CN105044065A - 一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于荧光法测定叶绿素的藻液的制备方法,选取蛋白核小球藻藻种,配制BG-11培养基,然后将培养基灭菌、冷却,于无菌条件下进行藻种接种,接种完成,置于恒温光照培养箱中培养,在培养基灭菌之前,向所述的BG-11培养基中添加琼脂粉来培养蛋白核小球藻。本发明根据琼脂粉的凝胶性、稳定性提出了一种藻液的制备方法、向BG-11培养基中添加琼脂粉(0.08-0.10g/100ml)作为助悬剂培养蛋白核小球藻,培养的蛋白核小球藻作为制备藻液,提高了藻液的悬浮性、稳定性,进而确保了利用荧光法测定叶绿素含量的结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于水质环境监测的技术领域,具体涉及一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法。
背景技术
叶绿素a含量在一定程度上反应水体中藻类数量和水质状况,是水体水质环境监测中的常规监测项目、是水体富营养化指标之一。
实验室分光光度法[1-2]、荧光分光光度法[3]是实验室测定叶绿素a实现对浮游植物的定量测定的最为常用的方法。采用荧光光度法测定水体中的叶绿素a,灵敏度比分光光度法高10倍,不需要对样品进行预处理,操作简单,可连续监测,随着荧光法叶绿素在线分析仪的开发与研究,实现水体中叶绿素的实时原位分析。
实验过程中发现现有技术荧光检测法直接测定藻液时,藻细胞沉降明显、测量值随时间变化较大得到的数据不准确,无法正确判断出水质环境。准确、完整的监测数据是环境管理工作的基础和依托,一个错误的数据可能导致错误的决策与行动,因此正确测量水质环境至关重要。
发明内容
本发明为解决现有技术中荧光法测定藻液时,容易沉降,无法获得准确的藻液浓度数据,提供了一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法。本发明为实现其目的采用的技术方案是:
一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法,选取蛋白核小球藻藻种,配制BG-11培养基,然后将培养基灭菌、冷却,于无菌条件下进行藻种接种,接种完成,置于恒温光照培养箱中培养,在培养基灭菌之前,向所述的BG-11培养基中添加琼脂粉来培养蛋白核小球藻。
所述的BG-11培养基放入灭菌锅于121℃下灭菌30min,取出后放入超净台冷却。
所述的BG-11培养基在接种之前,置于紫外灯下照射30min以上。
所述恒温光照培养箱中的培养条件是:光照度为2000lx,温度为25℃,湿度为75%RH,光暗周期为12h:12h,静置培养,每日摇瓶2-3次,同时更换锥形瓶的位置,以免引起光照不足。
BG-11培养基中琼脂粉的添加量为0.08-0.10g/100mL。
本发明的有益效果是:本发明根据琼脂粉的凝胶性、稳定性提出了一种藻液的制备方法、向BG-11培养基中添加琼脂粉(0.08-0.10g/100ml)作为助悬剂培养蛋白核小球藻,培养的蛋白核小球藻作为制备藻液,提高了藻液的悬浮性、稳定性,减少藻体沉降对测定结果的影响,进而确保了利用荧光法测定叶绿素含量的结果的准确性。
附图说明
图1是蛋白核小球藻叶绿素a的激发光谱和发射光图谱。横坐标为扫描波长,纵坐标为荧光强度,左边为激发图谱,右边为发射图谱。
图2是测量间隔时间与1号原藻液荧光值间的关系曲线。横坐标为测量间隔时间,纵坐标为荧光值的变化率,图中△F/F0=-9.96%表示当T=1min时,△F/F0=-9.96%。
图3是测量间隔时间与1-6号荧光值相对变化率间的关系曲线。横坐标为测量间隔时间,纵坐标为荧光值的变化率。
图4是测量间隔时间与光密度值相对变化率间的关系曲线。横坐标为测量间隔时间,纵坐标为光密度值的变化率。
具体实施方式
