CN102424832A - 一种用于检测大肠杆菌o157：h7的显色培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，培养基含有琼脂、蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠、山梨醇、肌醇、中性红、β-半乳糖苷酶显色底物、β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、牛胆盐、亚碲酸钾、头孢克肟。本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌O157：H7，检测灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴别，检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本，可对食品生产和环境中大肠杆菌O157：H7进行全面、系统、准确的检测和初步鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物检测的培养基，尤其涉及一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基。
背景技术
食品微生物安全是食品安全中的重中之重，肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌，包括了O157：H7、O157：NM、O26：H11、O111：H8、O125：NM、O121：H19、O45：H2、O4：NM、O145：NM、O5：NM、O91：H21、O103：H2、O113：H2等血清型的部分菌株。其中以大肠杆菌O157：H7血清型为代表菌株，是近年来新发现的危害严重的肠道传染性致病菌。
大肠杆菌O157：H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇以及编码的β-葡萄糖醛酸苷酶无活性外，其它常见的特征与大肠埃希氏菌基本相似。大肠杆菌O157：H7传统的检测方法利用的是常规生化原理，由于与其它肠杆菌如大肠埃希氏菌的生化特征非常相似，在传统山梨醇麦康凯琼脂培养基（SMAC）中选择效果不明显，可疑菌落不易识别，而且当有其它的肠道菌群存在时会影响大肠杆菌O157的检测，给检测技术人员带来极大的工作量与不确定性。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的大肠杆菌O157：H7检测方法，如PCR法、金标试纸法、免疫法、乳胶凝集试验和DNA探针技术等快速检验方法，已在不断得到扩大应用。然而由于这些方法需要较高的技术且仪器试、剂的成本较高，而且酶联免疫吸附法、乳胶凝集试验等会与大肠杆菌的多种血清型出现交叉反应。相比以显色培养基为基础的特异性显色生化鉴定技术在当前能更好地与传统方法相接轨，这种技术可以把检测、计数和初步鉴别一次完成，大幅度提高检测的速度和准确性，检测成本较低，因此其应用前景广阔。
目前国内已有的大肠杆菌O157显色培养基利用的原理为大肠杆菌O157：H7不发酵或在2天内不发酵山梨醇以及表达β-半乳糖苷酶，因此在含山梨醇的基础培养基中添加山梨醇及β-半乳糖苷酶的底物，这种显色培养基中大肠杆菌菌落显示发酵山梨醇的色泽，而大肠杆菌O157：H7仍呈现半乳糖苷酶的底物中显色基团的色泽。由于目前发现的大肠杆菌中存在也不发酵山梨醇，β-葡萄糖醛酸苷酶阳性，但O157：H7血清也不凝集的菌株，所以存在一定的假阳性。另一方面，肠杆菌中还存在像阪崎肠杆菌这一类的细菌，与大肠杆菌O157：H7一样不发酵山梨醇且β-半乳糖苷酶阳性，上述原理的显色培养基却不可以把这类菌与大肠杆菌O157：H7相区分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基。
本发明的所采用的技术方案为：
一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂12～20g、蛋白胨8～20g、牛肉浸粉3～7g、氯化钠4～7g、山梨醇10～20g、肌醇4～7g、中性红0.005～0.03g、β-半乳糖苷酶显色底物0.05～0.2g、β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物0.05～0.3g、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.05～0.15g、牛胆盐1～5g、亚碲酸钾1～5mg、头孢克肟0.01～0.06mg。
优选的，β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷。
优选的，β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷。
优选的，用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂 14g、蛋白胨10g、牛肉浸粉4g、氯化钠5g、山梨醇 15g、肌醇 5g、中性红0.01g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.1g、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷0.08g、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.1g、牛胆盐1.5g、亚碲酸钾2mg、头孢克肟0.04mg。
本发明在培养基中添加了山梨醇和中性红，除大肠杆菌O157：H7外的大肠菌群发酵山梨醇产酸，在pH指示剂中性红作用下显示出红色色泽，而大肠杆菌O157：H7不利用山梨醇而呈现无色菌落。
本发明在培养基中添加了β-半乳糖苷酶显色底物，大肠菌群在β-半乳糖苷酶作用下分解底物，游离出显色剂，使菌落呈现出显色剂的色泽。
