CN103267748A - 用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法 - Google Patents
用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，其步骤包括：A、铜绿微囊藻的培养；B、铜绿微囊藻叶绿素荧光参数的确定，使用荧光光谱仪进行叶绿素荧光参数的测定；C、稀释至不同浓度的铜绿微囊藻与其光密度关系测定；D、铜绿微囊藻浓度-叶绿素荧光曲线的建立；E、用于测定莠去津生物毒性铜绿微囊藻藻液的获取，用经过高压灭菌的蒸馏水稀释生长至对数期的铜绿微囊藻，使其在680nm处的OD值为0.3-0.5，该稀释后的藻液即可用于莠去津生物毒性测定。利用本发明制备的藻液能够简便、快速的测定莠去津的生物毒性，成本低廉，绿色环保。
Description
技术领域
本发明涉及水环境污染物生物毒性检测技术领域，尤其是一种可用于快速测定莠去津生物毒性的藻液的制备方法。
背景技术
莠去津(atrazine，阿特拉津)是一种化学除草剂，化学名称为2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基-1,3,5-三嗪，1952年由Geigy化学公司开发，1958年申请瑞士专利，1958年申请了瑞士专利,1959年正式投入生产。由于成本低、除草效果好而很快得到广泛应用。莠去津是选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，适用于玉米、高粱、果园和林地等，可防除1年生禾本科杂草和阔叶杂草，对某些多年生杂草也有一定的抑制作用。但莠去津极性大，易溶解于水，很容易进入地下水层，对地下水资源具有潜在的威胁。一些欧共体国家已经禁止其使用，而在使用量最大的美国，EPA也已经将其列入控制使用类农药。近年来又发现莠去津有内分泌干扰作用，目前已认定属于内分泌干扰剂物质。我国生产和使用莠去津的历史较短，但已有较大的污染事故发生，应引起足够的重视。莠去津在土壤中不易降解，土壤中残留的莠去津还具有淋溶性，易被雨水、灌溉水淋溶至较深土层，或是随地表径流进入河流、湖泊，对地下水和地表水造成污染。
莠去津造成的水污染情况日益严重，对莠去津的检测手段主要集中在HPLC高效液相色谱法和气相色谱法，但这两种方法只能测定莠去津的含量，用浓度表示出来，不能直观反映其在生物体上的毒性表现。现在生物监测方法发展较快，因为其能直接反映污染物对生物体生理特征的影响变化，直接反应污染物的毒性。目前发光细菌法是比较成熟的生物毒性检测方法，莠去津对发光细菌的毒性作用通过发光细菌的发光强度的变化来反映，从而确定莠去津毒性，但是发光细菌法也存在发光细菌不稳定和方法成本高等问题。藻类由于生长周期短，对毒物敏感，也被广泛用于该方面的研究。铜绿微囊藻属蓝藻，在水环境中非常常见，在实验室易培养，生长周期短，荧光信号稳定，可用来检测莠去津生物毒性。利用分光光度计和荧光仪测定不同浓度的铜绿微囊藻，建立不同浓度藻液的光密度与叶绿素荧光强度的关系曲线，确定藻液特征参数，制备用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，利用该藻液能够简便、快速的测定莠去津的生物毒性，成本低廉，绿色环保。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，其步骤包括：
A、铜绿微囊藻的培养：取铜绿微囊藻藻种，配制BG-11培养基,然后将培养基灭菌、冷却，于无菌条件下进行藻种接种；接种完成，置于恒温光照培养箱中培养；将生长至对数期的藻按比例转接到灭菌培养基中，如此反复转接，使藻种达到同步生长；
B、铜绿微囊藻叶绿素荧光参数的确定：使用荧光光谱仪进行叶绿素荧光参数的测定；对铜绿微囊藻进行波长扫描，确定铜绿微囊藻叶绿素荧光的最佳激发波长Ex／发射波长Em为435nm／680nm；
C、稀释至不同浓度的铜绿微囊藻与其光密度关系测定：用灭菌的蒸馏水对生长至对数期的铜绿微囊藻进行稀释，稀释成一系列不同浓度，用铜绿微囊藻所占百分数表示；然后使用可见分光光度计，测定稀释至不同浓度的铜绿微囊藻在680nm处的光密度OD值，绘制藻液浓度与光密度的关系曲线，同时计算其回归方程；
D、铜绿微囊藻浓度-叶绿素荧光曲线的建立：使用荧光光谱仪在435nm／680nm波长下测定稀释至不同浓度的铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度，绘制铜绿微囊藻藻液浓度对应的光密度与叶绿素荧光强度的关系曲线，其中光密度在0～0.74范围内光密度与叶绿素荧光强度呈线性正相关关系，计算其回归方程；
