CN110343736A - 一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，由蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾和琼脂组成；其中，各组分配比如下：每1000ml培养基中，含有蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、牛胆汁粉5g、蔗糖20g、柠檬酸铁1g、胆酸盐3g、溴麝香草酚蓝0.04g、麝香草酚蓝0.04g、硫代硫酸钠7‑10g、青霉素钾1000‑6000U、琼脂11‑15g；pH＝8.6±0.2；该培养基可抑制乳酸菌和芽孢杆菌的生长，改善TCBS培养基的特异性和灵敏度，实现了以快速简便经济的方式来检测水产养殖中弧菌数量。

Description

一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体为一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基。

背景技术

目前国内致病性弧菌的检测中只有少数几种有标准的检测程序，如GB-19584-1995中规定了霍乱弧菌的检测标准；GB/T 4789.7-2008中规定了水产品中副溶血性弧菌检测采用的日常检测方法。另外，进出口水产品检测标准SN中规定了进出口水产品中副溶血性弧菌、霍乱弧菌以及溶藻弧菌的检测标准。其它致病性弧菌的检测主要参照GB/T4789.7-2008中副溶血性弧菌的检测。此标准检测程序主要依靠常规细菌学培养结合细菌生化试验，需经过选择性增菌培养、分离纯化、筛选试验、生理生化反应等步骤，必要时进行血清学试验，此法还可作为其它快速检测方法的初筛方法，检测结果准确，但过程繁琐，一般需一周左右才能得到检验结果。

国内外致病性弧菌的检测标准主要是针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌，但其余致病性弧菌对水产品安全以及人类健康的威胁也越来越明显，因此国内外也越来越关注其它致病性弧菌标准检测方法及快速检测方法的建立。

目前水产养殖中弧菌检测方法一般都为直接使用TCBS培养基进行涂板计数，此方法易受乳酸菌和芽孢杆菌的影响，造成弧菌计数的误差。此实验为了寻找一种快速简便经济的方式来检测水产养殖中弧菌数量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可抑制乳酸菌和芽孢杆菌的生长，改善TCBS培养基的特异性和灵敏度的改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，包括由蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾和琼脂组成。

进一步地，各组分配比如下：每1000ml培养基中，含有蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、牛胆汁粉5g、蔗糖20g、柠檬酸铁1g、胆酸盐3g、溴麝香草酚蓝0.04g、麝香草酚蓝0.04g、硫代硫酸钠7-10g、青霉素钾1000-6000U、琼脂11-15g。

进一步地，pH＝8.6±0.2，温度为25℃。

本发明提供另一种技术方案：一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基的实验方法，包括以下步骤：

S1：挑选菌种：霍乱弧菌、溶血弧菌、副溶血弧菌、屎肠球菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、乳酸肠球菌、食窦魏斯氏菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、类地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、纳豆芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌，于-80℃保存备用；

S2：菌种活化：将上述保存的菌种转接到由蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾和琼脂组成的TCBS固体培养基中，37℃培养24h，备用；

S3：种子液的制备：从固体板上挑取一环单菌落接种到装有20ml培养液的50ml三角瓶中，乳酸菌静置于37℃培养箱中培养48h，弧菌和芽孢菌于37℃、220r/min条件下震荡培养，培养24h，备用；

S4：TCBS培养基的特异性：将上述种子培养液分别稀释涂布于TCBS培养基中，37℃下培养并观察；

S5：优化TCBS培养基试验：选取在TCBS生长较好的菌株在含不同青霉素钾的TCBS培养基上生长状况。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，由蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾和琼脂组成；该培养基可抑制乳酸菌和芽孢杆菌的生长，改善TCBS培养基的特异性和灵敏度，实现了以快速简便经济的方式来检测水产养殖中弧菌数量。

具体实施方式

以下将详细说明本发明实施例，然而，本发明实施例并不以此为限。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中：提供一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，包括由蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾和琼脂组成；其中，各组分配比如下：每1000ml培养基中，含有蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、牛胆汁粉5g、蔗糖20g、柠檬酸铁1g、胆酸盐3g、溴麝香草酚蓝0.04g、麝香草酚蓝0.04g、硫代硫酸钠7-10g、青霉素钾1000-6000U、琼脂11-15g；pH＝8.6±0.2，温度为25℃。

为了进一步更好的解释说明本发明，还提供如下具体的基于本发明培养基的实验方法，步骤如下：

第一步：实验材料，(1)菌种：包括霍乱弧菌、溶血弧菌、副溶血弧菌、屎肠球菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、乳酸肠球菌、食窦魏斯氏菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、类地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、纳豆芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等为本实验室筛选，于-80℃保存；(2)制备包括蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾、琼脂的培养基；

