados para sFlt-1 são usados para inibir competitivamente a liga; de VEGF ou PIGF a sFlt-1, deste modo aumentando os níveis de VEGF e PIGF livres. Interferência de RNA e oligômeros de nucleobase anti15 sentido também são usados para reduzir os níveis de sFlt-1. Finalmente, a presente invenção proporciona a aplicação e a monitoração de sFlt-1, VEGF, e PIGF como ferramentas de detecção para o diagnóstico e tratamento precoces de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, ou uma predisposição para as mesmas.

Por conseguinte, em um aspecto, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente, administrando à paciente um composto capaz de ligar a sFlt-1, onde a administração é durante um tempo e em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente.

Em um aspecto relacionado, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente administrando à paciente um composto (por exemplo, nicotina, teofilina, adenosina, Nifedipina, Minoxidil, ou Sulfato de Magnésio) que aumenta o nível de um fator do crescimento capaz de ligar a sFlt-1, onde a administração é du30 rante um tempo e em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir préeclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente.

Em outro aspecto relacionado, a invenção proporciona um mé4

todo para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente administrando um anticorpo sFlt-1 purificado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo à paciente durante um tempo e em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente.

Em ainda outro aspecto relacionado, a invenção proporciona um método, para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente administrando à paciente um oligômero de nucleobase anti-sentido complementar a no mínimo uma porção de uma seqüência de ácidos nucléicos sFlt-1, onde a administração é suficiente para tratar ou prevenir pré10 eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente. Em uma modalidade, o oligômero de nucleobase anti-sentido tem 8 a 30 nucleotídeos de extensão.

Em outro aspecto relacionado, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente. O método envolve a etapa de administrar à paciente um RNA de filamento du15 pio (dsRNA) que contém no mínimo uma porção de uma seqüência de ácidos nucléicos sFlt-1, onde a administração é suficiente para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia na paciente. Em uma modalidade, o RNA de filamento duplo é processado em pequenos RNAs interferentes (siRNAs) de 19 a 25 nucleotídeos de extensão.

Em. várias modalidades dos aspectos acima, o composto candidato é um fator do crescimento, tal como, fator do crescimento endotelial vascular (VEGF), inclusive todas as isoformas, tais como, VEGF189, VEGF121, ou VEGF165; fator do crescimento placentário (PIGF), inclusive todas as isoformas; ou fragmentos dos mesmo. Em modalidades preferenci25 ais, o composto candidato é um anticorpo que liga sFlt-1. Em outras modalidades dos aspectos acima, o método envolve adicionalmente administrar a uma paciente um composto anti-hipertensivo. Em ainda outras modalidades dos aspectos acima, a paciente é uma mulher grávida, uma mulher no pósparto, ou é não-humana (por exemplo, uma vaca, uma égua, uma ovelha, uma porca, uma cabra, uma cadela, ou uma gata).

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. O método envolve administrar a

uma paciente que necessite de semelhante tratamento uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica comprèendendo um polipeptídeo VEGF ou PIGF. Em uma modalidade, a composição contém um polipeptídeo VEGF. Em outra modalidade, a composição contém um polipeptídeo PIGF.

Em um aspecto relacionado, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Este método envolve

administrar a uma paciente que necessite de semelhante tratamento uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucléico codificando VEGF ou PIGF. Em uma modalida10 de, a composição contém uma molécula de ácido nucléico VEGF. Em outra modalidade, a composição contém uma molécula de ácido nucléico PIGF.

Em outro aspecto relacionado, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente. O método envolve a etapa de administrar à paciente um composto (por exem15 pio, composto químico, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, ou um fragmento do mesmo) que inibe a ligação do fator do crescimento a um polipeptídeo sFlt-1, onde a administração é suficiente para tratar ou prevenir préeclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente. Em uma modalidade, o composto liga a sFlt-1 e bloqueia a ligação do fator do crescimento.

Em várias modalidades dos aspectos acima, o método adicionalmente envolve a etapa de administrar a uma paciente um composto antihipertensivo (por exemplo, adenosina, Nifedipina, Minoxidil, e Sulfato de Magnésio). Em outras modalidades dos aspectos acima, a paciente é uma mulher grávida, uma mulher no pós-parto, ou não é humana (por exemplo, 25 uma vaca, uma égua, uma ovelha, uma porca, uma cabra, uma cadela, ou uma gata).

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para diagnosticar uma paciente como tendo, ou tendo uma tendência a desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, o método envolve medir o nível de polipeptídeo 30 sFlt-1, VEGF, ou PIGF em uma amostra da paciente.

Em um aspecto relacionado, a invenção proporciona um método para diagnosticar uma paciente como tendo, ou tendo uma tendência a des-

envolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, determinando os níveis de no mínimo dois dos polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF em uma amostra de uma paciente e calculando a relação entre os níveis de sFlt-1 VEGF, ou PIGF usando uma métrica, onde uma alteração na amostra da paciente com relação a 5 uma referência diagnostica pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente.

Em uma modalidade, a métrica é um índice antiangiogênico de préeclâmpsia (PAAI): [sFlt-1/VEGF + PIGF], onde o PAAI é usado como um

indicador de atividade antiangiogênica. Em uma modalidade, um PAAI maior do que 20 é indicativo de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em outra modalida10 de, os níveis de polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF são determinados por um ensaio imunológico, tal como, um ELISA.

Em várias modalidades dos aspectos acima, a amostra é um fluido corporal, tal como, soro ou urina. Em uma modalidade, um nível de sFlt-1 maior do que 2 ng/ml é indicativo de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em modalidades preferenciais dos aspectos acima, o nível de polipeptídeo sFIt- medido é o nível de polipeptídeo sFlt-1 livre, ligado, ou total. Em outras modalidades preferenciais dos aspectos acima, o nível de VEGF ou PIGF é o nível de VEGF ou PIGF livres.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para dia20 gnosticar uma paciente como tendo, ou tendo uma tendência a desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Este método envolve medir o nível de molécula de ácido nucléico sFlt-1, VEGF, ou PIGF em uma amostra da paciente e comparar a mesma com uma amostra de referência, onde uma alteração nos níveis diagnostica pré-eclâmpsia ou eclâmpsia na paciente, ou diagnos25 tica uma tendência a desenvolver pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para diagnosticar uma paciente como tendo, ou tendo uma tendência a desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Este método envolve determinar a seqüência de ácidos nucléicos de um gene sFlt-1, VEGF, ou PIGF em uma paciente e 30 comparar a mesma com uma seqüência de referência, onde uma alteração na seqüência de ácidos nucléicos da paciente que muda o nível de produto genético na paciente diagnostica a paciente com pré-eclâmpsia ou ou eclâmpsia, ou uma tendência a desenvolver pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em uma modalidade, a alteração é um polimorfismo na seqüência de ácidos nucléicos.

Em várias modalidades dos aspectos acima, a amostra é um fluido corporal (por exemplo, urina, líquido amniótico, soro, plasma, ou fluido cerebroespinal) da paciente na qual o sFlt-1, VEGF, ou PIGF é normalmente detectável. Em modalidades adicionais, a amostra é um tecido ou uma célula. Exemplos não-limitantes incluem tecido placentário ou células placentárias, células endoteliais, e leucócitos (por exemplo, monócitos). Em outras 10 modalidades dos aspectos acima, a paciente é uma mulher não-grávida, uma mulher grávida, ou uma mulher no pós-parto. Em outras modalidades dos aspectos acima, a paciente é não-humana (por exemplo, uma vaca, uma égua, uma ovelha, uma porca, uma cabra, uma cadela, ou uma gata). Em outras modalidades dos aspectos acima, no mínimo um dos níveis medido é 15 o nível de sFlt-1 (livre, ligado, ou total). Em outras modalidades dos aspectos acima, quando o nível de VEGF é medido então o nível de sFlt-1 ou PIGF também é medido. Em várias modalidades dos aspectos acima, um aumento no nível de ácido nucléico ou polipeptideo sFlt-1 com relação a uma referência é um indicador diagnóstico de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em outras 20 modalidades dos aspectos acima, uma redução no nível de ácido nucléico

VEGF ou polipeptideo VEGF livre com relação a uma referência é um indicador diagnóstico de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em outras modalidades dos aspectos acima, uma redução no nível de ácido nucléico PIGF ou polipeptídeo PIGF livre com relação a uma referência é um indicador diagnóstico 25 de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

Em modalidades adicionais dos aspectos acima, os níveis são medidos em duas ou mais ocasiões e uma alteração nos níveis entre as medições é um indicador diagnóstico de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em uma modalidade preferencial, o nível de sFlt-1 aumenta da primeira medição para 30 a medição seguinte. Em outra modalidade preferencial, o nível de VEGF ou PIGF diminui da primeira medição para a medição seguinte.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um kit diagnóstico para ο diagnóstico de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos, ou fragmento da mesma, selecionada entre o grupo consistindo em molécula de ácido nucléico sFlt-1, VEGF, e PIGF, ou uma seqüência complementar à mesma, ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade preferencial, o kit compreende no mínimo duas sondas para a detecção de uma molécula de ácido nucléico sFlt-1, VEGF, ou PIGF.

Em um aspecto relacionado, a invenção proporciona um kit para o diagnóstico de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente compreendendo um meio de detecção de um polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o meio de detecção é selecionado entre o grupo consistindo em um ensaio imunológico, um ensaio enzimático, e um um ensaio colorimétrico. Em outras modalidades dos aspectos acima, o kit diagnostica uma tendência a desenvolver préeclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente grávida ou uma não-grávida. Em modalidades preferenciais dos aspectos acima, o kit detecta sFlt-1 ou PIGF. Em outras modalidades preferenciais dos aspectos acima, quando o kit detecta VEGF então sFlt-1 ou PIGF também é detectado.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para identificar um composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, o método envolve por uma célula que expressa uma molécula de ácido nucléico sFlt-1, VEGF, ou PIGF em contato com um composto candidato, e comparar o nível de expressão da molécula de ácido nucléico na célula que está em contato com o composto candidato com o nível de expressão em uma célula de controle que não está em contato com o composto candidato, onde uma alteração na expressão da molécula de ácido nucléico sFlt-1, VEGF, ou PIGF identifica o composto candidato como um composto que melhora préeclâmpsia ou eclâmpsia.

Em uma modalidade, a alteração é uma redução no nível de sFlt-1. Em outras modalidades, a alteração é um aumento no nível de VEGF ou PIGF. Em outras modalidades, a alteração é na transcrição ou na translação. Em outra modalidade, quando o método identifica um composto can didato que aumenta a expressão de VEGF, o composto candidato também aumenta a expressão de PIGF ou reduz a expressão de sFlt-1.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica incluindo um polipeptideo VEGF ou PIGF ou porção do mes5 mo, formulada em um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto relacionado, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucléico PIGF, ou porção do mesmo, formulada em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição adicionalmente contém uma 10 molécula de ácido nucléico VEGF, ou porção do mesmo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo um anticorpo purificado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que liga especifica mente sFlt-1. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo evita a ligação de um fator do crescimento a sFlt-1. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em outras modalidades preferenciais, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo é um anticorpo humano ou humanizado. Em outras modalidades, o anticorpo carece de uma porção Fc. Em ainda outras modalidades, o anticorpo é um

F(ab’)₂, um Fab, ou uma estrutura Fv. Em outras modalidades, o anticorpo 20 ou fragmento de ligação antigênica do mesmo está presente em um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para identificar um composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Este método envolve por uma célula que expressa um polipeptideo sFlt-1, VEGF, ou PIGF em contato com um composto candidato, e comparar o nível de expressão do polipeptideo na célula que está em contato com o composto candidato com o nível de polipeptideo expressão em uma célula de controle que não está em contato com o composto candidato, onde uma alteração na expressão do polipeptideo sFlt-1, VEGF, ou PIGF identifica o composto candidato como um composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em uma modalidade, a alteração na expressão é testada usando um ensaio imunológico, um ensaio enzimático, ou um imunoensaio. Em uma modalida

de, a alteração na expressão é uma redução no nível de sFlt-1. Em outra modalidade, a alteração na expressão é um aumento no nível de VEGF ou PIGF.

Em óutro aspecto, a invenção proporciona um método para identificar um composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. O método envolve por uma célula que expressa um polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF em contato com um Composto candidato, e comparar a atividade biológica do polipeptídeo na célula que está em contato com o composto candidato com o nível de atividade biológica em uma célula de controle que não 10 está em contato com o composto candidato, onde um aumento na atividade biológica do polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF identifica o composto candidato como um composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em uma modalidade, o aumento na atividade biológica é testado usando um ensaio imunológico, um ensaio enzimático, ou um imunoensaio. Em uma 15 modalidade, a alteração na expressão é uma redução na atividade de sFlt-1.

Em outra modalidade, a alteração na expressão é um aumento na atividade de VEGF ou PIGF.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para identificar um composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. O método 20 envolve detectar ligação entre um polipeptídeo sFlt-1 e um fator do crescimento na presença de um composto candidato, onde uma redução na ligação, com relação à ligação entre o polipeptídeo sFlt-1 e o fator do crescimento na ausência do composto candidato identifica o composto candidato como um composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em uma mo25 dalidade, o fator do crescimento é VEGF. Em outra modalidade, o fator do crescimento é PIGF.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para identificar um polipeptídeo, ou fragmento da mesma, que evita a ligação entre um polipeptídeo sFlt-1 e um fator do crescimento. O método envolve de30 tectar ligação entre um polipeptídeo sFlt-1 e um fator do crescimento na presença do polipeptídeo candidato, onde uma redução na ligação, com relação à ligação entre o polipeptídeo sFlt-1 e o fator do crescimento na au

sência do polipeptídeo candidato identifica o polipeptídeo candidato como um polipeptídeo que evita a ligação entre um polipeptídeo sFlt-1 e um fator do crescimento. Em uma modalidade, o fator do crescimento é VEGF. Em outra modalidade, o fator do crescimento é PIGF.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para identificar um composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, compreendendo detectar a ligação de um polipeptídeo sFlt-1 e um composto candidato, onde um composto que liga o polipeptídeo sFlt-1 melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

Em um aspecto relacionado, a invenção proporciona um composto identificado de acordo com o aspecto anterior, onde o composto é um polipeptídeo que especificamente liga um polipeptídeo sFlt-1 e evita que o polipeptídeo sFlt-1 ligue a VEGF ou PIGF. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo é um anticorpo. Em outra modalidade preferencial, o polipeptídeo é um fragmento de sFlt-1, VEGF, ou PIGF.

Em modalidades preferenciais dos aspectos acima, o composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia reduz os níveis de expressão ou atividade biológica de sFlt-1. Em modalidades preferenciais dos aspectos acima, o composto que melhora pré-eclâmpsia ou eclâmpsia aumenta os níveis de expressão ou atividade biológica de VEGF ou PIGF.

Para os fins da presente invenção, as abreviações e termos seguintes são definidos abaixo.

Por alteração se indica uma mudança (aumento ou redução) nos níveis de expressão de um gene ou polipeptídeo conforme detectado por métodos conhecidos na técnica de rotina tais como os descritos acima. Conforme usado neste relatório, um aumento ou redução inclui uma mudança de 10% nos níveis de expressão, preferencialmente uma mudança de 25%, mais preferencialmente uma mudança de 40%, e ainda mais preferencialmente uma mudança de 50% ou maios nos níveis de expressão. Alteração também pode indicar uma alteração (aumento ou redução) na atividade biológica de quaisquer dos polipeptídeos da invenção (por exemplo, sFlt-1, VEGF, ou PIGF). Exemplos de atividade biológica para PIGF ou VEGF in

cluem ligação a receptores conforme medido por imunoensaios, testes de ligação de ligante ou análise de plotagem de Scatchard, e indução de proliferação ou migração celular conforme medido por marcação BrdU, experimentos de contagem celular, ou testes quantitativos para síntese de DNA, tais como, incorporação de ³H-timidina. Exemplos de atividade biológica para sFlt-1 incluem ligação a PIGF e VEGF conforme medido por imunòensaios, testes de ligação de ligante, ou análise de plotagem de Scatchard. Exemplos adicionais de atividade biológica para cada um dos polipeptídeos são descritos neste relatório. Conforme usado neste relatório, um aumento ou redução inclui uma mudança de 10% na atividade biológica, preferencialmente uma mudança de 25%, mais preferencialmente uma mudança de 40%, e ainda mais preferencialmente uma mudança de 50% ou mais na atividade biológica.

Por oligômero de nucleobase anti-sentido se indica um oligômero de nucleobase, independente da extensão, que é complementar ao filamento codificante ou RNAm de um gene sFlt-1. Por um oligômero de nucleobase se indica um composto que inclui uma cadeia de no mínimo oito nucleobases, preferencialmente no mínimo doze, e ainda mais preferencialmente no mínimo dezesses bases, unidas juntas por grupamentos de ligação. Incluídos nesta definição estão oligonucleotídeos naturais e nãonaturais, tanto modificados quanto não-modificados, bem como, oligonucleotídeo miméticos, tais como, Ácidos Nucléicos de Proteínas, ácidos nucléicos travados (locked), e ácidos arabinonucléicos. Numerosas nucleobases e grupamentos de ligação podem ser empregados nos oligômeros de nucleobase da invenção, inclusive os descritos nos Requerimentos de Patente U.S. N^os. 20030114412 e 20030114407, incorporados a este relatório por meio de referência. O oligômero de nucleobase também pode ser orientado para os sítios de início e de parada translacional. Preferencialmente o oligômero de nucleobase anti-sentido compreende a partir de cerca de 8 a 30 nucleotídeos. O oligômero de nucleobase anti-sentido também pode conter no mínimo 40, 60, 85, 120, ou mais nucleotídeos consecutivos que são complementares ao RNAm ou DNA de sFlt-1, e pode ser tão comprido

quanto o gene ou RNAm de extensão total.

Por composto se indica qualquer pfequena molécula composto químico, anticorpo, molécula de ácido nucléico, ou polipeptídeo, ou fragmentos dos mesmos.

Por anticorpo quimérico se indica um polipeptídeo compreendendo no mínimo a porção de ligação de antígeno de uma molécula de anticorpo encadeada a no mínimo parte de outra proteína (tipicamente um domínio constante de imunoglobulina).

Por RNA de filamento duplo (dsRNA) se indica uma molécula 10 de ácido ribonucléico consistindo em tanto um filamento de sentido quanto um anti-sentido. dsRNAs são tipicamente usados para mediar interferência de RNA.

Por expressão se indica a detecção de um gene ou polipeptídeo por métodos conhecidos na técnica de rotina. Por exemplo, a expressão 15 do polipeptídeo é frequentemente detectada por Western blotting, a expressão do DNA é freqüentemente detectada por Southern blotting ou reação de cadeia polimerase (PCR), e a expressão do RNA é freqüentemente detectada por Northern blotting, PCR, ou testes de proteção de RNAse.

Por fragmento se indica uma porção de um polipeptídeo ou 20 molécula de ácido nucléico. Esta porção contém, preferencialmente, no mínimo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, ou 60% de todo o comprimento da molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo de referência. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100, 200, 300, 400, 500, 600,

700, 800, 900, ou 1000 nucleotídeos ou aminoácidos.

Por homólogo se indica qualquer gene ou seqüência de proteína que possui no mínimo 30% de homologia, mais preferencialmente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, e ainda mais preferencialmente 90% ou mais de homologia a um gene ou seqüência de proteína conhecidos sobre a extensão da seqüência de comparação. Uma proteína homóloga também 30 pode ter no mínimo uma atividade biológica da proteína de comparação.

Para os polipeptídeos, a extensão das seqüências de comparação geralmente será de no mínimo 16 aminoácidos, preferencialmente no mínimo /51 aminoácidos, mais preferencialmente no mínimo 25 aminoácidos, e ainda mais preferencialmente 35 aminoácidos òu mais. Para os ácidos nucléicos, a extensão das seqüências de comparação geralmente será de no mínimo 50 nucleotídeos, preferencialmente no mínimo 60 nucleotídeos, mais prefe5 rencialmente no mínimo 75 nucleotídeos, e ainda mais preferencialmente no mínimo. 110 nucleotídeos. Homologia” também pode ser referir a uma substancial similaridade entre um epítope usado para produzir anticorpos e a proteína ou o fragmento da mesma ao qual os anticorpos são dirigidos. Neste caso, homologia refere-se a uma similaridade suficiente para provocar I 10 a produção de anticorpos que podem reconhecer especificamente a proteína em questão.

Por anticorpo humanizado se indica uma variante de seqüência de aminoácidos de imunoglobulina ou fragmento da mesma que é capaz de ligar a um predeterminado antígeno. Ordinariamente, o anticorpo conterá 15 tanto a cadeia leve, bem como, no mínimo o domínio variável de uma cadeia

pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões CH1, de articulação, CH2, CH3, ou CH4 da cadeia pesada. O anticorpo humanizado compreende uma região de estrutura (FR) tendo substancialmente a seqüência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e uma região determinante de 20 complementaridade (CDR) tendo substancialmente a seqüência de aminoácidos de uma imunoglobulina não-humana (as seqüências de importação).

De modo geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos aminoácidos introduzidos no mesmo de uma fonte que é não-humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos 25 de no mínimo um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc, Fv) nos quais todos ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às regiões de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as regiões de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente 30 compreenderá no mínimo uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a região constante de uma imunoglobulina humana.

Por região determinante de complementaridade (CDR) se indica as três seqüências hipervariáveis nas regiões variáveis dentro de cada uma das cadeias leve e pesada da imunoglobulina.

Por região de estrutura (FR) se indica as seqüências de ami5 noácidos localizadas em qualquer lado das três seqüências hipervariáveis (CDR) das cadeias leve e pesada da imunoglobulina.

