CN103760122A - 一种大肠杆菌的紫外可见分光光度检测法 - Google Patents

Abstract

一种大肠杆菌的紫外可见分光光度检测法，包括以下步骤：(1)配置大肠杆菌显色培养基，对大肠杆菌进行培养；(2)微生物代谢将显色底物进行氧化生成有色物质；(3)对有色物质进行紫外可见分光光度法检测。本发明提供的大肠杆菌紫外可见分光光度检测方法，能够在一定范围内能够对大肠杆菌进行定量检测，适用于快速检测，检测方法方便、快捷、实用。

Description

一种大肠杆菌的紫外可见分光光度检测法

 

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体为一种大肠杆菌的紫外可见分光光度检测法。

背景技术

特定微生物可在特异性培养基上生长，并且微生物在代谢过程中呼吸链中的细胞色素c在氧化还原过程中可以将显色底物氧化生成有色物质，此过程可通过光学检测系统检测，并且显色与否和显色的程度与特定微生物的有无及浓度存在定量关系，此过程中的颜色变化可通过分光光度法检测。因此可实现特定微生物的快速定量检测。

其中分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。具体如下：将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量分析。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们都以Beer-Lambert定律为基础。当一束强度为I ₀的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的吸光度A为: 

　　A=abc 

式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/L)， a为吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。 

由上式可知，当固定溶液层厚度b和吸光系数a时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长 ，然后以此波长 的光为光源，测定一系列已知浓度c溶液的吸光度A，作出A-c工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A和预先测量得到的工作曲线即可确定出待测物浓度。

选择性培养基可以允许特定微生物生长，同时抑制其他微生物的生长。这种选择性可以通过几种方式获得。例如，某种微生物可以以培养基中所含特定糖类物质作为唯一的碳源，从而抑制其他不能利用该特定糖类物质做为碳源的微生物的生长。同样，某些微生物可以被培养基中所含可影响微生物新陈代谢或酶系统的特定染料，抗生素，盐类或特殊抑制剂所选择性抑制。例如，培养基中包含0.1-0.5g/L的亚碲酸钾，叠氮化钠或乙酸铊可以抑制所有革兰氏阴性细菌的生长。而亚碲酸盐琼脂可用来筛选革兰氏阳性细菌，含有抗生素盘尼西林的培养基可用来筛选革兰氏阴性细菌。因而，在检测过程中采用适当的选择性培养基可以特异性筛选出待测微生物并同时抑制其他微生物的生长。目前发展有大肠杆菌／大肠菌群、沙门氏菌、李斯特菌／单核增生李斯特菌、大肠杆菌0157、阪崎肠杆菌等显色培养基，并且这些培养技术得到了ISO、WHO、AOAC、FDA等国际或官方组织得认可和采纳。

大肠杆菌又称大肠埃希氏菌(E. coli)，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种大肠杆菌的紫外可见分光光度检测法，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明提供如下技术方案：

一种大肠杆菌的紫外可见分光光度检测法，包括以下步骤：

(1) 配置大肠杆菌显色培养基，对大肠杆菌进行培养； 

(2) 微生物代谢将显色底物进行氧化生成有色物质； 

(3) 对有色物质进行紫外可见分光光度法检测。

步骤(1)中，所述大肠杆菌显色培养液包括营养物质和显色剂，显色培养液的pH 值为6.8±0.2。

综上所述，本发明有益效果：

本发明提供的大肠杆菌紫外可见分光光度检测方法，能够在一定范围内能够对大肠杆菌进行定量检测，适用于快速检测，检测方法方便、快捷、实用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种大肠杆菌的紫外可见分光光度检测法，包括以下步骤：

(1)称取待检测物品40.0g 加入1000ml蒸馏水，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过1分钟，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，冷却至45-50℃时，倾入无菌培养试管，在37℃的培养箱中放置1-2小时，以无菌试管吸取1ml匀液加入大肠杆菌显色培养液中，在36±1℃对大肠杆菌进行培养6～12h，

其中待检测物品需要进行前处理，包括以下步骤:

1）固体和半固体样品

称取25g样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液；

2）液体样品

以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液；

(2) 将培养完成后的样品进行离心处理，取上清液待测；

(3) 将标样管从冰箱取出，置于室温平衡温度，待温度达到室温（约15min），打开标样瓶，将标样放于100ml无菌水中，充分混匀待用；按步骤(1)中的操作，分别配置一系列不同浓度的大肠杆菌标液,见表1、表2

表1

浓度(cfu/ml)	0	10	50	100
					6h吸光度	0	0.002	0.008	0.026

                        表2 

浓度(cfu/ml)	0	100	1000	10000
					6h吸光度	0	0.026	0.084	0.126

本发明提供的大肠杆菌紫外可见分光光度检测方法，能够在一定范围内能够对大肠杆菌进行定量检测，适用于快速检测，检测方法方便、快捷、实用。

实施例2

面包中大肠杆菌的检测。

称取25g面包样品，放入盛有225ml生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，制成1:10的样品匀液。以无菌试管吸取1ml匀液加入大肠杆菌显色培养液中，36±1℃培养6h。培养完成后，离心处理，取上清液进行检测，获得其吸光度，数值为0，结果为未检出。

实施例3

牛奶中大肠杆菌的检测。

以无菌吸管吸取25ml某品牌巴氏消毒奶，置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内放置4颗无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。以无菌试管吸取1ml匀液加入大肠杆菌显色培养液中，36±1℃培养64h。培养完成后，离心处理，取上清液进行检测，获得其吸光度，数值为0.009，结果为55cfu/ml。同时采用平皿计数法对此牛奶大肠杆菌进行检测，结果为59cfu/ml。证明次方法准确、可靠。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。 

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (1)

1.一种大肠杆菌的紫外可见分光光度检测法，其特征是，包括以下步骤：

(1) 配置大肠杆菌显色培养基，对大肠杆菌进行培养； 

(2) 微生物代谢将显色底物进行氧化生成有色物质； 

(3) 对有色物质进行紫外可见分光光度法检测。