CN115791716A - 蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白核小球藻技术领域，提出了蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，在有机硅条件下利用蛋白核小球藻检测扑灭通生物毒性，所述有机硅包括乙氧基改性聚三硅氧烷。通过上述技术方案，解决了现有技术中检测扑灭通生物毒性的方法测定周期长，灵敏度低的问题。

Description

蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法

技术领域

本发明涉及蛋白核小球藻技术领域，具体的，涉及蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法。

背景技术

扑灭通(prometon)属三嗪类非选择性除草剂，化学名称为6-甲氧基-2-N,4-N-二(丙-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺，分子式是C₁₀H₁₉N₅O。扑灭通为内吸传导型除草剂，植物根、茎、叶均可吸收，通过抑制光合作用而致效，从而达到清除杂草的目的。

扑灭通用于防除非耕地中一年生和多年生阔叶杂草、禾本科杂草和灌木丛，可用于工厂、铁路、公路等作灭生性除草用，能通过根、茎、叶吸收并传导全株。扑灭通溶度大，易于在土壤中移动，持效期较长，每公顷用药量2.25kg时半衰期6-7个月，广泛使用扑灭通不仅会导致植物和土壤中的农药残留，而且还会通过食物链积累在人体中，对眼睛、呼吸道和皮肤有刺激作用，对人体健康有潜在的危害，研究这种除草剂的农药残留水平对土壤及水环境监测有重要意义，有利于对环境中扑灭通的防控与去除。

扑灭通的大量使用造成严重的水体、土壤环境的污染，目前针对扑灭通的检测方法包括分光光度法、化学发光法、毛细管电泳、气相色谱法、伏安法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)和高效液相色谱-质谱联用法(HPLC/MS)等，其中，HPCL、GC/MS、HPCL/MC应用最多。但是，这些方法往往存在前处理繁琐、辅助溶剂消耗量大、过程冗长、运行费用高和造价高等诸多缺点。传统理化检测法只能定量分析有毒污染物，不能综合反映污染物对环境的生物毒性效应。随着扑灭通检测技术的发展，生物毒性检测方法使用更为广泛。目前使用生物毒性方法是检测除草剂的一种综合、筛查型、准确的检测技术，能够直观与全面地反应除草剂等污染物对生物种群的毒性和对环境造成的综合影响，现已经成为污染物监控预警重要技术手段。生物毒性检测除草剂的方法包括蚤类毒性法、鱼类毒性法、发光细菌法和藻生长抑制法等。藻生长抑制法采用微藻作为生物毒性实验材料，藻类具有体积微小、细胞结构简单、分布广、繁殖快、易于分离与培养、保存稳定，并可直接观察藻类细胞水平上的状况，该方法准确性、稳定性高，但测定周期长，灵敏度低。

发明内容

本发明提出蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，解决了藻生长抑制法检测扑灭通生物毒性测定周期长，灵敏度低的问题。

本发明的技术方案如下：

蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，在有机硅条件下利用蛋白核小球藻检测扑灭通生物毒性，所述有机硅包括乙氧基改性聚三硅氧烷。

作为进一步技术方案，包括以下步骤：取系列浓度扑灭通标准液，加入有机硅溶液，再加入到蛋白核小球藻藻液中，充分混合并摇匀，控制蛋白核小球藻藻液、有机硅溶液和扑灭通标准溶液的体积比为1：(1-2)：(1-2)，经暗处理10min后，测定蛋白核小球藻的各叶绿素荧光动力学参数，测定扑灭通的生物毒性；

所述测定扑灭通的生物毒性时，以培养基代替扑灭通标准溶液作为空白对照组。

作为进一步技术方案，所述蛋白核小球球藻为将蛋白核小球藻藻种接种至培养基后，置于恒温光照培养箱中培养至对数期得到。

作为进一步技术方案，所述培养基包括以下组分：NaNO₃1.5g/L、K₂HPO₄ 0.04g/L、MgSO₄·7H₂O 0.075g/L、CaCl₂·2H₂O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001g/L、Na₂CO₃ 0.02g/L、H₃BO₄ 2.86g/L dH₂O、MnCl₂·4H₂O 1.86g/L dH₂O、ZnSO₄·7H₂O0.22g/L dH₂O、Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g/L dH₂O、CuSO₄·5H₂O 0.079g/L dH₂O、Co(NO₃)₂·6H₂O0.049g/L dH₂O、6-BA 0.001g/L、NAA 0.002g/L；