As regiões FR e CDR do anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente às seqüências parentais, por exemplo, o CDR de importação ou o FR de consenso podem ser mutagenizados por substi10 tuição, inserção ou eliminação de no mínimo um resíduo de modo que o resíduo CDR ou FR neste local não corresponde ao anticorpo de importação ou ao de consenso. As mutações referidas, no entanto, não serão extensivas. Geralmente, no mínimo 75%, preferencialmente 90%, e ainda mais preferencialmente no mínimo 95% dos resíduos de anticorpos humanizados corresponderão aos de seqüências parentais FR e CDR.

Por hibridizar se indica paridade para formar uma molécula de filamento duplo entre seqüências de polinucleotídeos complementares, ou porções da mesma, sob várias condições de estringência. (Ver, por exemplo, Wahl e Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, Methods 20 Enzymol. 152:507, 1987.) Por exemplo, a concentração salina estringente ordinariamente terá menos de cerca de 750 mM de NaCI e 75 mM de citrato trissódico, preferencialmente menos de cerca de 500 mM de NaCI e 50 mM de citrato trissódico, e ainda mais preferencialmente menos de cerca de 250 mM de NaCI e 25 mM de citrato trissódico. Pode ser obtida hibridização de baixa estringência na ausência de solvente orgânico, por exemplo, formamida, enquanto hibridização de alta estringência pode ser obtida na presença de no mínimo cerca de 35% de formamida, e ainda mais preferencialmente no mínimo cerca de 50% de formamida. Condições de temperatura estringentes ordinariamente incluirão temperaturas de no mínimo cerca de 30°C, mais preferencialmente de no mínimo cerca de 37°C, e ainda mais preferencialmente de no mínimo cerca de 42°C. Parâmetros adicionais variáveis, tais como, tempo de hibridização, a concentração de detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), e a inclusão ou exclusão de DNA de veículo, são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Vários níveis de estringência são conseguidos combinando estas várias condições conforme necessário. Em uma modalidade preferencial, ocorrerá hibridização a 30°C 5 em 750 mM de NaCI, 75 mM de citrato trissódico, e 1% de SDS. Em uma modalidade mais preferencial, ocorrerá hibridização a 37°C e, 500 mM de

NaCI, 50 mM de citrato trissódico, 1% de SDS, 35% de formamida, e 100

pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado (ssDNA). Em uma modalidade ainda mais preferencial, ocorrerá hibridização a 42°C em 250 mM de 10 NaCI, 25 mM de citrato trissódico, 1% de SDS, 50% de formamida, e 200 pg/ml de ssDNA. Variações úteis destas condições serão prontamente evidentes para os versados na técnica.

Para a maioria das aplicações, as etapas de lavagem que seguirão a hibridização também variarão em estringência. As condições de es15 tringência de lavagem podem ser definidas pela concentração salina e pela temperatura. Como acima, a estringência de lavagem pode ser aumentada reduzindo a concentração salina ou aumentando a temperatura. Por exemplo, uma concentração salina estringente para as etapas de lavagem serão preferencialmente menos de cerca de 30 mM de NaCI e 3 mM de citrato tris20 sódico, e ainda mais preferencialmente menos de cerca de 15 mM de NaCI e 1,5 mM de citrato trissódico. Condições de temperatura estringente para as etapas de lavagem geralmente incluirão uma temperatura de no mínimo cerca de 25°C, mais preferencialmente de no mínimo cerca de 42°C, e ainda mais preferencialmente de no mínimo cerca de 68°C. Em uma modalidade 25 preferencial, as etapas de lavagem ocorrerão a 25°C em 30 mM de NaCI, 3 mM de citrato trissódico, e 0,1% de SDS. Em uma modalidade mais preferencial, as etapas de lavagem ocorrerão a 42°C em 15 mM de NaCI, 1,5 mM de citrato trissódico, e 0,1% de SDS. Em uma modalidade ainda mais preferencial, as etapas de lavagem ocorrerão a 68°C em 15 mM de NaCI, 1,5 mM 30 de citrato trissódico, e 0,1% de SDS. Variações adicionais destas condições serão prontamente evidentes para os versados na técnica. As técnias de hibridização são de conhecimento geral das pessoas versadas na técnica e

são descritas, por exemplo, em Benton e Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein e Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger e Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, 5 Academic Press, New York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Por retardo do crescimento intrauterino (RCIU)” se indica uma síndrome que resulta em um peso ao nascer o qual é menor do que 10 por cento do peso fetal previsto para a idade gestacional do feto. O critério cor10 rente da Organização Mundial de Saúde para baixo peso ao nascer é um peso menor que 2.500 gm (5 libras e 8 onças.) ou abaixo do 10° percentil para a idade gestacional de acordo com as tabelas U.S. de peso ao nascer para idade gestacional por raça, paridade, e sexo do bebê (Zhang e Bowes, Obstet. Gynecol. 86:200-208, 1995). Estes bebês de baixo peso ao nascer também são referidos como pequenos para a idade gestacional (N.T., em inglês, SGA). Pré-eclâmpsia é uma condição que se sabe que está associada com RCIU ou SGA.

Por métrica se indica uma medida. Pode ser usada uma métrica, por exemplo, para comparar os níveis de uma molécula de ácido nucléi20 co ou polipeptideo de interesse. Métricas típicas incluem, mas não estão limitadas a, fórmulas matemáticas ou algoritmos, tais como, proporções. A métrica a ser usada é a que melhor discrimina entre níveis de sFlt-1, VEGF, ou PIGF em uma paciente tendo pré-eclâmpsia ou eclâmpsia e uma paciente de controle normal. Dependendo da métrica que é usada, o indicador diagnóstico de eclâmpsia ou pré-eclâmpsia pode estar significativamente acima ou abaixo de um valor de referência (por exemplo, de uma paciente controle não tendo pré-eclâmpsia ou eclâmpsia).

O nível de sFlt-1 é determinado medindo a quantidade de sFlt-1 livre, ligado (isto é, ligado a fator do crescimento), ou total (ligado + livre). Os níveis de VEGF ou PIGF são determinados medindo a quantidade de PIGF livre ou de VEGF livre (isto é, não ligados a sFlt-1). Uma métrica típica é [sFlt-1/(VEGF + PIGF)], também referida como o índice antiangiogênico pré eclâmpsia (PAAI).

Por índice antiangiogênico pré-eclâmpsia (PAAI) se indica a proporção de sFlt-1/VEGF + PIGF usada como um indicador da atividade antiangiogênica. Um PAAI maior do que 20 é considerado indicativo de pré5 eclâmpsia ou risco de pré-eclâmpsia.

Por encadeado operavelmente” se indica que um gene e uma ou mais sequências regulatórias estão conectadas de tal maneira de modo a

permitir a expressão genética quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras transcripcionais) são ligadas à seqüência ou às 10 seqüências regulatórias.

Por veículo farmaceuticamente aceitável se indica um veículo que é fisiologicamente aceitável para o mamífero tratado ao mesmo tempo que retendo as propriedades terapêuticas do composto com o qual é administrado. Uma substância típica de veículo farmaceuticamente aceitável é 15 salina fisiológica. Outros veículos fisiologicamente aceitáveis e suas formulações são de conhecimento das pessoas versadas na técnica e estão descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, (20^th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

Por placentário fator do crescimento (PIGF) se indica um fator do crescimento mamífero que é homólogo à proteína definida pelo número de acesso do GenBank P49763 e que tem atividade biológica de PIGF. PIGF é um homodímero glicosilado pertencente à família VEGF e pode ser encontrado em duas isoformas distintas através de mecanismos de união alternativos. PIGF é expresso por cito- e sinciciotrofoblastos na placenta e 25 atividades biológicas de PIGF incluem indução de proliferação, migração, e ativação de células endoteliais, particularmente células trofoblásticas.

Por pré-eclâmpsia se indica o distúrbio multi-sistema que se caracteriza por hipertensão com proteinúria ou edema, ou ambas, disfunção glomerular, edema cerebral, edema hepático, ou anormalidades da coagula30 ção devidas a gravidez ou a influência de uma gravidez recente. Geralmente pré-eclâmpsia ocorre depois da 20^a semana de gestação. A pré-eclâmpsia é geralmente definida como alguma combinação dos seguintes sintomas: (1) /6 Τ' uma pressão sangüínea sistólica (BP) >140 mm Hg e uma pressão sangüínea diastólica (BP) >90 mm Hg depois de 20 semanas de gestação (geralmente medida em duas ocasiões, com 4-168 horas de diferença), (2) novo início de proteinúria (1+ por dipstik na análise urinária, >300mg de proteína 5 em uma coleta de urina de 24 horas, ou uma única amostra de urina aleató-

ria tendo uma proporção de proteína/creatinina >0,3), e (3) resolução da hipertensão e da proteinúria por volta de 12 semanas pós-parto. A préeclâmpsia severa é geralmente definida como (1) uma pressão sangüínea diastólica BP > 110 mmHg (geralmente medida em duas ocasiões, com 410 168 horas de diferença) ou (2) proteinúria caracterizada por uma medição de 3,5 g ou mais de proteína em uma coleta de urina de 24 horas ou duas amostras de urina aleatória com no mínimo 3+ proteína por dipstick. Na pré-eclâmpsia, geralmente ocorre hipertensão e proteinúria dentro de sete dias uma da outra. Na pré-eclâmpsia severa, hipertensão severa, proteinúria severa e síndrome de HELLP (hemólise, enzimas hepáticas elevadas, baixo teor de plaquetas) ou eclâmpsia podem ocorrer simultaneamente ou somente um sintoma de cada vez. Ocasionalmente, a pré-eclâmpsia severa pode levar ao desenvolvimento de ataques. Esta forma grave de síndrome é referida como eclâmpsia. Eclâmpsia também pode incluir disfunção ou le20 são de vários órgãos ou tecidos, tais como, o fígado (por exemplo, lesão hepatocelular, necrose periportal) e o sistema nervoso central (por exemplo, edema cerebral e hemorragia cerebral). Acredita-se que a etiologia dos ataques seja secundária ao desenvolvimento de edema cerebral e espasmo focal de pequenos vasos sangüíneos no rim.

Por proteína ou polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo se indica qualquer cadeia de mais de dois aminoácidos, independente de modificação pós-translacional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação), constituindo todo ou parte de um polipeptídeo ou peptídeo que não-ocorre naturalmente, ou constituindo um polipeptídeo ou peptídeo que não-ocorre naturalmente.

Por reduzir ou inibir se indica a capacidade para causar uma redução global preferencialmente de 20% ou mais, mais preferencialmente

de 50% ou mais, e ainda mais preferencialmente de 75% ou mais, no nível de proteína ou ácido nucléico, detectada pelos testes supracitados (ver a expressão), quando comparado a amostras não-tratadas com oligômeros de nucleobase anti-sentido ou dsRNA usados para interferência de RNA.

Por pequenos RNAs interferentes (siRNAs) se indica uma molécula de dsRNA isolada, preferencialmente maior do que 10 nucleotídeos de extensão, mais preferehcialmente maior do que 15 nucleotídeos de extensão, e e mais preferencialmente maior do que 19 nucleotídeos de exten-

são que é usada para identificar o gene alvo ou RNAm a ser degradado. Um 10 alcance de 19 a 25 nucleotídeos é o tamanho mais preferencial para siRNAs. siRNAs também podem incluir RNAs de grampo curto nos quais ambos os filamentos de um dupléx siRNA estão incluídos dentro de uma única molécula de RNA. siRNA inclui qualquer forma de dsRNA (produtos clivados proteoliticamente de dsRNA maior, RNA parcialmente purificado, RNA es15 sencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido de modo recombinante) bem como RNA alterado que difere de RNA que ocorre naturalmente pela adição, eliminação, substituição, e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. As alterações referidas podem incluir a adição de material não-nucleotídeo, tal como, a extremidade ou extremidades do RNA 21 a 23 nt ou interna20 mente (em um ou mais nucleotídeos do RNA). Em uma modalidade preferencial, as moléculas de RNA contêm um grupamento 3’hidroxila. Nucleotídeos nas moléculas de RNA da presente invenção também podem compreender nucleotídeos não de rotina, inclusive nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou deoxirribonucleotídeos. Coletivamente, todos os RNAs alte25 rados referidos são referidos como análogos de RNA. siRNAs da presente invenção somente precisam ser suficientemente semelhantes ao RNA natural pelo fato de ter a capacidade de mediar interferência de RNA (RNAi). Conforme usado neste relatório, RNAi refere-se à clivagem orientada ATPdependente e degradação de uma molécula de RNAm específica através da 30 introdução de pequenos RNAs ou dsRNAs interferentes em uma célula ou um organismo. Conforme usado neste relatório mediar RNAi refere-se à capacidade para distinguir ou identificar quais RNAs serão degradados.

Por Flt-1 solúvel (sFlt-1) (também conhecido como sVEGF-RI) se indica a forma solúvel do receptor Flt-1, que é homólogo à proteína definida pelo número de acesso no GenBank U01134, e que tem atividade biológica de sFlt-1. A atividade biológica de um polipeptídeo sFlt-1 pode ser 5 avaliada usando qualquer método de rotina, por exemplo, avaliando a ligação de sFlt-1 a VEGF. sFlt-1 carece do domínio transmembrana e do domínio de tirosina quinase citoplásmico do receptor Flt-1. sFlt-1 pode ligar a VEGF e PIGF ligam com alta afinidade, mas não pode induzir proliferação ou angiogênese e portanto é funcionalmente diferente dos receptores Flt-1 e 10 KDR. sFlt-1 foi inicialmente purificado a partir de células endoteliais umbilicais humanas e posteriormente foi demonstrado que é produzido por células de trofoblasto in vivo. Conforme usado neste relatório, sFlt-1 inclui qualquer membro ou isoforma da família sFlt-1.

Por liga especificamente se indica um composto ou anticorpo o 15 qual reconhece e liga um polipeptídeo da invenção mas que não reconhece substancialmente e liga outras moléculas em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica, a qual naturalmente inclui um polipeptídeo da invenção. Em um exemplo, um anticorpo que liga especifica mente sFlt-1 não liga Flt-1.

Por indivíduo se indica um mamífero, inclusive, mas não limitado a, um mamífero humano ou não-humano, tal como um bovino, eqüino, canino, ovino, ou felini. Incluídos nesta definição estão mamíferas grávidas, no pós-parto, e não-grávidas.

Por essencialmente idêntica se indica uma seqüência de ami25 noácidos a qual difere somente por substituções de aminoácidos conservadoras, por exemplo, substituição de um aminoácido por outro da mesma classe (por exemplo, valina por glicina, arginina por lisina, e etc.) ou por uma ou mais substituções não-conservadoras, eliminações, ou inserções localizadas em posições da seqüência de aminoácidos as quais não destróem a função da proteína. Preferencialmente, a seqüência de aminoácidos é no mínimo 70%, mais preferencialmente no mínimo cerca de 80%, e ainda mais preferencialmente no mínimo cerca de 90% homóloga a outra seqüência de aminoácidos. Métodos para determinar identidade estão disponíveis em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador para determinar identidade entre duas seqüências incluem, mas não estão limitados a, o pacote de programa GCG (Devereux et al., 5 Nucleic Acids Research 12: 387, 1984), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). Também pode ser usado o algoritmo de Smith Waterman conhecido de modo geral para determinar identidade. O programa BLAST está disponível publicamente na NCBI e em outras fontes (BLAST Manual, Altschul, et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD b 10 20894; BLAST 2.0 em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Estes programas de software combinam seqüências semelhantes atribuindo graus de semelhança a várias substituições, eliminações, e outras modificações. Substituições conservadoras tipicamente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido 15 glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina.

Por sintomas de pré-eclâmpsia se indica qualquer um dos seguintes: (1) uma pressão sangüínea sistólica (BP) >140 mmHg e uma pressão sanguínea diastólica BP >90 mmHg depois de 20 semanas de gesta20 ção, (2) novo início de proteinúria (1+ por dipstik na análise urinária, >300mg de proteína em uma coleta de urina de 24 horas, ou proporção de proteína/ creatinina na urina aleatória >0,3), e (3) resolução de hipertensão e proteinúria por volta de 12 semanas após o parto. Os sintomas de pré-eclâmpsia também podem incluir disfunção renal e endoteliose ou hipertrofia glomeru25 lar. Por sintomas de eclâmpsia se indica o desenvolvimento de qualquer um dos seguintes sintomas devido a gravidez ou à influência de uma gravidez recente: ataques, coma, trombocitopenia, edema hepático, edema pulmonar, e edema cerebral.

Por quantidade terapêutica se indica uma quantidade que 30 quando administrada a uma paciente que esteja sofrendo de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia é suficiente para causar uma redução qualitativa ou quantitativa nos sintomas de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia conforme descrito neste

relatório. Uma quantidade terapêutica também pode significar uma quantidade que quando administrada a uma paciente que esteja sofrendo de préeclâmpsia ou eclâmpsia é suficiente oara causar uma redução nos níveis de expressão de sFlt-1 ou um aumento nos níveis de expressão de VEGF ou 5 PIGF conforme medido pelos testes descritos neste relatório.

Por tratar se indica administrar um composto ou uma composi-

ção farmacêutica para fins profiláticos e/ou terapêuticos. Tratar doença ou usar para tratamento terapêutico refere-se a administrar tratamento a uma paciente que já esteja sofrendo de uma doença para melhorar a condição da 10 paciente. Preferencialmente, a paciente é diagnosticada como sofrendo de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia com base na identificação de qualquer um dos sintomas característicos descritos abaixo ou na aplicação dos métodos diagnósticos descritos neste relatório. Prevenir doença refere-se a tratamento profilático de uma paciente que ainda não esteja doente, mas que seja sus15 cetível a, ou de outro modo em risco de, desenvolver uma doença em particular. Preferencialmente uma paciente é determinada como estando em risco de desenvolver pré-eclâmpsia ou eclâmpsia usando os métodos diagnósticos descritos neste relatório. Portanto, nas reivindicações e modalidades, tratar é a administração a um mamífero ou para fins terapêuticos ou 20 profiláticos.

Por trofoblasto se indica a camada de células mesectodérmicas cobrindo o blastocisto que erode a mucosa uterina e através da qual o embrião recebe nutrição da mãe; as células contribuem para a formação da placenta.

Por fator do crescimento endotelial vascular (VEGF) se indica um fator do crescimento mamífero que é homólogo ao fator do crescimento definido nas Patentes U.S. N^os 5.332.671; 5.240.848; 5.194.596; e Charnock-Jones et al. (Biol. Reproduction, 48: 1120-1128, 1993), e tem atividade biológica de VEGF. VEGF existe como um homodímero glicosilado e inclui 30 no mínimo quatro isoformas diferentes alternativamente unidas. A atividade biológica de VEGF nativo inclui a promoção do crescimento seletivo de células endoteliais vasculares ou células endoteliais da veia umbilical e indu

ção de angiogênese. Conforme usado neste relatório, VEGF inclui qualquer membro ou isoforma da família de VEGF (por exemplo, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF189, VEGF165, ou VEGF 121). Preferencialmente, VEGF é a isoforma VEGF121 ou VEGF165 (Tischer et al., J. Biol.

Chem. 266, 11947-11954, 1991; Neufed et al. Câncer Metastasis 15:153158, 1996), a qual é descrita nas Patentes U.S. N°^s. 6.447.768; 5.219.730; e

5.194.596, por meio deste, incorporadas a este relatório por meio de referência. Também são incluídas formas mutantes de VEGF, tais como, a VEGF

KDR-seletiva e VEGF Flt-seletiva descritas em Gille et al. (J. Biol. Chem.

276:3222-3230, 2001). Embora seja preferencial VEGF humana, a invenção não está limitada a formas humanas e pode incluir outras formas animais de VEGF (por exemplo, camundongo, rato, cachorro, ou frango).

Por vetor se indica uma molécula de DNA, geralmente derivada de um plasmídeo ou bacteriófago, na qual fragmentos de DNA podem ser inseridos ou clonados. Um vetor recombinante conterá um ou mais sítios únicos de restrição, e pode ser capaz de replicação autônoma em um organismo de veículo ou hospedeiro definido de tal modo que a seqüência clonada é reprodutível. Um vetor contém um promotor encadeado operavelmente a um gene ou região codificante de tal modo que, na transfecção 20 para uma célula receptora, é expresso um RNA.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição das modalidades preferenciais da mesma, e das reivindicações.

Descrição Resumida dos Desenhos

A Figura 1 mostra expressão de RNAm e de proteína sFlt-1 na pré-eclâmpsia. A Figura 1A mostra expressão de RNAm de sFlt-1 placentário de três pacientes com pré-eclâmpsia (P1, P2, P3) e três mulheres grávidas normotensas a termo (N1, N2, N3) conforme determinado por meio de análise Northern blot. A maior banda (7,5 kb) é o RNAm flt-1 de extensão total e a menor banda e mais abundante (3,4 kb) é o RNAm de sFlt-1 alternativamente unido. GAPDH é incluído como um controle e a ponta da seta indica 28S RNA. As pacientes P1 e P2 tinham pré-eclâmpsia severa, ao

passo que a paciente P3 tinha pré-eclâmpsia branda. A Figura 1B é um gráfico mostrando os níveis de sFlt-1 no soro de pacientes com pré-eclâmpsia branda (PE branda), pacientes com pré-eclâmpsia severa (PE severa), e mulheres grávidas normotensas a termo (normal). Os níveis de sFlt-1 foram 5 medidos por um ELISA realizado para sFlt-1 usando um kit disponível co-

mercialmente (R & D Systems, Minneapolis, MN). Pacientes com partos prétermo por outros motivos (pré-termo) foram incluídas como controles adicionais para excluir alterações específicas da idade gestacional. O número de pacientes testadas é apresentado entre parênteses no eixo X. Foram colhi10 das amostras antes do parto (t=0) e 48 horas depois do parto (t=48). A Figura 1C é um gráfico mostrando proporções do índice anti-angiogênese (PAAI=sFlt-1/(VEGF + PIGF)) proporções por ocasião do parto (t=0) conforme determinado por ELISA para todas as pacientes descritas na Figura 1B.