本发明在培养基中添加了β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物，可以区分某些不发酵山梨醇的非O157：H7的大肠杆菌。非O157：H7大肠杆菌在β-葡萄糖醛酸苷酶作用下分解出显色剂，呈现出显色剂的色泽菌落，从而与大肠杆菌O157：H7相区分。
本发明中β-半乳糖苷酶显色底物和β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物是由糖苷类特定结合物和显色基团合成的，显色底物包括ONPG、PNPG、Salmon - Gal、X-Gal或BN-GAL、8HQ - Gal、CHE - Gal、Aliz - Gal和荧光底物MUGal等，由于本发明使用的是固体培养基，而在固体培养基中ONPG、PNPG或MUGal断裂后的显色终产物会产生大面积扩散，所以这类底物仅适用于液体培养基。本发明采用了5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-Gal）和5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷（Magenta- GlcA），这两种底物在固体培养基中检测β-半乳糖苷酶及β-葡萄糖醛酸苷酶的活性比其它显色或荧光底物更有效。
本发明在培养基中添加了山梨醇以外的碳水化合物，可以区分样品中的其它与大肠杆菌O157：H7相似的不发酵山梨醇，能分解β-半乳糖苷酶显色底物的肠道菌如阪崎肠杆菌，故可添加阪崎肠杆菌发酵而大肠杆菌O157：H7不发酵的碳水化合物——肌醇，鼠李糖，水杨素和纤维二糖，本发明优选肌醇。
本发明在培养基中添加了胆盐，可抑制样品中大部分的革兰氏阳性球菌。胆盐包括牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠和混合胆盐，本发明优选牛胆盐。
本发明在培养基中添加了抗生素亚碲酸钾和头孢克肟，可抑制样品中部分的革兰氏阴性杆菌如大肠菌群以及容易扩散生长的变型杆菌。
本发明的有益效果是：
本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌O157：H7，检测灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴别，检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可对食品和环境中大肠杆菌O157：H7进行全面、系统、准确的检测和初步鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
本发明的显色培养基能准确快速地从大肠菌群中鉴别出大肠杆菌O157：H7，本发明的显色培养基中添加了山梨醇和肌醇，特点为大肠杆菌O157：H7不利用而其它肠道菌利用的糖类，添加了β-半乳糖苷酶显色底物、β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物以显色反应来区分目标菌株，观察方便，还添加了胆盐和抗生素，能抑制部分的革兰氏阳性球菌和阴性杆菌及容易扩散生长的变型杆菌。
具体实施方式
一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂12～20g、蛋白胨8～20g、牛肉浸粉3～7g、氯化钠4～7g、山梨醇10～20g、肌醇4～7g、中性红0.005～0.03g、β-半乳糖苷酶显色底物0.05～0.2g、β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物0.05～0.3g、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.05～0.15g、牛胆盐1～5g、亚碲酸钾1～5mg、头孢克肟0.01～0.06mg。
优选的，β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷。
优选的，β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷。
优选的，一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂 14g、蛋白胨10g、牛肉浸粉4g、氯化钠5g、山梨醇 15g、肌醇 5g、中性红0.01g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.1g、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷0.08g、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.1g、牛胆盐1.5g、亚碲酸钾2mg、头孢克肟0.04mg。
本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌O157：H7的方法，包括如下步骤：
1) 制备显色平板：每1000mL去离子水中加入上述显色培养基除亚碲酸钾、头孢克肟外的原料，搅拌，加热煮沸至完全溶解，待冷至约50℃，加入过滤除菌的亚碲酸钾、头孢克肟，混匀，倒平板，备用；
2) 接种培养：将样品或含样品的增菌液接种到显色平板上，37℃培养22～26h；
3) 结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的蓝绿色或深蓝绿色的菌落，说明该样品存在大肠杆菌O157：H7，其它肠道菌或被抑制或为显示红色或显示紫红色的菌落。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷均购自Sigma公司。
实施例1
