JP2005164587A - 特異標的部位に結合するリガンドのスクリーニング - Google Patents

Abstract

【課題】種々の薬物標的結合部位における結合識別のための化合物のスクリーニング法を提供する。
【解決手段】様々な医薬標的結合部位での結合識別用化合物のスクリーニング方法を、結合反応のエンタルピーを測定するディバイスで使用する。該方法はテストリガンドと標的化合物とを併合すること、および少なくとも１種の遮断剤の存在下にテストリガンドと標的化合物とを併合することからなる。一次反応熱は併合したテストリガンドと標的化合物の溶液について検出し、二次反応熱は少なくとも１種の遮断剤の存在下に、併合したテストリガンドと標的化合物の溶液について検出する。この反応の２つの熱を比較し、反応が起こったかどうかを判定する。
【選択図】図３

Description

本開示は、概略、薬物標的などの標的と結合する化合物のスクリーニングに関する。さらに詳しくは、薬物標的などの標的上の異なる部位での結合の識別に関し、例えば、特異基質部位での阻害性結合と、ある種他の基質、補助因子、レギュレーター、または酵素標的上のシグナル伝達部位での阻害性結合との識別に関する。

近年、処理能力の高い手法に対する要求が高まっており、研究者および企業は、新規化合物、材料、化学の合成、発見、発展にコンビナトリアル法およびそのテクニックを用いている。例えば、薬剤の研究者は、コンビナトリアルライブラリを、医薬発見のための新規リード化合物のソースとして用いている。この分野の進歩を概説として、ドラッグ スクリーニング ハンドブック（Handbook of Drug Screening）を参照（R. Seethala and P.B. Fernandes, eds., Marcel Dekker Inc., 2001）。コンビナトリアル法は、他の産業においても利用されている。具体的に企業を例示すると、Symyx Technologies （登録商標）は、コンビナトリアルの手法をライフサイエンス、化学、および電子産業における材料の発見に利用している。

さらに、コンビナトリアルケミストリ法の使用および改良法の必要性を示すために、この分野における薬剤の研究を例として、以下、より詳細に説明する。薬剤の研究者は、コンビナトリアルライブラリを、薬剤発見用の新規リード化合物のソースとして用いている。コンビナトリアルライブラリは、化学的化合物の集合であり、それは化学的合成または生物学的合成により、たくさんの化学的な「構築ブロック（building blocks）」を反応物として組み合わせることにより、生成される。例えば、コンビナトリアルポリペプチドライブラリは、与えられた化合物の長さ（即ち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）に対して可能なすべてのアミノ酸のセットを組み合わせることにより、形成される。理論上、多数の化学的化合物が、そのような化学的構造ブロックのコンビナトリアル的な混合により合成される。

一旦、ライブラリが構築されると、それは、いくつかの生物学的または薬学的活性を有する医薬候補を設計するためのリードとして使用される化合物を同定するために、スクリーニングされなければならない。例えば、スクリーニングは、公知の生物学的反応に加わり、あるいは調節機能に必然的に含まれる特異的な生物学的化合物（しばしば、標的として言及される）を用いて行うことが出来る。ターゲットと反応するライブラリ化合物は、ターゲットの生物学的活性に作用する候補となり、治療薬の候補を開発するための有用なリードとなり得る。

コンビナトリアル法は、同時に多くの化合物と反応を調査できるので、同時に多くの小サンプルの反応と相互作用を測定でき、コンビナトリアル的な発見手法の必要性に適う装置が必要である。ユーザは、安価に測定でき、コンタミネーションおよびクロスコンタミネーションの問題を最小限にする装置を望んでいる。

ところで、反応および相互作用を測定する方法の一つとして、熱量測定法がある。熱量測定法は、反応物をラベル化（例えば、放射線ラベル、または蛍光ラベル）または表面に固定化することなく、熱力学的および速度論的な反応を測定することができる。他の殆どの現在の測定方法では、基質または補助因子の何れかに何らかの修飾すること（例えば、蛍光試薬ラベル、表面定着等）が必要である。〔ドラッグ スクリーニング ハンドブック（Handbook of Drug Screening, R. Seethala and P.B. Fernandes, eds., Marcel Dekker Inc., 2001）〕。

米国特許第６，３８０，６０５号明細書 米国特許第６，５４５，３３４号明細書

いくつかの事例においては、研究用サンプルは高価であり、標準的な微小熱量計で一回の測定に要求される試料は比較的多く、間に合わない場合がある。例えば、研究用として、生物学的相互作用を有する天然物抽出物または合成化合物が必要とされるが、ある場合には、熱量測定用の充分な濃度の試料を利用できる量は、わずか数ミリリットルである。標準的な微小熱量計で測定を行う場合、例えば、市販されているMicroCal（登録商標）Inc.（モデル VP ITC）、Calorimetry Sciences Corporation（登録商標）（モデル CSC 4500）は、１〜２ｍｌの試料が必要である。それは、おそらく、その大半またはすべての貴重な試料を、一度または少ないシリーズの測定のために使用しなければならない。より少ないサンプル量で熱量測定を可能とする手段があれば、このような制限の問題を克服するのに有用であろう。また、標準的な熱量測定は、一度の測定に何時間も要してしまう。

開示した実施形態は、上記の技術分野および本明細書に引用した技術に指摘されている問題の改善解決の例示である。これらの例示では、種々の薬物標的結合部位で結合を識別するための化合物のスクリーニング改良法が示されており、その方法は結合の反応エンタルピーを測定するディバイスと共に使用する。該方法は、テストリガンドと標的化合物とを併合すること、および遮断剤の存在下にテストリガンドと標的化合物とを併合することからなる。一次反応熱は併合したテストリガンドと標的化合物の溶液について検出し、二次反応熱は少なくとも１種の遮断剤の存在下に、併合したテストリガンドと標的化合物の溶液について検出する。この２つの反応熱を比較し、反応が起こったかどうかを判定する。

もう一つの実施形態においては、結合のための反応エンタルピーを測定するナノ熱量測定ディバイスを使用して種々の薬物標的結合部位で結合を識別するための化合物のスクリーニング法を開示している。ナノ熱量測定ディバイスは、熱単離領域、参照領域、および測定領域からなる。該方法は、ナノ熱量測定ディバイスの測定領域内の異なる位置で、標的化合物と１滴のテスト化合物を析出させることからなる。ナノ熱量計の参照領域内では、標的化合物とテスト化合物溶液を異なる位置で析出させる。測定領域内の物質は併合し、参照領域内の物質は遮断剤の存在下に併合する。それぞれの領域の反応熱を検出し、比較して反応が起こったかどうかを判定する。

本明細書にて使用する場合、“リガンド”という用語は、標的化合物に結合する作用物質をいう。本開示によると、リガンドは標的化合物の認識された機能領域、例えば、酵素の活性部位、抗体の抗原結合部位、レセプターのホルモン結合部位、補助因子結合部位などに結合する作用物質などであるが、これらに限定されるものではない。本開示を実施するに際し、リガンドは標的化合物の表面または立体配座領域に結合する作用物質でもあり得る。従って、本開示のリガンドは、上記の様式で標的に結合する能力の範囲を超えて、それ自体において、またはそれ自体について明白なまたは既知の生物学的機能をもたない作用物質をも包含する。リガンドという用語は結合反応する作用物質および結合以外反応しない作用物質を包含する。

本明細書にて使用する場合、“テストリガンド”という用語は、標的化合物に結合する能力についてテストを受ける化合物、分子または複合体を含む作用物質をいう。テストリガンドは、実質的にいかなる作用物質であってもよく、限定されるものではないが、金属、ペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、核酸、小型有機分子、合成有機化合物、およびその組合せからなる。１種を超えるテストリガンドを含み得る天然物抽出物などの物質の複雑な混合物もテストすることが可能であり、標的に結合する成分をその後の工程において混合物から精製することができる。

本明細書にて使用する場合、“酵素”という用語は、生物系の反応を触媒する作用物質をいう。殆どの既知酵素はタンパク質であるが、他の生物分子、例えば、触媒的に活性なＲＮＡは酵素として機能し得るし、この定義の範囲内に含まれる。酵素として分類される例は、キナーゼ、ホスファターゼ、タンパク質分解酵素、ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰアーゼ、ポリメラーゼ、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、およびさらに一般的なオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼなどである。一部の酵素は活性であるために１つを超えるタンパク質分子を必要とする（すなわち、多量体酵素）。このような場合、特に断りのない限り、全体としての複合体が酵素と呼称される。