所述培养基配制用1M NaOH或1M HCl调节pH为7.1。

作为进一步技术方案，所述恒温光照培养箱的培养条件：光照度为2000-2500lx，温度为25±2℃，湿度为75％RH，光暗周期为12h：12h静置培养；所述对数期的蛋白核小球藻，为转接过程中由初始值OD₆₈₀＝0.1于培养箱中培养生长，随后选定OD₆₈₀＝1.0即通过显微镜镜检得出藻细胞密度，此时细胞密度范围在(1-1.2)×10⁶ind/mL的蛋白核小球藻藻液浓度作为检测扑灭通生物毒性的藻的浓度，用于扑灭通生物毒性的测定。

作为进一步技术方案，所述有机硅溶液和扑灭通标准溶液的体积比为1:1、1:2或2:1。

作为进一步技术方案，所述测定蛋白核小球藻的各叶绿素荧光动力学参数时，使用水样荧光仪进行测定，激发波长为680nm。

作为进一步技术方案，所述有机硅溶液的体积浓度为5％。

作为进一步技术方案，作为进一步技术方案，所述动力学参数包括PSⅡ最大光能转化效率、PSⅡ实际光能转化效率、光合电子传递效率、光化学淬灭系数。

作为进一步技术方案，所述系列浓度的扑灭通标准液的浓度依次为：20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L。

本发明的工作原理及有益效果为：

1、本发明在有机硅条件下利用蛋白核小球藻检测扑灭通生物毒性，在有机硅条件下可以增加除草剂与藻液的接触面积，增强除草剂的渗透效果，促进蛋白核小球藻的吸收，能促进扑灭通对蛋白核小球藻的毒性作用效果，提升检测灵敏度。

2、本发明添加有机硅检测扑灭通生物毒性，有机硅的主链十分柔顺，其分子间的作用力比碳氢化合物要弱得多，因此，比同分子量的碳氢化合物粘度低，表面张力弱，表面能小，成膜能力强，可显著降低药液表面张力，且其具有的超延展性和高效内吸传导性可提高靶标药液附着量，增强除草剂渗透和微藻的吸收，有机硅生物毒性极低，并且可增强扑灭通等内吸传导型除草剂对小球藻的光能利用率的抑制。

3、本发明中蛋白核小球藻的培养对后续用于测定扑灭通生物毒性作用尤为重要，蛋白核小球藻的培养情况直接影响扑灭通生物毒性的检测。在藻培养过程中，其生长状况受外界环境所影响，包括温度、CO₂、PH、光照强度、光照时间、培养基中的营养成分(碳源、氮源、无机盐等)，其中植物激素和生长调节剂对植物细胞的生长起到非常重要的调节作用，而微藻很多的生物学性质与植物细胞非常接近，因此利用激素来调控微藻细胞生长情况，从而为实现微藻快速稳定生长的可能。所以在目前所使用的BG-11培养基的基础上添加植物激素α-萘乙酸(NAA)，NAA是一种广谱植物生长调节剂，能促进细胞分裂与增大，提高植物的生物量并且能缓解螯合剂对植物细胞的胁迫作用。6-苄氨基嘌呤(6-BA)是一种合成的细胞分裂素，可与植物生长素一起使用增强植物生长发育反应，刺激细胞分裂并降低细胞衰亡的几率，提高植物存活期，增强植物对外界应激如干旱、高盐、严寒等的免疫性，并改善植物自身应对疾病的能力。将这两种植物激素加入BG-11培养基中会有效的促进蛋白核小球藻的生长，增加小球藻的存活率，延长小球藻的存活周期。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为实施例1扑灭通对蛋白核小球藻PSⅡ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))影响曲线；

图2为实施例1扑灭通对蛋白核小球藻光合电子传递效率(ETR)影响曲线；

图3为实施例1扑灭通对蛋白核小球藻光化学淬灭系数(qP)影响曲线；

图4为实施例1扑灭通对蛋白核小球藻PSⅡ的最大光能转化效率(Fv/Fm)影响曲线；

图5为实施例2扑灭通对蛋白核小球藻PSⅡ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))影响曲线；

图6为实施例2扑灭通对蛋白核小球藻光合电子传递效率(ETR)影响曲线；

图7为实施例2扑灭通对蛋白核小球藻光化学淬灭系数(qP)影响曲线；

图8为实施例2扑灭通对蛋白核小球藻PSⅡ的最大光能转化效率(Fv/Fm)影响曲线；

图9为实施例3扑灭通对蛋白核小球藻PSⅡ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))影响曲线；

图10为实施例3扑灭通对蛋白核小球藻光合电子传递效率(ETR)影响曲线；

图11为实施例3扑灭通对蛋白核小球藻光化学淬灭系数(qP)影响曲线；

图12为实施例3扑灭通对蛋白核小球藻PSⅡ的最大光能转化效率(Fv/Fm)影响曲线；

图13为实施例2、对比例1-2扑灭通对蛋白核小球藻、斜生栅藻、铜铝微囊藻光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))影响曲线；