一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂 14g、蛋白胨10g、牛肉浸粉4g、氯化钠5g、山梨醇 15g、肌醇 5g、中性红0.01g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.1g、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷0.08g、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）0.1g、牛胆盐1.5g、亚碲酸钾2mg、头孢克肟0.04mg。
实施例2
一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂12g、蛋白胨12g、牛肉浸粉3g、氯化钠7g、山梨醇 15g、肌醇4g、中性红0.005g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.05g、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷0.3g、IPTG 0.05g、牛胆盐1g、亚碲酸钾3mg、头孢克肟0.01mg。
实施例3
一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂15g、蛋白胨20g、牛肉浸粉7g、氯化钠6g、山梨醇 20g、肌醇 7g、中性红0.03g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.2g、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷0.05g、IPTG 0.2g、牛胆盐5g、亚碲酸钾5mg、头孢克肟0.06mg。
实施例4
一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂20g、蛋白胨8g、牛肉浸粉5g、氯化钠4g、山梨醇 10g、肌醇 6g、中性红0.02g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.1g、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷0.1g、IPTG 0.15g、牛胆盐3g、亚碲酸钾1mg、头孢克肟0.03mg。
特异性试验：
将Escherichia coli O157:H7 NCTC12900，E.coli O157:H7 882364，E.coliO157:H7 ATCC 43895，E.coliO157:H7 ATCC 43888，E.coliATCC8739，E.coliCMCC(B)44102，E.coliCMCC(B)44103，E.coliATCC35218，E.coli8099，E.coli ATCC25922，E.coliCMCC(B)44113，Klebsiella pneumoniae广临检-57，Enterobacter sakazakii ATCC51329，Citrobacter freundii ATCC8090，E.aerogenes CMCC(B)45103，E.cloacae CMCC(B)45301，Salmonella arizona CMCC(B)47001，Proteus vulgaris CMCC(B)49027等18种标准菌株分别制成适当浓度的标准菌悬液（浓度为108～109cfu/ml），分别划线接种到用实施例1显色培养基制成的平板上，37℃培养18～24h。
特异性试验结果见表1，注：划线法生长情况用划线生长几个区代表生长的好坏：生长良好——4区，菌落大小正常；生长受抑制——1～3区，菌落偏小或生长少于4区。
由表1可知，4株E.coli O157:H7均显蓝绿色，为阳性菌，除E.coli O157:H7 ATCC 43895受到部分抑制外，其余3株菌均生长良好；对于非目标菌，E.coliATCC35218、E.coli8099、K.pneumoniae广临检-57和E.sakazakii ATCC51329受抑制较小，但颜色可以与目标菌E.coliO157:H7相区分，其余杂菌均受抑制。表明本发明的用于检测大肠杆菌O157:H7的显色培养基具有较高的特异性。
将上述18种标准菌株中的部分菌种及E.sakazakii ATCC29544、C.freundiiATCC43864、S.faecalis ATCC29212，S.aureus ATCC6538、Vibrio cholerae non O1等18种菌株分别制成适当浓度的标准菌悬液（浓度为106～108cfu/ml），分别划线接种到实施例1显色培养基（简称HKM）及对照厂家的显色培养基制成的平板上，37℃培养 24小时，观察显色效果。对照厂家的显色培养基有：梅里埃大肠杆菌O157显色培养基（简称梅里埃），科玛嘉大肠杆菌O157显色培养基（简称科玛嘉），山梨醇麦康凯琼脂(简称SMAC)，国内厂家O157显色培养基（简称国内厂家）。检测结果见表2。
上述培养基检测的特征性菌为大肠杆菌O157， HKM检测的特征性菌落色泽为蓝绿色，梅里埃检测的特征性菌落色泽为蓝绿色，科玛嘉检测的特征性菌落色泽为品红色，国内厂家检测的特征性菌落色泽为紫红色，SMAC检测的特征性菌落色泽为无色。
由表2可知，E.coli O157:H7在HKM、科玛嘉和SMAC平板上均显示阳性的特征性色泽，但在梅里埃和国内厂家的平板上，E.coliO157:H7 882364、ATCC43888和ATCC43895均不能显示阳性的特征性色泽；而且，其它非E.coli O157的菌，在HKM和科玛嘉平板（S.arizona除外）上均可以与E.coliO157相区分，但E.sakazakii、P.vulgaris、V.cholerae non O1、S.aureus和E.coli ATCC35218在SMAC上不可以与E.coli O157相区分；国内厂家以及梅里埃对其它非E.coliO157的菌显色效果相当，均存在部分假阳性菌，不能区分两株E.sakazakii和E.coli ATCC35218。表明本发明所述的大肠杆菌O157:H7显色培养基与科玛嘉平板在特异性显色方面均无明显差异，均优于SMAC、国内厂家及梅里埃产品。