本明細書にて使用する場合、“基質”という用語は、酵素反応においてある産物に変換される反応体をいう。“代替基質”とは基質の一つのタイプであり、それらが天然産基質の代わりにアッセイに使用し得るため、代替と命名される。

本明細書にて使用する場合、“補助因子”という用語は、酵素が触媒として活性であるために必要な作用物質をいい、例えば、補欠分子族および補酵素などであり、その工程では消費されることがない、すなわち、酵素反応終了時に未変化で見出されることを意味する。

本明細書にて使用する場合、“レギュレーター”という用語は、酵素の活性を変化させる分子をいう。この用語はインヒビター（競合および非競合）およびエフェクターを包含する。この用語はアロステリックに結合するレギュレーターも包含する。

本明細書にて使用する場合、“シグナル伝達パートナー”という用語は、シグナル伝達経路の一部としてタンパク質と結合する分子をいう。この意味において、シグナル伝達パートナーは、酵素が関与する反応または一連の反応を開始、促進、または減速させる酵素と結合するタンパク質または非タンパク質作用物質であり、シグナル伝達パートナーまた下流の反応、一連の反応、または経路を開始、促進、または減速させるために酵素が結合するタンパク質または非タンパク質作用物質も含む。

本明細書にて使用する場合、“スクリーニング”とは、分子または化合物のその標的に結合する能力につき多様性をテストすることをいう。

本明細書にて使用する場合、“生物学的標的”という用語は、ペプチド、タンパク質、核酸、タンパク質−核酸複合体、およびその他のレセプターなどを包含する。この用語は酵素と酵素ではないタンパク質の両方を包含する。この用語は単量体および多量体のタンパク質および酵素を包含する。多量体のタンパク質および酵素はホモマーまたはヘテロマーでもよい。この用語は少なくとも２個のヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドからなる核酸を包含する。核酸は一本鎖、二本鎖、または三本鎖であり得る。この用語は合成オリゴヌクレオチドである核酸、組換えＤＮＡ分子の一部分、または染色体ＤＮＡの一部分を包含する。生物学的標的という用語はまたペプチドの一部であって、限定されるものではないが、補助因子、補酵素、補欠分子族、脂質、オリゴ糖、またはリン酸基などの置換する二級、三級、または四級の折り畳み構造をも包含する。

本明細書にて使用する場合、“標的化合物”という用語は、生物学的標的ならびに１つ以上のさらなる化合物の結合の標的であるその他の化合物を包含する。本明細書にて使用する場合、“標的化合物”と“標的”という用語は同義語である。

本明細書にて使用する場合、“酵素特異的基質”という用語は、一群の酵素に共通の基質から特定の酵素を識別するために、その酵素に特異的である基質をいう。例えば、殆どのタンパク質キナーゼは１つの基質としてＡＴＰを使用するが、他の基質タンパク質は対象の特定のタンパク質キナーゼに特異的である。この場合、ＡＴＰは、どの一つのキナーゼにも、またはキナーゼの小フラクションにも特異的ではないため、酵素特異的基質ではない。しかし、タンパク質基質は酵素特異的基質である。酵素特異的基質は１つを超える酵素に対しての基質であり得る。本明細書にて使用する場合、特定の基質を分け合う１分類の酵素（例えば、キナーゼ）の数が全体としてこの分類の酵素の数よりも少ない限り、なお酵素特異的と考える。“キナーゼ特異的基質”という用語は、酵素がキナーゼである場合の酵素特異的基質をいう。酵素特異的基質の例は、ヘキソキナーゼに対するグルコース、ホスホフルクトキナーゼに対するフルクトース−６−リン酸、およびホスホグルコースイソメラーゼに対するグルコース−６−リン酸などである。

本明細書にて使用する場合、“熱変化”という用語は、熱形態のエネルギーの放出または熱形態のエネルギーの吸収を包含する。

本明細書にて使用する場合、“標的化合物の併合”という用語は、広い意味で、標的化合物を、結合のために、または反応のために選抜すべきテストリガンドと共に溶液中に加えることを意味する。やや広い意味で、併合するとは標的化合物と結合について選抜すべきテストリガンドとの溶液を回転させること、撹拌すること、振盪すること、または振動することを意味する。より具体的には、併合するとは標的化合物と結合について選抜すべきテストリガンドとを混合することをいう。混合は、例えば、ピペットの先端での吸込みと放出を繰り返すことにより、またはロボット手段による沈着により実施することができる。他の手段を用いてサンプルを混ぜ合わせることも可能であり、本明細書に、また請求項に十分に検討されている。例えば、液体を支持体に沿っての滴状並進により熱センサー近傍で一緒にするか、または例えば、ＭＥＭＳ、“ソフトリトグラフ法”、または他のバイオチップ組立て法を用いてディバイスに組込んだ流動体チャンネルなどの１個または複数のチャンネルを通して、液滴状、連続液状、または液体パケットの並進により、混ぜ合わせる。好ましくは、併合するとは、標的化合物と、結合についてテストすべきテストリガンド間の結合を平衡状態とすることをいう。

本開示はナノ熱量計を包含し、また結合事象、反応、相変化、分子立体配座の変化などから生じるエンタルピー変化など、エンタルピー変化を測定し得るナノ熱量計アレイを包含する。本明細書の目的として、ナノ熱量計とはナノカロリー以上の範囲の反応熱を、例えば、検出限界約０.０１ナノカロリーないし１００００ナノカロリーで測定し得るディバイスをいう。さらに、本開示はコンビナトリアル法および高処理能力スクリーニング法を包含するが、これらの方法では、新規化合物、物質、化学薬品、および化学方法の研究、発見、および開発、ならびに化合物または物質の高処理能力モニターリング、または化合物または物質の合成または修飾に使用する工程の高処理能力モニターリングに際してナノ熱量計を使用する。本開示はまた上記方法によって同定される化合物または物質、およびその治療上の使用（診断、予防または処置目的用）、精製分離法での使用、およびそれらの新規な物理的または化学的に関連する使用に関する。

一例として、本開示は標的化合物に結合するリガンドを同定する高処理能力スクリーニング法を包含する。テストリガンドが結合する標的化合物が疾患または症状と関連するかまたは原因となる場合、該リガンドは該疾患または症状の診断、予防または処置に有用であり得る。本方法により同定したリガンドは精製または分離方法、例えば、混合物から標的化合物を精製または分離する方法などに使用するリガンドであり得る。本開示はまた本方法により同定されるリガンド、およびそれらの治療上の使用（診断、予防または処置目的用）、精製分離法での使用にも関わる。一例として、本開示は酵素であるタンパク質、ならびにリボザイムなどの非タンパク質酵素に関する。

本開示の実施に際して、テストリガンドは標的化合物と組合せ、その混合物は、テストリガンドが標的化合物に結合するのを試験するために十分な時間、適切な条件下に維持する。異なるテスト部位では、標的上の特異部位に対する結合と競合する過剰量の作用物質の存在下、またはさもなくば標的上の特異部位に対する結合を遅延させるか遮断する作用物質の存在下に、同じテストリガンドと同じ標的化合物を組合わせる。かかる作用物質は遮断剤と呼ぶ。遮断基質など、過剰量の遮断剤の不存在下での結合と存在下での結合との差が、該作用物質と競合するテストリガンドが結合するかどうかのシグナルである。詳しくは、テストリガンドが遮断剤と同じ部位で結合する場合には、過剰の遮断剤の存在しない場合よりも、存在する場合の方がテストリガンドが結合し難くなり、差異を示すシグナルを生じる。

逆に、テストリガンドが遮断剤の影響を受けない別の部位で結合する場合には、遮断剤の存在または不存在が影響せず、それによる差異を示すシグナルは生じない。実験条件は各システムについて実験的に決定する。複数のテストリガンドをテストする場合、インキュベーション条件は、通常、殆どのリガンド：標的化合物相互作用が期待通りに進行し、完結するように選択する。高処理能力スクリーニングを適用する場合、テストリガンドは、通常、標的化合物に対してモル過剰に存在する。標的化合物は可溶形態にあるか、細胞膜、膜フラグメント、合成膜、小胞、細胞器官もしくはそのフラグメント、合成細胞器官もしくはそのフラグメント、ミセルまたは等価の不均質環境にあるか、または別途、固相に結合し得る。固相のマトリックスは、制限はないが、ビーズ、膜フィルター、プラスチック面、または他の適切な固体支持体からなる。

