CN104087652B - 一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和检测培养液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和检测培养液。该方法先提供一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液，过滤浓缩后加到检测培养液中培养，然后记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液的特征时间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和特征时间的线性方程；然后将待测水样过滤浓缩，加入到检测培养液培养，在其410nm吸光度有明显变化的前提下，记录待测水样特征时间，将其代入到线性方程中获得浓度值。本发明基于酶底物法的原理，以吸光度和荧光强度为标准，采用适合于大肠埃希氏菌的检测培养液，能够快速、准确地检测出水中大肠埃希氏菌的浓度，可实时监测水中微生物污染情况。

Description

一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和检测培养液

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和试剂盒。

背景技术

总大肠菌群(Total Coliform)、耐热大肠菌群(Thermotolerant Coliform)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)是指示水体中粪便污染的最重要的3个细菌学指标。这些菌属可以在人、畜粪便中检出，也可以在营养丰富的水体中检出，即在非粪便污染的情况下，也有检出这些细菌的可能性。耐热大肠菌群组成与总大肠菌群组成相同，但主要组成是埃希氏菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有1个种，即大肠埃希氏菌，而其他如柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属所占数量较少。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希氏菌检出的意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些。

目前，世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要环境卫生学指标，并对其提出了严格的限制。世界卫生组织《饮用水水质标准》(第二版)中规定，所有用于饮用的水中大肠埃希氏菌或耐热大肠菌在任意100mL水样中不得检出；现行美国饮用水水质标准国家一级饮用水标准规定总大肠菌群为0CFU/ml；中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》规定，总大肠菌群、耐热大肠菌群及大肠埃希氏菌每100mL水样中不得检出。

检测大肠埃希氏菌等的传统方法包括多管发酵法和滤膜法。多管发酵法适用于各种样品，但操作复杂，检测时间较长，滤膜法主要用于检测杂质较少的水样，操作比多管发酵法更为简单，但是不适合检测高浊度和其他复杂水样。这两种方法都具有检测周期长，程序繁琐的缺点，难以适应污染源快速诊断的需要。目前，国内外研究人员已经发展了一些新方法进行大肠埃希氏菌等的快速检测，主要包括酶底物法、聚合酶链反应技术(PCR)、免疫分析法、生物传感器法等。

其中酶底物法是已经纳入国标的标准检测方法，聚合酶链反应技术(PCR)、免疫分析法、生物传感器法等方法还不成熟。

与传统方法相比，国标酶底物法虽然将检测时间缩短至24h，但是仍然不能满足快速检测的需要。以酶底物法为原理开发出来的在线实时监测仪器价格昂贵，而且基本上都是以进口产品为主。

中国专利200910148688.7公开了快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法，该方法以酶底物法为检测原理，首先选择培养液显色底物，连续测定不同稀释度粪大肠菌群或大肠菌群的生长曲线，通过生长曲线设定显色底物特征值，然后测定不同稀释度粪大肠菌群或大肠菌群显色达到特征值所需时间，并建立初始浓度与达到特征值所需时间之间的线性关系，根据此曲线确定未知样品的菌浓度。但是，该方法检测对象是大肠菌群，其检测方法并不适合用来检测大肠埃希氏菌，同时最为关键的显色培养基并未公开，而这些都是影响检测准确度和检测时间的重要因素。此外，现有以酶底物法为原理的检测方法都存在取样量过少的问题，一般只能取到55.5-100mL，而取样量多少可以影响检测结果的不确定性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，使得该方法能够快速检测出水中大肠埃希氏菌；

本发明的另一个目的在于提供一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，使得该方法能够增加待检测样本取样量；

本发明的另一个目的在于提供一种检测水中大肠埃希氏菌的检测培养液，使其能够促使大肠埃希氏菌快速繁殖，缩短检测时间。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，包括如下步骤：

步骤1、提供一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液，浓缩，分别加入到检测培养液中培养，然后记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液的特征时间，所述特征时间为各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和特征时间的线性方程；

