CN113151393A - 离心过滤结合荧光染色判定液体菌种细菌污染情况的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其具体是以液体菌种培养过程中或培养结束后的培养液作为样品，将其过滤去除菌丝体后进行离心过滤，使细菌富集，再通过CTC染色检测及CFDA染色检测，以判断液体菌种有无发生细菌污染的情况。采用本发明方法可快速、灵敏的检出食用菌液体菌种是否被细菌污染，可确保高纯度液体菌种用于食用菌生产，避免潜在重大栽培风险，有利于促进食用菌产业的健康发展。
Description
技术领域
本发明属于食用菌液体菌种制备技术领域，具体涉及一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法。
背景技术
我国食用菌栽培面积大，栽培种类多，年产量占世界总产量的70%以上，是世界上食用菌的主要生产者。目前食用菌栽培是我国重要的现代农业产业，产值继粮、油、果、菜占第5位。食用菌栽培离不开菌种，通常采用以木屑为主要培养料成分制备的固体菌种作为接种物。固体菌种具有投资少、生产技术要求相对较低等优点，适合小农户、家庭作坊式生产模式，但具有菌种制备周期长、菌种菌龄不一致、接种效率低、菌丝萌发慢、吃料慢、同步性差等缺点。近年来，随着我国食用菌栽培技术以及产业集中度的提高，工厂化栽培模式已逐渐成为主流。食用菌工厂化栽培中，为提高生产效率，液体菌种的使用受到企业青睐。目前，我国大多数金针菇、杏鲍菇栽培企业开始普遍采用液体菌种。
防止杂菌污染是食用菌液体菌种制备的关键，其受多种因素影响，如操作规范性、员工技术水平、生产设备、培养基组成、生产场地环境条件、管理、微生物种类等。与其它种类微生物相比，食用菌液体培养时生长速度较慢，培养时间长，易发生杂菌污染，因而制备高纯度菌种的难度很大。另外一方面，食用菌液体菌种发生低水平细菌污染时，肉眼无法发现，即使采用一些传统检测方法，包括显微镜检、肉汤培养、平板划线法等也不易检测到细菌污染。而生产上食用菌栽培需使用高纯度菌种，即使发生轻微细菌污染也会对食用菌生产带来灾难性影响，造成重大经济损失，对生产构成重大潜在风险，因此，制备高纯度液体菌种至关重要，而这离不开快速、灵敏的细菌污染检测方法。
本发明提供了一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，采用本发明方法进行细菌污染检测，具有灵敏度高、检测时间短、检测结果易观测等优点，有利于促进食用菌液体菌种在栽培中的应用，降低潜在风险，避免经济损失，有利于食用菌产业的健康发展，并为高纯度食用菌液体菌种的制备和应用提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种离心过滤结合荧光染色判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其可快速、灵敏的检出食用菌液体菌种是否被细菌污染，有助于筛选出高纯度液体菌种用于食用菌生产，促进食用菌产业的健康发展。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其包括如下步骤：
1）培养取样：于液体菌种培养过程中或培养结束后取培养液作为样品，以监测培养过程有无细菌污染发生或栽培应用前液体菌种的纯度；
2）离心过滤：无菌条件下将取到的样品分别用40目无菌铁纱布过滤去除菌丝体，再将过滤液采用离心过滤管进一步离心过滤（8000-10000 rpm离心5-10 min），以使污染细菌富集至过滤管中亲水性的过滤膜（孔径为0.22 μm）上，过滤液的体积应不低于离心过滤管容量的1/5；每份样品平行制备两份富集细菌的过滤膜；
3）CTC染色检测：在其中一份过滤膜上滴入20-50 μL、1 mmol/L的5-氰基-2,3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物（CTC）染液（用PBS缓冲液配制），于37℃下染色60 min，然后采用肉眼进行初步观测，如肉眼可观测到红色或浅黄色，表明液体菌种发生细菌污染，不能用于食用菌栽培；