一部の事例では、例えば、全体の中の１成分を取り出すのが難しいため、上に検討した両方のテスト部位に遮断剤が存在し得ることを認識し得る。示差シグナルは、遮断剤が上記の一次テスト部位に存在する場合、例えば、二次テスト部位におけるよりも有意に濃度が低いか、または性質か異なるために、該遮断剤が当該一次テスト部位に余り影響しない限り、なお可能である。このような場合は、本明細書と請求項の範囲内に完全に包含される。

本方法が多くのタンパク質と殆どの酵素に共通の物理化学的性質に基づくものであるという事実は、応用範囲が広いことを意味する。本開示は大規模の系統的高処理能力手法に適用可能であり、数千ないし数百万ものテストリガンドと標的化合物の経済的なスクリーニングを可能とする。標的−リガンド対が本開示方法により同定された場合、このものはさらに使用した特定の標的に特異的な既知方法により、より詳細に分析することができる。

本明細書ではその考察のために、具体的なナノ熱量計を用いて、アッセイサンプル調製法および分析法の操作を説明する。しかし、当業者は本方法が他のナノ熱量計構成ならびにミクロ熱量計構成によっても有利に実施し得ることを容易に認識するであろう。これらはすべて本明細書と特許請求項の範囲に完全に包含される。

ここで図１を参照すると、本明細書記載の方法に従って利用し得るナノ熱量計アレイの一実施形態の一部である検出計１００の一態様の方式図を示してある。この例示の態様では、液滴併合前後で当該ディバイスにより、タンパク質、水およびリガンド液滴の受身熱平衡化が可能であり、その結果としての温度変化を温度感知素子により検出することができる。測定領域は、アルミニウムまたは銅などの熱伝導層の組立ての際に、相当に小さく、また十分な熱伝導を保持し得るので、受身の平衡化時間を短縮し得る。このサンプル態様のナノ熱量計については、米国特許出願１０／１１４，６１１、「化学反応検出用ナノ熱量計の装置および方法」に詳細に記載されている（本出願を参照により本明細書の一部とする）。

この実施形態のナノ熱量計のいくつかの特徴について、本明細書に記載の方法の理解を容易にするために簡単に記載する。しかし、これは本方法を実施する際に使用する適切なナノ熱量計の一実施形態に過ぎないが、種々の形状のナノ熱量計による様々な態様にも有利に応用し得ることは理解されよう。これらはすべて本明細書と請求項の範囲に完全に包含される。ナノ熱量計１００は、測定領域１６０と参照領域１７０を含む熱隔離層１１０を含む。領域１６０および１７０は別個の隔離領域に入っている。熱隔離領域１１０は、気相を取囲む領域１６０と１７０と共に、周囲の熱環境から隔離し、結果として測定時間を延ばし、熱ノイズを減少させる。層１１０は、この例示態様では、ナノ熱量計１００の反応と温度感知構成要素を熱的に隔離するために使用するが、本方法の別の態様においてはこれら構成要素を熱的に隔離する如何なる手段も使用することができる。熱隔離が絶対に必要ということではないことは理解すべきである。むしろ、熱隔離は熱損失を減速させるものであり、例え、完全にかかる損失を止められないにしても、その目的には役立つ。

すでに示唆したように、熱平衡化領域は、反応により引き起こされる温度差が比較的長い時間を要して放散されるように、その周囲から熱的に隔離されている。この放散時間が長いほど、シグナルは測定に際してより長時間積算し得ることとなり、シグナル／ノイズ比が改善される。

測定領域１６０と参照領域１７０は、それぞれ熱平衡化領域１２０と１２５を含み、検出器の機械的支持体から熱的に隔離されている。この例示態様において、熱平衡化領域１２０は反応温度を測定する２つの抵抗温度計を備えているが、熱平衡化領域１２５は参照温度の変動を測定する２つの温度計１４０を第二セットとして備えている。抵抗温度計は標準的製法、例えば、限定されるものではないが、薄膜のリトグラフパターン化、超小型電子製法（例えば、スパッターリング、化学的エッチング、蒸着など）、および印刷回路盤製法などにより熱平衡化領域１２０に配置する。熱平衡化領域１２０および１２５は共に、例えば、直接プリンティング法または他の液滴析出法により析出した個別の液滴状タンパク質とリガンドを受け入れ、保持するために十分な大きさであり、また例示の液滴併合ディバイス１３０により生起させた併合後のこれら２滴の組合せを保持するために十分な大きさである。例えば、４００ｎＬの最終液滴サイズでは、測定領域と参照領域を有する検出器は３.７ｍｍ×４.６ｍｍである。各熱平衡化領域１２０おより１２５は、その領域が周辺への熱放散に相対的に急速に平衡化するために、十分な熱伝導性をもつ。

各熱平衡化領域１２０および１２５は、温度計１４０と液滴併合電極１３０とを収容する。ここでの目的上、温度計１４０は各熱平衡化領域１２０および１２５上のより中央に位置する電極１３０からスペースを置いて示してあるが、この形状は例示手段のためのみのものである。ただし、液滴併合ディバイス１３０と温度計１４０は高電導性フィルムと良好な熱的接触状態にあり、温度計１４０と液滴併合電極１３０の正確な位置づけは、熱を考慮する上で重要ではない。

操作にあたって、熱平衡化領域１２０に配置する２個の抵抗温度計１４０は、熱平衡化領域１２０内に析出した低濃度の任意のタンパク質およびリガンド間の反応熱を検出する。この例では、反応熱はブリッジ回路での電圧変化の測定を介して検出されるが、この変化はブリッジ回路に組込まれている温度計の抵抗変化によるものである。熱平衡化領域１２０の抵抗温度計１４０は、サンプルリガンドとタンパク質間の反応を検出する。他方、熱平衡化領域１２５の抵抗温度計１４５は参照としての役割をもつ。結果として、ブリッジ回路からのシグナルは、熱平衡化領域１２０と熱平衡化領域１２５で発生した熱の差を検出する。本開示では、標的化合物の特定部位での結合を遮断または遅延する作用物質の不存在および存在下における結合を測定比較することにより、標的化合物上の異なる部位での結合を識別する方法を記載しているように、ここに記載のようなブリッジ回路は、所望の識別可能な結合シグナルの直接的検出を可能とする故、有用である。

一実施形態として、本明細書に記載の方法では、標的−リガンド対の同定においてナノ熱量測定法を利用する。ナノ熱量測定法は、米国特許出願１０／１１４，６１１（「化学反応検出用ナノ熱量計の装置および方法」）に記載されているように、この目的には、リガンドと標的の結合に基づき直接反応熱を検出する故、有用である。蛍光、化学発光、もしくは放射標識タグなど、タグ標識の付着、またはリガンドまたは標的の他の特別のフォーマット化または固定化は必要でない。

ここで図２に移ると、ここには例示テストディバイスの単一ナノ熱量計セル２００内での液滴析出の一態様が示されているが、これはより大型のテストアレイ形状の一部分である。この態様において、参照領域２３０と測定領域２４０は、共に熱隔離領域２１０内にある。ナノ熱量計セルはそれぞれの領域の液滴の併合に基づき、測定側と参照側の間の熱の差を直接測定する。この態様においては、対象の標的化合物を含む液滴２６０（例えば、酵素標的）とテストリガンドを含む別の液滴２２０をナノ熱量計セルの測定領域上に置く。参照側には対象の標的化合物と標的上の特定部位に対する結合を遅延または遮断する作用物質を含む液滴２５０を置く。さらに、参照側には、液滴２２０と同じテストリガンドを含む液滴２２５を同じまたは略同じ濃度で、また標的上の特定部位に対する結合を遅延または遮断する液滴２２０におけると同じ作用物質を同じまたは略同じ濃度で載置する。液滴２２５に遮断剤を含める目的は、混合の熱またはテストリガンドと遮断剤の相互作用から生じるエンタルピーの変化を最少とするためである。これらの影響が小さい場合、またはさもなければ、測定またはその後のデータ解析を考慮して、遮断剤が液滴２２５に存在する必要はない。例示として、標的は酵素であり得、標的上の特定部位に対する結合を遅延または遮断する作用物質は、大過剰の基質、補助因子、インヒビター、または対象の特定部位に結合するレギュレーターであり得る。液滴サイズは約１００ｐＬないし約１００μＬの範囲である。この態様のナノ熱量計を使用するためには、液滴サイズは約１００ｐＬないし約１μＬの範囲である。