步骤2、将待测水样浓缩，加入步骤1所述检测培养液培养，在其410nm吸光度有明显变化的前提下，记录待测水样特征时间，将其代入到步骤1中的线性方程中获得待测水样中大肠埃希氏菌的浓度；

其中，所述检测培养液包括Tryptone、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、亚硫酸钠、吐温-80、NaH₂PO₄·H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、3号胆盐。

在本发明检测方法中，只有吸光度有明显变化且荧光强度达到所设定的阈值240，才可认定为存在大肠埃希氏菌，然后通过荧光强度定量检测出水样的大肠埃希氏菌浓度。如果只有吸光度有明显变化，而荧光强度超过10h未达到阈值240，或者只有荧光强度在10h内达到阈值240，但吸光度未有明显变化，则不能认定待测水样中存在大肠埃希氏菌。双标准的选择极大地增加了检测的准确性，杜绝了其他影响因素的干扰。

本发明为了确保检测时间控制在10h以内，达到缩短检测时间的目的，以1MPN/100mL的极低浓度水样在本发明所述检测培养液中培养10h左右达到的荧光强度240为荧光强度阈值。为了达到前述目的，本发明在付出了创造性的劳动后，确立了优化后的检测培养液组成。

作为优选，所述检测培养液包括：

Tryptone10.0g/L、硫酸镁50-100mg/L、硫酸锰0.5-1mg/L、硫酸锌0.5-1mg/L、硫酸铵5.0-10.0g/L、氯化钠10.0g/L、氯化钙50-100mg/L、亚硫酸钠40-100mg/L、吐温-800.5-2g/L、NaH₂PO₄·H₂O6.10g/L、K₂HPO₄·3H₂O2.75g/L、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷250mg/L、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷35mg/L、3号胆盐1.0-3.0g/L。

针对现有技术取样量过少的缺陷，本发明在检测前均对水样进行过滤浓缩处理，以此达到增加取样量的目的。作为优选，所述过滤浓缩采用0.45μm，47mm醋酸纤维素滤膜过滤浓缩。按照本发明优选方案可增加取样量到10L，最大程度避免了大肠埃希氏菌在水样中不均一性带来的检测误差。

采用本发明的检测培养液可以在10h内促使大肠埃希氏菌达到可检测的浓度，缩短了检测时间，因此本发明还提供了一种检测水中大肠埃希氏菌的检测培养液，包括：

Tryptone、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、亚硫酸钠、吐温-80、NaH₂PO₄·H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、3号胆盐。

作为优选，所述检测培养液包括：

Tryptone10.0g/L、硫酸镁50-100mg/L、硫酸锰0.5-1mg/L、硫酸锌0.5-1mg/L、硫酸铵5.0-10.0g/L、氯化钠10.0g/L、氯化钙50-100mg/L、亚硫酸钠40-100mg/L、吐温-800.5-2g/L、NaH₂PO₄·H₂O6.10g/L、K₂HPO₄·3H₂O2.75g/L、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷250mg/L、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷35mg/L、3号胆盐1.0-3.0g/L。

按照本发明所述方法进行水中大肠埃希氏菌的检测，比国标酶底物法缩短了14h左右，同时和检测大肠菌群的专利200910148688.7的检测时间相比，本发明检测时间减少了1h-1.5h，特别是在低浓度水样的检测中，检测时间更短。

由以上技术方案可知，本发明基于酶底物法的原理，以吸光度和荧光强度为标准，采用适合于大肠埃希氏菌的检测培养液，能够快速、准确地检测出水中大肠埃希氏菌的浓度，可实时监测水中微生物污染情况。