As Figuras 2A-2F são fotomicrografias mostrando o efeito anti15 angiogênico do excesso de sFlt-1 na pré-eclâmpsia. Foram realizados testes de tubo endotelial usando soro de quatro controles grávidas normais e quatro pacientes com pré-eclâmpsia. É mostrado um experimento representativo de uma paciente controle normal e uma paciente com pré-eclâmpsia. As Figuras 2A, 2B, e 2C mostram testes realizados usando soro de uma paci20 ente normal, enquanto as Figuras 2D, 2E, e 2F mostram testes realizados usando soro de uma paciente com pré-eclâmpsia. Na Figura 2A, t=0 (10% do soro de uma mulher grávida normal a termo); na Figura 2B, t=48 (10% do soro de mulher grávida normal 48 horas depois do parto); na Figura 2C, t=0 + sFlt-1 exógeno (10 ng/ml); na Figura 2D, t=0 (10% do soro de mulher pré25 eclâmptica antes do parto); na Figura 2E, t=48 (10% do soro de mulher préeclâmptica 48 horas depois do parto); e na Figura 2F, t=0 + VEGF exógeno (10 ng/ml) + PIGF (10 ng/ml). O teste de tubo foi quantificado e a extensão média do tubo +/- SEM é apresentada em pixeis na parte de baixo de cada painel.

As Figuras 3A e 3B são gráficos mostrando que a inibição de

VEGF e PIGF induziu vasodilatação de microvasos renais por sFlt-1. A Figura 3A mostra que o aumento nas reações de relaxamento de arteríolas re

nais de rato para sFlt-1 (S), VEGF (V), PIGF (P) foi medida em três doses diferentes. V+ e P+ representam reações vasodilatadoras dos reagentes individuais na presença de sFlt-1 a 100 ng/ml. Todos os experimentos foram feitos em 6 microvasos renais de ratos dissecados diferentes e os dados

são apresentados como média +/- SEM. O * representa a importância estatística çom p<0,01 comparados com reagentes individuais somente. A Figura 3B mostra o aumento nas reações de relaxamento em doses fisiológicas: VEGF 100 pg/ml (V), PIGF 500 pg/ml (P), sFlt-1 10 ng/ml (S), VEGF (100 pg/ml) + PIGF 500 pg/ml (V +P) ou VEGF (100 pg/ml) + PIGF 500 pg/ml + 10 sFlt-1 10 ng/ml (V + P + S). Todos os experimentos foram feitos em 6 microvasos renais de ratos dissecados diferentes e os dados são apresentados como média +/- SEM. O * representa a importância estatística com p<0,05 comparados com V+P.

As Figuras 4A e 4B mostram indução por sFlt-1 de endoteliose glomerular. A Figura 4A é uma fotomicrografia mostrando fingimento com hematoxilina e epsina (Η & E) em uma oclusão capilar nos animais tratados com sFlt-1 com glomérulos dilatados e citoplasma inchado comparados com controles. Endoteliose glomerular com citoplasma bolhoso é mostrada nos animais tratados com sFlt-1 em tintura com schiffde ácido periódico (PAS). 20 Todas as fotografias de microscopia ótica foram tiradas a 60X, ampliação original. A Figura 4B é uma micrografia eletrônica de glomérulos tratados com sFlt-1 que confirma o entumescimento citoplasmático das células endocapilares. A imunofluorescência (IF) para fotografias de fibrina foram tiradas a 40X e as fotografias de EM foram tiradas a 2400X, ampliação original. To25 das as figuras foram reproduzidas em ampliações idênticas.

As Figuras 5A-5C mostram os níveis de sFlt-1 medidos antes e depois do início da pré-eclâmpsia por idade gestacional. A Figura 5A é um gráfico mostrando as concentrações séricas médias em pg/ml para pacientes controles normotensas (linha mais clara com triângulos abertos), casos 30 antes da pré-eclâmpsia (círculos cheios), e casos depois da pré-eclâmpsia amostras de desfecho - (quadrados cheios) dentro de janelas de 4-5 semanas de idade gestacional antes do início do trabalho de parto. Os parên

teses indicam erro padrão da média. Asteristicos indicam diferenças significantes com respeito a amostras de controle dentro da mesma janela de idade gestacional depois de transformação logarítmica: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. A Figura 5B é um gráfico mostrando as concentrações séricas médias de sFItl em pg/ml para casos antes e depois do início da préeclâmpsia dentro de intervalos de semanas antes da pré-eclâmpsia. PE in-

dica a média aritmética de 43 amostas de desfecho (obtidas em ou após o início da pré-eclâmpsia). A idade gestacional média (em dias) é indicada dentro de parênteses abaixo de cada intervalo de tempo. A linha horizontal 10 indica o nível nas amostras de desfecho. As linhas verticais demarcam o período <5 semanas antes da pré-eclâmpsia. A Figura 5C é um gráfico mostrando as concentrações séricas médias de sFlt-1 em pg/ml por janelas de idade gestacional para pacientes controles normotensas e casos antes da pré-eclâmpsia, depois excluindo amostras obtidas dentro de 5 semanas 15 do início da pré-eclâmpsia. Não há diferenças importantes.

As Figuras 6A-6C mostram os níveis de PIGF antes e depois da pré-eclâmpsia por idade gestacional. A Figura 6A é um gráfico mostrando os níveis de PIGF em todas as amostras obtidas antes do trabalho de parto e do parto. Os parênteses indicam erro padrão da média. Asteriscos indicam differenças significantes com respeito a amostras de controle dentro do mesmo intervalo depois de transformação logarítmica: **p<0,01, ***p<0,001.

A Figura 6B é um gráfico mostrando as concentrações séricas médias de

PIGF em pg/ml para casos antes e depois do início da pré-eclâmpsia dentro de intervalos de semanas antes da pré-eclâmpsia. PE indica a média arit25 mética de 43 amostras de desfecho (obtidas em ou depois do início da préeclâmpsia). A idade média gestacional (em dias) é indicada dentro de pa rênteses abaixo de cada intervalo de tempo. A linha horizontal indica o nível nas amostras de desfecho. As linhas verticais demarcam o período <5 se manas antes da pré-eclâmpsia. A Figura 6C é um gráfico mostrando as con30 centrações séricas médias de PIGF em pg/ml por janelas de idade gestacional para pacientes controles normotensas e casos de início da pré eclâmpsia.

As Figuras 7A e 7B mostram os níveis de sFlt-1 e PIGF por condição pré-eclâmpsia e severidade. A Figura 7A é um gráfico mostrando a média aritmética das concentrações séricas de sFlt-1 (barras pretas) e PIGF (barras brancas) em 23-32 semanas de gestação em controles e casos (antes do início da doença clínica) com pré-eclâmpsia branda, pré-eclâmpsia severa, pré-eclâmpsia com início <37 semanas, pré-eclâmpsia com um bebê pequeno para a idade gestacional (SGA), e pré-eclâmpsia com início <34

semanas. Os números das amostras são registrados abaixo de cada par de colunas. Ó ajuste para idade gestacional e índice de massa corporal resul10 tou em alterações menores sem nenhum efeito sobre o nível de significância. A Figura 7B é um gráfico mostrando a média aritmética das concentrações séricas de sFlt-1 (barras pretas) e PIGF (barras brancas) em 33-41 semanas de gestação em controles e casos (antes do início da doença clínica) com pré-eclâmpsia branda, pré-eclâmpsia severa, pré-eclâmpsia com 15 início <37 semanas, e pré-eclâmpsia com um bebê pequeno para a idade gestacional. Os números das amostras são registrados abaixo de cada par de colunas. O ajuste para idade gestacional e índice de massa corporal resultou em alterações menores sem nenhum efeito sobre o nível de significância.

Descrição Detalhada

Foi descoberto que os níveis de sFlt-1 estão elevados em amostras de soro sanguíneo tiradas de mulheres pré-eclâmpticas. sFlt-1 liga a VEGF e PIGF com alta afinidade e bloqueia a atividade mitogênica e angiogênica destes fatores do crescimento. Deste modo, sFlt-1 é um excelente 25 marcador diagnóstico para a pré-eclâmpsia e VEGF e PIGF podem ser usados para tratar pré-eclâmpsia. Além disso, nós descobrimos agentes tera pêuticos que interferem com a ligação de sFlt-1 a VEGF ou PIGF purificado, ou agentes que aumentam os níveis de VEGF ou PIGF biologicamente ati vos, podem ser usados para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente. Os agentes referidos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos para sFlt-1, oligonucleotídeos para anti-sentido ou RNAi que reduzem os níveis de sFlt-1, compostos que aumentam os níveis de VEGF ou

PIGF, e pequenas moléculas que ligam sFlt-1 e bloqueiam o sítio de ligação do fator do crescimento. A invenção também se caracteriza por métodos para medir os níveis de fatores do crescimento; os métodos podem ser usados como ferramentas diagnosticas para detecção precoce de pré5 eclâmpsia ou um aumento do risco para desenvolver pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

Apesar da descrição detalhada apresentada neste relatório se referir especificamente a sFlt-1, VEGF, ou PIGF, será evidente para uma pessoa versada na técnica que a descrição detalhada também pode se apli10 car a membros das famílias de sFlt-1, VEGF, ou PIGF, isoformas, e/ou variantes, e a fatores do crescimento que seja demostrado que ligam sFlt-1. Os exemplos seguintes são para fins de ilustrar a invenção, e não devem ser considerados como limitantes.

Exemplo 1. Aumento dos níveis de proteína e RNAm de sFlt-1 em mulheres 15 grávidas com pré-eclâmpsia.

Em uma tentativa de identificar novos fatores secretados que desempenham um papel patológico na pré-eclâmpsia, foi realizado o perfil da expressão genética de tecido placentário de mulheres com e sem préeclâmpsia usando microarray chips Affymetrix U95A. Foi descoberto que o 20 gene para sFlt-1 estava regulado para cima em mulheres com préeclâmpsia.

De modo a confirmar a regulação para cima de sFlt-1 na préeclâmpsia, nós realizamos Northern blots para analisar os níveis placentários de RNAm de sFlt-1 (Figure 1A) e testes ELISA para medir os níveis séri25 cos de proteína sFlt-1 (Figure 1B) em mulheres grávidas pré-eclâmpticas comparadas com mulheres grávidas normotensas. A pré-eclâmpsia foi definida como (1) uma pressão sangüínea sistólica (BP) >140 mm Hg e uma pressão sangüínea diastólica >90 mm Hg depois 20 semanas de gestação, (2) novo início de proteinúria (1+ por dipstik na análise urinária, >300mg de 30 proteína em uma coleta de urina de 24 horas, ou proporção urinária aleatória de proteína/creatinina >0,3, e (3) resolução da hipertensão e da proteinúria por volta de 12 semanas pós-parto. Pacientes com hipertensão subja-

cente, proteinúria, ou doença renal foram excluídas. As pacientes foram divididas em pré-eclâmpsia branda e severa com base na presença ou na ausência de proteinúria de alcance nefrítico (>3g de proteína em uma coleta de

urina de 24 horas ou proporção urinária de proteína/creatinina maior do que

3,0). As proporções urinárias médias de proteína/creatinina no grupo com pré-eclâmpsia branda foram de 0,94 +/- 0.2 e no grupo com pré-eclâmpsia severa foram de 7,8 +/- 2,1. As idades gestacionais médias dos vários grupos foram como se segue: normal 38,8 +/-0,2 semanas, pré-eclâmpsia branda 34 +/- 1,2 semanas, pré-eclâmpsia severa 31,3 +/-0,6 semanas, e pré-termo 29,5 +/- 2,0 semanas. Foram obtidas amostras placentárias imediatamente depois do parto. Foram colhidas quatro amostras aleatórias de cada placenta, dispostas na solução de estabilização RNAIater (Ambion, Austin, TX) e armazenadas a -70° C. Foi realizado isolamento de RNA usando Qiagen RNAeasy Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Foi detectado um aumento tanto no RNAm de sFlt-1 placentário quanto na proteína sFlt-1 do soro materno em mulheres grávidas préeclâmpticas comparadas com mulheres grávidas normotensas. O nível sérico médio de sFlt-1 foi quase quatro vezes maior nas pacientes com préeclâmpsia severa comparadas com mulheres grávidas de controle normal.

Para excluir a possibilidade de que este efeito seja devido à idade gestacional precoce dos casos de pré-eclâmpsia, nós também medimos os níveis de sFlt-1 em mulheres normotensas combinando as idades gestacionais que tiveram parto prematuramente por outras razões (idades gestacionais 23-36 semanas), e nós não descobrimos diferença significante neste grupo com25 parado com gravidezes a termo de normotensas. As sondas usadas para Northern blots foram obtidas por PCR e incluíram um fragmento de 500 bp na região codificante de cDNA de flt-1 humano pUC 118, e um cDNA de GAPDH que foi usado como controle de normalização.

Na gravidez normal há um equilíbrio entre fatores pró- e antian30 giogênicos secretados pela placenta que é necessário para desenvolvimento placentário adequado. Nós usgerimos a hipótese de que na préeclâmpsia, o aumento da produção de sFlt-1 e diminuição da produção de

VEGF e PIGF muda o equilíbrio em favor da anti-angiogênese. Para tratar da atividade antiangiogênica pura nós medimos ós níveis séricos de VEGF e PIGF e descobrimos que os níveis séricos de PIGF e VEGF foram menores em pacientes com pré-eclâmpsia comparadas com pacientes de controle 5 normal (PIGF médio, 235,3 +/- 45,3 pg/ml versus 464 +/- 116,6 pg/ml) conforme foi descrito (Tidwell et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 184:1267-1272, 2001). Quando nós incorporamos os níveis de sFlt-1, VEGF e PIGF em um índice antiangiogênico, ou PAAI, como um indicador da atividade antiangiogênica pura, foi descoberto que podería claramente separar as pacientes 10 pré-eclâmpticas das normais e que o PAAI parecia se correlacionar com a gravidade da pré-eclâmpsia (Figura 1C). Este PAAI pode ser usado como ferramenta diagnostica para a detecção de pré-eclâmpsia em mulheres grávidas.

Exemplo 2. Soro de mulheres com pré-eclâmpsia inibe a anqioqênese em um teste de tubo endotelial in vitro

Foi sugerido a hipótese de que o excesso de sFlt-1 circulante em pacientes com pré-eclâmpsia causa disfunção endotelial e leva a um estado antiangiogênico. Para tratarmos disto, foi usado um teste de tubo endotelial como um modelo in vitro de angiogênese. Matrigel reduzido com 20 fator de crescimento (7 mg/mL, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) foi colocado em cavidades (100 pl/cavidade) de uma lâmina de cultura de células de 48 cavidades pré-gelada e incubado a 37° C por 25-30 minutos apra permitir polimerização. Células endoteliais da veia umbilical humana (30.000 + em 300 pl de meio basal endotelial sem soro, Clonetics, 25 Walkersville, MD) em passagens 3-5 foram tratadas com 10% de soro da paciente, laminadas sobre as células revestidas com Matrigel, e incubadas a 37° C por 12-16 horas. A formação do tubo foi em seguida avaliada através de um microscópio de contraste de fase invertida a 4X (Nikon Corporation, Tokyo, Japão) e analisada quantitativamente (área do tubo e extensão total) 30 usando o programa de análise do estudo por imagens Simple PCI.

As condições do teste de formação do tubo foram ajustadas de modo que células endoteliais da veia umbilical humana normal formam tu bos somente na presença de fatores do crescimento exógenos, tais como, VEGF. Sob estas condições, foi descoberto que enquanto o soro de mulheres normotensas induziu células endoteliais a formarem estruturas semelhantes a tubos regulares, o soro de mulheres com pré-eclâmpsia inibiu a formação de tubo (Figura 2). Notavelmente, por volta de 48 horas pós-parto este efeito antiangiogênico tinha desaparecido sugerindo que a inibição dos tubos mencionados com o soro de pacientes com pré-eclâmpsia foi provavelmente devida a um fator circulante liberado pela placenta. Quando sFlt-1 foi adicionado ao soro de pacientes normotensas em doses semelhantes às encontradas em pacientes com pré-eclâmpsia, não ocorreu a formação de tubo, semulando os efeitos vistos com o soro de mulheres pré-eclâmpticas. Quando VEGF e PIGF exógenos foram adicionados ao teste usando soro de pacientes pré-eclâmpticas, foi restaurada a formação de tubo (Figura 2). Foram usados para estes testes VEGF humano recombinante, PIGF humano, e Flt-1Fc humano. Estes resultados sugeriram que as propriedades antiangiogênicas do soro pré-eclâmptico foram devidas ao antagonismo de VEGF e PIGF por sFlt-1 endógeno. Estes resultados também sugeriram que a adição de VEGF e/ou PIGF purificados pode reverter ou reduzir a condição préeclâmptica e pode ser usada terapeuticamente.

Exemplo 3. sFlt-1 inibe a vasodilatação de microvasos renais induzida por VEGF e PIGF

O papel causai de sFlt-1 na vasoconstrição foi determinado usando um experimento de reatividade microvascular in vitro. Foram feitos experimentos de reatividade microvascular conforme descrito previamente usando microvasos renais de rato (Sato et al., J. Surg. Res., 90:138-143, 2000). Microvasos da artéria renal (70-170 pm de diâmetro interno) foram dissecados de rins de rato usando um microscópio de dissecção de 10x a 60x (Olympus Optical, Tokyo, Japão). Os microvasos foram colocados em uma câmara de microvasos isolada, canulada com micropipetas de vidro duplas medindo 30-60 pm de diâmetro, e fixada com uma sutura de monofilamento de nylon 10-0 (Ethicon, Somerville, NJ). Solução tampão de Krebs oxigenadca (95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono) aquecida a 37° C

foi circulada continuamente através da câmara de vasos e um reservatório contendo um total de 100 ml da solução. Os vasós foram pressurizados a 40 mm Hg em um estado não-escoável usando um manômetro de burette en-

chido com uma solução tampão de Krebs. Com um microscópio invertido (40x a 200x; Olympus CK2 Olympus Optical) conectado a câmera de vídeo, a imagem dos vasos foi projetada em um monitor de televisão preto e branco. Um analisador dimensional eletrônico (Living System Instrumentation, Burlington, VT) foi usado para medir o diâmetro da luz interna. As medições foram registradas com um gravador de diagrama de fita (Graphtec, Irvine, 10 CA). Os vasos foram deixados em banho dentro da câmara de microvasos por no mínimo 30 minutos antes de qualquer intervenção. Em todos os grupos experimentais, as reações de relaxamento dos microvasos renais foram examinadas depois da pré-contração dos microvados com U46619 (agonista de tromboxano) para 40-60% de seu diâmetro basal em uma pressão de 15 distensão de 40 mm Hg. Uma vez que foi atingido o tono do estado estacionário, foram examinadas as reações a vários reagentes tais como VEGF,

PIGF, e sFlt-1. Foram usados para estes testes VEGF de rato recombinante,

PIGF de camundongo, e Flt-1Fc de camundongo. Todas as drogas foram aplicadas extraluminalmente. As medições foram feitas quando a reação 20 tinha estabilizado (geralmente 2-3 minutos depois da droga ter sido administrada). Uma a quatro intervenções foram realizadas em cada vaso. Os vasos foram lavados com uma solução tampão de Krebs e deixados para equilibrar em uma solução tampão de Krebs livre de drogas por 20-30 minutos entre as intervenções.

Foi descoberto que sFlt-1 sozinho não causa vasoconstrição significante, no entanto bloqueou o aumento, responsivo à droga, na vasodilatação induzida por VEGF ou PIGF (Figura 3A). Além disso, foi descoberto que VEGF e PIGF, em níveis fisiológicos vistos na gravidez, induziram importante relaxamento arteriolar dose-dependente, e que este efeito foi bloqueado pela adição de 10 ng/ml de sFlt-1, uma concentração observada em mulheres gravemente pré-eclâmpticas (Figura 3B). Este resultado suge riu que sFlt-1 circulante em pacientes com pré-eclâmpsia pode antagonizar

vasorrelaxamento, deste modo contribuindo para a hipertensão. Estes resultados corroboram a conclusão de que sFlt-1 é responsável por muitos dos sintomas clínicos e patológicos da pré-eclâmpsia, inclusive hipertensão. A inibição de sFlt-1, através do uso de anticorpos dirigidos, por exemplo,

poderia reverter os efeitos da proteína em mulheres pré-eclâmpticas e os inibidores de sFlt-1 referidos poderíam potencialmente ser usados comó um agente terapêutico.

Exemplo 4. Efeitos de sFlt-1 em um modelo animal de pré-eclâmpsia

Com base nos resultados acima, foi sugerido a hipótese de que a adição de sFlt-1 exógeno produziría hipertensão e proteinúria em um modelo animal. Foi demonstrado que adenovírus expressando sFlt-1 produzem níveis de sFlt-1 sistêmicos suétentados associados com importante atividade anti-tumoral (Kuo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98:4605-4610, 2001). Este adenovírus recombinante codificando sFlt-1 murino foi injetado na veia da cauda de ratas prenhes Sprague-Dawley no dig 8-9 da gestação. Adenovírus codificando Fc murino e sFlk1-Fc (proteína de fusão de 1 ectodomínio Flk1 receptor de VEGF de camundongo e proteína Fc) em doses equivalentes foram usados como controles. Foi demonstrado que Flk1 liga a

VEGF, mas não PIGF. Deste modo, sFlk-1 Fc foi escolhido como um controle para ajudar a djscriminar entre a atividade anti-VEGF e a anti-PIGF de sFItl.