実施例１（下記参照）に示した基質濃度は基質を大過剰とした一例であり、この場合の遮断基質Ｓは１ｍＭの濃度で存在するが、この値は対象の基質が対象の酵素に結合するための解離結合定数Ｋｓ＝２μＭと比較して大きい。実施例１の等式（１）が暗示するように、Ｋｓよりもかなり大きく、また酵素濃度Ｅよりもかなり大きい濃度の遮断基質を供給すると、テストリガンドと遮断基質との置換わりが困難となり、結果として所望の効果が得られる。

ナノ熱量計セルに載置した後、測定側と参照側の間に有意な示差熱を生じない何らかの既知手段により、液滴を併合し得る；例えば、代理人整理番号Ｎｏ．Ｄ／Ａ１５７８Ｑ、米国出願番号１０／１１５，３３６（流体移動させる静電力を使用する装置と方法）に記載された手段などである。測定は測定側の反応熱を検出し、それを参照領域の液滴を組合せて測定した測定値と比較することにより行う。図１の態様の場合、ブリッジ測定が測定領域と参照領域で発生する熱の差を直接感知するので、２つの値の厳格な比較は必要ない。

サンプルを混ぜ合わせるためには、他の手段も使用可能であり、本明細書および請求項に十分に考慮されている。例えば、液体は電気力、液滴析出、支持体に沿う液滴並進を適用することにより、または、例えば、ＭＥＭＳ、“ソフトリトグラフ法”、または他のバイオチップ組立て法を用いてディバイスに組込んだ流動体チャンネルなどの１個または複数のチャンネルを通しての液滴状、連続液状、または液体パケットの並進などのいずれかを適用することにより、熱センサー近傍で混ぜ合わせる。また、具体的に、液滴は、示差熱が放散するのに十分長い時間シグナルが検出される限り、測定側と参照側の間に有意な示差熱を導入する方法で導入してもよい。かかる場合は、例えば、混合熱のパルスが検出器から放散する時間よりも長い時間、酵素反応が進行することにより熱が発生する場合に起こり得る。

この例示態様において、テストリガンドなどのテスト化合物が標的化部位以外の部位に結合する場合、そこでは通常、殆どまたは全くシグナルが生じないが、その理由は結合が相当の範囲まで測定側と参照側両方に起こるからである。しかし、テスト化合物が標的部位に結合する場合、テスト化合物の結合に対するＫ_Ｌ値（解離定数）が小さすぎない限り（すなわち、非常に強い）、通常、標的化合物に対する結合に予測されるシグナルに匹敵するシグナルが生じる。標的化部位に対し識別し得た結合の事例では、標的化部位が参照領域で遮断されるのに対し、リガンド結合は測定側で妨害されずに進行する。このアッセイ法を用い、標的化部位への結合について、大型化合物ライブラリーをスクリーニングすることが可能であり、他の部位に結合するリガンドからの不所望なヒットを得る問題を除くことができる。このタイプの測定では、上記に検討した抗体に基づくエンドポイントアッセイなどの今日利用し得る技法を用いることができない。

この例示態様の方法は、特異的結合部位を遮断する作用物質によって、または作用物質なしに調べることにより、標的化合物上の特異部位に対する結合をスクリーニングする方法であり、これを図３に要約する。標的化合物の溶液、これは具体的には酵素標的化合物の溶液であるが、これをナノ熱量計の測定領域において、３１０で析出させる。３２０にて、標的化合物プラス対象の結合部位を遮断する作用物質の溶液（具体的には、例えば、酵素標的と大過剰の酵素特異基質であり得る）は、ナノ熱量計の参照領域に析出する。テスト化合物は潜在的なリガンドを含み得るものであり、ナノ熱量計の参照領域と測定領域に３３０で析出する。具体的に、参照領域上の液滴は、混合熱を最小とするために３２０で使用する場合、同じ濃度の遮断剤、例えば、過剰の酵素特異的基質を含む。酵素析出３１０、標的化合物析出３２０、および潜在的リガンド析出３３０についての析出パターンは、如何なる順序でも起こり得るし、また同時にも起こり得る。

参照領域および測定領域内の物質はそれぞれ３４０で併合する。液滴は測定側と参照側の間に有意な示差熱を持ち込まない既知手段により併合し得るが、かかる手段については、例えば、代理人整理番号Ｎｏ．Ｄ／Ａ１５７８Ｑ、米国出願番号１０／１１５，３３６（流体移動させる静電力を使用する装置と方法）に記載されている。ナノ熱量計は３５０の測定領域での反応熱を検出測定し、また３６０の参照領域での反応熱を検出測定する。反応熱の検出測定は既知方法で実施し得るが、それに関しては上記図１にて考察した通りであり、同時にまたは連続的に起こり得る。測定した反応熱は、次いで、３７０で比較する。さらに、ナノ熱量計ディバイスは直接に反応熱の比較結果を提供し、別個に反応熱を測定する必要はない。図１に描出したナノ熱量計の態様の場合、ブリッジ構造により直接“比較”する；すなわち、熱センサーのブリッジ構造が直接に示差熱を検出する。この態様はノイズを最少とすることが可能であり、従って、より高い感度を与え得る。他の態様において、反応熱は個別に測定し、ある手段で記録または一時的に保存し、測定後に比較する。

サンプルを混ぜ合わせるためには他の手段も使用可能であり、本明細書および請求項においてもすべて意図するものである。例えば、液体は液滴析出、支持体に沿う液滴並進、または、例えば、ＭＥＭＳ、“ソフトリトグラフ法”、または他のバイオチップ組立て法を用いてディバイスに組込んだ流動体チャンネルなどの１個または複数のチャンネルを通しての液滴状、連続液状、または液体パケットの並進などのいずれかを適用することにより、熱センサー近傍で混ぜ合わせることができる。また、具体的に、液滴は、示差熱が混合物から放散するのに十分長い時間シグナルが検出される限り、測定側と参照側の間に有意な示差熱を導入する方法で導入することができる。かかる場合は、例えば、混合熱のパルスが検出器から放散する時間よりも長い時間進行する酵素反応により熱が発生する場合に起こり得る。

遮断剤として同じ部位に結合するテスト分子がなくても示差シグナルの発生し得る場合があるが、かかる場合は、参照領域での結合部位遮断が標的化合物をアロステリックに変化させ、その変化が標的部位以外の部位で、テストリガンドの結合エンタルピーを有意に変えるのに十分である場合である。かかる場合は、遮断された標的化合物と、対する未遮断標的化合物に結合するための結合熱が異なるため、スクリーニング作業においてはヒットと考えるべき十分に大きな規模の示差シグナルを生じ得る。多くの場合、結合エンタルピーのかかる差異は小さくすべきで、高処理能力スクリーニング法においては、通常、この影響を生じる事例数をヒット数よりも小さくすべきである。具体的に、かかるアロステリックな影響を配慮し、かかるアロステリックな結合剤を選定する必要のある場合は、アロステリック結合を追跡試験することにより、またはアロステリック結合部位に対する遮断剤を示差測定の測定側に加えることにより、処理することができる。薬物スクリーニングに重要となり得るアロステリックな影響の一例として、一部の例で、ＡＴＰの結合がキナーゼの活性部位に立体配座の変化を引き起こし、実質的に基質結合と変換のために活性化する。基質結合部位の活性化状態は、非活性化状態とは異なる状態で基質に結合し得るが、また、活性化状態に特異的に結合するテストリガンドを見出すことが望ましい。

上記の方法は過剰なＡＴＰを測定側に加えることからなるが、この事例を予測している。測定側に加えたＡＴＰにより、キナーゼは測定側で活性化状態となり、それによって活性化側に結合するリガンドのスクリーニングが可能となるが、同時にＡＴＰに結合する化合物による擬陽性を除き得る。陽性シグナルを示すテストリガンドについての追跡測定は、テストリガンドが酵素触媒反応（例えば、リン酸化）を受けるか、または単に結合するだけであるかを判定するために実施する。前者の型のヒットは代替基質として有用であり、後者の型のヒットは医薬開発のヒットおよびリードとして有用である。具体的に、前者の型のヒットを避けたい場合、非水解性のＡＴＰ類似体をＡＴＰの代わりに加えてＡＴＰを加水分解することなく酵素を活性化することが可能であり、それによって基質代謝回転を回避する。非水解性ＡＴＰ類似体の例は、アデニリルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、およびアデノシン５′−［γ−チオ］三リン酸（ＡＴＰ−γ−Ｓ）である。