附图说明

图1所示为空白培养液吸光度变化的折线图；

图2所示为空白培养液荧光强度变化的折线图；

图3所示为初始浓度为1MPN/100mL大肠埃希氏菌培养液吸光度变化的折线图；

图4所示为初始浓度为1MPN/100mL大肠埃希氏菌培养液荧光强度变化的折线图；

图5所示为实施例1中不同浓度大肠埃希氏菌菌悬液建立的线性曲线；

图6所示为实施例2中不同浓度大肠埃希氏菌菌悬液建立的线性曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和培养液，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

依照本发明所述方法，在确立荧光强度阈值时，以空白检测培养液为对照，其吸光度一直维持在0.1左右，而荧光强度一直维持在150左右，见图1和图2。在采用1MPN/100mL的极低浓度水样确立荧光强度阈值时，在10h内吸光度有明显变化时，记录此时间段水样的荧光强度值为阈值。

所述吸光强度明显变化，是指吸光强度大于或者等于0.2，本发明优选0.3左右。分光光度计吸光强度最佳检测范围为0.1-0.8，其中空白培养液的吸光强度接近0.1，若培养液的吸光强度达到或者大于0.2，可认为吸光强度有明显变化。故本发明确立240为本发明荧光强度阈值(见图3和图4)。如非特殊说明，本发明所述吸光度为410nm处吸光度，而荧光强度为365nm激发光下产生的450nm荧光强度。

以下就本发明所提供的一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和培养液做进一步说明。

实施例1：本发明所述方法

检测培养液：Tryptone10.0g、硫酸镁50mg、硫酸锰0.5mg、硫酸锌0.5mg、硫酸铵5.0g、氯化钠10.0g、氯化钙50mg、亚硫酸钠40mg、吐温-802g、NaH₂PO₄·H₂O6.10g、K₂HPO₄·3H₂O2.75g、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷250mg、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷35mg、3号胆盐3.0g。

无菌水稀释制备一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液(5.2、52、5.2×10²、5.2×10³、5.2×10⁴、5.2×10⁵、5.2×10⁶、5.2×10⁷MPN/100mL)各100mL，先经膜孔径为0.45μm、膜直径为47mm醋酸纤维素滤膜过滤浓缩，将滤膜加入到检测培养液中培养，培养温度为37℃，培养期间连续检测培养液在365nm激发光下产生的450nm荧光强度，记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时间，表示为特征时间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和特征时间的线性方程，线性方程为Y＝-1.80391X+18.30408(R²＝0.99899)，对应的线性曲线见图5。

取待测水样10L，先经膜孔径为0.45μm、膜直径为47mm醋酸纤维素滤膜过滤浓缩，将滤膜加入到检测培养液中培养，培养温度为37℃，培养期间连续检测培养液在410nm处吸光度以及365nm激发光下产生的450nm荧光强度，在吸光度有明显变化的前提下，记录待测水样在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时间，表示为特征时间，将其代入到上述线性方程中获得待测水样的大肠埃希氏菌的浓度值为17.1MPN/100mL。

同时，将来源相同的待测水样按照国标酶底物法检测，结果为16.3MPN/100mL，其和本发明检测结果接近，没有明显差异，表明本发明所述方法的检测准确性较高。

实施例2：本发明所述方法

检测培养液：Tryptone10.0g、硫酸镁100mg、硫酸锰1mg、硫酸锌1mg、硫酸铵10.0g、氯化钠10.0g、氯化钙100mg、亚硫酸钠100mg、吐温-800.5g、NaH₂PO₄·H₂O6.10g、K₂HPO₄·3H₂O2.75g、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷250mg、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷35mg、3号胆盐1.0g。

无菌水稀释制备一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液(6.3、63、6.3×10²、6.3×10³、6.3×10⁴、6.3×10⁵、6.3×10⁶、6.3×10⁷MPN/100mL)各100mL，先经膜孔径为0.45μm、膜直径为47mm醋酸纤维素滤膜过滤浓缩，将滤膜加入到检测培养液中培养，培养温度为37℃，培养期间连续检测培养液在365nm激发光下产生的450nm荧光强度，记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时间，表示为特征时间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和特征时间的线性方程，线性方程为Y＝-1.78068X+18.09218(R²＝0.99851)，对应的线性曲线见图6。