Tanto ratas Sprague-Dawley prenhes quanto não prenhes foram injetadas com 1 x 10⁹ pfu de Ad Fc, Ad sFlt-1, ou Ad sFlk-1Fc por meio de injeções na veia da cauda. Estes adenovírus foram descritos previamente (Kuo et al., supra) e foram produzidos no Harvard Vector Core Laboratory.

Ratas prenhes foram injetadas com os adenovírus no dia 8-9 da gravidez (início do segundo trimestre) e foi medida a pressão sangüínea no dia 16-17 da gravidez (início do terceiro trimestre). Em animais não prenhes, as pressões sangüíneas foram medidas no dia 8 depois da injeção dos adenovírus. As pressões sangüíneas foram medidas nas ratas depois de anestesia com sódio pentobarbital (60 mg/kg, i.p.). A artéria carótida foi isolada e canulada com um cateter microtip 3-Fr de alta fidelidade conectado a um transdutor de pressão (Millar Instruments, Houston, TX). O cateter Millar Mikro-Tip foi

introduzido dentro da artéria para registrar a pressão sangüínea. A pressão sangüínea e a freqüência cardíaca foram registradas por gravador de diagrama de fita (modelo 56-1X 40-006158, Gould Instrument Systems, Cleveland, OH) e foi feita a média durante um período de 10 minutos. Em seguida 5 foram obtidas amostras de sangue, tecido, e urina antes da eutanásia. A albumina urinária foi medida por dipstick padrão e quantificada por imunoensaio ligado a enzima competitivo (ELISA) conforme foi descrito alhures (Cohen et al., Kidney Intl., 45: 1673-1679, 1994). A creatinina urinária foi medida por um kit de procedimento colorimétrico com ácido pícrico (Sigma, 10 St. Louis, MO). Foram medidas as pressões sangüíneas intrarteriais no início do terceiro trimestre da gestação para simular a patologia natural da préeclâmpsia. Estes experimentos também foram realizados em ratos fêmeas não prenhes Sprague-Dawley para determinar se os efeitos de sFlt-1 é direto ou indireto através de seus efeitos sobre a placenta. Foi confirmado por 15 meio de análise Western blot que os níveis sistêmicos de sFlt-1 no dia da medição da pressão sangüínea estavam dentro do alcance de 25-350 ng/mL nos vários animais tratados com sFlt-1 no dia das medições da pressão sangüínea. A pressão sangüínea e a proteinúria nos diferentes grupos experimentais é apresentada na Tabela 1.

Tabela 1. Pressão Sangüínea e Proteinúria em Ratas

	N	MAP (mmHg)	Proporção de alb:cr na urina
Fc(P)	5	75,6 ± 11,1	62 ±21
sFlt-1 (P)	4	109,0 ±19,3*	6923 ± 658*
sFlk-1Fc (P)	4	72,8 ± 14,7	50 ±32

Fc (NP)	5	89,3 ± 5,7	138 ±78
SFlt-1 (NP)	6	117,9 ± 12,9*	12947 ±2776*
SFIk-IFc(NP)	4	137,3 ±2,3*	2269 ± 669*

Ratas prenhes (P) e não prenhes (NP) foram administradas adenovírus expressando proteína Fc (controle), sFlt-1, ou sFlk-1Fc. A pressão sangüínea arterial média (MAP = diastólica + 1/3 da pressão diferencial em mmHg) ± S.E.M e proporção de albuminarCr na urina (mg de albumina 25 por grama de creatinina) ± S.E.M foram medidas oito dias depois, corres

pondendo ao terceiro trimestre inicial nas ratas prenhes. N = o número de animais em cada grupo experimental. O ‘ representa impotância estatística com p< 0,01 quando comparado com o grupo de controle (Fc).

Ratas prenhes tratadas com sFlt-1 tiveram importante hiperten5 são e albuminúria em faixa nefrótica comparadas com controles com Fc. Ratas não prenhes administradas sFItl também desenvolverm hipertensão e proteinúria. Notavelmente, as ratas não prenhes tratadas com sFlk-Fc desenvoveram hipertensão e proteinúria, ao passo que as ratas prenhes

tratadas com sFlk-Fc não desenvolveram. Portanto, na gravidez, o antago10 nismo de VEGF sozinho é insuficiente para produzir pré-eclâmpsia, possivelmente devido à presença de altos níveis de PIGF. No estado não grávido, onde PIGF está virtualmente ausente, o antagonismo de VEGF sozinho é suficiente para romper o equilíbrio pró/antiangiogênico e produzir patologias renais semelhantes às associadas com a pré-eclâmpsia. Várias técnicas de tingimento foram usadas para examinar a lesão renal que foi observada em todas as ratas tratadas com sFlt-1 (Figura 4). Os rins colhidos das ratas foram fixados em solução de Bouin, seccionados e corados com pigmentos de H&E e PAS. Para microscopia eletrônica, o tecido renal foi fixado em glutaraldeído, embutido em mistura de araldite-epon, e seções renais ultrafinas (1

pm) foram cortadas, coradas com azul de Tolueno e avaliadas usando um

Zeiss EM 10 em várias ampliações. Foi feita imunofluorescência para depósitos de fibrina dentro dos glomérulos usando anticorpo policlonal anti-fibrina (ICN, Suíça). Endoteliose glomerular difusa e global foi a lesão renal observada universalmente nas ratas tratadas com sFlt-1. Foi detectado dilatação 25 glomerular com oclusão das alças capilares por inchamento e hipertrofia das células endocapilares. Foram vistas numerosas gotículas de ressorção de proteínas evidentes nas células epiteliais glomerulares. Não foi observada glomerulosclerose segmentar. Foram vistos contornos duplos isolados e deposição focal de fibrina dentro dos glomérulos. Este achado de deposição de fibrina na ausência de interposição mesangial importante é similar ao que foi descrito como típico do estágio pré-parto da doença humana (KincaidSmith, Am. J. Kidney Dis., 17:144-148, 1991). Imunofluorescência para fibri

na apresentou focos de deposição de fibrina dentro dos glomérulos de animais tratados com sFlt-1 mas não de animais tratados com Fc. As ratas não prenhes tratadas com sFlkl desenvolveram a mesma lesão. De fato, quando sFlkl foi usado nos mesmo níveis que sFlt-1, a lesão renal foi mais grave 5 nas ratas não prenhes, uma vez que há menos moléculas pro-angiogênicas

circulantes para o sFlt-1 antagonizar. Estes resultados sugeriram que elevados níveis de sFlt-1 podem ser responsáveis pela endoteliose glomerular associada com a pré-eclâmpsia, mas que estes efeito foi independente da placenta uma vez que as alterações glomeruláres foram detectadas em ra10 tos não prenhes bem como prenhes. Estes resultados também sugeriram que o antagonismo tanto de VEGF quanto de PIGF é importante na patologia da pré-eclâmpsia uma vez que ocorreram hipertensão e proteinúria em camundongos não prenhes tratados com sFlk-1 mas não em camundongos prenhes tratados com sFlk-1 onde os níveis de PIGF estão elevados.

O modelo animal criado neste relatório pode ser usado como um modelo experimental para testar novos compostos terapêuticos. Tanto a eficácia de compostos terapêuticos potenciais quanto a farmacologia e a toxi cidade podem ser estudadas usando este modelo animal.

Exemplo 5. Efeitos de sFlt-1 em um modelo animal de eclâmpsia

Ratas prenhes no início de seu segundo trimestre de gestação são injetadas com sFlt-1 exógeno. As ratas são então monitoradas e testadas durante o início de seu terceiro trimestre para o desenvolvimento de eclâmpsia. Os testes usados para detecção de eclâmpsia podem incluir MRI dos cérebros das ratas para o desenvolvimento de edema, EEG dos cére25 bros das ratas para o desenvolvimento de ataques, e histologia dos cérebros das ratas para determinar se ocorreu lesão endotelial ao longo da barreira sangüínea cerebral e do plexo coróide usando marcadores endoteliais específicos.

Exemplo 6: Proporção de PIGF/creatinina na urina é diagnóstico de préeclâmpsia

Foram obtidas amostras de urina de 10 mulheres às 16 semanas de gestação (cinco normais, quatro pré-eclâmpticas brandas, e uma pré5 eclâmptica severa). Estas amostras foram proporcionadas pelo Dr. Ravi

Thadhani no Hospital Geral de Massachusetts. As proporções médias de PIGF/creatinina livres urinárias (pg de PIGF por mg de çreatinina) para as mulheres grávidas normais foram de 78+/-10,7 e para as quatro préeclâmpticas brandas foram de 33 +/-5,0 e para a paciente pré-eclâmptica 10 severa foi de 17. Deste modo, uma alteração na proporção de PIGF para çreatinina na urina é útil como um indicador diagnóstico para pré-eclâmpsia em uma paciente. '

Exemplo 7: Níveis de proteína sFlt-1 e PIGF como um indicador diagnóstico e pré-eclâmpsia e eclâmpsia em mulheres

Para este estudo foram usadas amostras arquivadas do estudo de Cálcio para Prevenção de Pré-eclâmpsia de modo a analisar os padrões gestacionais de sFlt-1 circulante, PIGF livre, e VEGF livre em gestações normotensas e pré-eclâmpticas. Calcium for Pre-eclampsia Prevention, ou

CPEP, foi um estudo clínico duplo-cego aleatório conduzido durante 199220 1995 para avaliar os efeitos da suplementação diária com 2 g de cálcio elemental ou placebo sobre a incidência e a gravidade da pré-eclâmpsia (Levine et al., N. Engl. J. Med. 377:69-76, 1997; Levine et al., Control Clin. Trials

17:442-469, 1996). Mulheres nulíparas saudáveis com gestações únicas foram registradas entre 13 e 21 semanas de gestação em cinco centros mé25 dicos participantes dos Estados Unidos e acompanhadas até 24 horas pósparto usando um protocolo comum e formas idênticas de coleta de dados. No registro, todas as participantes do CPEP tinham pressão sangüínea < 135/85 mm Hg, e nenhuma tinha disfunção renal ou proteinúria. A idade gestacional foi determinada por exame de ultrassom. Foram obtidas amos30 tras de soro das participantes antes do registro no estudo (13-21 semanas), às 26-29 semanas, às 36 semanas caso ainda grávida, e quando foram observadas hipertensão ou proteinúria. Amostras de desfecho” foram amos

tras obtidas em ou depois do início dos sinais e sintomas de pré-eclâmpsia, mas antes do trabalho de parto e do parto conforme descrito alhhures (Levine et al., 1996, supra). Foram obtidas amostras de sangue arquivadas do estudo CPEP através de colaboração com o Dr. Richard Levine no NIH.

Participantes

Foram selecionados pacientes tendo completa informação do

prognóstico, amostras de soro obtidas em <22 semanas, e um bebê do sexo masculino nascido vivo. De 4.589 participantes do CPEP, foram excluídos 253 perdidos durante o seguimento, 21 cuja gravidez havia encerrado antes 10 de 20 semanas, 13 em que faltavam dados do prognóstico materno ou perinatal, 4 sem história de fumo, 9 com hipertensão não verificada por equipes de revisão de quadro, e 32 outras com natimortos, deixando 4.257 mulheres com informações adequadas e bebês vivos. Entre estas 2.156 tiveram bebês do sexo masculino. Depois de excluir uma mulher cujo bebê teve uma 15 anormalidade cromossômica, 381 com hipertensão gestacional, e 43 sem uma amostra de soro basal, restaram 1.731 mulheres. Destas, 175 desenvolveram pré-eclâmpsia e 1.556 permaneceram normotensas durante toda a

gravidez.

Como a suplementação de cálcio não teve nenhum efeito sobre o risco e a gravidade da pré-eclâmpsia e não foi relacionada com as concentrações de moléculas pró- e antiangiogênicas, os casos e os controles foram escolhidos independentemente do tratamento do CPEP. Para cada caso de pré-eclâmpsia foi selecionada uma normotensa de controle, combinada por local de registro, idade gestacional na coleta da pimeira amostra de soro (dentro de uma semana), e tempo de armazenagem no freezer a 70° C (dentro de 12 meses). 120 pares combinados (casos e controles) foram escolhidos aleatoriamente para análise de todas as 657 amostras de soro obtidas antes do trabalho de parto (Tabela 2, abaixo). A idade gestacional média na coleta da primeira amostra de soro foi de 112,8 e 113,6 dias nos casos e controles, respectivamente; a duração média de armazenagem no freezer foi de 9,35 e 9,39 anos.

(te

TABELA 2: Características dos casos e dos controles no registro do CPEP e

de seus bebês recém-nascidos
Característica	Casos(n=120)	Controles (n=120)
Idade (anos)	20,8 ± 4,5	20,2 ± 3,6
Altura (cm)	161,0 ±6,7	163,0 ±6,9*
Peso (kg)	71,0 ± 19,4	66,8 ± 17,1'
índice de massa corporal	27,3 ± 6,8	25,1 ±6,1 **
Pressão sangüínea sistóiica (mm Hg)	109,5 ±8,8	105,7 ±9,0**
Pressão sangüínea diastólica (mm Hg)	62,0 ± 7,9	59,4 ± 7,4 **
Perda de gravidez anterior [n (%)]	23(19,2)	25 (20,8)
Fumante atual [n (%)]	9 (7,5)	13(10,8)
Seguro saúde privado [n (%)]	8(6,7)	13(10,8)
Casada (N.T.: Evermarried) [n (%)]	25 (20,8)	24 (20,0)
Raça/etnia	24 (20,0)	35 (29,2)
Branca, não-Hispânica [n (%)]
Branca, Hispânica [n (%)]	21 (17,5)	14(11,7)
Afro-Americana [n (%)]	69 (57,5)	68 (56,7)
Outra, desconhecida [n (%)]	6 (5,Ó)	3 (2,5)
Peso ao riascer (g)	3100 ±796	3255 ± 595
Parto <37 semanas [n (%)]	29 (24,2)	9 (7,5) **
Pequeno para idade gestacional	18(15,0)	4 (3,3) **
(<10^o percentil) [n (%)]

Média ± desvio padrão a menos que indicado * p<0,05 ** p<0,01

Para este estudo, hipertensão foi definida como uma pressão sangüínea diastólica de no mínimo 90 mm Hg em duas ocasiões com 4-168 horas de diferença. Hipertensão severa foi definida como uma pressão sangüínea diastólica de no mínimo 110 mm Hg em duas ocasiões com 4-168 horas de diferença, ou em uma ocasão se a mulher tivesse recebido terapia anti-hipertensiva. Proteinúria foi definida como 300 mg ou mais de proteína em uma coleta de urina de 24 horas, duas amostras de urina aleatórias com

4-168 horas de diferença contendo no mínimo 1+ proteína pordipstick, uma amostra de urina única com uma proporção de proteína/ creatinina de no mínimo 0,35, ou uma amostra de urina aleatória única contendo no mínimo 2+ proteína por dipstick. Foi diagnosticada proteinúria severa por uma 15 amostra de coleta de urina de 24 horas contendo no mínimo 3,5 g proteína

ou por duas amostras de urina aleatórias com no mínimo 3+ proteína por dipstick. Pré-eclâmpsia foi definida como hipertensão e proteinúria ocorrendo dentro de 7 dias uma da outra; pré-eclâmpsia severa foi definida como pré-eclâmpsia com hipertensão severa, proteinúria severa, síndrome HELLP (hemólise, enzimas hepáticas elevadas, baixa contagem de plaquetas), ou eclâmpsia. O início da pré-eclâmpsia foi o momento de detecção da primeira pressão sanguínea elevada ou proteinúria ná amostra de urina levando ao diagnóstico de pré-eclâmpsia.

Pequeno para a idade gestacional (SGA) foi definido como peso ao nascer menor do que o 10° percentil para a idade gestacional de acordo com as tabelas dos Estados Unidos de peso ao nascer para a idade gestacional por raça, paridade, e sexo da criança (Zhang e Bowes 1995, supra). Procedimentos

Os testes foram realizados no Beth Israel Deaconess Medicai Center pela equipe do laboratório a qual desconhecia os diagnósticos das pacientes e outras informações clínicas relevantes. As amostras foram ordenadas aleatoriamente para análise. Foram realizados testes imunossorventes ligados a enzima (ELISA) para sFlt-1 humana, PIGF livre, e VEGF livre de acordo com as instruções do fabricante, usando kits adquiridos da R&D Systems (Minneapolis, MN). Alíquotas de amostras de soro as quais tinham sido armazenadas a -70°C, foram degeladas até a temperatura ambiente, diluídas com salina tamponada com BSA/Tris, e incubadas por 2 horas em uma lâmina de 96 cavidades pré-revestida com um anticorpo de captura orientado contra sFlt-1, PIGF, ou VEGF. As cavidades foram em seguida lavadas três vezes, incubadas por 20 minutos com uma solução de substrato contendo peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina, e a reação foi extinta com ácido sulfúrico a 2N. A densidade ótica foi determinada a 450 nm (correção do comprimento de onda de 550 nm). Todos os testes foram realizados em duplicata. As concentrações protéicas foram calculadas usando uma curva padrão derivada de concentrações conhecidas das proteínas recombinantes respectivas. Quando a diferença entre as duplicatas excedeu 25%, o teste foi repetido e os resultados iniciais descartados. Os testes tiveram sensibilidades de 5, 7, e 5 pg/ml para sFlt 1, PIGF, e VEGF, respectivamente, com coeficientes de variação inter- e intra-teste de 7,6% e 3,3% para sFlt 1,11,2% e 5,4% para PIGF, e 7,3% e 5,4% para VEGF. Análise Estatística

Foram usados testes t e qui-quadrados em análises de características maternas ou infantis para comparar variáveis categóricas ou contínuas, respectivamente. Embora os valores da média aritmética das concen-

trações sejam dados no texto e nas figuras, a experimentação estatística foi realizada depois da transformação logarítmica a menos que mencionado de 10 outro modo. Foi realizado ajuste usando regressão logística sobre concentrações transformadas logaritmicamente.

Resultados

Dos 120 casos, 80 desenvolveram pré-eclâmpsia branda e 40 severa, inclusive 3 com síndrome HELLP e 3 com eclâmpsia. As pacientes 15 dos casos foram mais curtas do que pacientes de .controle, tinham um maior índice de massa corporal, e maior pressão sangüínea basal (Tabela 2). Além disso maiores proporções de pacientes de casos tiveram gestações complicadas por parto pré-termo ou bebês pequenos para a idade gestacional (SGA). As pacientes dos casos contribuíram com uma média de 2,9 amostras de soro para o estudo; as pacientes controles, com 2,6 amostras.

Foi primeiro confirmado que sFlt-1, PIGF, e VEGF estavam alterados em pacientes com pré-eclâmpsia por ocasião da doença ativa comparadas com controles combinadas por idade gestacional neste grupo de estudo do CPEP. Amostras colhidas por ocasião da pré-eclâmpsia clínica es25 tabelecida (amostras de desfecho) tiveram níveis dramaticamente aumentados de sFlt-1, níveis reduzidos de PIGF, e níveis reduzidos de VEGF comparadas com controles com idades gestacionais (4382 vs. 1643 pg/ml de sFItl, p<0,0001; 137 vs. 669 pg/ml de PIGF, p<0,0001; e 6.41 vs. 13.86 pg/ml de

VEGF, p=0,06) para casos e controles, respectivamente, em 23 pares com30 binados por idade gestacional) de modo similar aos relatórios publicados anteriormente (Maynard et al., J. Clin. Invest. 111:649-658, 2003).

De modo a avaliar o padrão gestacional dos níveis de sFlt-1,

PIGF e VEGF, nós medimos as concentrações circulantes de sFlt-1, PIGF, e VEGF de amostras de soro obtidas de pacientès de casos e pacientes de controle dentro de várias janelas de idades gestacionais. O padrão gestacional da proteína sFlt-1 para 120 mulheres pré-eclâmpticas e 120 mulheres de controle é apresentado na Figura 5A. Os níveis de sFlt-1 nas pacientes de controle permaneceu constante até 33-36 semanas, quando aumentaram

cerca de 145 pg/ml por semana até o trabalho de parto e o parto. Entre as pacientes de casos antes dos sintomas clínicos, sFlt-1 pareceu começar a aumentar em 21-24 semanas, com um aumento mais agudo e uma diferen10 ça estatisticamente significante dos controles em 29-32 semanas (Figura

5A). Globalmente, as diferenças entre pacientes de casos e controles medidas antes do início dos sintomas clínicos foram de 17% (p<0,05) na metade da gestação. As amostras de desfecho estavam significativamente elevadas comparadas com amostras colhidas antes da doença. De modo a avaliar os mecanismos de aumento de sFlt-1 antes do início da doença clínica, nós plotamos as concentrações de sFlt-1 em todas as pré-eclâmpticass por semanas antes do início da pré-eclâmpsia (Figura 5B). As concentrações médias de sFlt-1 em amostras de pacientes de casos foram plotadas por semanas completadas antes do início da pré-eclâmpsia. Iniciando em 5 sema20 nas antes da pré-eclâmpsia, as concentrações de sFlt-1 aumentaram subs-

tancialmente até 1 semana antes do início da doença quando se aproximaram das concentrações observadas em amostras de desfecho. Os aumen tos de sFlt-1 em 4, 3, 2, e 1 semana(s) antes da pré-eclâmpsia ocorreram com pouca alteração na idade gestacional média e não podem ser explica25 das por aumentos do final do último trimestre com avanço da idade gestacional. A partir de 8-6 até 5 semanas antes da pré-eclâmpsia sFlt-1 aumentou

962 pg/ml, ao passo que a idade gestacional média subiu 31 dias. Cerca de um terço deste aumento em sFlt-1 não pode ser atribuído ao avanço da gestação. Quando foi feito gráfico da sFlt-1 por idade gestacional em con30 troles e em casos depois de remover amostras obtidas <5 semanas antes do início da pré-eclâmpsia, não foram observadas diferenças substanciais (Figura 5C). Estes dados sugerem que a maior concentração de sFlt-1 em

pacientes de casos antes do início da pré-eclâmpsia é devida a aumentos agudos na sFlt-1 dentro das 5 semanas antes do início de doença clínica.