一態様においては、参照領域のキナーゼが、例えば、測定領域と参照領域の酵素間の立体配座の差を最少とするために、ＡＴＰにより“活性化”されていることが望ましい。かかる差異を最少とすることにより、活性化した酵素と、対する非活性化酵素に違う様式で結合するが、標的部位には結合しないアロステリック結合剤によって、ヒット数を減少させることができる。医薬の発見に経験のある者なら分かるように、一部の事例では、アロステリック結合剤からのヒットを最少とすることが有用であり、一方、他の事例では、かかるアロステリック結合からのヒットを同定し、さらに潜在的な医薬リード化合物と考えることが有用である。この選択は特定薬物の発見にどのくらい活発かに左右される。前者の場合、参照領域のキナーゼの活性化は、参照領域に遮断剤として存在する基質または代替基質が存在する場合に複雑となることがある。かかる場合、代謝回転が熱を発生させ、事実上遮断剤を排除してしまうので、基質または代替基質の代謝回転を防止することが望ましい。具体的には、ＡＴＰの非水解性類似体を参照部位に加え、ＡＴＰを加水分解させることなく酵素を活性化させることが可能であり、それによって基質の代謝回転を回避する。非水解性ＡＴＰ類似体の例は、アデニリルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、およびアデノシン５′−［γ−チオ］三リン酸（ＡＴＰ−γ−Ｓ）である。

さらにもう一つの例として、ＡＴＰ結合部位とは異なる酵素特異的基質部位に結合する化合物を見出すためのスクリーニング法の一つとしてキナーゼの場合を考察しよう。キナーゼによりリン酸化される酵素特異的基質を参照側の遮断剤として用い、上記の方法が提供されるが、さらに、測定側の液滴に過剰のＡＴＰを加えることができる。過剰のＡＴＰがない場合、テスト化合物は、遮断剤が原因のアロステリック作用のため、参照側よりも高いエンタルピーをもつ測定側でＡＴＰ結合部位に結合することとなり、それを間違ってさらに検討すべき候補と見えてしまう。しかし、過剰のＡＴＰは測定側でＡＴＰ部位に結合するのを遮断し、結果としてテスト化合物は参照側でのみ結合熱を発生することとなる。これはマイナスの示差シグナルを生じるので、この化合物は医薬ヒットまたはリードとしてはさらなる考察から除くことができる。薬物スクリーニングにおいて、結合の発熱エンタルピーをもつ結合剤は一般に結合の吸熱エンタルピーをもつ結合剤よりもより好適なヒットまたはリード化合物であると考えられる。もしテスト化合物が測定側でＡＴＰ遮断剤と置換わる程に強くＡＴＰ部位に結合するなら、結合は参照側でも同じ程度に生じるので、そこにはプラスの示差熱が存在しないであろう。具体的に、ＡＴＰの非水解性類似体は、参照側でのＡＴＰ結合部位に対する結合を排除するために、参照側に加えてもよい。非水解性ＡＴＰ類似体の例は、アデニリルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、およびアデノシン５′−［γ−チオ］三リン酸（ＡＴＰ−γ−Ｓ）である。

図４に描出したこのテストの態様において、遮断剤として過剰のＡＴＰも含み得る標的キナーゼの液滴４６０、および同じまたは略同じ濃度のＡＴＰを含むテストリガンド液滴４２０はナノ熱量計セルの測定側４４０に析出させる。さらに、遮断剤としての酵素特異的基質および液滴４６０と同じ標的キナーゼ含むが、ＡＴＰは含まない参照液滴４５０、および液滴４５０と同じまたは略同じ濃度の遮断剤を含むリガンド液滴４２５は、ナノ熱量計セルの参照側４３０に析出させる。具体的に、ＡＴＰの非水解性類似体は液滴４５０および４２５に加え得る。具体的に、ＡＴＰの非水解性類似体は液滴４６０および４２０にてＡＴＰの代わりに使用し得る。参照領域４３０および測定領域４４０は共に熱隔離領域４１０内に存在する。ナノ熱量計セルでは標的化合物液滴およびテスト化合物液滴をそれぞれ併合して、測定側と参照側間の熱の差を直接測定する。該液滴は測定側と参照側の間に有意な示差熱を生じない何らかの既知手段により、併合し得る；例えば、代理人ファイルＮｏ．Ｄ／Ａ１５７８Ｑ、米国出願番号１０／１１５，３３６（流体移動させる静電力を使用する装置と方法）に記載された手段などである。測定は測定側に発生する熱を検出し、それを参照領域の液滴を組合わせて測定した測定値と比較することにより実施する。測定側が参照側よりもより結合熱を発生する場合には、テスト化合物はこの態様にて望ましい、ＡＴＰ結合部位以外の部位で結合する候補リガンドとなる。

この態様のための方法、すなわち、キナーゼのＡＴＰ部位には結合しないがキナーゼ特異基質部位には結合するか、または該基質により有意に遮断される結合をもつ化合物の同定方法を、図５に要約する。標的化合物に対するリガンドして可能性のあるテスト化合物を含む液滴は、５１０にてナノ熱量計の参照領域と測定領域のそれぞれに析出させる。具体的には、参照側でテスト化合物を含む液滴もまた参照側に用いた遮断剤、例えば、過剰濃度のキナーゼ特異的基質を含む。具体的に、測定側の液滴はＡＴＰ遮断剤を含むが、その濃度はＡＴＰ濃度の差による混合熱を最小化または除去する濃度とするのがよい。バッファー条件、例えば、ｐＨは、ＡＴＰ塩の存在下に混合熱を最小化するために厳密に調和するようにする。標的化合物と遮断剤の溶液は、具体的に、過剰の酵素特異基質の酵素の液滴であり、５２０のナノ熱量計参照領域内に析出する。具体的に、該液滴は、混合の示差熱を最小とするために、５１０で相当するテスト化合物の液滴に使用したキナーゼ特異基質など、同じ濃度または略同じ濃度の遮断剤を含む。

５３０では、過剰のＡＴＰを含む標的化合物の液滴が、ナノ熱量計の測定領域に析出する。具体的には、該液滴は混合の示差熱を最小とするために、５１０で相当するテスト化合物の液滴に使用した同じ濃度または略同じ濃度のＡＴＰを含む。再び、混合の示差熱を最小とするために、ＡＴＰ濃度を調和させることに加えて、ｐＨなどのバッファー条件を調和させることが重要である。参照領域と測定領域内のそれぞれの物質は５４０にて併合する。該液滴は測定側と参照側の間に有意な示差熱を生じない何らかの既知手段により併合し得る；例えば、代理人整理番号Ｎｏ．Ｄ／Ａ１５７８Ｑ、米国出願番号１０／１１５，３３６（流体移動させる静電力を使用する装置と方法）に記載された手段などである。ナノ熱量計は５５０の測定領域で発生した熱を検出測定し、また５６０の参照領域で発生した熱を検出測定する。反応熱の検出と測定は、上記の図１にて検討した方法も含め、いずれかの既知方法で実施可能であり、同時または連続的に起こり得る。測定した反応熱は次いで５７０で比較する。酵素析出５１０、標的化合物析出５２０、および潜在的リガンド析出５３０の析出パターンは、次々とまたは同時に起こり得る。

具体的に、テスト化合物の当初選抜後の確認選抜を用いて、当初ヒットの性質を試験することができる。例えば、医薬スクリーニングにおける酵素標的の場合、テスト化合物がインヒビター、レギュレーターなどとして作用するのか、あるいは恐らく酵素標的による触媒反応を受けるのかを知ることは興味深い。当初選抜において結合を示した基質、何らかの必要な補助因子、およびテスト化合物による当初選抜後の確認測定では、テスト化合物の存在による酵素反応の増大または低下に関するデータが提供される。テスト化合物が遮断剤の存在下に参照領域において吸熱的に結合するが、測定領域では結合しないという可能性もあり、この場合に示差シグナルを生じる。確認選抜は擬陽性を確認するためにも使用し得る。