E、用于测定莠去津生物毒性铜绿微囊藻藻液的获取：根据步骤D建立的铜绿微囊藻藻液光密度和叶绿素荧光强度的关系曲线，选定OD值为0.3-0.5的铜绿微囊藻藻液浓度作为检测莠去津生物毒性的藻的浓度；用经过高压灭菌的蒸馏水稀释生长至对数期的铜绿微囊藻，使其在680nm处的OD值为0.3-0.5，该稀释后的藻液即可用于莠去津生物毒性测定。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中BG-11培养基放入灭菌锅于121℃下灭菌30min，取出后放入超净台冷却。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中藻种在恒温光照培养箱中的培养条件是：光照度为2000-2500lux，温度为25±1℃，湿度为75%RH，光暗周期为12h:12h，静置培养，每日摇瓶2-3次，每次随机调换三角瓶的位置，以免引起光照不均。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B和步骤D中使用F-7000荧光光谱仪进行叶绿素荧光参数的测定；F-7000荧光光谱仪工作参数：狭缝为5nm，扫描速度2400nm／min，激发波长400nm～500nm，发射波长600nm～700nm，步长5nm，电压700V，1cm的标准四通石英比色皿。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中使用722型可见分光光度计测定铜绿微囊藻的光密度OD值来确定藻液浓度。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤E中，用经过高压灭菌的蒸馏水稀释生长至对数期的铜绿微囊藻，使其在680nm处的OD值为0.4，该稀释后的藻液即可用于莠去津生物毒性测定。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：用本发明制备的铜绿微囊藻叶绿素荧光方法与发光细菌法测定莠去津的生物毒性，两方法结果对比见下表：
两种方法对实际样品进行检测，经t检验求得|t|=0.279，给定α=0.05，由t界值表查得t0.05(2)=4.303，|t|=0.279﹤4.303=t0.05(2)，P﹥0.05，说明用该制备方法制取的铜绿微囊藻进行叶绿素荧光检测与发光细菌法检测结果无显著性差异，且两种方法测定的结果比值相近。
综上，使用用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻的制备方法制取的铜绿微囊藻进行莠去津毒性检测简单可行，检测结果与发光细菌法无显著性差异。
附图说明
图1是实施例1步骤1.2中铜绿微囊藻在435nm处的荧光发射光谱，图中显示铜绿微囊藻在680nm处有一峰，对应荧光强度最大；在660nm前有一个相对平缓的峰，对应的是铜绿微囊藻的藻蓝蛋白。最终确定铜绿微囊藻叶绿素荧光的最佳Ex/Em为435nm/680nm。
图2是实施例1步骤1.3中稀释至不同浓度的铜绿微囊藻与其在680nm处的光密度（OD值）的关系曲线，图中横坐标为稀释后的藻液浓度，用藻液所占百分数表示，纵坐标是铜绿微囊藻在680nm处的OD值；图中给出铜绿微囊藻浓度与其在680nm处的OD值的相关关系，线性关系良好，回归曲线为y=1.1875x+0.0249，相关系数r=0.9994；其中，y为其OD值，x为铜绿微囊藻所占百分数（%）。
图3是实施例1步骤1.4中铜绿微囊藻藻对应的光密度与叶绿素荧光强度的关系，图中，铜绿微囊藻680nm处的OD值在0～0.74范围内，OD值与叶绿素荧光强度有良好的线性关系，回归方程为y=9.8148x+0.5942，相关系数r=0.9889，y为其荧光强度值，x为稀释不同浓度的铜绿微囊藻的OD值。
图4显示实施例步骤1.6中“莠去津对铜绿微囊藻叶绿素荧光的影响随时间的变化”，可见莠去津溶液对铜绿微囊藻的光合信号抑制作用随时间不同,0-10min内叶绿素荧光强度随时间而明显增大，说明在此时间内，莠去津对铜绿微囊藻产生影响，抑制了藻的光合作用使其叶绿素荧光强度迅速增大；10-20min内叶绿素荧光强度变化趋于平稳，信号稳定，铜绿微囊藻已经适应了莠去津的毒性；实施例1中选15min作为铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的响应时间。