Foi em seguida plotado o padrão gestational da proteína PIGF no mesmo grupo de pacientes conforme mostrado na Figura 6A. As con5 centrações da proteína PIGF dos controles aumentou durante os primeiros dois trimestres, teve pico em 29-32 semanas, e caiu durante o final da gestação. Entre as pacientes de casos, antes da pré-eclâmpsia, as concentrações da proteína PIGF seguiram um padrão gestacional semelhante, mas foram significativamente menores do que os controles a partir de 13-16 se10 manas. Globalmente, as diferenças de PIGF entre as pacientes de casos e as pacientes de controles medidas antes do início de sintomas clínicos foram de 35% (p<0,0001) na metade da gestação. Os níveis de PIGF nos casos antes do início da pré-eclâmpsia é representado por semanas antes da pré-eclâmpsia (Figura 6B), e por idade gestacional depois da remoção de 15 amostras <5 semanas antes da pré-eclâmpsia (Figura 6C). Por volta de 1 semana antes do início da pré-eclâmpsia, as concentrações se aproximaram das concentrações observadas depois do início da pré-eclâmpsia (Figura 6B). Comparados com controles, os níveis de PIGF das pacientes de casos estavam moderadamente reduzidos distante do parto, com reduções mais 20 substanciais em 5 e 3 semanas antes do parto. As concentrações das pacientes de controle permaneceram elevadas a partir de 17-15 até 3 semanas antes do parto, e em seguida caíram dramaticamente. O gráfico mostrando níveis de PIGF excluindo amostras obtidas <5 semanas antes da préeclâmpsia indica uma menor redução nos casos com relação aos controles 25 em 29-32 semanas de gestação e nenhuma nas amostras obtidas das pacientes de casos em 33-36 semanas (Figura 6C). Isto sugere que a queda nas concentrações de PIGF nas semanas antes da doença foi responsável pelos níveis dramaticamente baixos de PIGF observados no início da doença (ou amostras de desfecho apresentadas na Figura 6A).

As concentrações de VEGF durante toda a gestação foram muito baixas e semelhantes em controles e casos antes da pré-eclâmpsia, exceto por uma redução significante em pacientes de casos em 37-41 se

manas. As concentrações médias de VEGF em 23-32 semanas em casos excluindo amostras obtidas 5 semanas antes da pré-eclâmpsia não diferiram significativamente dos controles (11,6 vs. 12,8 pg/ml), enquanto as concentrações em casos incluindo amostras <5 semanas antes do parto diferiram (5,1 vs. 12,8 pg/ml, p<0,01). Em 33-41 semanas as concentrações de VEGF dos casos >5 ou <5 semanas antes da pré-eclâmpsia foram maiores e menores do que os controles, respectivamente (11,2 pg/ml e 8,3 vs. 9,7 pg/ml), embora estas diferenças não tenham sido significativas.

A Figura 7 representa sFlt-1 e PIGF em 23-32 semanas (Figura

7A) e 33-41 semanas (Figura 7B) por estado e gravidade da pré-eclâmpsia.

Os gráficos mostram que os aumentos desFlt-1 e redução de PIGF antes do início da pré-eclâmpsia foram associados com a gravidade da doença, tempo de início, e a presença de um bebê pequeno para a idade gestacional. Em 23-32 semanas, sFlt-1 e PIGF em pacientes de casos com um bebê pe15 queno para a idade gestacional antes do início da pré-eclâmpsia foram significativamente maior ou menor, respectivamente, do que concentrações correspondentes em pacientes de controle com um bebê pequeno para a idade gestacional. Além disso, em comparação com pacientes de controle que tiveram parto pré-termo, pacientes de caso com parto pré-termo tiveram 20 maior sFlt-1 e PIGF significativamente menor.

Em seguida foi determinado se podería ser usadas as concentrações circulantes de PIGF e/ou sFlt-1 durante o primeiro trimestre para identificar mulheres em risco para o desenvolvimento de pré-eclâmpsia. Em

8-20 semanas, depois de ajuste por idade gestacional, índice de massa cor25 poral, e sFlt-1, pacientes de casos com PIGF no menor quartil da distribuição de valores de controle tiveram um aumento de quase 12 vezes do risco de pré-eclâmpsia em <34 semanas (Proporção de Disparidades [N.T.: em inglês, OR (Odds Ratio)] 11,7, p<0,05) comparadas com casos com PIGF nos três maiores quartis (Tabela 3). O risco para pré-eclâmpsia em <34 se30 manas no menor quartil, comparado com o maior quartil estava aumentado quase 16 vezes (OR 15,8, p<0,01).

TABELA 3: Proporções de Disparidades (OR) para Pré-eclâmpsia de Início

Precoce por Quartis de Distribuição de PIGF Controle em 8-20 Semanas

PE Início <34 Semanas PE Início <37 Semanas

	PIGF (pg/ml)	Casos (N)	Controles (N)	ORAj.* (95% Cl)	Casos (N)	Controles (N)	ORAj.* (95% Clj
	Q4 >267,5	2	30	1,0 Referente	4	30	1,0 Referente
	Q3 >128,6- 267,5	1	30	0,7(0,1- 8,9)	4	30	.1,3(0,3- 5,8)
	Q2>70,1- 128,6	3	30	2,3 (0,3- 19,3)	6	30	2,6 (0,6- 12,1)
p	Q1 < 70,1	5	30	15,8(1,5- 172,8)**	¹⁷	30	22,3 (3,7- 135,6)***

* Proporções de Disparidades ajustadas para idade gestacional, índice de massa corporal, log sFlt-1 ** p<0,01 ***p<0,001 95% Cl = 95% de Limites de Confiança

Estes resultados demonstram que os níveis de sFlt-1 começam a aumentar dramaticamente cerca de 5 semanas antes do início dos sinto-

mas da pré-eclâmpsia. Paralelo com o aumento nos níveis de sFlt-1, os ní10 veis de PIGF livre e de VEGF livre diminuem, sugerindo que a redução em

PIGF e VEGF pode ser devida no mínimo parcialmente a antagonismo por sFlt-1 e não devida a uma redução na produção placentário de PIGF e VEGF. Três subgrupos de pré-eclâmpsia - pré-eclâmpsia severa, início precoce da doença, e bebês pequeno para a idade gestacional - tiveram maio15 res concentrações de sFlt-1 e menores de PIGF em 23-32 semanas e em

33-41 semanas do que controles ou mulheres com pré-eclâmpsia branda.

Foi também demonstrado uma redução pequena porém significante em PIGF livre iniciando cedo no segundo trimestre entre mulheres destinadas a desenvolver pré-eclâmpsia. Estes resultados demonstram que uma redução 20 nos níveis de PIGF pode ser um preditor útil de pré-eclâmpsia de início precoce.

Foi descrito aqui pela primeira vez o padrão gestacional de sFIt- na gestação normal, observando níveis relativamente estáveis durante

toda a gestação seguidos por um aumento estável iniciando em 33-36 semanas. Este aumento corresponde à última queda gestacional em PIGF observada na gestação normal por outros (Torry et al., J. Soc. Gynecol. Invest.

10:178-188, 1998; Taylor et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 188:177-182, 2003) e nos resultados descritos neste relatório. A associação temporal, junto com o conhecimento de que sFlt-1 interfere com medição por ELISA de PIGF (Maynard et al., supra) sugere que a queda nos níveis de PIGF livre durante o final da gestação pode ser devida ao aumento nos níveis de sFlt-1. Durante o primeiro e o segundo trimestre, quando é necessário o crescimento 10 placentário para acompanhar demandas fetais crescentes, as concentrações de PIGF são altas e as concentrações de sFlt-1 são baixas, criando um estado relativamente pró-angiogênico. No final da gestação, quando o crescimento vascular placentário pode precisar ser moderado e sustado, há um aumento na sFlt-1 antiangiogênica e redução resultante no PIGF. Em mulhe15 res com pré-eclâmpsia, o aumento da sFlt-1 começa cedo na gestação, aproximadamente cinco semanas antes do início dos sintomas, em cerca de

29-32 semanas de gestação em média. Deste modo, na pré-eclâmpsia, os freios antiangiogênicos podem ser aplicados cedo demais e forte demais, resultando em um exagero de um processo fisiológico normal o qual inter-

rompe o crescimento placentário. Parece claro que as alterações placentárias patológicas que caracterizam a pré-eclâmpsia ocorrem cedo na gestação (10-14 semanas), bem antes do aumento dramático da sFlt-1. A própria isquemia placentária resultante pode aumentar a produção de sFlt-1, basicamente dando início a uma explosão de sFlt-1.

Além das grandes diferenças vistas nas cinco semanas antes do desenvolvimento de sintomas clínicos, mulheres destinadas a desenvolve rem pré-eclâmpsia tiveram reduções pequenas, mas estatisticamente significantes, no PIGF livre tão cedo quanto em 13-16 semanas de gestação. Esta queda no PIGF geralmente não foi acompanhada por um aumento re30 cíproco nos níveis de sFlt-1. No entanto, houve uma tendência para níveis ligeiramente maiores de sFlt-1 nos casos durante o primeiro trimestre embora não tenha sido estatisticamente significante (por exemplo na janela de 17-

semanas, os níveis médios de sFlt-1 nos casos foram de 865,77 pg/ml versus 795,25 nos controles). Esta redução nos níveis de PIGF cedo na gestação pode refletir uma menor produção placentária de PIGF em gestações comprometidas por condições tais como pré-eclâmpsia ou SGA. De 5 modo importante, em pacientes com pré-eclâmpsia complicada por SGA, foi descoberto um aumento estatisticamente significante tanto na elevação de Flt-1 quanto na queda de PIGF antes da apresentação da doença. Também é possível que não haja alteração na produção placentária de PIGF em mulheres pré-eclâmpticas e que a elevação dos níveis locais de sFlt-1 na pla10 centa possa contribuir para a redução no PIGF livre circulante. Isto é corroborado pelo achado de que o PIGF placentário, medido por imunohistoquímica, não está alterada na pré-eclâmpsia (Zhou et al., Am. J. Pàthol. 160:1405-1423, 2002).

Em resumo, foi demonstrado que sFlt-1 começa a subir na pré15 eclâmpsia no mínimo 5 semanas antes do início da doença clínica a qual é acompanhada por redução no PIGF livre circulante e VEGF livre. A redução do PIGF durante o primeiro trimestre pode servir como um preditor de préeclâmpsia e sFlt-1 elevada pode servir como um preditor de proximidade da doença clínica. Estes dados em conjunção com o estudo animal descrito 20 acima demonstrando que sFlt-1 sozinho induz sintomas semelhantes a préeclâmpsia em roedores sugerem um provável papel etiológico para sFlt-1 na patogênese da pré-eclâmpsia. Os dados limitados sobre bebês pequenos para a idade gestacional e parto pré-termo em controles, comparados com pacientes de casos, sugerem que o aumento das alterações nos níveis de 25 proteínas observados em gestações pré-eclampticas com um bebê pequeno para a idade gestacional são mais substanciais do que uma diferença devida somente a restrição do crescimento intra-uterino ou parto pré-termo na ausência de pré-eclâmpsia.

Diagnósticos

A presente invenção caracteriza-se por testes diagnósticos para a detecção de pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou a tendência para desenvolver tais condições. Os níveis de VEGF, PIGF, ou sFlt-1, quer níveis livres ou

totais, são medidos em uma amostra da paciente e usados como um indicador de pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou da tendência para desenvolver tais condições.

Em uma modalidade, é usada uma métrica para determinar se uma relação entre níveis de no mínimo duas das proteínas é indicativa de

pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Podem ser usados métodos de rotina para medir os níveis de VEGF, PIGF, ou polipeptídeo sFlt-1 em qualquer fluido corporal, inclusive, mas não limitado a, urina, soro, plasma, saliva, líquido amniótico, ou líquido cerebroespinhal. Os métodos referidos incluem imunoen10 saio, ELISA, Western blotting usando anticorpos orientados para VEGF,

PIGF ou sFlt-1, e técnicas de imunoensaio enzimático quantitativo tais como as descritas em Ong et al. (Obstet. Gynecol. 98:608-611, 2001) e Su et al. (Obstet. Gynecol., 97:898-904, 2001). Os testes ELISA são o método preferencial para medir os níveis de VEGF, PIGF, ou sFlt-1. Níveis séricos de 15 sFlt-1 maiores do que 2 ng/ml são considerados um indicador positivo de pré-eclâmpsia. Adicionalmente, qualquer alteração detectável nos níveis de sFlt-1, VEGF, ou PIGF com relação aos níveis normais é indicativa de eclâmpsia, pré-eclâmpsia, ou da tendência a desenvolver tais condições. Preferencialmente sFlt-1 é medido, mais preferencialmente a medição de

VEGF e PIGF é combinada com esta medição, e ainda mais preferencialmente são medidas todas as três proteínas (ou níveis de RNAm indicativo dos níveis protéicos).

Em outra modalidade, a proporção PAAI (sFlt-1/ VEGF + PIGF) é usada como um índice antiangiogênico que é diagnóstico de pré25 eclâmpsia, eclâmpsia, ou da tendência a desenvolver tais condições. Se a proporção PAAI for maior do que 20 então a paciente é considerada como tendo pré-eclâmpsia ou estando em risco iminente de desenvolver a mesma.

A proporção PAAI (sFlt-1/ VEGF + PIGF) é meramente um exemplo de uma métrica útil que pode ser usada como um indicador diagnóstico. Não se pretende que limite a invenção. Pode ser usada como um indicador diagnóstico virtualmente qualquer métrica que detecte uma alteração no índice antiangiogênico em uma paciente tendo eclâmpsia com relação a um con50 trole normal.

Os níveis de expressão de ácidos nucléicos ou polipeptídeos particulares podem ser correlacionados com um estado de doença particular (por exemplo, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia), e portanto são úteis em diagno5 se. Oligonucleotídeos ou fragmentos mais longos derivados de uma sequência de ácidos nucléicos sFlt-1, PIGF, ou VEGF podem ser usados como uma sonda não somente para monitorar expressão, mas também para identificar pacientes que têm uma variação genética, mutação, ou polimorfismo

em uma molécula de ácido nucléico sFlt-1, PIGF, ou VEGF que são indicati10 vos de uma predisposição para desenvolver as condições. Os polimorfismos refereridos são de conhecimento do técnico versado e são descritos por Parry et al. (Eur. J Immunogenet. 26:321-3, 1999). As alterações genéticas referidas podem estar presentes na seqüência promotora, um quadro de leitura aberto, seqüência intrônica, ou região 3’ não-traduzida de um gene sFlt-1. Informações relacionadas com alterações genéticas podem ser usadas para diagnosticar uma paciente como tendo pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência a desenvolver tais condições. Conforme mencionado do início ao fim, alterações específicas nos níveis de atividade biológica de sFlt1, VEGF, e/ou PIGF podem ser correlacionadas com a probabilidade de pré20 eclâmpsia ou eclâmpsia, ou a predisposição para as mesmas. Em conseqüência, uma pessoa versada na técnica, tendo detectado uma dada mutação, pode então testar uma ou mais métricas da atividade biológica da proteína para determinar se a mutação causa ou aumenta a probabilidade de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

Em uma modalidade, uma paciente tendo pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência a desenvolver tais condições apresentará um aumento na expressão de um ácido nucléico codificando sFlt-1 ou uma alteração nos níveis de PIGF ou VEGF. Os métodos para detectar semelhantes alterações são de rotina na técnica e são descritos em Ausubel et al., supra.

Em um exemplo, northern blotting ou PCR em tempo real é usado para detectar os níveis de RNAm de sFlt-1, PIGF, ou VEGF.

Em outra modalidade, hibridização com sondas de PCR que são

capazes de detectar uma molécula de ácido nucléico sFlt-1, inclusive seqüências genômicas, ou moléculas intimamentè relacionadas, podem ser usadas para hibridizar a uma seqüência de ácidos nucléicos derivada de uma paciente tendo pré-eclâmpsia ou eclâmpsia ou em risco de desenvolver tais condições. A especificidade da sonda, quer seja feita de uma região altamente específica, por exemplo, a região regulatória 5’, ou de uma região menos específica, por exemplo, um motivo conservado, e o rigor da hibridização ou da amplificação (máxima, elevada, intermediária, ou baixa), deter

minam se a sonda hibridiza a uma seqüência que ocorre naturalmente, vari10 antes alélicos, ou outras seqüências relacionadas. Podem ser usadas técnicas de hibridização para identificar mutações indicativas de uma préeclâmpsia ou eclâmpsia em uma molécula de ácido nucléico sFlt-1, ou podem ser usadas para monitorar os níveis de expressão de um gene codificando um polipeptideo sFlt-1 (por exemplo, por análise Northern, Ausubel et 15 al., supra).

Em ainda outra modalidade, mulheres podem ser diagnosticadas para uma tendência a desenvolver pré-eclâmpsia ou eclâmpsia por meio da análise direta da seqüência de uma molécula de ácido nucléico sFlt-1,

VEGF, ou PIGF.

Uma paciente tendo pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência a desenvolver tais condições mostrará um aumento na expressão de um polipeptideo sFlt-1. Um anticorpo que liga especificamente um polipeptideo sFlt-1 pode ser usado para o diagnóstico de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia ou para identificar uma paciente em risco de desenvolver tais condições. São conhecidos uma variedade de protocolos para medir uma alteração na expressão de semelhantes polipeptídeos, inclusive métodos imunológicos (tais como ELISAs e RIAs), e proporcionam uma base para o diagnóstico de pré eclâmpsia ou eclâmpsia ou de um risco para desenvolver tais condições.

Novamente, um aumento no nível do polipeptideo é diagnóstico de uma pa30 ciente tendo pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência a desenvolver tais condições.

Em uma modalidade, o nível de polipeptideo ou ácido nucléico

de sFlt-1, VEGF, ou PIGF, ou qualquer combinação dos mesmos, é medido no mínimo em duas ocasiões diferentes e uma alteração nos níveis comparados com níveis de referência normais durante o tempo é usada como um indicador de pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência para desnvolver tais condições.

O nível de sFlt-1, VEGF, ou PIGF nos fluidos corporais de uma paciente tendo pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência para desnvolver tais condições pode ser alterado por tão pouco quanto 10%, 20%, 30%, ou

40%, ou por tanto quanto 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% com relação ao 10 nível de sFlt-1,VEGF, ou PIGF em um controle normal. O nível de sFlt-1 presente nos fluidos corporais de uma paciente tendo pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência para desnvolver tais condições pode ser aumentado por 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou mesmo por tanto quanto vezes ou mais com relação aos níveis em uma paciente de controle nor15 mal.

Em uma modalidade, a amostra de uma paciente de um fluido corporal (por exemplo, urina, plasma, soro, líquido amniótico) é coletada no início da gravidez antes do início dos sintomas de pré-eclâmpsia. Em outro exemplo, a amostra pode ser um tecido ou célula coletados no início da gra20 videz antes do início dos sintomas de pré-eclâmpsia. Exemplos nãolimitantes incluem tecido placentário, células placentárias, células endoteliais, e leucócitos tais como monócitos. Nas mulheres, por exemplo, amostras de soro sangüíneo materno são colhidas da veia antecubital de mulheres grávidas durante o primeiro, o segundo, ou o terceiro trimestre da gestação.

Preferencialmente, o teste é realizado durante o primeiro trimestre, por exemplo, em 4, 6, 8, 10, ou 12 semanas, ou durante o segundo trimestre, por exemplo, em 14, 16, 18, 20, 22, ou 24 semanas. Os testes referidos também podem ser conduzidos ao final do segundo trimestre ou no início do terceiro trimestre (em torno de 28 semanas). É preferencial que os níveis de 30 sFlt-1, VEGF, ou PIGF sejam medidos duas vezes durante este período de tempo. Para o diagnóstico de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia pós-parto, podem ser realizados testes para sFlt-1, VEGF, ou PIGF pós-parto.

Em um exemplo particular, amostras de sangue seriais podem ser coletadas durante a gravidez e os níveis dé sFlt-1 solúvel determinado por ELISA. Em um estudo usando esta técnica, o RNAm alternativamente unido codificando sFlt-1 é altamente expresso por células trofoblásticas e a 5 proteína foi prontamente detectável no plasma de mulheres grávidas. Foi observado que os níveis de sFlt-1 aumentaram aproximadamente 3 vezes entre 20 e 36 semanas de gestação. Foi observado que os níveis são significativamente maiores em mulheres de alto risco que em seguida passaram a desenvolver pré-eclâmpsia (Charnock-Jones et al., J. Soc. Gynecol. Inves10 tig. 10(2):230, 2003).

Na prática veterinária, podem ser realizados testes a qualquer momento durante a gestação, mas, preferencialmente, são realizados no início da gestação, antes do início dos sintomas de pré-eclâmpsia. Dado que o termo das gestações varia amplamente entre as espécies, o momento do 15 teste será determinado por um veterinário, mas geralmente corresponderá ao momento dos testes durante uma gestação humana.

Os métodos diagnósticos descritos neste relatório podem ser usados individualmente ou em combinação com qualquer outro método diagnóstico descrito neste relatório para um diagnóstico mais preciso da pre20 sença, da gravidade, ou do tempo de início estimado da pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Além disso os métodos diagnósticos descritos neste relatório podem ser usados em combinação com quaisquer outros métodos diagnósticos determinados para serem úteis para o diagnóstico acurado da presença, da gravidade, ou do tempo de início estimado da pré-eclâmpsia ou 25 eclâmpsia.