一つの部位、例えば、基質部位にて、遮断剤、例えば、過剰な基質の存在により結合を遮断することは、基質Ｋ_Ｓよりも遥かに低い解離定数Ｋ_Ｌでリガンドが結合する場合、あまり効果がなく、結果として上記の下限に至る。一例として、下記実施例１に関して検討し、遮断剤として使用したＫ_Ｓ＝２μＭの基質について、下記実施例１に掲載した濃度と条件を考察しよう。この事例の場合、リガンド解離定数の下限（それ以下では選抜が偽陰性となる）に対する実際的な値は、例示に使用したナノ熱量計による検出の下限を１０μ℃と仮定して、約Ｋ_Ｌ＝１ｎＭである。Ｋ_Ｌ＜１ｎＭでの偽陰性は、薬物標的の当初の高処理能力スクリーニングにおいてかかる強力な結合剤を見つけることは希であるので、多くの場合、心配すべきではない。以下に検討するように、対照の結合部位を遮断する確りと結合する基質を同定するために、予備的選抜を行うことによりさらに下限を低下させることができる。

対峙する例として、実施例２について考察する。この例では、基質Ｋ_Ｓが１００μＭに等しい。基質結合が弱いため、遮断剤としては役立たない。実施例２で考察するように、この例示遮断剤は約２５ｎＭ以下のＫ_Ｌで無効となり、実施例１に比較して偽陰性の可能性が増大する。この例では、Ｋ_Ｌのより低い値でより大きなシグナルを得るのが望ましい。かかる事例では、例えば、１００μＭでよりもＫ_Ｓ≦２μＭで結合する代替基質または単純な結合剤を見出すために予備選抜を実施するのがよく、それによって実施例１に記載するように、検出可能なＫ_Ｌ値の下限を約１ｎＭ以下まで低下させる。

具体的には、代替基質を用いて対象の酵素標的上の相当する基質結合部位に対する結合を遮断することができる。代替の基質は酵素標的による医薬発見において重要な役割を演じる。今日使用されているエンドポイントアッセイでは、触媒作用に対する基質と反応の完結を認識する方法が必要である。一般に、天然の基質は全活性を維持したまま単離するのが難しく、また多くの場合限られた量しか入手できないので、代替基質（アミノ酸の長さが２０〜６０個の短鎖ペプチド）がアッセイの基質として使用される。さらに、天然の基質は比較的大きな分子である傾向があるが、広く使用されている読取りフォーマットの多く、すなわち、ＦＰおよびＦＣＳなどは次段階の生成物サイズによる識別化に依存するため、小分子間の反応を必要とする。本発明が目的とする場合、天然の基質は、多くの場合、良好な遮断剤であるために必要なＫ_Ｓ値に比べて、比較的大きなＫ_Ｓ値を有する。より強い結合剤、すなわち、より低いＫ_Ｓ値をもつ代替基質を使用することが有用である。

代替基質は酵素とその天然の基質を理解した上で、化学的に設計することができる。これら分子にとってタンパク質配列は、多くの場合、出発点であり、代替物は反復修飾により構築する。多くの場合、特定分類の酵素の全体の配列はその分類における新規の酵素の出発点である。そのゴールは酵素の存在下に代替物を迅速に反応させることである。要すれば、ナノ熱量計アレイまたは他の高処理能力技法を用いて、新規の代替基質を設計する過程で、化合物を選抜することができる。

具体的には、テスト代替基質のライブラリー中の化合物は、酵素および何らかの必要な補助基質または補助因子と組合せ、発生する熱を測定する。この熱は、ナノ熱量計での測定など、測定側と参照側両方で対照に比較して測定するか、または酵素とテスト代替基質が十分に高い場合には、直接に熱を測定することができる。テスト代替基質が対象の酵素の実際の基質であることが分かった場合、そのテスト基質による実験では熱を発生させるであろうし、酵素アッセイにおける代替基質として使用する候補として、または適切な代替基質へ導くさらなる修飾用の候補として、該テスト基質を同定する。具体的には、テスト基質は、すでに検討したように、類似の酵素に対する基質についての知識に基づき、選択または設計することができる。代替基質を選抜し、開発するためのナノ熱量測定法を用いることで、エンドポイントアッセイの必要性と、反応した基質を認識する対応する方法の必要性がなくなる。また、代替基質を選抜し、開発するためのナノ熱量測定法を用いて一般的な方法を開発し得るが、ナノ熱量測定法により発生した熱を測定し得る限り、抗体の認識および結合、蛍光または分光法による測定、またはテスト化合物の内のある分類に特異的であり得る他の検出方法を必要としない。

酵素標的が関わる態様においては、テストリガンドが当初選抜の参照領域において補助因子または補助基質部位に結合するという可能性、また事実上遮断剤として使用される基質または代替基質との反応を受けるという可能性がある。測定側よりも参照側により熱の発生があるので、かかる事例も同定可能であり、この発生がある場合には、テストリガンドは対象とならない。（このシグナルの符号の変化は、テストリガンドが基質側に吸熱的に結合する場合に起きるが、吸熱的に結合するテストリガンドは一般に医薬開発のリード化合物の対象たり得ない。）

一部の事例および実施形態においては、基質部位よりもむしろ特異的補助因子またはレギュレーター部位に結合するインヒビターを見出すことが望ましい。例えば、多くの酵素がその反応の産物またはその反応のさらに下流の産物により阻害される。その一例として、キナーゼはそのキナーゼのリン酸化基質により阻害される。（周知の例はヘキソキナーゼであり、このものはその産物であるグルコース−６−リン酸により弱いながら阻害される）。かかる調節部位での結合はＡＴＰのような補助因子の結合よりも、その酵素にはるかに特異的であるはずであり、その結果、ある場合には、その部位が薬物の標的化にとって魅力的な部位となり得る。具体的には、上記の方法は、例えば、調節結合部位を遮断する参照側に、過剰の基質の代わりに天然のインヒビター／産物を導入することにより、調節部位を標的として使用することができる。同様の技法を用いてエフェクター部位を標的とすることが可能であり、これはエフェクターが酵素特異的である場合に望ましい。

さらにもう一つの実施形態においては、一部すでに標的化した部位以外の標的上の部位に結合するヒットを見出すために、テスト化合物のライブラリーを選抜することが望ましく、強力に結合するリガンドは当該すでに標的とした部位に対して同定されている。一例は、ＡＴＰ結合部位に結合するが、特異的にではない既知の強力に結合するリガンドをもつＡＴＰキナーゼの場合である。かかるリガンドはキナーゼでの初期スクリーニング作業において発見し得たものであるが、例えば、結合の特異性を欠いていたため医薬のリード化合物として殆ど価値がないと見なされ見出されたものである。今や、研究者はテストリガンドのライブラリーに対して医薬標的を再選抜したいとしており、一方でＡＴＰ結合部位以外の部位でのみ結合するヒットを見出そうと望んでもいる。この態様において、ＡＴＰ結合部位に強力に結合するすでに同定したリガンドは、最新の開示情報を実施する際に遮断剤として使用する。この例では、遮断剤をナノ熱量計の測定側で使用し、標的化合物上の対応する部位で結合を遮断し、参照側では遮断剤を使用しない。その場合の発熱シグナルは、すでに同定されているリガンドの存在下に結合する新しいリガンドに相当する。

一部の事例では、その新しいリガンドは全く新規の医薬リードまたは化合物を開発するために使用し得る。他の場合、新規リガンドを、すでに同定したリガンドに接合する候補として使用する目的で、すでに同定したリガンドの存在下に結合するリガンドを見出すことが望ましい。新規リガンドとすでに同定したリガンドとの接合は、その場合、強力な結合力と必要な特異性の両方をもつ医薬リードを開発するために使用することができる。