图14为实施例2、对比例3-4乙氧基改性聚三硅氧烷、不添加有机硅、添加吐温-80、添加十二烷基苯磺酸钠对光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))影响曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。

通过用蛋白核小球藻测定，发现扑灭通影响蛋白核小球藻的光合作用，通过其对蛋白核小球藻光合作用的影响，可直观反应其在生物体上的毒性表现。

实施例1

1.材料

藻种：本发明所使用藻种蛋白核小球(FACHB-5)，藻种购自中国科学院野生生物质库—淡水藻种库。

仪器：光照培养箱(E-30B0美国Percival)、Water-PAM水样叶绿素荧光仪(Walz，Germany)、荧光显微镜(德国蔡司)、DR6000紫外分光光度计。

乙氧基改性聚三硅氧烷，购自河北德尔科技有限公司。

2.蛋白核小球藻的培养

无菌条件下将蛋白核小球藻接种至装有高温高压灭菌培养基的锥形瓶中，接种完成，置于恒温光照培养箱中培养至对数期。光照度为2000～2500lx，温度为25±2℃，湿度为75％RH，光暗周期为12h：12h，静置培养，每日定时摇瓶2-3次，同时更换锥形瓶的位置，使其受光均匀，培养至对数期，备用；

培养基组分如下表：

表1培养基组分

表2表1中A5(微量元素)组分

注：配制好的培养基需用1M NaOH或1M HCl调节pH为7.1。

1M NaOH：取40g NaOH用蒸馏水稀释至1L。

1M HCl：取84mL密度为1.18g/mL用蒸馏水稀释至1L。

3.蛋白核小球藻藻液的制备

将在蛋白核小球藻藻种的培养过程中得到的对数期的蛋白核小球藻，即转接过程中由初始值OD₆₈₀＝0.1于培养箱中培养生长，随后选定OD₆₈₀＝1.0的蛋白核小球藻藻液浓度作为检测扑灭通生物毒性的藻的浓度测定，此时细胞密度范围在(1-1.2)×10⁶ind/mL的蛋白核小球藻藻液浓度作为检测扑灭通毒性的藻浓度，用于扑灭通毒性的测定。

4、扑灭通标准液的制备

20000μg/L扑灭通储备液：取1mL浓度为100μg/mL扑灭通标准液，加去离子水稀释至5mL，得到扑灭通储备液；

200μg/L扑灭通中间液：取2.0mL扑灭通储备液于100mL容量瓶中，去离子水定容，得到扑灭通中间液；

扑灭通标准液：分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL扑灭通中间液于5个10mL容量瓶中，纯水定容，其扑灭通浓度分别是20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L。

5、有机硅溶液的制备

取5mL有机硅和适量去离子水于烧杯中使用搅拌器混合均匀后倒入100mL容量瓶中，去离子水定容，得到有机硅溶液。

实施例1

扑灭通对蛋白核小球藻荧光效应影响的测定：

在蛋白核小球藻生长对数期(即OD₆₈₀＝1.0)取蛋白核小球藻藻液、系列浓度的扑灭通标准液和培养基按体积比为1：2：1进行混合并摇匀，并同时设置空白组(培养基代替扑灭通)对照。混合液经暗置10min后，用水样叶绿素荧光仪测定蛋白核小球藻藻液叶绿素荧光动力学参数，包括光系统Ⅱ的最大光能转化效率(Fv/Fm)、光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))、光合电子传递效率(ETR)、光化学淬灭系数(qP)，进行3组平行对照实验，取其平均值并记录，得出空白组和实验组各荧光参数的变化，判断扑灭通对蛋白核小球藻的各荧光参数的影响效果。

有机硅条件下扑灭通对蛋白核小球藻荧光效应影响的测定：

选择在扑灭通生长对数期(即OD₆₈₀＝1.0)取蛋白核小球藻藻液、系列浓度的扑灭通标准液和有机硅溶液按体积比为1：2：1进行混合并摇匀，并同时设置空白组(培养基代替扑灭通)对照。混合液经暗置10min后，用水样叶绿素荧光仪测定藻液叶绿素荧光动力学参数，包括光系统Ⅱ的最大光能转化效率(Fv/Fm)、光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))、光合电子传递效率(ETR)、光化学淬灭系数系数(qP)，进行3组平行对照实验，取其平均值并记录，得出空白组和实验组各荧光参数的变化，判断扑灭通对蛋白核小球藻的各荧光参数的影响效果。