第二步：菌种活化：将保存的菌种转接到固体培养基中，37℃培养24h，备用；

第三步：种子液的制备：从固体板上挑取一环单菌落接种到装有20ml培养液的50ml三角瓶中，乳酸菌静置于37℃培养箱中培养48h，弧菌和芽孢菌于37℃、220r/min条件下震荡培养，培养24h，备用；

第四步：TCBS培养基的特异性：将上述种子培养液分别稀释涂布于TCBS培养基中，37℃下培养并观察；

第五步：优化TCBS培养基试验：选取在TCBS生长较好的菌株在含不同青霉素钾的TCBS培养基上生长状况。

实验结果：

(1)各菌株在TCBS培养基上的生长，参见下表1：

表1 各种芽孢杆菌，乳酸菌在TCBS培养基上生长状况

注：“+”表示菌种可以生长，“-”表示菌种不能生长

由上表可知：各类芽孢杆菌大部分不能在TCBS培养基上生长，少数可以生长的速度较慢，且菌落为白色；而大部分乳酸菌可以在TCBS生长，不过生长速度较弧菌稍慢，为小的圆形黄色菌落，会对弧菌计数造成一定的影响，造成弧菌计数偏高。

(2)乳酸菌和弧菌在含青霉素钾的TCBS培养基上的生长，参见下表2：

表2 乳酸菌和弧菌在含不同青霉素钾的TCBS培养基上生长状况

注：“+”表示菌种可以生长，“-”表示菌种不能生长

由上表2选取在TCBS生长较好的屎肠球菌、粪肠球菌、YLL-1三株乳酸菌及副溶血弧菌、溶藻弧菌在含不同青霉素钾的TCBS培养基上生长状况，在普通TCBS培养基中添加10U/ml单位的青霉素钾可以有效的减少乳酸菌假阳性的产生，但其对弧菌的生长有一定的抑制作用。

表3 乳酸菌和弧菌在含不同青霉素钾的TCBS培养基上生长状况

注：“+”表示菌种生长良好，“+/-”表示菌种可生长但有抑制，“-”表示菌种不能生长。

由上表2-3可知，在培养基中添加4U/ml单位的青霉素钾可以有效的减少乳酸菌生长形成的假阳性，同时对弧菌生长没有出现抑制作用，对弧菌的检测会有影响。

综上所述：本发明提供的一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，包括由蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾和琼脂组成；其中，各组分配比如下：每1000ml培养基中，含有蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、牛胆汁粉5g、蔗糖20g、柠檬酸铁1g、胆酸盐3g、溴麝香草酚蓝0.04g、麝香草酚蓝0.04g、硫代硫酸钠7-10g、青霉素钾1000-6000U、琼脂11-15g；pH＝8.6±0.2，此培养基可抑制乳酸菌和芽孢杆菌的生长，改善TCBS培养基的特异性和灵敏度。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，其特征在于，包括由蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾和琼脂组成。

2.如权利要求1所述的一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，其特征在于：各组分配比如下：每1000ml培养基中，含有蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、柠檬酸钠10g、牛胆汁粉5g、蔗糖20g、柠檬酸铁1g、胆酸盐3g、溴麝香草酚蓝0.04g、麝香草酚蓝0.04g、硫代硫酸钠7-10g、青霉素钾1000-6000U、琼脂11-15g。

3.如权利要求2所述的一种改进型水产弧菌选择性鉴别培养基，其特征在于：pH＝8.6±0.2，温度为25℃。

4.一种如权利要求1所述的改进型水产弧菌选择性鉴别培养基的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：挑选菌种：霍乱弧菌、溶血弧菌、副溶血弧菌、屎肠球菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、乳酸肠球菌、食窦魏斯氏菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、类地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、纳豆芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌，于-80℃保存备用；

S2：菌种活化：将上述保存的菌种转接到由蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、柠檬酸钠、牛胆汁粉、蔗糖、柠檬酸铁、胆酸盐、硫代硫酸钠、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、青霉素钾和琼脂组成的TCBS固体培养基中，37℃培养24h，备用；

S3：种子液的制备：从固体板上挑取一环单菌落接种到装有20ml培养液的50ml三角瓶中，乳酸菌静置于37℃培养箱中培养48h，弧菌和芽孢菌于37℃、220r/min条件下震荡培养，培养24h，备用；

S4：TCBS培养基的特异性：将上述种子培养液分别稀释涂布于TCBS培养基中，37℃下培养并观察；

S5：优化TCBS培养基试验：选取在TCBS生长较好的菌株在含不同青霉素钾的TCBS培养基上生长状况。