例えば、実施例３での濃度を考えてみる。この実施例では、テストリガンドと遮断剤との液滴、および標的化合物と遮断剤との第二の液滴を、上に検討した態様に従って、ナノ熱量計の測定側に析出させる。テストリガンドと遮断剤との液滴、および標的化合物を含まない遮断剤の第二の液滴を参照側に析出させる。バッファーは厳密に配合し、混合熱を最少とする。液滴を併合し、示差熱を測定する。示差熱がある場合、共通様式の熱効果、例えば、混合熱が実験上、適切に制御されていると仮定すれば、テストリガンドは遮断された部位以外の部位に結合するヒットである。もしそれが起こるなら、該リガンドは、単独または遮断剤との接合で、可能性のある医薬リード化合物としてさらに検討するために同定する。具体的には、上記測定の参照側によって付与される共通様式の拒絶がなく、結合検出可能な程に十分強ければ、参照領域を備えた検出器を必要とせずに、検出を実施し得る。

さらにもう一つの態様においては、一つを超える同定部位に対しての結合をより効率的に選抜するために、多重遮断剤による測定を実施し得る。例えば、２つの基質部位に加えて、補助因子部位とレギュレーター部位をもつ酵素標的を考える。また、第一基質部位、補助因子部位、またはレギュレーター部位には結合するが、第二基質部位には結合しないリガンドを見出すのが望ましい事例について考える。第一セットの実験では、測定領域と参照領域の両方を有するディバイスの参照領域において、溶液中に存在する第一基質部位、補助因子部位、およびレギュレーター部位のすべての遮断剤によりテストリガンドを酵素標的に対して選抜する。さらに、第二基質部位に対する遮断剤は測定領域の溶液中に存在する。より一般的には、標的とされる部位はすべて参照領域において遮断され、結合を望まない部位はすべて測定領域において遮断される。テストリガンドをテストする場合、測定領域における結合のプラスシグナルを与えるものは好適な部位の一つに結合する候補リガンドであり、追跡テストはこれらリガンドの特定の１つの特異的結合部位を決めるために実施し得る。追跡テストの一例として、補助因子部位の遮断剤は測定領域に移動させることが可能であり、第二セットの実験は第一セットの実験で陽性であったヒットに関して実施し得る。反応熱の符号を逆転させるリガンドは補助因子に対するリガンドとして同定され、また反応熱の符号の逆転を示さないリガンドはレギュレーター部位または第一基質部位に対するリガンドと同定されよう。明らかに、その後のテストはレギュレーター部位に対する結合と第一基質部位に対する結合をさらに識別するために使用し得る。

この態様への利点は、標的が対象の多重結合部位をもち、かつスクリーニングテストが低い割合のヒットを与えると期待される場合に有意である。例えば、一時に１部位を遮断することにより３つの異なる部位に対する結合を１００万種の化合物について選抜しようとするなら、３００万回のスクリーニング事象が必要となる。代わりに、この態様を実施して、３つの部位のいずれかに結合する１００万種の化合物について選抜し、０.１％の化合物がヒットであるなら、１,０００のヒット（１,０００,０００の０.１％）すべてが１００万回のスクリーニング事象の後に同定される。この二番目の事例では、どの結合部位が各ヒットに対応するかを同定するために、最大３０００回のさらなるスクリーニング事象が必要なだけである。

最初の２つの実施例においては、基質Ｓの結合と酵素Ｅに対するリガンドＬの競合的結合を考察する。

（実施例１）
酵素Ｅに対する基質ＳとテストリガンドＬとの競合結合の計算
条件は該基質が反応を受けないものとする。例えば、ＥはＡＴＰキナーゼでよく、Ｓは基質、またＡＴＰは供給しない；基質はＡＴＰが存在しないのでリン酸化されることはない。選択肢として、非水解性ＡＴＰ類似体、例えば、アデニリルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）またはアデノシン５′−［γ−チオ］三リン酸（ＡＴＰ−γ−Ｓ）などを存在させてもよい。酵素に対する基質の結合（Ｋ_Ｓは解離平衡定数である）は、Ｅが遊離の酵素、Ｓが遊離の基質、またＥ・Ｓが互いに結合した酵素Ｅと基質Ｓであるとした場合、以下の反応がモデルとなる：

（式１）

酵素に対するテストリガンドの結合（Ｋ_Ｌは解離平衡定数である）は、Ｅが遊離の酵素、Ｌが遊離のテストリガンド、またＥ・Ｌが互いに結合した酵素ＥとテストリガンドＬであるとした場合、以下の反応がモデルとなる：

（式２）

これらの等式において、カギ括弧はモル濃度を示す。Ｅ、Ｓ、およびＬそれぞれは以下の物質収支の式に従う：

（式３）

（式４）

（式５）

等式３〜５において、Ｅ_０およびＬ_０は測定領域と参照領域両方の併合した液滴中の、酵素およびリガンドそれぞれの合計モル濃度であり、結合種、非結合種の両方を含む。またＳ_０は参照領域中の併合した液滴の基質合計濃度であり、結合した基質および遊離基質の両方を含む。等式（３）はＳおよびＬが同じ部位での結合に対して競合し、同時に酵素分子に結合することはできないものとする。等式１〜５を解いて、測定ディバイスの測定領域および参照領域両方における結合したリガンドＬと基質Ｓの量を決定し、結合のモルエンタルピーに結合種の濃度を掛けて、温度シグナルΔΔＴを求める。ΔΔＴ項は測定領域のΔＴと参照領域のΔＴ間の差である。

以下の条件を考慮する：
Ｋ_Ｓ＝基質と酵素の結合に対して２μＭ
Ｓ_０＝基質の合計濃度＝１ｍＭ
Ｅ_０＝酵素の合計濃度＝５μＭ
Ｌ_０＝テストリガンドの合計濃度＝７.５μＭ
ΔＨ_Ｌ＝リガンドと酵素の結合に対して−１０ｋｃａｌ／モル
ΔＨ_Ｓ＝基質と酵素の結合に対して−１ｋｃａｌ／モル

これらのパラメータ値について、表１はテストリガンドの解離定数Ｋ_Ｌの関数として予測計算した示差シグナルを一覧として示す。示差シグナルは遮断基質Ｓ（Ｓ_０＝０）の不存在下でのリガンドＬと酵素Ｅの結合からのエンタルピーに相当し、上記濃度の遮断剤Ｓの存在下（すなわち、Ｓ_０＝１ｍＭ）、リガンドＬが結合したことによるエンタルピーを差し引いたものである。高処理能力スクリーニングにおけるテストリガンドでは、通常、Ｋ_Ｌは予め分かっておらず、従って、表１はどの範囲のＫ_Ｌがスクリーニングの研究においてヒットを生じるかを示している。この実施例の目的として、ヒットは＞１０μ℃の結合により上昇する示差温度による測定値であると仮定する。

（実施例２）
より高いＫ_Ｓでの酵素Ｅに対する基質ＳとテストリガンドＬの競合結合
Ｋ_Ｓがより大きい場合、基質は基質部位にテスト化合物が結合するのを阻害するのに効果的ではない。

以下の条件を考慮する：
Ｋ_Ｓ＝基質と酵素の結合に対して１００μＭ
Ｓ_０＝基質の合計濃度＝２ｍＭ
Ｅ_０＝酵素の合計濃度＝５μＭ
Ｌ_０＝テストリガンドの合計濃度＝７.５μＭ
ΔＨ_Ｌ＝リガンドと酵素の結合に対して−１０ｋｃａｌ／モル
ΔＨ_Ｓ＝基質と酵素の結合に対して−１ｋｃａｌ／モル

これらのパラメータ値について、表２はテストリガンドの解離定数Ｋ_Ｌの関数として予測計算した示差シグナルを一覧として示す。高処理能力スクリーニングにおけるテストリガンドでは、Ｋ_Ｌは通常予め分かっておらず、従って、表２はどの範囲のＫ_Ｌがスクリーニングの研究においてヒットを生じるかを示している。実施例１の基質は約Ｋ_Ｌ＝１ｎＭの低値までテストリガンドを遮断するが、本実施例での基質による遮断は約Ｋ_Ｌ＝２５ｎＭまでであり、偽陰性の可能性を大きくすることになる。

（実施例３）
以下の実施例では、遮断剤Ｂ（例えば、特定の結合部位に対するすでに同定したリガンド）の結合およびリガンドＬと酵素Ｅとの同時結合について考える。本実施例で我々は遮断剤Ｂの結合部位以外の部位に対する結合剤についてスクリーニングするが、これは実施例１および２の場合と逆の場合である。ナノ熱量計または他の測定ディバイスの測定領域において、我々は酵素と遮断剤の液滴を、テストリガンドと遮断剤の液滴と併合する。参照領域において、我々は遮断剤の液滴（酵素含まず）と、遮断剤およびテストリガンドの液滴を併合する。ナノ熱量計により測定領域と参照領域にて発生した熱の差を測定する。条件は遮断剤が酵素反応を受けないようにする。