取待测水样10L，先经膜孔径为0.45μm、膜直径为47mm醋酸纤维素滤膜过滤浓缩，将滤膜加入到检测培养液中培养，培养温度为37℃，培养期间连续检测培养液在410nm处吸光度以及365nm激发光下产生的450nm荧光强度，在吸光度有明显变化的前提下，记录待测水样在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时间，表示为特征时间，将其代入到上述线性方程中获得待测水样的大肠埃希氏菌的浓度值为15.3MPN/100mL。

同时，将来源相同的待测水样按照国标酶底物法检测，结果为16.8MPN/100mL，其和本发明检测结果接近，没有明显差异，表明本发明所述方法的检测准确性较高。

实施例3：检测时间的对比

无菌水稀释制备一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液各100mL，先经膜孔径为0.45μm、膜直径为47mm醋酸纤维素滤膜过滤浓缩，将滤膜加入到检测培养液中培养，培养温度为37℃，培养期间连续检测培养液在365nm激发光下产生的450nm荧光强度，记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时间。

同时，根据专利200910148688.7的线性曲线和线性方程，将本实施例配制的不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液代入其中，计算获得该专利方法所要花费的检测时间，结果见表1。

表1不同浓度样品检测时间

样品序号	浓度(MPN/100ml)	本发明检测时间h	现有专利检测时间h
				1	1.0	9.95	11.48
2	2.0	9.60	11.06
				3	3.1	9.37	10.8
4	7.5	8.92	10.26
				5	8.5	8.86	10.2
6	8.6	8.85	9.77
				7	17.1	8.50	9.76
8	17.3	8.49	9.77
				9	36.4	8.11	9.32
10	75	7.74	8.88
				11	148	7.39	8.48

由表1可知，和专利200910148688.7的检测时间相比，本发明检测时间减少了1h-1.5h。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、提供一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液，过滤浓缩，分别加入到检测培养液中培养，然后记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液的特征时间，所述特征时间为各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和特征时间的线性方程；

步骤2、将待测水样过滤浓缩，加入步骤1所述检测培养液培养，在其410nm吸光度有明显变化的前提下，记录待测水样特征时间，将其代入到步骤1中的线性方程中获得待测水样中大肠埃希氏菌的浓度；

其中，所述检测培养液包括Tryptone、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、亚硫酸钠、吐温-80、NaH₂PO₄·H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、3号胆盐。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测培养液包括：

Tryptone10.0g/L、硫酸镁50-100mg/L、硫酸锰0.5-1mg/L、硫酸锌0.5-1mg/L、硫酸铵5.0-10.0g/L、氯化钠10.0g/L、氯化钙50-100mg/L、亚硫酸钠40-100mg/L、吐温-800.5-2g/L、NaH₂PO₄·H₂O6.10g/L、K₂HPO₄·3H₂O2.75g/L、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷250mg/L、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷35mg/L、3号胆盐1.0-3.0g/L。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述过滤浓缩采用膜孔径为0.45μm、膜直径为47mm醋酸纤维素滤膜过滤浓缩。

4.一种检测水中大肠埃希氏菌的检测培养液，其特征在于，包括：

Tryptone、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、亚硫酸钠、吐温-80、NaH₂PO₄·H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、3号胆盐。

5.根据权利要求4所述检测培养液，其特征在于，包括：

Tryptone10.0g/L、硫酸镁50-100mg/L、硫酸锰0.5-1mg/L、硫酸锌0.5-1mg/L、硫酸铵5.0-10.0g/L、氯化钠10.0g/L、氯化钙50-100mg/L、亚硫酸钠40-100mg/L、吐温-800.5-2g/L、NaH₂PO₄·H₂O6.10g/L、K₂HPO₄·3H₂O2.75g/L、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷250mg/L、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷35mg/L、3号胆盐1.0-3.0g/L。