Os métodos diagnósticos descritos neste relatório também podem ser usados para monitorar e tratar pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente. Em um exemplo, caso se determine que uma paciente tem um nível sérico de proteína sFlt-1 de 10 ng/mL e um nível sérico de PIGF livre 30 de 100 pg/mL, então pode ser administrado VEGF até o nível sérico de

PIGF aumentar para aproximadamente 400 pg/mL. Nesta modalidade, os níveis de sFlt-1, PIGF, e VEGF, ou qualquer um todos estes, são medidos repetidamente como um método para não somente diagnosticar doença mas monitorar o tratamento e a administração da pré-eclâmpsia e da eclâmpsia.

Kits Diagnósticos

A invenção também proporciona um kit de teste diagnóstico. Por exemplo, um kit de teste diagnóstico pode incluir anticorpos para sFlt-1, VEGF, ou PIGF, e meios para detectar, e mais preferencialmente avaliar, ligação entre os anticorpos e o polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF. Para

detecção, ou o anticorpo ou o polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF é marca10 do, e ou o anticorpo ou o polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF é ligado a substrato, de tal modo que á interação entre polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF e anticorpo pode ser estabelecida determinando a quantidade de marcador fixado ao substrato após ligação entre o anticorpo e o polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF. Um ELISA convencional é um método comum e co15 nhecido na técnica para detectar interação entre anticorpo e substrato e pode ser proporcionado com o kit da invenção. Os polipeptídeos sFlt-1, VEGF, ou PIGF podem ser detectados em virtualmente qualquer fluido corporal inclusive, mas não limitado a urina, soro, plasma, saliva, líquido amniótico, ou líquido cerebroespinhal. Um kit que determina uma alteração no nível de polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF com relação a uma referência, tal como o nível presente em um controle normal, é útil como um kit diagnóstico nos métodos da invenção.

Testes de Triagem

Conforme discutido acima, a expressão de um ácido nucléico ou polipeptídeo sFlt-1 está aumentada em uma paciente tendo pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência a desenvolver tais condições. Com base nestas descobertas, as composições da invenção são úteis para a triagem de alta produtividade e baixo custo de compostos candidatos para identificar os que modulam a expressão de um polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF ou molécula de ácido nucléico cuja expressão está alterada em uma paciente tendo uma pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

Qualquer número de métodos estão disponíveis para realizar

testes de triagem para identificar novos compostos candidatos que alteram a expressão de uma molécula de ácido nucléico sFlt-1, VEGF, ou PIGF. Em um exemplo de trabalho, compostos candidatos são adicionados em concentrações variáveis ao meio de cultura de células cultivadas expressando 5 uma seqüência de ácidos nucléicos de sFlt-1, VEGF, ou PIGF. Em seguida é medida a expressão genética, por exemplo, por análise de microarranjo, análise Northern blot (Ausubel et al., supra), ou RT-PCR, usando qualquer fragmento apropriado preparado a partir da molécula de ácido nucléico

como uma sonda de hibridização. O nível de expressão genética na presen10 ça do composto candidato é comparado ao nível medido em um meio de cultura de controle carecendo do composto candidato. Um composto que estimula uma alteração tal como um aumento na expressão de um gene, molécula de ácido nucléico, ou polipeptideo VEGF ou PIGF, ou uma redução na expressão de um gene, molécula de ácido nucléico, ou polipeptideo sFlt-1, ou um equivalente funcional dos mesmos, é considerado útil na invenção; uma molécula semelhante pode ser usada, por exemplo, como um terapêutico para tratar pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente.

Em outro exemplo de trabalho, o efeito dos compostos candidatos pode ser medido ao nível da produção de polipeptídeos usando a mesma abordagem geral e técnicas imunológicas de rotina, tais como Western blotting ou imunoprecipitação com um anticorpo específico para um polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF. Por exemplo, podem ser usados imunoensaios para detectar ou monitorar a expressão de no mínimo um dos poli peptídeos da invenção em um organismo. Anticorpos policlonais ou mono25 clonais (produzidos conforme descrito acima) que são capazes de ligar a um polipeptideo semelhante podem ser usados em qualquer formato de imunoensaio de rotina (por exemplo, ELISA, Western blot, ou teste RIA) para medir o nível do polipeptideo. Em algumas modalidades, um composto que estimula uma alteração tal como um aumento na expressão ou na atividade 30 biológica de um polipeptideo VEGF ou PIGF ou uma redução na expressão ou na atividade biológica de um polipeptideo sFlt-1 é considerado particularmente útil. Novamente, uma molécula semelhante pode ser usada, por

Ο^{1 10} e

exemplo, como um terapêutico para retardar, melhorar, ou tratar uma préeclâmpsia ou eclâmpsia, ou os sintomas de uma pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, em uma paciente.

Em ainda outro exemplo de trabalho, compostos candidatos podem ser triados para aqueles que ligam especificamente a um polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF. A eficácia de um composto candidato semelhante é dependente de sua capacidade para interagir com um polipeptídeo semelhante ou um equivalente funcional do mesmo. Uma interação semelhante pode ser prontamente avaliada usando qualquer número de técnicas de ligação de rotina e testes funcionais (por exemplo, os descritos em Ausubel et al., supra). Em uma modalidade, um composto candidato pode ser testado in vitro para sua capacidade para ligar especificamente um polipeptídeo da invenção. Em outra modalidade, um composto candidato é testado para sua capacidade para reduzir a atividade biológica de um polipeptídeo sFlt-1 reduzindo a ligação de um polipeptídeo sFlt-1 e um fator do crescimento, tal como VEGF ou PIGF.

Em outro exemplo de trabalho, um ácido nucléico de sFlt-1, VEGF, ou PIGF é expresso como uma fusão transcripcional ou traducional com um repórter detectável, e expresso em uma célula isolada (por exemplo, célula de mamífero ou inseto) sob o controle de um promotor heterólogo, tal como um promotor indutível. A célula expressando a proteína de fusão é em seguida posta em contato com um composto candidato, e a expressão do repórter detectável nesta célula é comparada com a expressão do repórter detectável em uma célula de controle não-tratada. Um composto candidato que reduz a expressão de um repórter detectável de sFlt-1, ou que aumenta a expressão de um repórter detectável de VEGF ou PIGF é um composto que é útil para o tratamento de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Em modalidades preferenciais, o composto candidato altera a expressão de um gene repórter fundido a um ácido nucléico ou ácido nucléico.

Em um exemplo de trabalho particular, pode ser identificado um composto candidato que liga a um polipeptídeo sFlt-1 usando uma técnica à base de cromatografia. Por exemplo, um polipeptídeo recombinante da in30

venção pode ser purificado por meio de técnicas de rotina a partir de células produzidas para expressar o polipeptídeo (por exemplo, as descritas acima) e pode ser imobilizado sobre uma coluna. Uma solução de compostos candidatos é em seguida passada através da coluna, e um composto específico 5 para o polipeptídeo sFlt-1 é identificado com base em sua capacidade para ligar ao polipeptídeo e ser imobilizado sobre a coluna. Para isolar o composto, a coluna é lavada para remover moléculas ligadas nãoespecificamente, e o composto de interesse é em seguida liberado da coluna e coletado. Podem ser usados métodos semelhantes para isolar um 10 composto ligado a uma microssérie de polipeptídeos. Compostos isolados por este método (ou qualquer outro método apropriado), caso desejado, podem ser adicionalmente purificados (por exemplo, por meio de cromatografia líquida de alta performance). Além disso estes composto candidatos podem ser testados para sua capacidade para reduzir a atividade de um polipeptí15 deo sFlt-1 ou para aumentar a atividade de um caminho de sinalização de

VEGF (por exemplo, conforme descrito neste relatório). Compostos isolados por esta abordagem também podem ser usados, por exemplo, como terapêuticos para tratar pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente humana. Compostos que são identificados como ligando a um polipeptídeo da inven20 ção com uma constante de afinidade menor do que ou igual a 10 mM são considerados particularmente úteis na invenção. Alternativamente, pode ser utilizado qualquer sistema de detecção de interação de proteína in vivo, por exemplo, qualquer teste de dois híbridos para identificar compostos ou proteínas que se ligam a um polipeptídeo da invenção.

Antagonistas potenciais incluem moléculas orgânicas, peptídeos, miméticos de peptídeos, polipeptídeos, ácidos nucléicos, e anticorpos que ligam a uma seqüência de ácidos nucléicos sFlt-1 ou polipeptídeo sFIt-

1.

Seqüências de DNA de sFlt-1 também podem ser usadas na descoberta e no desenvolvimento de um composto terapêutico para o tratamento de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. A proteína codificada, na expressão, pode ser usada como um alvo para a triagem dos fármacos. Adicionalmente, as seqüências de DNA codificando as regiões de terminal amino da proteína codificada ou Shine-Delgarno ou outras seqüências de facilitação de translação do RNAm respectivo podem ser usadas para construir seqüências que reduzem a expressão de uma seqüência codificante de sFlt-1. As seqüên5 cias referidas podem ser isoladas por meio de técnicas de rotina (Ausubel et al., supra).

Opcionalmenté, compostos identificados em qualquer um dos

testes descritos acima podem ser confirmados como úteis em um teste para compostos que reduzem a atividade biológica de sFlt-1 ou que aumentarm a 10 atividade de um caminho de sinalização de VEGF.

Moléculas pequenas da invenção preferencialmente têm um peso molecular abaixo de 2.000 dáltons, mais preferencialmente entre 300 e 1.000 dáltons, e ainda mais preferencialmente entre 400 e 700 dáltons. É preferencial que estas pequenas moléculas sejam moléculas orgânicas.

Terapêuticos tendo como objetivo o caminho de sinalização de VEGF

VEGF é um potente mitógeno específico para células endoteliais que estimula a angiogênese, a hiperpermeabilidade vascular, e vasodilatação. Foram identificados três receptores de sinalização de tirosina-quinase para VEGF. A ligação do receptor de VEGF dispara uma cascata de sinali20 zação que resulta na fosforilação por tirosina de fosfolipase Ογ1, levando a aumentos nos níveis intracelulares de inositol 1,4,5-trifosfato e aumentos no cálcio intracelular que ativa a óxido nítrico sintase para produzir óxido nítrico (NO). A formação de óxido nítrico ativa a guanilato ciclase dentro das células dos músculos lisos vasculares e das células endoteliais, provocando 25 produção de cGMP. Imagina-se que esta cascata NO/cGMP medie os efeitos vasoativos de VEGF. Outro caminho que parece estar einvolvido na mediação dos efeitos vasoativos de VEGF é o caminho de liberação da prostaciclina. VEGF induz produção de PGI2 através da ativação da fosfolipase A2 como uma conseqüência da iniciação da cascata MAPK.

Níveis aumentados de VEGF são úteis para o tratamento de pré-eclâmpsia e eclâmpsia. Compostos terapêuticos que têm como objetivo caminhos de sinalização de VEGF, ou componentes de um caminho de si

nalização de VEGF, e aumentam a atividade de um caminho de sinalização de VEGF também são úteis para o tratamento de pré-eclâmpsia e eclâmpsia. Os compostos referidos incluem sildenafil, análogos da prostaciclina, tais como Flolan, Remodulin, e Tracleer.

Compostos de teste e extratos

Em geral, compostos capazes de reduzir a atividade de um polipeptídeo sFlt-1 ou aumentar a atividade de VEGF ou PIGF são identificados a partir de grandes bibliotecas tanto de produtos naturais ou de extratos sintéticos (ou semi-sintéticos) ou bibliotecas químicas ou a partir de bibliotecas de polipeptídeos ou ácidos nucléicos, de acordo com métodos conhecidos na técnica. As pessoas versadas no campo da descoberta e do desenvolvimento de drogas entenderão que a fonte precisa dos extratos ou compostos de teste não é crucial para o procedimento ou procedimentos de triagem da invenção. Compostos usados nas triagens podem incluir compostos conhecidos (por exemplo, terapêuticos conhecidos usados para outras doenças ou distúrbios). Alternativamente, virtualmente qualquer número de compostos ou extratos químicos desconhecidos pode ser triado usando os métodos descritos neste relatório. Exemplos de semelhantes extratos ou compostos incluem, mas não estão limitados a, extratos à base de plantas, à base de fungos, à base de procarióticos ou à base de animais, caldos de fermentação, e compostos sintéticos, bem como modificação de compostos existentes. Numerosos métodos também estão disponíveis para produzir síntese aleatória ou dirigida (por exemplo, semi-síntese ou síntese total) de qualquer número de compostos químicos, inclusive, mas não limitados a, compostos à base de sacarídeos, à base de lipídeos, à base de peptídeos, e à base de ácidos nucléicos. Bibliotecas de compostos sintéticos estão disponíveis comercialmente na Brandon Associates (Merrimack, NH) e Aldrich Chemical (Milwaukee, Wl). Alternativamente, bibliotecas de compostos naturais sob a forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais, e animais estão disponíveis comercialmente em uma série de fontes, inclusive Biotics (Sussex, Reino Unido), Xenova (Slough, Reino Unido), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FL), e PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, MA).

Além disso bibliotecas naturais e produzidas sinteticamente são produzidas, caso desejado, de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de métodos de extração e fracionamento de rotina. Além disso, caso desejado, qualquer biblioteca ou composto é prontamente modificado usando métodos químicos, físicos, ou bioquímicos de rotina.

Além disso, as pessoas versadas na técnica da descoberta e do desenvolvimento de drogas prontamente entendem que devem ser empregados sempre que possível métodos para desreplicação (por exemplo, desreplicação taxonômica, desreplicação biológica, e desreplicação química, ou qualquer combinação dos mesmos) ou a eliminação de replicatas ou repetições de materiais já conhecidos por sua atividade de ruptura de mudança de pele.

Quando se descobre que um extrato bruto reduz a atividade de um polipeptídeo sFlt-1, ou ligando a um polipeptídeo sFlt-1, é necessário adicionalmente fracionamento do extrato de ligação positivo para isolar constituintes químicos responsáveis pelo efeito observado. Deste modo, a meta do processo de extração, fracionamento, e purificação é a cuidadosa caracterização e identificação de uma entidade química dentro do extrato bruto que reduz a atividade de um polipeptídeo sFlt-1. Métodos de fracionamento e purificação de semelhantes extratos heterogêneos são conhecidos na técnica. Caso desejado, compostos que foi demonstrado serem úteis como terapêuticos para o tratamento de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma mulher são quimicamente modificados de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Terapêuticos

A presente invenção se caracteriza por métodos para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia em uma paciente. Preferencialmente o terapêutico é administrado durante a gravidez para o tratamento ou a prevenção de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia ou depois da gravidez para tratar pré-eclâmpsia ou eclâmpsia pós-parto. As técnicas e dosagens para administração variam dependendo do tipo de composto (vetor anticorpo, antisentido, ácido nucléico, e etc.) e são de conhecimento geral das pessoas

Φ versadas na técnica ou são prontamente determinadas.

Os compostos terapêuticos da presente invenção podem ser administrados com um diluente, veículo, ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, sob forma de unidade de dosagem. A administração pode ser parenteral, intravenosa, subcutânea, oral ou local por meio de injeção direta no líquido amniótico. A liberação intravenosa por meio de infusão contínua é o método preferencial para administração dos compostos terapêuticos da presente invenção.

A composição pode estar sob a forma de uma pílula, comprimido, cápsula, líquido, ou comprimido de liberação sustentada para administração oral; ou um líquido para administração intravenosa, subcutânea ou parenteral; ou um polímero ou outro veículo de liberação gradual para administração local.

Métodos de conhecimento geral na técnica para preparar formulações são encontrados, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (20° ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Formulações para administração parenteral podem conter, por exemplo, excipientes, água esterilizada, solução salina, polialquileno glicóis tais como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, ou naftalenos hidrogenados. Podem ser usados polímero de lactídeo biocompatível, biodegradável, copolímero de lactídeo/glicolídeo, ou copolímeros de polioxietileno e polioxipropileno para controlar a liberação dos compostos. Formulações nanoparticuladas (por exemplo, nanopartículas biodegradáveis, nanopartículas de lipídeos sólidos, lipossomas) podem ser usadas para controlar a biodistribuição dos compostos. Outros sistemas de liberação parenteral potencialmente úteis incluem partículas de copolimeros de etileno-acetato de vinila, bombas osmóticas, sistemas implantáveis de infusão, e lipossomas. A concentração do composto na formulação varia dependendo de uma série de fatores, inclusive a dosagem da droga a ser administrada, e a via de administração.

O composto pode ser opcionalmente administrado como alguns sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais de adição de ácido não30

Ο tóxicos ou complexos metálicos que são usados comumente na indústria farmacêutica. Exemplos de sais de adição de ácido incluem ácidos orgânicos tais como ácidos acético, láctico, pamóico, maléico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzóico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metanossulfônico, toluenossulfônico, ou trifluoroacético ou semelhantes; ácidos poliméricos tais como ácido tânico, carboximetil celulose, ou semelhantes; e ácidos inorgânicos tais corno ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ou semelhantes. Complexos metálicos incluem zinco, ferro, e semelhantes.

Formulação para aplicação oral incluem comprimidos contendo o ingrediente ou ingredientes ativos em uma mistura com excipientes nãotóxicos farmaceuticamente aceitáveis. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes ou cargas inertes (por exemplo, sacarose e sorbitol), agentes lubrificantes, deslizantes, e antiaderentes (por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados, ou talco).

Formulações para aplicação oral também podem ser proporcionadas como comprimidos mastigáveis, ou como cápsulas de gelatina duras em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, ou como cápsulas de gelatina moles em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleaginoso.

A dosagem e o momento da administração do composto depende de vários fatores clínicos inclusive da saúde global da paciente e da gravidade dos sintomas da pré-eclâmpsia. Em geral, uma vez que seja detectada pré-eclâmpsia ou uma tendência a desenvolver pré-eclâmpsia, usa-se infusão contínua da proteína purificada para tratar ou prevenir progressão posterior da condição. O tratamento pode ser continuado durante um período de tempo variando de 1 a 100 dias, mais preferencialmente de 1 a 60 dias, e ainda mais preferencialmente de 1 a 20 dias, ou até o encerramento da gravidez. As dosagens variam dependendo de cada composto e da gravidade da condição e são tituladas para obter uma concentração sérica sangüínea em estado estacionário variando de 1 a 500 ng/ml_ de VEGF ou

PIGF, ou ambos, preferencialmente de 1 a 100 ng/ml_, mais preferencialmente de 5 a 50 ng/ml_ e ainda mais preferenciálmente de 5 a 10 ng/ml_ de VEGF ou PIGF, ou ambos.

Métodos para aumentar a expressão da proteína VEGF ou PIGF

A presente invenção se caracteriza por métodos para aumentar

os níveis de VEGF e PIGF em uma paciente diagnosticada com préeclâmpsia ou eclâmpsia. O aumento dos níveis de VEGF ou PIGF pode ser obtido usando várias metodologias diferentes que estão descritas abaixo, entre outras.

Proteínas purificadas

Em uma modalidade preferencial da presente invenção, formas purificadas de VEGF ou PIGF ou ambas são administradas à paciente de modo a tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

VEGF purificadas ou proteínas semelhantes a VEGF incluem qualquer proteína com uma seqüência de aminoácidos que é homóloga, mais desejavelmente, substancialmente idêntica à seqüência de aminoácidos de VEGF, ou qualquer membro da família de VEGF, que pode induzir angiogênese ou que é capaz de promover crescimento seletivo de células endoteliais vasculares ou de células endoteliais da veia umbilical. Um exem20 pio de um composto VEGF purificado é VEGF recombinante humana da Genentech, Inc. (San Francisco, CA).

PIGF purificadas ou proteínas semelhantes a PIGF incluem qualquer proteína com uma seqüência de aminoácidos que é homóloga, mais desejavelmente, substancialmente idêntica à seqüência de aminoáci25 dos de PIGF, ou qualquer membro da família de PIGF, que pode induzir angiogênese ou que é capaz de promover crescimento seletivo de células endoteliais vasculares ou de células endoteliais da veia umbilical. Um exemplo de PIGF purificada disponível comercialmente é PIGF recombinante humana da R&D Systems (catálogo n° 264-PG, R&D Systems, Minneapolis, MN). 30 ThromboGenics Ltd também está desenvolvendo uma forma purificada de

PIGF para o tratamento de derrame cerebral isquêmico; presumivelmente esta forma de PIGF seria eficaz para as aplicações descritas na presente invenção.

Compostos terapêuticos que aumentam a atividade de VEGF ou PIGF

A presente invenção proporciona a aplicação de qualquer composto que se sabe que estimula ou aumenta os níveis séricos sangüíneos 5 de VEGF ou PIGF, ou a atividade biológica destes polipeptídeos, para o tratamento ou a prevenção de pré-eclâmpsia em uma paciente. Estes compostos podem ser usados sozinhos ou em combinação com as proteínas purificadas descritas acima ou qualquer um dos outros métodos usados

para aumentar os níveis das proteínas VEGF ou PIGF descritos neste rela10 tório.

Um exemplo de um composto que foi demonstrado que estimula a produção de VEGF é a nicotina. Embora o fumo apresente muitos riscos para a saúde global de uma mulher grávida e seu feto em desenvolvimento, acredita-se que a nicotina por si só seja mais segura do que cigarros e pode 15 ser usada para terapia de curta duração em pacientes de alto risco. Exemplos incluem Nicorette (polacrilex de nicotina), que é um produto de goma de nicotina OTC preparado pela SmithKline Beecham e NicoDerm CQ, que é um emplastro de nicotina OTC preparado pela Hoechst Marion Roussel Inc.