图5显示实施例步骤1.7中“莠去津浓度与光合作用抑制率的剂量-效应关系”，由图5可知，藻光合作用的受到不同程度的抑制，且抑制程度与莠去津的浓度呈正相关，显示明显的浓度-剂量相关性，半数抑制浓度(IC50)为0.030mg/L；在浓度为0.002-0.064mg/L内，光合抑制率与莠去津浓度成明显的线性关系，计算得回归方程为y=0.034+15.466x，r=0.9953；该曲线作为铜绿微囊藻叶绿素荧光法定量测定莠去津生物毒性的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。其中，供试藻铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa可以从中国科学院武汉水生生物研究所购买。
实施例1
1.1铜绿微囊藻的培养
铜绿微囊藻属蓝藻门类，采用BG-11培养基，按比例配制100mL培养基,然后将培养基放入灭菌锅于121℃下灭菌30min。取出后放入超净台冷却，于无菌条件下进行藻种接种。接种完成，置于恒温光照培养箱中培养。培养条件是：光照度为2000-2500lux，温度为25±1℃，湿度为75%RH，光暗周期为12h：12h，静置培养。每日摇瓶2-3次，每次随机调换三角瓶的位置，以免引起光照不均。将生长至对数期的藻按比例转接到灭菌培养基中，如此反复转接3次以上，使其达到同步生长。
1.2铜绿微囊藻叶绿素荧光参数的确定
使用F-7000荧光光谱仪进行叶绿素荧光参数的测定。对铜绿微囊藻进行波长扫描，比较藻的荧光光谱图（图1），确定铜绿微囊藻叶绿素荧光的最佳激发波长（Ex）/发射波长(Em)为435nm/680nm。F-7000荧光光谱仪工作参数：狭缝为5nm，扫描速度2400nm/min，激发波长400nm～500nm，发射波长600nm～700nm，步长5nm，电压700V，1cm的标准四通石英比色皿。
1.3稀释至不同浓度的铜绿微囊藻与其光密度关系测定
用灭菌的蒸馏水对生长至对数期的铜绿微囊藻进行稀释，稀释成一系列不同浓度，用铜绿微囊藻所占百分数（%）表示。然后，使用722型可见分光光度计，测定稀释至不同浓度的铜绿微囊藻在680nm处的光密度（OD值），绘制藻液浓度与光密度的关系曲线（图2），同时计算其回归方程y=1.1875x+0.0249，相关系数r=0.9994，其中y为其OD值，x为铜绿微囊藻所占百分数（%）。
1.4铜绿微囊藻浓度-叶绿素荧光曲线的建立
使用F-7000荧光光谱仪进行在435nm/680nm波长下测定稀释至不同浓度的铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度，绘制铜绿微囊藻藻液浓度对应的光密度与叶绿素荧光强度的关系曲线（图3）。其中光密度0～0.74范围内光密度与叶绿素荧光强度呈正相关关系，计算其回归方程y=9.8148x+0.5942，相关系数r=0.9889，y为其荧光强度值，x为稀释不同浓度的铜绿微囊藻的OD值。
1.5用于测定莠去津生物毒性铜绿微囊藻藻液的获取
根据建立的铜绿微囊藻藻液光密度和叶绿素荧光强度的关系曲线，选定OD值为0.4的铜绿微囊藻藻液浓度作为检测莠去津生物毒性的藻的浓度。用经过高压灭菌的蒸馏水稀释生长至对数期的铜绿微囊藻，使其在680nm处的OD值为0.4，该稀释后的藻液即可进行莠去津生物毒性测定。
1.6铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的响应时间的确定
莠去津样品的前处理：38%莠去津悬乳剂，由山东乐邦化学品有限公司生产。有效含量38%,取0.2g的莠去津悬乳剂用灭菌的蒸馏水溶解定容至100mL,制得2000mg/L的莠去津母液，置于冰箱4℃保存。实验前对莠去津母液进行稀释，使其含莠去津的有效浓度为0.2、0.8、1.6、3.2、4.8、6.4mg/L，与藻液混合后，终浓度为0.002、0.008、0.016、0.032、0.048、0.064mg/L。
取一定浓度的莠去津溶液1mL加入到铜绿微囊藻制备液中，定容至100mL，震荡使其充分混合，每3min取一次藻液至10mm光程的荧光比色皿中，放入F-7000荧光光谱仪中测定铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度（仪器工作参数：狭缝为5nm，扫描速度2400nm/min，激发波长Ex=435nm，发射波长Em=680nm，步长5nm，电压700V），绘制铜绿微囊藻叶绿素荧光强度随时间变化的关系曲线，确定铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的最佳响应时间。