4）CFDA染色检测：对于CTC染色后不显色的样品，将相应平行制备的过滤膜转至营养琼脂平板中，35℃培养8-12 h，再在膜上滴入20-50 μL、浓度为200 μg/mL的5(6)-羧基二乙酸荧光素（CFDA）染液（用二甲基亚砜作为溶剂配制），492 nm LED灯下观察，从而对液体菌种细菌污染情况进行进一步判定，如观察到细菌菌落，则液体菌种发生细菌污染，不能用于食用菌栽培。
本发明的有益效果是：
1）本发明将培养液进行离心过滤，其样品处理量大，可实现细菌的有效富集；
2）本发明采用CTC染色结合CFDA染色进行检测，其中CTC染色成本低、操作简便，有利于对细菌污染程度进行快速初步判断，以便及时对污染程度较高的培养液进行终止培养或不能用于生产应用，避免培养时间的消耗及原料的浪费；而对未显色样品进一步进行CFDA染色检测，可提高检测灵敏度，样品中低至1-2 cfu/mL的细菌污染也可检出，因而其可兼顾检测时间、成本控制以及检测灵敏度；
3）本发明方法检测步骤少、检测时间短，最短1 h内可获得检测结果，适用于大量样品的快速检测。
附图说明
图1为实施例2中不同量滤液离心富集于过滤膜上染色后的情况图，其中A为30mL、B为10mL、C为5mL。
图2为实施例3中CFDA染色后的情况图，由图中可见存在少量菌斑。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围。
所用浓度为1 mmol/L的CTC染液是将1 mg 5-氰基-2,3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物于3.75 mL、pH=7.2的PBS缓冲液中充分溶解制得。
所用浓度为200 μg/mL的CFDA染液是将2 mg 5(6)-羧基二乙酸荧光素于10 mL二甲基亚砜中充分溶解制得。
所用营养琼脂平板中培养基的组成为：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15-20 g，加水定容至1000 mL；培养皿直径为9 cm。
实施例1 液体菌种细菌污染检测能力测试
1. 于金针菇液体菌种罐（200 L）培养结束时进行取样，经平板法及肉汤培养法确认其为高纯度菌种；
2. 无菌条件下，在所得样品中接入大肠杆菌或枯草芽孢杆菌作为污染菌，获得细菌浓度为1 cfu/mL-1000 cfu/mL的细菌污染样品；
3. 取30 mL细菌污染样品，用无菌铁纱布（40目）过滤去除菌丝体，滤液用50 mL的离心过滤管进行离心过滤（8000 rpm离心10 min），使样品中的污染细菌富集到离心过滤管的过滤膜上；每个污染水平做2个平行样品；
4. 在培养后的过滤膜上滴入30 μL、1 mmol/L的CTC染液，于37℃染色60 min；
5. 将另一平行样品的过滤膜于无菌条件下取出，转至营养琼脂平板中，于35℃恒温培养箱培养10 h，使污染细菌生长；然后在膜上滴入30 μL、200 μg/mL的CFDA染液进行染色，492 nm LED灯下进行观察。
结果显示，CTC染色后膜上截留的细菌数量（滤液用量mL×菌浓cfu/mL）低于约9000 cfu时，染色后无明显显色，肉眼不能判断污染情况；采用CFDA检测法时，膜上截留的细菌数量高于1 cfu时即可检测。
实施例2 杏鲍菇液体菌种细菌污染情况检测
1. 杏鲍菇菌株活化后，将母种接种至装有PDB培养基的摇瓶中进行培养，培养温度为25℃、转速150为 r/min、培养时间为5 d；
2. 将摇瓶培养获得的菌种利用超声波技术进行破碎，形成菌丝分散的液体菌种；
3. 取500 mL菌丝分散的液体菌种接种至装有150 L液体培养基（每升含：豆粕粉3g，玉米粉10 g，蔗糖10 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.5 g）的200 L食用菌液体菌种罐中进行培养，培养条件为：通气量50 L/min，温度25℃，培养时间4 d；
4. 培养结束后于无菌条件下取样80 mL，先用无菌铁纱布（40目）过滤去除菌丝体，然后分别将5 mL、10 mL和30 mL的滤液用50 mL离心过滤管（膜孔径0.22 μm）于8000rpm离心10min，使污染细菌富集于离心过滤管的过滤膜上；每个不同滤液量做2个平行样品；
5. 取不同滤液量的过滤膜分别滴入30 μL 1 mmol/L的CTC染液，于37℃染色60min。