灵敏度试验：
将上述的4种阳性标准菌株：E.coliO157:H7 NCTC12900，E.coliO157:H7 882364，E.coliO157:H7 ATCC43895，E.coliO157:H7 ATCC43888分别制成适当浓度的标准菌悬液（浓度为102～103cfu/ml），用螺旋接种法接种到用实施例1显色培养基（简称HKM），梅里埃大肠杆菌O157显色培养基（简称梅里埃），科玛嘉大肠杆菌O157显色培养基（简称科玛嘉），山梨醇麦康凯琼脂(简称SMAC)，营养琼脂培养基（简称营养琼脂）等5种培养基制成的平板上，37℃培养24 h，量取菌落直径和计算菌落总数。结果见表3。
由表3可知，在灵敏度检测方面，HKM、科玛嘉、营养琼脂的菌落数目相当，且均优于SMAC与梅里埃；在菌落大小方面，4株E.coliO157:H7在科玛嘉平板上均比较大，E.coliO157:H7 882364和E.coliO157:H7 ATCC43888在梅里埃平板上稍小，HKM与营养琼脂无明显差异，SMAC平板上显示的菌落最小。表明本发明所述的大肠杆菌O157:H7显色培养基与科玛嘉平板在检测灵敏度方面无明显差异，均优于SMAC及梅里埃产品。
人工污染样品中
E.coli
O157:H7的检测：
1. 菌种
将E.coliO157:H7 NCTC12900和E.coliO157:H7 ATCC43895等2种标准菌珠分别制成适当浓度的标准菌悬液（浓度为101～102cfu/ml），备用。
2. 增菌培养
将上述不同浓度的E.coliO157:H7悬液分别加入到250 mL的增菌液中，41℃培养18 h。 250 mL的增菌液的制备：取25 mL纯牛奶置于225 mL已灭菌的mEC肉汤中，混匀。
3. 接种培养
各取1环培养后的增菌液，划线接种不同显色培养基平板上，37℃培养22～26h，观察记录菌落颜色和形态。显色培养基有：实施例1显色培养基（简称HKM），梅里埃大肠杆菌O157显色培养基（简称梅里埃），科玛嘉大肠杆菌O157显色培养基（简称科玛嘉），国内厂家O157显色培养基（简称国内厂家）。检测结果见表4。
由表4可知，在纯牛奶中添加E.coliO157:H7 NCTC12900，四种显色培养基均能达到10cfu的检出限；在纯牛奶中添加E.coliO157:H7 ATCC 43895，在添加较高浓度的菌量（120cfu）情况下三种显色培养基均能检出，但在在添加较低浓度的菌量（15cfu）情况下，HKM与国内厂家和科玛嘉均能检出，而梅里埃不能检出，可能与E.coliO157:H7 ATCC 43895在梅里埃显色平板上的特征性不强有关。表明本发明用于检测E.coliO157：H7的显色培养基与科玛嘉平板对模拟样品的检测效果相当，且优于梅里埃产品。
实际样品中
E.coli
O157:H7的检测：
1. 采集样品
从市场和超市采集肉类样品共30份，猪肉17份，鸡肉8份，牛肉5份。
2. 增菌培养
各取25 g样品置于225 mL已灭菌的mEC肉汤中，41oC培养18 h，得含样品的增菌液。
3. 接种培养
各取1环含样品的增菌液，划线接种到用实施例1显色培养基制成的平板上，37℃培养22～26h，观察记录菌落颜色和形态。
4. 结果观察和分析
30份样品中，有3份检出E.coliO157:H7，同时使用GB 4789.6-2010和API20E生化鉴定系统检测比对样品，与显色培养基方法结果一致。两种方法检测结果均与预期结果一致。
综上所述，本发明所述的大肠杆菌O157显色培养基对目标菌E.coli O157:H7检测灵敏度较高，特异性强，综合检测效果可达到进口科玛嘉同类产品水平，优于国内已有显色培养基。
Claims (4)
1.一种用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，每1000mL培养基含有琼脂12～20g、蛋白胨8～20g、牛肉浸粉3～7g、氯化钠4～7g、山梨醇10～20g、肌醇4～7g、中性红0.005～0.03g、β-半乳糖苷酶显色底物0.05～0.2g、β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物0.05～0.3g、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.05～0.15g、牛胆盐1～5g、亚碲酸钾1～5mg、头孢克肟0.01～0.06mg。
2.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，其特征在于：β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷。
3.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，其特征在于：β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用于检测大肠杆菌O157：H7的显色培养基，其特征在于：每1000mL培养基含有琼脂 14g、蛋白胨10g、牛肉浸粉4g、氯化钠5g、山梨醇 15g、肌醇 5g、中性红0.01g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0.1g、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷0.08g、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.1g、牛胆盐1.5g、亚碲酸钾2mg、头孢克肟0.04mg。
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