如附图4所示，莠去津溶液对铜绿微囊藻的光合信号抑制作用随时间不同,0-10min内叶绿素荧光强度随时间而明显增大，说明在此时间内，莠去津对铜绿微囊藻产生影响，抑制了藻的光合作用使其叶绿素荧光强度迅速增大；10-20min内叶绿素荧光强度变化趋于平稳，信号稳定，铜绿微囊藻已经适应了莠去津的毒性。本实验选15min作为铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的响应时间。
1.7利用铜绿微囊藻叶绿素荧光测定莠去津生物毒性的标准曲线的绘制
取100μL系列浓度的莠去津标准液加入到铜绿微囊藻制备液中定容至10mL，使其充分混合15min后，用F-7000荧光光谱仪测定铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度。每一浓度设置三个平行样。用灭菌的蒸馏水替代样品设置一组空白样。按公式1计算光合抑制率，
式中：yi——空白叶绿素荧光强度；y0——样品叶绿素荧光强度。
由图5可知，铜绿微囊藻的光合作用受到不同程度的抑制，且抑制程度与莠去津的浓度呈正相关，显示明显的浓度-剂量相关性，半数抑制浓度(IC50)为0.030mg/L。在浓度为0.002-0.064mg/L内，铜绿微囊藻光合抑制率与莠去津浓度成明显的线性关系，计算得回归方程为y=0.034+15.466x，r=0.9953。该曲线作为铜绿微囊藻叶绿素荧光法定量测定莠去津生物毒性的标准曲线。
1.8验证
1.8.1发光细菌方法的验证
按照《水质急性毒性的测定发光细菌法》的方法，用Eclox生物毒性快速检测仪进行发光细菌发光强度的测定。将复苏后的发光细菌加入到不同浓度的莠去津溶液中测定发光细菌发光强度的变化，每一浓度设置三个平行样。用等量的2%氯化钠溶液替代莠去津溶液设置一组空白样。按公式2计算发光细菌的发光抑制率，实验结果见表1。
式中：Fi——空白发光强度；F0——样品发光强度。
表1不同浓度莠去津的铜绿微囊藻叶绿素荧光法与发光细菌法测定
Table1Determination of different concentrations of atrazine inphotobacteria method and fluorescence method
由表1知，莠去津浓度与发光抑制率正相关，回归方程y=0.024+10.883x，相关系数为r=0.9962。经t检验求得|t|=0.895，给定α=0.05，由t界值表查得t0.05(5)=2.57，|t|=0.895﹤2.57=t0.05(5)，P﹥0.05，说明叶绿素荧光法与发光细菌法测定莠去津毒性结果无显著性差异，证明可以用铜绿微囊藻叶绿素荧光检测方法替代发光细菌法测定农药莠去津的生物毒性。发光细菌法测定莠去津的半抑制浓度(IC50)为0.046mg/L，测定的浓度范围大于铜绿微囊藻叶绿素荧光方法。
1.8.2实际样品的铜绿微囊藻叶绿素荧光方法与发光细菌法的测定结果的对比
取某农场莠去津喷雾器清洗废水样品3个，分别用铜绿微囊藻叶绿素荧光法和标准发光细菌法测定他们的生物毒性。实际样品的叶绿素荧光方法测定步骤：
取100μL的样品至制备得的铜绿微囊藻中，定容至10mL，震荡使其充分混合15min，然后用F-7000荧光光谱仪进行测定叶绿素荧光强度，记录数据。设置三个平行样。用等量的灭菌蒸馏水替代样品设置一组空白样。利用公式1计算光合抑制率，三个平行样求平均，见表2。再将计算所得的光合抑制率带入上述的标准曲线，求得莠去津的浓度，见表3。
表2铜绿微囊藻叶绿素荧光法与发光细菌法测定实际样品结果比较
Table2A comparison of measurement results in photobacteria methodand fluorescence method
表3铜绿微囊藻叶绿素荧光法与发光细菌法测定实际样品莠去津含量的比较
Table3A comparison of atrazine concentration in photobacteriamethod and fluorescence method