酵素に対する遮断剤の結合（Ｋ_Ｂは遮断剤に対する解離平衡定数である）は、Ｅが遊離の酵素、Ｂが遊離の遮断剤、またＥ・Ｂが互いに結合した酵素Ｅと遮断剤Ｂであるとした場合、以下の反応がモデルとなる：

（式６）

酵素に対するテストリガンドの結合（Ｋ_Ｌはテストリガンドに対する解離平衡定数である）は、Ｅが遊離の酵素、Ｌが遊離のテストリガンド、またＥ・Ｌが互いに結合した酵素ＥとテストリガンドＬであるとした場合、以下の反応がモデルとなる：

（式７）

これらの等式において、カギ括弧はモル濃度を示す。等式（７）は、Ｂがすでに結合している場合、ＬはＥに結合せず、従って、これを競合結合事例として記載する。ＢおよびＬの種が同じ部位でＥとの結合に際し、完全に競合する事例では、Ｅ、Ｂ、およびＬそれぞれは物質収支の式に従う：

（式８）

（式９）

（式１０）

等式８〜１０において、Ｅ_０は測定領域で併合した液滴中の、結合種、非結合種の両方を含む酵素の合計モル濃度であり、またＬ_０およびＢ_０は測定領域と参照領域両方における併合した液滴のテストリガンドと遮断剤の合計濃度であり、結合種および遊離種の両方を含む。等式（８）は、ＢまたはＬがＢの“遮断する”部位に結合するが、同時に両方には結合しないために成り立つ。等式６〜１０を解いて、結合したリガンドＬと遮断剤Ｂの量を決定し、結合のモルエンタルピーに結合種の濃度を掛けて、競合結合の温度シグナルを求める。

Ｂから独立してＬがＥに結合する場合、相当する等式は以下の通りである：

（式１１）

（式１２）

（式１３）

ただし、Ｅ′は遊離のＥ、およびＢに結合しＬには結合していないＥをプラスしたものである。等式１１〜１３を解いて、結合したリガンドＬ量を決定し、結合のモルエンタルピーに結合種の濃度を掛けて、独立結合に対する温度シグナルを求める。

以下の条件を考慮する：
Ｋ_Ｂ＝基質と酵素の結合に対して２０ｎＭ
Ｂ_０＝遮断剤の合計濃度＝１ｍＭ
Ｅ_０＝酵素の合計濃度＝５μＭ
Ｌ_０＝テストリガンドの合計濃度＝７.５μＭ
ΔＨ_Ｌ＝リガンドと酵素の結合に対して−１０ｋｃａｌ／モル
ΔＨ_Ｂ＝遮断剤と酵素の結合に対して−１２ｋｃａｌ／モル

本実施例において、Ｋ_Ｂは２０ｎＭで比較的低い。このような値は薬物標的に対するすでに確認された強力な結合剤である遮断剤では理に適っており、医薬スクリーニング操作において発見され、最適化されはしたが、対象の標的に対して十分に特異的ではないことが判明している強力な結合リガンドの場合なども同様である。これらのパラメータ値について、表３はテストリガンドの解離定数、Ｋ_Ｌの関数として予測計算した示差シグナルを一覧として示す。示差シグナルはテストディバイスの測定領域における遮断剤Ｂ（Ｂ_０＝１ｍＭ）の存在下でのリガンドＬと酵素Ｅの結合によるエンタルピーに相当し、ナノ熱量計テストディバイスの参照領域において、酵素Ｅの不存在下、リガンドＬと遮断剤Ｂとの混合によるエンタルピーを差し引いたものである。高処理能力スクリーニングにおけるテストリガンドでは、Ｋ_Ｌは通常予め分かっておらず、従って、表３はどの範囲のＫ_Ｌがスクリーニングの研究においてヒットを生じるかを示しており、それがこの実施例では、＞１０μ℃の示差温度での結合相互作用である。

表３に見るように、本実施例ではＢから独立して（例えば、異なる部位で）結合するＫ_Ｌ＞０.５ｎＭの結合剤はすべてスクリーニングテストにおいて陽性となるが、Ｂと同じ部位に結合する同等に強力な結合剤は陰性の試験結果となる。結合定数が０.５ｎＭ未満であるリガンドは擬陰性となり得るが、医薬スクリーニングにおいてそのリスクはそれ程に大きくない。その理由は０.５ｎＭ未満の解離定数での一次スクリーニングからのヒットが非常に稀有だからである。

本明細書に記載の方法を実施する際に利用するナノ熱量計の一実施形態の構成要素を示す構成図である。 本方法の一態様によるテスト実施アレイの単一セル内の酵素およびリガンド液滴析出を示す説明図である。 図２の方法の態様を説明する図式である。 本方法のもう一つの態様によるテスト実施アレイの単一セル内の酵素およびリガンド液滴析出を示す説明図である。 図４の方法の態様を説明する図式である。

符号の説明

１００ ナノ熱量計、１１０ 熱隔離層、１６０，２４０，４４０ 測定領域、１７０，２３０，４３０ 参照領域、２１０ 熱隔離領域。

Claims (3)

1. 種々の薬物標的結合部位における結合識別のための化合物のスクリーニング法であって、かかる結合の反応エンタルピーを測定するディバイスを使用し；
   該反応エンタルピー測定ディバイス上の少なくとも１つの一次位置にて、少なくとも１種のテストリガンドと少なくとも１種の標的化合物とを併合すること、その場合の当該標的化合物が少なくとも１つの結合対象部位と少なくとも１つの回避すべき結合部位を含むこと；
   該反応エンタルピー測定ディバイス上の少なくとも１つの二次位置にて、少なくとも１種の一次遮断剤の存在下に、少なくとも１種のテストリガンドと少なくとも１種の標的化合物とを併合すること、その場合の当該標的化合物が少なくとも１つの結合対象部位と少なくとも１つの回避すべき結合部位を含むこと；
   当該一次位置にて、当該併合した少なくとも１種のテストリガンドと当該少なくとも１種の標的化合物について一次反応熱を検出すること；
   当該二次位置にて、遮断剤の存在下に、当該併合した少なくとも１種のテストリガンドと当該少なくとも１種の標的化合物について二次反応熱を検出すること；および
   当該一次反応熱および二次反応熱を比較すること；
   を含むことを特徴とするスクリーニング法。
2. さらに、代替基質について予備スクリーニングを実施することを特徴とする請求項１に記載の化合物のスクリーニング法。
3. 種々の薬物標的結合部位における結合識別のための化合物のスクリーニング法であって、かかる結合の反応エンタルピーを測定するナノ熱量測定ディバイスを使用し、その場合のナノ熱量測定ディバイスが、熱単離領域、参照領域、および測定領域を有し、該スクリーニング方法は；
   少なくとも１ヶ所の測定領域内にて、少なくとも１滴の標的化合物を析出させること、その場合の当該標的化合物が少なくとも１つの結合対象部位と少なくとも１つの回避すべき結合部位を含むこと；
   少なくとも１ヶ所の参照領域内にて、少なくとも１滴の標的化合物を析出させること、その場合の当該標的化合物が少なくとも１つの結合対象部位と少なくとも１つの回避すべき結合部位を含むこと；
   少なくとも１ヶ所の測定領域内にて、少なくとも１滴のテスト化合物を析出させること；
   少なくとも１ヶ所の参照領域内にて、少なくとも１滴のテスト化合物を析出させること；
   少なくとも１ヶ所の参照領域内にて、少なくとも１種の一次遮断剤の存在下に、当該標的化合物と当該テスト化合物とを併合すること；
   少なくとも１ヶ所の測定領域内にて、当該標的化合物と当該テスト化合物とを併合すること；
   少なくとも１ヶ所の参照領域内にて、少なくとも１種の遮断剤の存在下に、当該併合した標的化合物と当該テスト化合物について一次反応熱を検出すること；
   少なくとも１ヶ所の測定領域内にて、当該併合した標的化合物と当該テスト化合物について二次反応熱を検出すること；および
   少なくとも１ヶ所の参照領域および少なくとも１ヶ所の測定領域について、当該反応熱を比較すること；
   を含むことを特徴とするスクリーニング方法。

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