(anteriormente Marion Merrell Dow). A nicotina liberada através do tabaco é especificamente excluída dos métodos da invenção onde a paciente também não foi diagnosticada usando os métodos da invenção.

A nicotina é administrada depois do diagnóstico de préeclâmpsia ou eclâmpsia usando ou o emplastro ou a goma. As dosagens variam dependendo da gravidade da condição e da saúde global da paci25 ente. Em geral, são seguidas as instruções do fabricante apra obter um nível sérico de nicotina variando a partir de 5 até 500 ng/mL, mais preferencialmente 5 até 100 ng/mL, e ainda mais preferencialmente 50 até 100 ng/mL.

Teofilina é outro exemplo de um composto adicional que pode ser usado para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. A teofilina é um broncodilatador o qual é freqüentemente usado para o tratamento da asma e está disponível sob muitos nomes comerciais (por exemplo, Aerolate Sr, Asmalix, Elxophyllin, e etc.) bem como a genérica. Os métodos de admi65 φ 10 nistração e as dosagens variam de acordo com cada fabricante e são escolhidos com base na saúde global da paciente e na gravidade da condição. Em geral, as dosagens diárias variam a partir de 1 até 500 mg, mais preferencialmente 100 até 400 mg, e ainda mais preferencialmente 250 até 350 mg administradas duas vezes ao dia para obter um nível sérico de teofilina de 5 até 50 pg/mL

Adenosina é outro exemplo de um composto adicional que pode ser usado para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Adenosina (Fujisawa Pharmaceutical Co.) é comumente usada como uma droga antihipertensiva. Os métodos de administração e as dosagens variam de acordo com cada fabricante e são escolhidos com base na saúde global da paciente e na gravidade da condição. Em geral, uma dosagem diária de 50 mg/kg administrada duas vezes ao dia é típica para a adenosina.

Nifedipina é outro exemplo de um composto adicional que pode ser usado para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Nifedipina (Bayer Pharmaceuticals) é comumente usada como uma droga antihipertensiva. Os métodos de administração e as dosagens variam de acordo com cada fabricante e são escolhidos com base na saúde global da paciente e na gravidade da condição. Em geral, uma dosagem diária de 1-2 mg/kg administrada duas vezes ao dia por via oral ou por via subcutânea é típica para a nifedipina.

Minoxidil é outro exemplo de um composto adicional que pode ser usado para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Minoxidil (Pfizer, Inc.) é comumente usada como uma droga anti-hipertensiva. Os métodos de administração e as dosagens variam de acordo com cada fabricante e são escolhidos com base na saúde global da paciente e na gravidade da condição. Em geral, uma dosagem diária de 0,25 a 1,0 mg/kg administrada duas vezes ao dia por via oral ou por via subcutânea é típica para o minoxidil.

Sulfato de magnésio é outro exemplo de um composto adicional que pode ser usado para tratar ou prevenir pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Sulfato de magnésio é uma droga genérica a qual é tipicamente usada como

uma droga anti-hipertensiva. Os métodos de administração e as dosagens variam de acordo com cada fabricante e são escolhidos com base na saúde global da paciente e na gravidade da condição. Em geral, uma dosagem diária de 1-2 gm administrada por via intravenosa a cada quatro horas é uma dosagem típica para o sulfato de magnésio.

Além da aplicação de compostos que podem aumentar os níveis séricos de VEGF ou PIGF, a invenção proporciona a aplicação de quaisquer medicações para hipertensão crônica usadas em combinação com quais

quer dos compostos dirigidos para VEGF ou PIGF. As medicações usadas para o tratamento da hipertensão durante a gravidez incluem metildopa, cloridrato de hidralazina, ou labetalol. Para cada uma destas medicações, os modos de administração e as dosagens são determinados pelo clínico e pelas instruções do fabricante.

Ácidos nucléicos terapêuticos

Um trabalho recente mostrou que a liberação de ácido nucléico (DNA ou RNA) capaz de expressar um mitógeno de células endoteliais tal como VEGF para o sítio de lesão de um vaso sangüíneo induzirá a prolife ração e a reendotelialização do vaso lesionado. Apesar da presente invenção não se referir à lesão de vaso sangüíneo, as técnicas para a liberação de ácido nucléico codificando mitógenos de células endoteliais tais como

VEGF e PIGF usados nestes estudos também podem ser empregadas na presente invenção. Estas técnicas são descritas nas Patentes U.S. N^os

5.830.879 e 6.258.787 e são incorporadas a este relatório por meio de refe rência.

Na presente invenção o ácido nucléico pode ser qualquer ácido nucléico (DNA ou RNA) inclusive DNA genômico, cDNA, e RNAm, codificando VEGF ou PIGF ou quaisquer membros das famílias VEGF ou PIGF. O ácido nucléico também pode incluir qualquer ácido nucléico o qual codifica uma proteína que foi demonstrado que liga ao receptor de sFlt-1. Os ácidos 30 nucléicos codificando a proteína desejda podem ser obtidos usando procedimentos de rotina na técnica, por exemplo, DNA recombinante, amplificação por PCR.

Ácidos nucléicos terapêuticos que inibem a expressão de sFlt-1

A presente invenção também se caracteriza pela aplicação de oligômeros de nucleobase anti-sentido para regular para baixo a expressão de RNAm de sFlt-1 diretamente. Ao ligar à sequência de ácidos nucléicos complementar (o filamento de sentido ou codificante), os oligômeros de nucleobase anti-sentido são capazes de inibir a expressão protéica presumivelmente através da divagem enzimática do filamento de RNA por RNAse

H. Preferencialmente o oligômero de nucleobase anti-sentido é capaz de

reduzir a expressão da proteína sFlt-1 em uma célula que expressa excesso dos níveis de sFlt-1. Preferencialmente a redução na expressão da proteína sFlt-1 é de no mínimo 10% com relação a células tratadas com um oligonucleotídeo de controle, mais preferencialmente de 25%, e ainda mais preferencialmente de 50% ou mais. Os métodos para selecionar e preparar oligômeros de nucleobase anti-sentido são de conhecimento geral na técnica.

Para um exemplo da aplicação dos oligômeros de nucleobase anti-sentido para regular para baixo a expressão de VEGF veja a Patente U.S. N° 6.410.322, incorporada a este relatório por meio de referência. Os métodos para testar os níveis de expressão de proteína também são de conhecimento geral na técnica e incluem Western blotting, imunoprecipitação, e

ELISA.

A presente invenção também se caracteriza pela aplicação de interferência de RNA (RNAi) para inibir a expressão de sFlt-1. Interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo descoberto recentemente de silenciamento genético pós-transcripcional (PTGS) no qual RNA de filamento duplo (dsRNA) correspondente a um gene ou RNAm de interesse é introduzido em um organismo resultando na degradação do RNAm correspondente. Na reação de RNAi, tanto os filamentos de sentido quanto anti-sentido de uma molécula de dsRNA são processados em pequenos fragmentos de RNA ou segmentos variando de extensão de 21 a 23 nucleotídeos (nt) e tendo cau30 das 3’ de 2 nucleotídeos. Alternativamente, dsRNAs sintéticos, os quais têm a 23 nt de extensão e têm caudas 3’ de 2 nucleotídeos, podem ser sintetizados, purificados e usados na reação. Estes dsRNAs de 21 a 23 nt são conhecidos como RNAs guia ou RNAs curtos interferentes (siRNAs).

Os dúplexes de siRNA em seguida ligam a um complexo de nuclease composto de proteínas que visam e destróem RNAms endógenos tendo homologia para o siRNA dentro do complexo. Embora a identidade das proteínas dentro do complexo permaneça incerta, a função do complexo é orientar a molécula de RNAm homóloga através de interações de pareamento de bases entre um dos filamentos de siRNA e o RNAm endógenou. O RNAm é então clivado aproximadamente 12 nt do término 3’ do siRNA e degradado. Desta maneira, genes específicos podem ser visados e degradados, deste modo resultando em uma falta de expressão de proteína do gene visado.

As exigências específicas e modificações de dsRNA são descritas na Publicação Internacional PCT N° WO01/75164 (incorporada a este relatório por meio de referência). Enquanto as moléculas de dsRNA podem variar de extensão, é mais preferencial usar moléculas de siRNA as quais são dsRNAs de 21 a 23 nucleotídeos com extremidades de projeções 3’ de 2 a 3 nucleotídeos características tipicamente ou (2’-desóxi)timidina ou uracila. As siRNAs tipicamente compreendem um grupo hidroxila 3’. Também pode ser usado siRNA de filamento único bem como formas de dsRNA de extremidade cega. De modo a aumentar adicionalmente a estabilidade do RNA, as projeções 3’ podem ser estabilizadas contra degradação. Em uma modalidade semelhante, o RNA é estabilizado incluindo nucleotídeos purina, tais como adenosina ou guanosina. Alternativamente, substituição de nucleotídeos pirimidina por análogos modificados, por exemplo, substituição de projeções de 2 nucleotídeos uridina por (2’-desóxi)timida é tolerada e não afeta a eficiência de RNAi. A ausência de um grupo 2’ hidroxila significativamente aumenta a resistência a nuclease da projeção em meio de cultura de tecido.

Alternativamente, siRNA pode ser preparado usando qualquer um dos métodos determinados na Publicação Internacional PCT N° WO01/75164 (incorporada a este relatório por meio de referência) ou usando procedimentos de rotina para procedimentos de transcrição in vitro de

RNA e recozimento de dsRNA conforme descrito em Elbashir et al. (Genes & Dev., 15:188-200, 2001). siRNAs também sãó obtidos conforme descrito em Elbashir et al. por meio de incubação de dsRNA que corresponde a uma seqüência do gene alvo em um lisado de Drosophila livre de células de em5 briões de Drosophila do blastoderma sincicial sob condições nas quais o dsRNA é processado para produzir siRNAs de cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos, os quais são então isolados usando técnicas de conhecimento das pessoas versadas na técnica. Por exemplo, eletroforese de gel pode ser usada para separar os RNAs de 21-23 nt e os RNAs podem ser em seguida 10 eluídos das fatias de gel. Além disso cromatografia (por exemplo, cromatografia por exclusão de tamanho), centrifugação de gradiente de glicerol, e purificação por afinidade com anticorpo podem ser usadas para isolar os RNAs de 21 a 23 nt.

Na presente invenção, o dsRNA, ou siRNA, é complementar à seqüência de RNAm de um RNAm de sFlt-1 e pode reduzir ou inibir a expressão de sFlt-1. Preferencialmente, a redução na expressão da proteína sFlt-1 é de no mínimo 10% com relação a células tratadas com um siRNA ou dsRNA de controle, mais preferencialmente 25%, e ainda mais preferencialmente no mínimo 50%. Métodos para avaliar os níveis de expressão de proteína também são de conhecimento geral na técnica e incluem Western blotting, imunoprecipitação, e ELISA.

Na presente invenção, os ácidos nucléicos usados incluem qualquer modificação que aumente a estabilidade ou a função do ácido nucléico de qualquer modo. Exemplos incluem modificação para estrutura prin25 cipal de fosfato, a ligação internucleotídeo, ou para a porção de açúcar.

Para simplificar a manipulação e o tratamento do ácido nucléico codificando a proteína de ligação de sFlt-1, o ácido nucléico é preferencialmente inserido em um cassete onde é encadeado operavelmente a um promotor. O promotor deve ser capaz de orientar a expressão da proteína de ligação de sFlt-1 na célula hospedeira alvo desejada. A seleção de promotores apropriados pode ser realizada prontamente. Preferencialmente, se usaria um promotor de alta expressão. Um exemplo de um promotor ade70

quado é o promotor do citomegalovírus (CMV) de 763 pares de bases. Também podem ser usados os promotores do vírus do sarcoma Rous (RSV) (Davis, et al., Hum. Gene Ther. 4:151-159, 1993) e do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV). Algumas proteínas podem ser expressas usando seu promotor nativo. Outros elementos que podem aumentar a expressão também podem ser incluídos (por exemplo, reforçadores ou um sistema que resulta em máiores níveis de expressão tal como um gene tat e elemento tar). O vetor recombinante pode ser um vetor de plasmídeo tal como pUC118, pBR322, ou outros vetores de plasmídeo conhecidos, que 10 incluem, por exemplo, uma origem de replicação de E. coli (ver, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989). O vetor de plasmídeo também pode incluir um marcador selecionável tal como o gene β lactamase para resistência a ampicilina, contanto que o polipeptídeo marcador não afete de modo adverso o meta15 bolismo do organismo que está sendo tratado. O cassete também pode ser ligado a uma porção de ligação de ácido nucléico em um sistema de liberação sintético, tal como o sistema revealdo na Publicação Internacional PCT N° WO95/22618.

O ácido nucléico pode ser introduzido nas células por quaisquer meios apropriados para o vetor empregado. Muitos dos métodos referidos são de conhecimento geral na técnica (Sambrook et al., supra, e Watson et al., Recombinant DNA, Capítulo 12, 2^a edição, Scientific American Books,

1992). Vetores recombinantes podem ser transferidos por meio de métodos tais como precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, transfecção me25 diada por lipossoma, pistola de gene, microinjeção, transferência mediada por capsídeo viral, transferência mediada por polibreno, ou fusão de protoplastos. Para uma revisão dos procedimentos para preparação de lipossomas, direcionamento e liberação de conteúdo, veja Mannino e GouldFogerite, (Bio Techniques, 6:682-690, 1988), Felgner e Holm, (Bethesda 30 Res. Lab. Focus, 11:21, 1989) e Maurer (Bethesda Res. Lab. Focus, 11:25, 1989).

A transferência do vetor recombinante (ou vetor de plasmídeo

♦ ou vetores virais) pode ser realizada através de injeção direta no líquido amniótico ou liberação intravenosa.

Também pode ser usada liberação de gene usando vetores adenovirais (AAV) ou adeno-associados. Adenovírus estão presentes em um grande número de espécies animais, não são muito patogênicos, e podem se duplicar igualmente bem em células em divisão e quiescentes. Como regra geral, os adenovírus usados para liberação de gene estão carecendo de um ou mais genes necessários para replicação viral. Vetores adenovirais recombinantes defeituosos para replicação usados para a liberação de VEGF, PIGF ou qualquer proteína de ligação de sFlt-1, podem ser produzidos de acordo com técnicas conhecidas na técnica (ver Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:2581-2584, 1992; Stratford-Perricadet et al.,

J. Clin. Invest., 90:626-630, 1992; e Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155, 1992). Para um exemplo da aplicação da terapia genética in utero veja a Patente U.S. N° 6.399.585.

Estão disponíveis uma variedade de métodos para transfecção, ou introdução, de dsRNA ou oligonucleotídeos em células de mamíferos. Por exemplo, há vários reagentes de transfecção comercialmente disponíveis incluindo mas não limitados a: TransIT-TKO® (Mirus, Cat. N° MIR 2150), Transmessenger® (Qiagen, Cat. No. 301525), e Oligofectamine® (Invitrogen, Cat. N° MIR 12252-011). Os protocolos para cada reagente de transfecção estão disponíveis nos fabricantes.

Uma vez transferido, o ácido nucléico é expresso pelas células no local da lesão durante um período de tempo suficiente para aumentar os níveis séricos sanguíneos de VEGF, PIGF, ou qualquer outra proteína de ligação de sFlt-1. Como os vetores contendo o ácido nucléico não são normalmente incorporados no genoma das células, a expressão da proteína de interesse ocorre somente por um tempo limitado. Tipicamente, a proteína é expressa em níveis terapêuticos durante cerca de dois dias até várias semanas, preferencialmente durante cerca de uma a duas semanas. Pode ser utilizada a reaplicação do DNA para proporcionar períodos adicionais de expressão da proteína terapêutica. Exemplos recentes de terapia genética

usando VEGF para o tratamento de doença vascular em mamíferos podem ser encontrados em Deodato et al. (Gene Ther., 9:777-785, 2002); Isner et al. (Human Gene Ther., 12:1593-1594, 2001); Lai et al. (Gene Ther., 9:804813, 2002); e revisados em Freedman e Isner (Ann. Intern. Med., 136:54-71,

2002) e Isner JM (Nature, 415:234-239, 2002).

Testes para expressão genética e protéica

Os métodos seguintes podem ser usados para avaliar a expressão protéica ou genética e determinar a eficácia para qualquer um dos mé-

todos mencionados acima para aumentar os níveis de VEGF, PIGF ou qualquer outra proteína de ligação de sFlt-1, ou para reduzir os níveis de proteína sFlt-1.

O soro sangüíneo da paciente é medido para níveis de VEGF,

PIGF, ou qualquer ligante protéico conhecido por ligar a sFlt-1. Os métodos usados para medir os níveis séricos de proteínas incluem ELISA, Western 15 blotting, ou imunoensaios usando anticorpos específicos. Além disso podem ser realizados testes de angiogênese in vitro para determinar se o sangue da paciente foi convertido de um estado antiangiogênico para um estado pró-angiogênico. Os testes referidos são descritos acima no Exemplo 2. Um resultado positivo é considerado um aumento de no mínimo 20%, preferen-

cialmente 30%; mais preferencialmente no mínimo 50%, e ainda mais preferencialmente no mínimo 60% nos níveis séricos de VEGF, PIGF, ou qualquer ligante protéico que se saiba que ligue a sFlt-1. Um resultado positivo também pode ser considerado conversão de um estado antiangiogênico para um estado pró-angiogênico usando o teste de angiogênese in vitro.

Há vários métodos conhecidos na técnica para testar a expressão genética. Alguns exemplos incluem a preparação de RNA das amostras sanguíneas da paciente e a aplicação do RNA para Northern blotting, amplificação à base de PCR, ou testes de proteção de RNAse.

Uso de anticorpos para tratamento terapêutico

Os elevados níveis de sFlt-1 encontrados nas amostras de soro tiradas de mulheres grávidas sofrendo de pré-eclâmpsia sugere que sFlt-1 tem ação como um dissipador fisiológico para ligar a e esgotar as células trofoblásticas e células endoteliais maternas de VEGF e PIGF funcionais. A aplicação de compostos, tais como anticorpos, para ligar a sFlt-1 e bloquear a ligação de VEGF ou PIGF, pode ajudar a prevenir ou tratar pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, produzindo um aumento em VEGF ou PIGF livres. Um aumento semelhante possibilitaria um aumento da proliferação de trofoblastos, migração e angiogênese necessária para o desenvolvimento placentário e a nutrição fetal, e para a saúde sistêmica das células endoteliais maternas.

A presente invenção proporciona anticorpos que ligam especificamente ao domínio de ligação de ligante de sFlt-1. Os anticorpos são usados para inibir sFlt-1 e acredita-se que o mecanismo mais eficaz seja através do bloqueio direto dos sítios de ligação para VEGF ou PIGF, no entanto, outros mecanismos não podem ser excluídos. São descritos métodos para a preparação e a aplicação de anticorpos para fins terapêuticos em várias patentes inclusive nas Patentes U.S. Números 6.054.297; 5.821.337; 6.365.157; e 6.165.464 e são incorporadas a este relatório por meio de referência. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais; são preferenciais anticorpos monoclonais.

Os anticorpos monoclonais, particularmente os derivados de roedores inclusive camundongos, têm sido usados para o tratamento de várias doenças; no entanto, há limitações para sua aplicação inclusive a indução de uma resposta de imunoglobulina humana anticamundongo que causa rápido clearance e uma redução na eficácia do tratamento. Por exemplo, uma importante limitação na aplicação clínica dos anticorpos monoclonais de roedores é uma reação antiglobulina durante a terapia (Miller et al., B/ood, 62:988-995 1983; Schroff et al., Câncer Res., 45:879-885, 1985).

A técnica tem tentado superar este problema construindo anticorpos quiméricos nos quais um domínio variável de ligação de antígeno animal é acoplado a um domínio constante humano (Patente U.S. N° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855, 1984; Boulianne et al., Nature, 312:643-646, 1984; Neuberger et al., Nature, 314:268-270, 1985). A produção e a aplicação de semelhantes anticorpos quiméricos estão descritas abaixo.

2/2.

A inibição competitiva de ligação de ligante a sFlt-1 é útil para a prevenção ou o tratamento de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia. Anticorpos orientados para sFlt-1 podem bloquear a ligação de VEGF ou PIGF a sFlt-1 resultando em aumento dos níveis de VEGF ou PIGF. Um aumento seme5 lhante pode resultar em um resgate da disfunção endotelial e uma mudança no equilíbrio de fatores pró-angiogênicos/antiangiogênicos em direção à angiogênese.

Um coquetel dos anticorpos monoclonais da presente invenção pode ser usado como um tratamento eficaz para pré-eclâmpsia ou 10 eclâmpsia. O coquetel pode incluir tão pouco quanto dois, três, ou quatro diferentes anticorpos ou tantos quanto seis, oito, ou dez diferentes anticorpos. Além disso os anticorpos da presente invenção podem ser combinados com uma droga anti-hipertensiva (por exemplo, metildopa, cloridreto de hidralazina, ou labetalol) ou qualquer outra medicação usada para tratar pré15 eclâmpsia, eclâmpsia, ou os sintomas associados com pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

Preparação de Anticorpos

Anticorpos monoclonais que ligam especificamente ao receptor sFlt-1 podem ser produzidos por meio de métodos conhecidos na técnica.

Estes métodos incluem o método imunológico descrito por Kohler e Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975) e Campbell (Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization ofRodent and Human Hybrídomas em Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985), bem como por meio do método de DNA recombinante descrito por Huse et al. (Science, 246, 1275-1281, 1989).