经计算，两种方法测得的实际样品中莠去津的含量见表3。对测定的结果进行t检验，得|t|=0.279，给定α=0.05，由t界值表查得t0.05(2)=4.303，|t|=0.279﹤4.303=t0.05(2)，P﹥0.05，说明利用铜绿微囊藻叶绿素荧光法和发光细菌法进行的实际水样测定结果无显著性差异，且两测定结果的比值相近，证明可以用铜绿微囊藻叶绿素荧光检测方法替代发光细菌法测定农药莠去津的生物毒性。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
Claims (6)
1.用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，其特征步骤包括：
A、铜绿微囊藻的培养：取铜绿微囊藻藻种，配制BG-11培养基,然后将培养基灭菌、冷却，于无菌条件下进行藻种接种；接种完成，置于恒温光照培养箱中培养；将生长至对数期的藻按比例转接到灭菌培养基中，如此反复转接，使其达到同步生长；
B、铜绿微囊藻叶绿素荧光参数的确定：使用荧光光谱仪进行叶绿素荧光参数的测定；对铜绿微囊藻进行波长扫描，确定铜绿微囊藻叶绿素荧光的最佳激发波长Ex／发射波长Em为435nm／680nm；
C、稀释至不同浓度的铜绿微囊藻与其光密度关系测定：用灭菌的蒸馏水对生长至对数期的铜绿微囊藻进行稀释，稀释成一系列不同浓度，用铜绿微囊藻所占百分数表示；然后使用可见分光光度计，测定稀释至不同浓度的铜绿微囊藻在680nm处的光密度OD值，绘制藻液浓度与光密度的关系曲线，同时计算其回归方程；
D、铜绿微囊藻浓度-叶绿素荧光曲线的建立：使用荧光光谱仪在435nm／680nm波长下测定稀释至不同浓度的铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度，绘制铜绿微囊藻藻液浓度对应的光密度与叶绿素荧光强度的关系曲线，其中光密度在0～0.74范围内光密度与叶绿素荧光强度呈线性正相关关系，计算其回归方程；
E、用于测定莠去津生物毒性铜绿微囊藻藻液的获取：根据步骤D建立的铜绿微囊藻藻液光密度和叶绿素荧光强度的关系曲线，选定OD值为0.3-0.5的铜绿微囊藻藻液浓度作为检测莠去津生物毒性的藻的浓度；用经过高压灭菌的蒸馏水稀释生长至对数期的铜绿微囊藻，使其在680nm处的OD值为0.3-0.5，该稀释后的藻液即可用于莠去津生物毒性测定。
2.根据权利要求1所述的用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，其特征在于：步骤A中BG-11培养基放入灭菌锅于121℃下灭菌30min，取出后放入超净台冷却。
3.根据权利要求1所述的用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，其特征在于：步骤A中藻种在恒温光照培养箱中的培养条件是：光照度为2000-2500lux，温度为25±1℃，湿度为75%RH，光暗周期为12h:12h，静置培养，每日摇瓶2-3次，每次随机调换三角瓶的位置，以免引起光照不均。
4.根据权利要求1所述的用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，其特征在于：步骤B和步骤D中使用F-7000荧光光谱仪进行叶绿素荧光参数的测定；F-7000荧光光谱仪工作参数：狭缝为5nm，扫描速度2400nm／min，激发波长400nm～500nm，发射波长600nm～700nm，步长5nm，电压700V，1cm的标准四通石英比色皿。
5.根据权利要求1所述的用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，其特征在于：步骤C中使用722型可见分光光度计测定铜绿微囊藻的光密度OD值来确定藻液浓度。
6.根据权利要求1所述的用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法，其特征在于：步骤E中，用经过高压灭菌的蒸馏水稀释生长至对数期的铜绿微囊藻，使其在680nm处的OD值为0.4，该稀释后的藻液用于莠去津生物毒性测定。
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2013
- 2013-04-19 CN CN201310140913.9A patent/CN103267748B/zh active Active
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