藻液叶绿素荧光动力学参数测试结果见图1-4。

实施例2

扑灭通对蛋白核小球藻荧光效应影响的测定

在蛋白核小球藻生长对数期(即OD₆₈₀＝1.0)取蛋白核小球藻藻液、系列浓度的扑灭通标准液和培养基按体积比为1：1：1进行混合并摇匀，并同时设置空白组(培养基代替扑灭通)对照。混合液经暗置10min后，用水样叶绿素荧光仪测定蛋白核小球藻藻液叶绿素荧光动力学参数，包括光系统Ⅱ的最大光能转化效率(Fv/Fm)、光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))、光合电子传递效率(ETR)、光化学淬灭系数系数(qP)，进行3组平行对照实验，取其平均值并记录，得出空白组和实验组各荧光参数的变化，判断扑灭通对蛋白核小球藻的各荧光参数的影响效果。

有机硅条件下扑灭通对蛋白核小球藻荧光效应影响的测定

选择在生长对数期(即OD₆₈₀＝1.0)取蛋白核小球藻藻液、系列浓度的扑灭通标准液和有机硅溶液按体积比1：1：1进行混合并摇匀，并同时设置空白组(培养基代替扑灭通)对照。混合液经暗置10min后，用水样叶绿素荧光仪测定藻液叶绿素荧光动力学参数，包括光系统Ⅱ的最大光能转化效率(Fv/Fm)、光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))、光合电子传递效率(ETR)、光化学淬灭系数系数(qP)，进行3组平行对照实验，取其平均值并记录，得出空白组和实验组各荧光参数的变化，判断扑灭通对蛋白核小球藻的各荧光参数的影响效果。

藻液叶绿素荧光动力学参数测试结果见图5-8。

实施例3

扑灭通对蛋白核小球藻荧光效应影响的测定

在蛋白核小球藻生长对数期(即OD₆₈₀＝1.0)取蛋白核小球藻藻液、系列浓度的扑灭通标准液和培养基按体积比为1：1：2进行混合并摇匀，并同时设置空白组(培养基代替扑灭通)对照。混合液经暗置10min后，用水样叶绿素荧光仪测定蛋白核小球藻藻液叶绿素荧光动力学参数，包括光系统Ⅱ的最大光能转化效率(Fv/Fm)、光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))、光合电子传递效率(ETR)、光化学淬灭系数系数(qP)，进行3组平行对照实验，取其平均值并记录，得出空白组和实验组各荧光参数的变化，判断扑灭通对蛋白核小球藻的各荧光参数的影响效果。

有机硅条件下扑灭通对蛋白核小球藻荧光效应影响的测定

选择在生长对数期(即OD₆₈₀＝1.0)取蛋白核小球藻藻液加入系列浓度的扑灭通标准液和有机硅溶液按体积比1：1：2进行混合并摇匀，并同时设置空白组(培养基代替扑灭通)对照。混合液经暗置10min后，用水样叶绿素荧光仪测定藻液叶绿素荧光动力学参数，包括光系统Ⅱ的最大光能转化效率(Fv/Fm)、光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))、光合电子传递效率(ETR)、光化学淬灭系数系数(qP)，进行3组平行对照实验，取其平均值并记录，得出空白组和实验组各荧光参数的变化，判断扑灭通对蛋白核小球藻的各荧光参数的影响效果。

藻液叶绿素荧光动力学参数测试结果见图9-12。

通过图1-12可以看出，在有机硅条件下扑灭通对蛋白核小球藻的荧光参数Y(II)、ETR、qP、和Fv/Fm有明显的增强抑制效果，随有机硅和除草剂之间的比例改变，抑制效果也发生变化，在低浓度20μg/L扑灭通胁迫下，将有无添加有机硅助剂的抑制率进行对比发现加入有机硅后，增强效果尤为显著，由此可见在有机硅条件下痕量扑灭通对蛋白核小球藻荧光参数的增强抑制效果更为明显，直观反应出蛋白核小球藻在光合作用中光系统II的实际光能转换效率、实际量子产量、光合电子传递效率、光合活性和光保护能力明显受到影响。