Anticorpos monoclonais podem ser preparados a partir de sobrenadantes de culturas de células de hibridoma ou a partir de ascites induzida por inoculação intraperitoneal de células de hibridoma em camundon30 gos. A técnica do hibridoma descrita originalmente por Kohler e Milstein (Eur. J. Immunol, 6, 511-519, 1976) tem sido amplamente aplicada para produzir linhagens de células híbridas que secretam altos níveis de anticor75

2/3 pos monoclonais contra muitos antígenos específicos.

A via e o esquema de imunização dó animal hospedeiro ou cultura de células produtoras de anticorpos dos mesmos são geralmente de acordo com técnicas estabelecidas e convencionais para estimulação e produção de anticorpos. Tipicamente, são usados camundongos como o modelo de teste, no entanto, qualquer paciente mamífero inclusive pacientes humanas ou células produtoras de anticorpos dos mesmos podem ser manipuladas de acordo com os processos desta invenção para servir como a base para produção de linhagens de células híbridas de mamífero, inclusive ser humano.

Depois da imunização, células linfóides imunes são fundidas com células de mieloma para gerar uma linhagem celular híbrida que pode ser cultivada e subcultivada indefinidamente, para produzir grandes quantidades de anticorpos monoclonais. Para os fins desta invenção, as células linfóides imunes selecionadas para fusão são linfócitos e sua progênie diferenciada normal, tomada ou de tecido de linfonodos ou de tecido esplênico de animais imunizados. A aplicação de células esplênicas é preferencial, uma vez que oferecem uma fonte mais concentrada e conveniente de células produtoras de anticorpos com respeito ao sistema do camundongo. As células de mieloma proporcionam a base para propagação contínua do híbrido fundido. Células de mieloma são células tumorais derivadas de células plasmáticas. Linhagens de células de mieloma murino podem ser obtidas, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Também foram descritas linhagens de células de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano (Kozbor et al., J. Immunol., 133:3001-3005, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcei Dekker, Inc., New York, pp. 51-63, 1987).

As linhagens de células híbridas podem ser mantidas in vitro em meios de cultura celular. Uma vez que a linhagem de células de hibridoma seja estabelecida, pode ser mantida em uma variedade de meios nutricionalmente adequados tais como meio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). Além disso, as linhagens de células híbridas podem ser armazena30 das e preservadas em qualquer número de modos convencionais, inclusive congelamento e armazenamento sob nitrogênio líquido. Linhagens de células congeladas podem ser revividas e cultivadas indefinidamente com síntese resumida e secreção de anticorpo monoclonal. O anticorpo secretado é recuperado do sobrenadante da cultura de tecido por meio de métodos convencionais tais como precipitação, cromotografia de permuta iônica, cromotografia por afinidade, ou semelhantes.

O anticorpo pode ser preparado em qualquer mamífero, inclusive camundongos, ratos, coelhos, cabras, e seres humanos. O anticorpo pode ser um membro de uma das seguintes classes de imunoglobulina: IgG, IgM, IgA, IgD, ou IgE, e as subclasses das mesmas, e preferencialmente é um anticorpo de IgG.

Apesar do animal preferencial para produção de anticorpos monoclonais ser o camundongo, a invenção não está limitada ao mesmo; de fato, podem ser usados anticorpos humanos e podem se comprovar preferenciais. Os anticorpos referidos podem ser obtidos usando hibridomas humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss Inc., p. 77-96, 1985). Na presente invenção, podem ser usadas técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos quiméricos unindo os genes de uma molécula de anticorpo de camundongo de apropriada especificidade antigênica junto com genes de uma molécula de anticorpo humano (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985); os anticorpos referidos estão dentro do escopo desta invenção e são descritos abaixo.

Como outra alternativa para a técnica de fusão celular, células B imortalizadas do vírus Epstein-Barr (EBV) são usadas para produzir os anticorpos monoclonais da presente invenção (Crawford D. et al., J. of Gen. Virol., 64:697-700, 1983; Kozbor e Roder, J. Immunol., 4:1275-1280, 1981; Kozbor et al., Methods in Enzymology, 121:120-140, 1986). Em geral, o procedimento consiste em isolar o vírus Epstein-Barr de uma fonte adequada, geralmente uma linhagem de células infectadas, e expor as células secreto30

ras de anticorpos alvos a sobrenadantes contendo o vírus. As células são lavadas, e cultivadas em um meio de cultura celular apropriado. Subseqüentemente, células transformadas viralmente presentes na cultura celular podem ser identificadas pela presença do antígeno nuclear viral Epstein5 Barr, e células secretoras de anticorpos transformadas podem ser identificadas usando métodos de rotina conhecidos na técnica. Outros métodos para produção de anticorpos monoclonais, tais como DNA recombinante, também são incluídos dentro do escopo da invenção.

Preparação de Imunóqenos sFlt-1 sFlt-1 podem ser usados por si só como um imunógeno, ou podem ser fixados a uma proteína de veículo ou a outros objetos, tais como contas de sefarose. sFlt-1 podem ser purificados a partir de células que se sabe que expressam a proteína endógena tais como células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC; Kendall et al., Biochem. Biophys. Res.

Comm., 226:324-328, 1996). Adicionalmente, moléculas de ácido nucléico que codificam sFlt-1, ou porções da mesma, pode ser inserida em vetores conhecidos para expressão em células hospedeiras usando técnicas de DNA recombinante de rotina. Células hospedeiras adequadas para expressão de sFlt-1 incluem células de baculovírus (por exemplo, células Sf9), cé20 lulas bacterianas (por exemplo, E. coli), e células de mamíferos (por exemplo, células NIH3T3).

Além disso, peptídeos podem ser sintetizados e usados como imunógenos. Os métodos para preparar anticorpo para peptídeos são de conhecimento geral na técnica e geralmente requerem acoplamento do 25 peptídeo a uma molécula de veículo adequada, tal como albumina sérica. Peptídeos incluem qualquer seqüência de aminoácidos que seja substancialmente idêntica a qualquer parte da seqüência de aminoácidos sFlt-1 correspondente ao número de acesso no GenBank U01134. Os peptídeos podem ter qualquer extensão, preferencialmente 10 aminoácidos ou mais, 30 mais preferencialmente 25 aminoácidos ou mais, e ainda mais preferencialmente 40, 50, 60, 70, 80, ou 100 aminoácidos ou mais. Preferencialmente, as seqüências de aminoácidos são no mínimo 60%, mais preferencialmente

85%, e, ainda mais preferencialmente 95% idênticas à seqüência de U01134. Os peptídeos podem ser obtidos comèrcialmente ou preparados usando técnicas de conhecimento geral na técnica, tais como, por exemplo, o método de fase sólida de Merrifield (Science, 232:341-347, 1985). O pro5 cedimento pode usar sintetizadores comercialmente disponíveis tais como uma máquina de peptídeos automatizada Biosearth 9500, com divagem dos aminoácidos bloqueados sendo obtida com fluoreto de hidrogênio, e os peptídeos purificados por meio de HPLC do preparativo usando um instrumento Waters Delta Prep 3000, em uma coluna de 15-20 pm Vydac C4 PrepPAK.

Equivalentes funcionais de anticorpos

A invenção também inclui equivalentes funcionais dos anticorpos descritos neste relatório descritivo. Equivalentes funcionais incluem polipeptídeos com seqüências de aminoácidos substancialmente idênticas à seqüência de aminoácidos das regiões variáveis ou hipervariáveis dos anti15 corpos da invenção. Equivalentes funcionais têm características de ligação comparáveis a dos anticorpos, e incluem, por exemplo, anticorpos quimerizados, humanizados e de cadeia única bem como fragmentos dos mesmos. Os métodos para produzir os equivalentes funcionais referidos são revelados na Publicação PCT N° WO93/21319; no Pedido de Patente Européia 20 N°. 239.400; na Publicação PCT N° WO89/09622; no Pedido de Patente

Européia N° 338.745; no Pedido de Patente Européia N° 332.424; e na Patente U.S. N° 4.816.567; cada um dos quais é incorporado a este relatório por meio de referência.

Os anticorpos quimerizados preferencialmente têm regiões 25 constantes derivadas substancialmente ou exclusivamente de regiões constantes de anticorpos humanos e regiões variáveis derivadas substancialmente ou exclusivamente da seqüência da região variável de um mamífero diferente de um ser humano. Os anticorpos humanizados referidos são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das 30 mesmas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ ou outras subseqüências de ligação de antígeno de anticorpos) os quais contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Os métodos para humanizar anticorpos

Ο ¹⁰ zfl· não-humanos são de conhecimento geral na técnica (para revisões veja Vaswani e Hamilton, Ann Allergy Asthma Immunol., 81:105-119, 1998 e Carter, Nature Reviews Câncer, 1:118-129, 2001). De modo geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos aminoácidos introduzidos no mesmo de uma fonte que é não-humana. Estes resíduos aminoácidos nãohumanos são freqüentemente referidos como resíduos de importação, os quais são tipicamente tirados de um domínio variável de importação. A humanização pode ser realizada essencialmente seguindo os métodos conhecidos na técnica (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; e Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 1988), substituindo seqüências CDRs de roedores ou outras seqüências CDR pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, os anticorpos humanizados referidos são anticorpos quiméricos em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana (veja por exemplo, a Patente U.S. N° 4.816.567). Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores (Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596, 1992).

Métodos adicionais para a preparação de anticorpos humanizados podem ser encontrados nas Patentes U.S. N^os 5.821.337, e 6.054.297, e em Carter, (supra) os quais são todos incorporados a este relatório por meio de referência. O anticorpo humanizado é selecionado entre qualquer classe de imunoglobulinas, inclusive IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isótipo, inclusive IgG,, lgG₂, lgG₃, e lgG₄. Onde a atividade citotóxica não é necessária, tal como na presente invenção, o domínio constante é preferencialmente da classe lgG₂. O anticorpo humanizado pode compreender seqüências de mais de uma classe ou isótipo, e a seleção de domínios constantes particulares para otimizar funções efetoras desejadas está dentro do conhecimento regular da técnica.

Anticorpos humanos também podem ser produzidos usando vá30 • 10 e

rias técnicas conhecidas na técnica, inclusive bibliotecas de apresentação de fago (Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991 e Winter et al. Annu. Rev. Immunol., 12:433-455, 1994). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também são úteis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., supra; Boerner et al., J. Immunol., 147: 86-95, 1991).

Mamíferos adequados diferentes de um ser humano incluem qualquer mamífero a partir do qual podem ser preparados anticorpos monoclonais. Exemplos de mamíferos diferentes de um ser humano incluem, por exemplo, um coelho, rato, camundongo, cavalo, cabra, ou primata; é preferencial um camundongo.

Equivalentes funcionais de anticorpos também incluem fragmentos de anticorpos de cadeia única, também conhecidos como anticorpos de cadeia única (scFvs). Os fragmentos de anticorpos de cadeia única são polipeptideos recombinantes os quais tipicamente ligam antígenos ou receptores; estes fragmentos contêm no mínimo um fragmento de uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada variável de anticorpo (V_H) amarrado a no mínimo um fragmento de uma seqüência cadeia leve variável de anticorpo (V_L) com ou sem um ou mais encadeadores interconectando. Um encadeador semelhante pode ser um peptídeo curto e flexível selecionado para assegurar que ocorra o apropriado dobramento tridimensional dos domínios V_L e V_H uma vez que sejam encadeados de modo a manter a especificidade de ligação da molécula alvo do anticorpo inteiro do qual é derivado o fragmento de anticorpo de cadeia única. De modo geral, o término de carboxila da seqüência V_L ou V_H é encadeado de modo covalente por um encadeador peptídico semelhante ao término de aminoácido de uma seqüência V_L e V_H complementar. Fragmentos de anticorpos de cadeia única podem ser produzidos por meio de clonagem molecular, biblioteca de apresentação de fagos de anticorpos ou técnicas semelhantes. Estas proteínas podem ser produzidas ou em células eucarióticas ou em células procarióticas, inclusive bactérias.

Os fragmentos de anticorpos de cadeia única contêm seqüências de aminoácidos tendo no mínimo uma das regiões variáveis ou CDRs

2/1 dos anticorpos inteiros descritos neste relatório descritivo, mas estão carecendo de parte ou todos os domínios constantes destes anticorpos. Estes domínios constantes não são necessários para ligação de antígeno, mas constituem uma porção importante da estrutura dos anticorpos inteiros.

Fragmentos de anticorpos de cadeia única podem portanto superar alguns dos problems associados com o uso de anticorpos contendo parte ou todo um domínio constante. Pór exemplo, fragmentos de anticorpos de cadeia única tendem a ser livres de interações indesejadas entre moléculas biológi-

cas e a região constante de cadeia pesada, ou outra atividade biológica in10 desejada. Adicionalmente, fragmentos de anticorpos de cadeia única são consideravelmente menores do que os anticorpos inteiros e portanto podem ter maior permeabilidade capilar do que anticorpos inteiros, possibilitando que fragmentos de anticorpos de cadeia única localizem e liguem a sítios de ligação de antígeno alvo de modo mais eficaz. Além disso, fragmentos de 15 anticorpos podem ser produzidos em uma escala relativamente grande em células procarióticas, deste modo facilitando sua produção. Além disso, o tamanho relativamente pequeno dos fragmentos de anticorpos de cadeia única faz com que seja menos provável que provoquem uma reação imune em um receptor do que anticorpos inteiros.

Equivalentes funcionais adicionalmente incluem fragmentos de anticorpos que têm as mesmas características de ligação ou características comparáveis às do anticorpo inteiro. Os fragmentos referidos podem conter um ou ambos os fragmentos Fab ou o fragmento F(ab’)₂. Preferencialmente os fragmentos de anticorpos contêm todos os seis CDRs do anticorpo intei25 ro, embora fragmentos contendo menos de todas as regiões referidas, tais como três, quatro ou cinco CDRs, também são funcionais.

Além disso, os equivalentes funcionais podem ser ou podem combinar membros de qualquer uma das classes de imunoglobulina seguintes: IgG, IgM, IgA, IgD, ou IgE, e as subclasses das mesmas.

Preparação de Equivalentes Funcionais de Anticorpos

Equivalentes de anticorpos são preparados por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, fragmentos de anticorpos podem ser preparados enzimaticamente a partir de anticorpos inteiros. Preferencialmente, equivalentes de anticorpos são preparados a partir de DNA codificando tais equivalentes. DNA codificando fragmentos de anticorpos podem ser preparados eliminando tudo exceto a porção desejada do DNA que codifica o anticorpo de extensão total.

DNA codificando anticorpos quimerizados podem ser preparados recombinando DNA codificando substancialmente ou exclusivamente regiões constantes humanas e DNA codificando regiões variáveis derivadas substancialmente ou exclusivamente da sequência da região variável de um mamífero diferente de um ser humano. DNA codificando anticorpos humanizados podem ser preparados recombinando DNA codificando regiões constantes e regiões variáveis diferentes dos CDRs derivados substancialmente ou exclusivamente das regiões de anticorpos humanos correspondentes e DNA codificando CDRs derivados substancialmente ou exclusivamente de um mamífero diferente de um ser humano.

Fontes adequadas de moléculas de DNA que codificam fragmentos de anticorpos incluem células, tais como hibridomas, que expressam o anticorpo de extensão total. Os fragmentos podem ser usados eles mesmos como equivalentes de anticorpos, ou podem ser recombinados em equivalentes, conforme descrito acima.

As eliminações de DNA e recombinações descritas nesta seção podem ser realizadas por meio de métodos conhecidos, tais como os descritos nos pedidos de patente publicados listados acima.

Triagem e Seleção de Anticorpos

Anticorpos monoclonais são isolados e purificados usando métodos conhecidos na técnica de rotina. Por exemplo, anticorpos podem ser triados usando métodos conhecidos na técnica de rotina tais como ELISA contra o antígeno peptídico sFlt-1 ou análise western blot. Exemplos de semelhantes técnicas são descritas nos Exemplos II e III da Patente U.S. N° 6.365.157, incorporada a este relatório por meio de referência.

Aplicações Terapêuticas de Anticorpos

Quando usados in vivo para o tratamento ou a prevenção de pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, os anticorpos da presente invenção são administrados à paciente em quantidades terapeuticamente eficazes. Preferencialmente, os anticorpos são administrados por via parenteral ou por via intravenosa por meio de infusão contínua. A dose e o regime de dosagem de5 pendem da gravidade da doença, e da saúde geral da paciente. A quantidade de anticorpo administrado é tipicamente dentro do alcance de cerca de

0,01 a cerca de 10 mg/kg de peso da paciente.

Para administração parenteral, os anticorpos são formulados em uma forma injetável de unidade de dosagem (solução, suspensão, emulsão) 10 em associação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Os veículos referidos são inerentemente não-tóxicos e não-terapêuticos. Exemplos de semelhantes veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, e albumina sérica humana a 5%. Também podem ser usados veículos não-aquosos tais como óleos fixos e oleato de etila. Lipos15 somas podem ser usados como carregadores. O veículo pode conter quantidades menores de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotoni cidade e a estabilidade química, por exemplo, tampões e conservantes. Os anticorpos tipicamente são formulados em semelhantes veículos em concentrações de cerca de 1 mg/ml a 10 mg/ml.

Compostos terapêuticos que inibem sFlt-1

Dado que os níveis de sFlt-1 estão aumentados em pacientes tendo pré-eclâmpsia, eclâmpsia, ou tendo uma tendência a desenvolver tais condições, qualquer agente que reduz a expressão de uma molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo sFlt-1 é útil nos métodos da invenção. Os 25 agentes referidos incluem pequenas moléculas que podem romper a ligação de sFlt-1 a VEGF ou PIGF, oligômeros de nucleobase anti-sentido, e dsRNAs usados para mediar interferência de RNA.

Combinação de terapias

Opcionalmente, um terapêutico contra pré-eclâmpsia ou eclâmpsia pode ser administrado em combinação com qualquer outra terapia de rotina contra pré-eclâmpsia ou eclâmpsia; tais métodos são de conhecimento do profissional versado na técnica e são descritos neste relato84 φ 10 e

22 rio. Um terapêutico contra pré-eclâmpsia ou eclâmpsia da invenção pode ser administrado em combinação com qualquer composto que aumenta a atividade de um caminho de VEGF. Exemplos não-limitantes de agentes os quais também induzem produção endógena de VEGF incluem nicotina, Minoxidil, Nifidepina, Adenosina, Sulfato de Magnésio, e teofilina. Em uma modalidade, pode ser usada proteína PIGF em combinação com quaisquer dos agentes que induzem produção endógena de VEGF listados acima. Monitoração da paciente

O estado de doença ou tratamento de uma paciente tendo préeclâmpsia, eclâmpsia, ou uma tendência a desenvolver uma condição semelhante pode ser monitorado usando os métodos e composições da invenção. Em uma modalidade, é monitorada a expressão de um polipeptídeo sFlt-1, VEGF, ou PIGF presente em um fluido corporal, tal como urina, plasma, líquido amniótico, ou CSF. Tal monitoração pode ser útil, por exemplo, na avaliação da eficácia de uma droga em particular em uma paciente ou na avaliação da progressão da doença. Terapêuticos que reduzem a expressão de uma molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo sFlt-1 ou que aumentam a expressão de uma molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo VEGF ou PIGF são considerados particularmente úteis na invenção.

Outras Modalidades

A partir da descrição precedente, é evidente que podem ser feitas variações e modificações da invenção descrita neste relatório para adaptá-la a várias utilizações e condições. As modalidades referidas também estão dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

Todas as publicações mencionadas neste relatório descritivo são incorporadas a este relatório por meio de referência na mesma extensão como se cada publicação independente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por meio de referência. Além disso, os Pedidods Provisórios dos Estados Unidos N^os60/451796, depositado em 3 de março de 2003, 60/397.481, depositado em 19 de julho de 2002, e 60/467.390 depositado em 2 de maio de 2003, são por meio deste incorporados por meio de referência em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma medida do nível do polipeptídeo sFlt-1 em uma amostra de uma paciente, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma ferramenta para diagnosticar a referida paciente como tendo, ou tendo a propensão de desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, em que o nível de sFlt-1 maior do que 2 ng/ml é um indicador do diagnóstico de, ou uma propensão de desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

2. Uso de uma medida do nível do polipeptídeo PlGF livre em uma amostra de uma paciente, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma ferramenta para diagnosticar a referida paciente como tendo, ou tendo a propensão de desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, em que o nível de polipeptídeo PlGF livre menor do que 150 pg/ml em 13 - 16 semanas de gravidez é um indicador do diagnóstico de, ou uma propensão de desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

3. Uso de uma medida do nível do polipeptídeo PIGF livre em uma amostra de uma paciente, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma ferramenta para diagnosticar a referida paciente como tendo, ou tendo a propensão de desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia, em que o nível de polipeptídeo PlGF livre menor do que 400 pg/ml no meio de uma gestação é um indicador do diagnóstico de, ou uma propensão de desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclâmpsia.

4. Uso de uma medida do nível do polipeptídeo VEGF livre em uma amostra de uma paciente, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma ferramenta para diagnosticar a referida paciente como tendo, ou tendo a propensão de desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclampsia, em que o nível de polipeptídeo VEGF livre menor do que 5 pg/ml no soro é um indicador do diagnóstico de, ou uma propensão de desenvolver, pré-eclâmpsia ou eclampsia.

5. Uso de uma medida dos níveis de pelo menos dois dos peptídeos sFlt1, VEGF livre ou polipeptídio PIGF livre em uma amostra de um paciente usando um métrico, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma ferramenta para diagnosticar o referido paciente como tendo, ou

Petição 870180167861, de 27/12/2018, pág.

6/12 tendo propensão a desenvolver, pré-eclampsia ou eclampsia, em que o referido métrico é um índice anti-angiogênico de pré-eclâmpsia (PAAI):[sFlt1/livre VEGF + PIGF livre], e em que um valor de PAAI maior do que 20 é um indicador do diagnóstico de pré-eclâmpsia ou eclampsia.