本发明为解决现有技术中荧光法测定藻液时,藻容易沉降,无法获得准确的藻液浓度数据,提供了一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法。下面结合具体实施例为本发明作进一步说明。
1、实验仪器与试剂
仪器:光照培养箱(E-30B0美国Percival);可见分光光度计(722型上海光谱仪器有限公司);紫外分光光度计(UV-2600上海天美科学仪器有限公司);荧光分光光度计(RF-5301日本岛津公司);离心机(Z323德国HERMLE-Z323);循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ郑州长城科工贸有限公司)。
试剂:盐酸(分析纯石家庄市华迪化工工贸有限公司);氢氧化钠(分析纯天津市大陆化学试剂厂);叶绿素a标准品(日本wako公司,10mg装);蛋白核小球藻(藻种购自中国科学院野生生物质库——淡水藻种库,培养基为灭菌BG-11培养液);琼脂粉(JapanMW:3000-9000)。
2、添加不同浓度琼脂粉配置BG-11培养基
选取6个规格为250ml的锥形瓶,每个锥形瓶中配置100mlBG-11培养基,并向每个锥形瓶中添加不同量的琼脂粉。
BG-11培养基的配方为:
注:用盐酸及氢氧化钠将培养基的PH调节至7.1;
微量金属A5溶液配方:
其中,
1号培养基:添加琼脂粉0g/100mL。
2号培养基:添加琼脂粉0.02g/100mL。
3号培养基:添加琼脂粉0.04g/100mL。
4号培养基:添加琼脂粉0.06g/100mL。
5号培养基:添加琼脂粉0.08g/100mL。
6号培养基:添加琼脂粉0.1g/100mL。
3、制备蛋白核小球藻藻液
选取的蛋白核小球藻购买自中国科学院野生生物质库——淡水藻种库,选择一瓶处于对数增长期且生长状态良好的蛋白核小球藻120ml,摇匀,平均分成6份,每份20ml,将六份蛋白核小球藻分别接种于1-6号培养基中作为出发藻,然后将接种有出发藻的锥形瓶置于E-30B0光照培养箱中培养,培养条件为:培养温度25℃,光照条件2000lx,时间设置为12h昼/12h夜,湿度条件75%RH。藻种静置培养,每日摇动锥形瓶2次同时更改锥形瓶位置,七日后同时取出即得用于荧光法测定叶绿素含量的藻液。
4、对制备的用于荧光法测定叶绿素的藻液悬浮稳定性的检测试验
4.1确定叶绿素a的最佳激发波长和发射波长
提取1号培养基中培养的蛋白核小球藻中的叶绿素a,使用岛津RF5301荧光分光光度计分别对叶绿素a进行光谱扫描。扫描条件:设定激发波长扫描范围为400nm~500nm,发射波长扫描范围为600nm~750nm,狭缝宽度:EX:5.0nm,EM:5.0nm;灵敏度:High;响应时间:Auto。扫描结果见图1。
由图1可以看出,蛋白核小球藻叶绿素a的激发波长为436nm,发射波长为672nm,激发波长和发射波长的狭缝宽度均为5.0nm。
4.2确定添加琼脂粉之后BG-11培养基的特征吸收
使用UV—2600型紫外可见分光光度计于室温下扫描添加0.10g/100ml的BG-11培养基在220~900nm波长范围内的吸光度值,确定了添加琼脂粉的BG-11培养基无特征吸收,因此琼脂的添加对藻液光密度的测定结果无影响。
4.3将得到的1-6号用于荧光法测定叶绿素含量的藻液静置10h后观察1-6号藻液的状态
同时从1-6号锥形瓶中培养的用于荧光法测定叶绿素含量的藻液中个取出10ml,分别置于对应的1-6号比色管中,即1号锥形瓶取出的藻液置于1号比色管中,2号锥形瓶取出的藻液置于2号比色管中,以此类推;然后静置10h后观察琼脂在藻体培养过程中对藻体的悬浮效果藻液状况,结果如下:
琼脂粉在藻液的培养中作为助悬剂,琼脂粉的添加量决定藻液的悬浮状况,添加量过少会使藻液悬浮不均匀,添加量过大导致培养基凝固。添加了琼脂粉的BG-11培养基培养的对数生长期的蛋白核小球藻静置10h后,琼脂粉添加量在0.08-0.10g/100ml的BG-11培养基培养的藻液悬浮均匀、不下沉、不分层,且溶液稳定;没有添加琼脂粉的1号比色管的藻液中藻细胞都沉淀了,所以从颜色上比2-6号比色管浅,2号和3号比色管的藻液中出现明显的藻体下沉现象,4号比色管出现明显的分层,而5号和6号比色管的藻液悬浮均匀、溶液稳定。