结果显示，滤液用量为30 mL及10 mL的过滤膜上可看到红色菌体，显示液体菌种中含有细菌，发生了污染，液体菌种不能用于栽培接种（平行样品可不必再进行CFDA检测）；而当滤液用量为5 mL过滤膜未显色，表明滤液用量过少会导致膜上截留的细菌数量过低，从而无法在显色后经肉眼判断污染情况。
实施例3 真姬菇液体菌种培养过程中的细菌污染情况过程监控
1. 将真姬菇试管母种接种至新鲜的PDA斜面，25℃培养5 d进行活化；
2．将活化的母种接种至装有100 mL PDB培养基的250 mL三角瓶中，25℃、150 r/min摇床培养5 d；
3. 取500 mL液体菌种接种至装有150 L液体培养基（每升含：豆粕粉3 g，玉米粉10 g，蔗糖10 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.5 g）的200 L食用菌液体菌种罐中进行培养，培养条件为：通气量 75 L/min，温度25℃，培养时间4 d；培养至第3 d时，于无菌罐中取样30 mL；
4. 将样品30 mL用无菌铁纱布（40目）过滤去除菌丝体，再取10 mL滤液用50 mL离心过滤管（膜孔径0.22μm）于8000 rpm离心10 min，使污染细菌富集于离心过滤管的过滤膜上；同时做2个平行样品；
6. 在一份样品的过滤膜上滴入20 μL、1 mmol/L的CTC染液，于37℃染色60 min，肉眼初步观测未显色；
7. 将另一平行样品的过滤膜于无菌条件下转至营养琼脂平板中，于37℃恒温培养12 h，使污染细菌生长，然后在膜上滴入30 μL、200 μg/mL的CFDA染液进行染色，492 nmLED灯观察，可见细菌菌落，表明液体菌种发生轻度细菌污染，须终止培养，重新生产。
实施例4 秀珍菇液体菌种培养过程中的细菌污染情况检测
1. 秀珍菇母种活化及食用菌种菌种罐培养同实施例3的操作；
2. 在液体菌种培养至第3 d时，于无菌罐中取样30 mL；
3. 将样品用无菌铁纱布（40目）过滤去除菌丝体，滤液用离心过滤管（膜孔径0.22μm）于10000 rpm离心10 min，使污染细菌富集于离心过滤管的过滤膜上；同时做2个平行样品；
4. 在一份样品的过滤膜上滴入25 μL、1 mmol/L的CTC染液，于37℃染色60 min；
5. 膜上可看到红色菌液，表明液体菌种含有细菌，发生了污染，须终止培养，重新生产（平行样品可不需再用CFDA法进行检测）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）培养取样：于液体菌种培养过程中或培养结束后取培养液作为样品；
2）离心过滤：无菌条件下将取到的样品用40目无菌铁纱布过滤去除菌丝体，再将过滤液采用离心过滤管进行进一步离心过滤，以使污染细菌富集到亲水性的过滤膜上；每份样品平行制备两份富集细菌的过滤膜；
3）CTC染色检测：在其中一份过滤膜上滴入20-50 μL、1 mmol/L的5-氰基-2,3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物染液，于37℃下染色60 min，然后采用肉眼进行初步观测，若显红色或浅黄色则表示液体菌种发生细菌污染；
4）CFDA染色检测：对于CTC染色后不显色的样品，将相应平行制备的过滤膜转至营养琼脂平板中，35℃培养8-12 h，再在膜上滴入20-50 μL、200 μg/mL的5(6)-羧基二乙酸荧光素染液，492 nm LED灯下观察，从而对液体菌种细菌污染情况进行进一步判定。
2.根据权利要求1所述的离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其特征在于：步骤2）离心过滤时，过滤液的体积应不低于离心过滤管容量的1/5。
3. 根据权利要求1所述的离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其特征在于：步骤2）中所用离心过滤管中过滤膜的孔径为0.22 μm。
4. 根据权利要求1所述的离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其特征在于：步骤2）中所述离心的转速为8000-10000 rpm，时间为5-10 min。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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