对比例1

与实施例2相比，对比例1将蛋白核小球藻藻液替换为同等体积和浓度的斜生栅藻藻液，其他与实施例2相同。

对比例2

与实施例2相比，对比例2将蛋白核小球藻藻液替换为同等体积和浓度的铜铝微囊藻藻液，其他与实施例2相同。

实施例2和对比例1-2的藻液叶绿素荧光动力学参数中光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))测试结果见图13。

从图13可以看出，与斜生栅藻和铜绿微囊藻相比，蛋白核小球藻对除草剂毒性的响应更明显，各荧光动力学参数的抑制效果更显著，说明蛋白核小球藻对除草剂毒性更敏感，从而对除草剂毒性的测定效果更直观和快速，缩短了测定周期。

对比例3

与实施例2相比，对比例3将乙氧基改性聚三硅氧烷替换为等量的吐温-80，其他与实施例2相同。

对比例4

与实施例2相比，对比例4将乙氧基改性聚三硅氧烷替换为等量的十二烷基苯磺酸钠，其他与实施例2相同。

实施例2和对比例3-4的藻液叶绿素荧光动力学参数中光系统Ⅱ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))测试结果见图14。

从图14可以看出与不添加有机硅，添加吐温-80或将乙氧基改性聚三硅氧烷替换为等量的十二烷基苯磺酸钠相比，添加乙氧基改性聚三硅氧烷，对于蛋白核小球藻的各荧光动力学参数的抑制效果更显著，说明添加乙氧基改性聚三硅氧烷可以更好的提高蛋白核小球藻对除草剂毒性的敏感性，使测定效果更直观和快速，缩短了测定周期。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，在有机硅条件下利用蛋白核小球藻检测扑灭通生物毒性，所述有机硅包括乙氧基改性聚三硅氧烷。

2.根据权利要求1所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：取系列浓度扑灭通标准液，加入有机硅溶液，再加入到蛋白核小球藻藻液中，充分混合并摇匀，控制蛋白核小球藻藻液、有机硅溶液和扑灭通标准溶液的体积比为1：(1-2)：(1-2)，经暗处理10min后，测定蛋白核小球藻的各叶绿素荧光动力学参数，测定扑灭通的生物毒性；

所述测定扑灭通的生物毒性时，以培养基代替扑灭通标准溶液作为空白对照组。

3.根据权利要求2所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，所述蛋白核小球球藻为将蛋白核小球藻藻种接种至培养基后，置于恒温光照培养箱中培养至对数期得到。

4.根据权利要求3所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，所述培养基包括以下组分：NaNO₃ 1.5g/L、K₂HPO₄ 0.04g/L、MgSO₄·7H₂O 0.075g/L、CaCl₂·2H₂O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA 0.001g/L、Na₂CO₃ 0.02g/L、H₃BO₄2.86g/L dH₂O、MnCl₂·4H₂O 1.86g/L dH₂O、ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L dH₂O、Na₂MoO₄·2H₂O0.39g/L dH₂O、CuSO₄·5H₂O 0.079g/L dH₂O、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.049g/L dH₂O、6-BA 0.001g/L、NAA 0.002g/L；

所述培养基pH为7.1。

5.根据权利要求3所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，所述恒温光照培养箱的培养条件：光照度为2000-2500lx，温度为25±2℃，湿度为75％RH，光暗周期为12h：12h静置培养；所述对数期的蛋白核小球藻，为转接过程中由初始值OD₆₈₀＝0.1于培养箱中培养生长，随后选定OD₆₈₀＝1.0即通过显微镜镜检得出藻细胞密度，此时细胞密度范围在(1-1.2)×10⁶ind/mL的蛋白核小球藻藻液浓度作为检测扑灭通生物毒性的藻的浓度，用于扑灭通生物毒性的测定。

6.根据权利要求2所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，所述有机硅溶液和扑灭通标准溶液的体积比为1:1、1:2或2:1。

7.根据权利要求2所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，所述测定蛋白核小球藻的各叶绿素荧光动力学参数时，使用水样荧光仪进行测定，激发波长为680nm。

8.根据权利要求2所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，所述有机硅溶液的体积浓度为5％。

9.根据权利要求2所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，所述动力学参数包括PSⅡ最大光能转化效率、PSⅡ实际光能转化效率、光合电子传递效率、光化学淬灭系数。

10.根据权利要求2所述的蛋白核小球藻荧光检测扑灭通生物毒性的方法，其特征在于，所述系列浓度的扑灭通标准液的浓度依次为：20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L。

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