4.4测定测量间隔时间对荧光值测量结果的影响实验
(1)测量间隔时间对不添加琼脂粉培养基制备的藻体荧光值测量的影响实验
取1号锥形瓶中的供试藻,用灭菌的蒸馏水稀释四倍,灭菌的蒸馏水作为空白参比,使用岛津RF5301荧光分光光度计在确定的荧光测定参数下每隔1min测定一次样品的荧光强度。建立测量间隔时间(T)与荧光值(F)间的关系曲线,如图2所示。
由图2可知,荧光值随测量间隔时间变化较大,测量值存在较大误差,不容忽略。这是因为藻细胞在静置1min内沉降严重荧光值下降较大,5min后基本荧光值趋于稳定,因此要求测定样品前必须摇匀、测量时要求快速,以减小因藻细胞因沉降造成的误差。
(2)测量间隔时间对添加琼脂粉培养基制备的藻体荧光值相对变化率的影响实验
取2-6号锥形瓶中的供试藻,灭菌的蒸馏水作为空白参比,使用岛津RF5301荧光分光光度计在确定的荧光测定参数下每隔1min测定一次样品的荧光强度。绘制测量间隔时间(T)与荧光值相对变化率(△F/F0)变化曲线,如图3所示。
由图3可知,5、6号供试藻荧光值相对变化率受测量间隔时间影响较小在±5%内,效果明显,溶液稳定。
4.5测定静置时间对光密度测量结果的影响
取1、5、6号锥形瓶中的供试藻,用灭菌的蒸馏水进行稀释四倍,灭菌的蒸馏水作为空白参比,使用722型可见分光光度于663nm波长处每隔1min测定一次蛋白核小球藻的光密度值D(663nm)。绘制光密度值相对变化率(△D(663nm)/D0)对测量间隔时间(T)变化曲线。如图5所示。
由图4可知,5、6号供试藻光密度值相对变化率受测量间隔时间影响较小在±5%内,且添加琼脂粉0.08-0.10g/100ml藻体悬浮基本均匀、不下沉、不分层,光密度值略有上升。
结论,综上研究,本发明通过向BG-11培养基中加入0.08-0.1g/100ml的琼脂粉,使得藻液悬浮稳定、不分层、不下沉,在用荧光法直接测定藻液时,测量结果稳定、准确,在水质环境中可行性突出。
Claims (5)
1.一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法,选取蛋白核小球藻藻种,配制BG-11培养基,然后将培养基灭菌、冷却,于无菌条件下进行藻种接种,接种完成,置于恒温光照培养箱中培养,其特征在于,在培养基灭菌之前,向所述的BG-11培养基中添加琼脂粉来培养蛋白核小球藻。
2.根据权利要求1所述的一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法,其特征在于:所述的BG-11培养基放入灭菌锅于121℃下灭菌30min,取出后放入超净台冷却。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法,其特征在于:所述的BG-11培养基在接种之前,置于紫外灯下照射30min以上。
4.根据权利要求1所述的一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法,其特征在于:所述恒温光照培养箱中的培养条件是:光照度为2000lx,温度为25℃,湿度为75%RH,光暗周期为12h:12h,静置培养,每日摇瓶2-3次,同时更换锥形瓶的位置,以免引起光照不足。
5.根据权利要求1所述的一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法,其特征在于:BG-11培养基中琼脂粉的添加量为0.08-0.10g/100mL。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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