CN113834805B - 一种可视化检测植物细胞水平无机磷分布的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可视化检测植物细胞水平无机磷分布的方法。该方法包括：将待测植物样本制作成切片；将切片置于无机磷染色液中染色；将染色后的样本置于固定液中固定；如果待测样本有色，则将固定后样本置于储存液中脱色，然后透明；如果待测样本无色，则直接将样本置于透明剂中透明；镜检。本发明将钼蓝染色法和水合氯醛法结合起来，在保持植物组织和细胞完整的情况下，在植物组织和细胞水平显示植物体内无机磷的分布，其具有周期短，操作简单，不需要昂贵设备的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可视化检测植物细胞水平无机磷分布的方法。
背景技术
磷是植物得以生存的必需元素，植物根系通过吸收土壤中的无机磷(Pi，-HPO4 2-和-H2PO4 -)来满足自身对磷的需求，而且无机磷是植物细胞中最灵活，最易移动和最主要的存储形式。但由于磷在土壤中的化学特性，如低溶解度，扩散速度慢和容易被土壤中的金属离子Al3+，Fe3+，Ca2+等固定，导致其成为限制作物产量的重要因素之一。为了应对低磷环境，植物的不同组织细胞也进化出不同的适应机制，导致植物中磷的分布模式各不相同。然而目前对于植物磷信号和磷平衡调控主要停留在器官水平，如植物的地上部和根部，导致错过很多细节信息，成为深入了解植物磷信号和磷平衡精细调控机制的限制因素。已经有一些研究方法如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)，电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)，二级电离质谱法(SIMS)，纳米SIMS(nanoSIMS)，激光烧蚀ICP-MS(LA-ICP-MS)及31P-核磁共振(NMR)等方法应用于检测植物体内的磷的分布。但这些检测方法都耗时耗力，且需要大型昂贵检测仪器，不能满足大部分实验室的需求。
钼蓝染色法是一种测定磷酸盐的经典方法，其作用原理是：在酸性介质中，磷酸盐与钼酸铵反应生成磷钼黄，在抗坏血酸的还原作用下成为磷钼蓝而呈现蓝色，通过分光光度计测定其吸光值可知其无机磷含量。因为它操作简单，成本低，特异性好成为实验室最为常用的检测植物无机磷含量的方法。已有研究报道，无机磷(phosphate，Pi)是植物体内波动最大，移动最快的含磷分子(Kanno et al.,2016)，是植物体内磷的主要储存方式，然而目前对植物无机磷的研究还停留在组织水平的含量上，还没有细胞水平可视化检测无机磷分布的原位检测技术。
发明内容
本发明的目的是找到一种简单、高效、经济、高分辨率的方法，可实现无机磷在植物不同组织和细胞中的分布可视化。为此，本发明开发了一种可视化的无机磷染色技术IPSA(Inorganic Phosphorous Staining Assay)，在细胞水平上原位检测植物无机磷的分布。
本发明要求保护一种原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布的方法。
本发明所要求保护的原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布的方法，可包括如下步骤：
(1)将待测植物样本制作成切片；
(2)将切片置于无机磷染色液中进行染色；
(3)将染色后的样本置于固定液中进行固定或不固定；
(4)将步骤(3)样本置于储存液中进行脱色或不脱色；
(5)将步骤(4)样本置于透明剂中进行透明，直至样本完全透明；
(6)镜检。
在步骤(3)中，如果所述待测植物样本为幼嫩无颜色样本(如幼嫩无色素根)，则可不进行固定处理。
在步骤(4)中，如果所述待测植物样本为有颜色的样本(如叶片)，则将固定后的样本置于储存液中进行脱色，脱色后进行步骤(5)；如果所述待测植物样本为无颜色样本(如无色素根)，则可将步骤(3)样本直接进行步骤(5)。
在步骤(1)中，将所述待测植物样本制作成切片可按照包括如下步骤的方法进行：将所述待测植物样本包埋于琼脂糖凝胶中然后制作成切片(使用震动切片机或徒手切片)。
进一步地，将所述待测植物样本包埋于琼脂糖凝胶中时的温度可为：60℃；所述琼脂糖凝胶的浓度可为2～4％(质量百分含量)。
在步骤(1)中，所述待测植物样本为植物组织或细胞。
在步骤(1)中，所述切片的厚度可为30～80μm，根据植物不同组织组成不同，选择不同厚度，根部组织可以在60μm左右，叶片可以在40μm左右。
在步骤(2)中，所述染色的时间可为30min至12h，根据样品中无机磷丰富程度决定。可以用比色法初步测得总样本中无机磷含量(从而知道无磷含量是高还是低，但是并不知道在哪个细胞，或者哪些细胞高)。实际操作中，只需要在能看到显色反应时即可终止反应，从而根据信号强弱差异即可判断不同细胞的磷浓度差异。
在步骤(3)中，所述固定的时长可为15min～30min。
在步骤(4)中，所述脱色的时间可为1～12h(如1-2h)。时间并不固定，根据样本情况，色素完全脱干净即可，对于根等无色素或色素较少的组织可以不脱色或缩短脱色时间。
在步骤(4)中，根据植物不同组织决定，可更换一次所述储存液。
在步骤(5)中，期间可更换一次所述透明剂。
在步骤(6)中，将步骤(5)处理后的样本置于载玻片上，在显微镜下观察，含有无机磷的组织和/或细胞被染成蓝色(磷钼蓝)。
在所述方法中，所述无机磷染色液的组成可如下：钼酸铵0.81mM，抗坏血酸17mM，酒石酸锑钾0.15mM，硫酸0.19M，余量为水。
在实际应用中，可配制10×无机磷染色液的储存液(储存液中先不加抗坏血酸)，每次染色前将其稀释成工作液同时添加抗坏血酸，充分混匀，方可用于染色。
在所述方法中，所述固定液的组成可如下：甲醛5％体积百分含量，冰乙酸5％体积百分含量，甘油5％体积百分含量，无水乙醇60％体积百分含量，余量为水。
在所述方法中，所述储存液的组成可如下：甲醛5％体积百分含量，冰乙酸5％体积百分含量，甘油5％体积百分含量，无水乙醇80％体积百分含量，余量为水。
在所述方法中，所述透明剂是水合氯醛、甘油和水按照160g：20ml：30ml的比例混合而成的。
在所述方法的操作步骤中应注意以下：(1)所用的试剂最好用分析纯，所使用的水是超纯水或去离子水，所使用的容器必需要纯净，操作全程佩戴手套并避免与反应液体接触，这样可以保证结果的可靠性；(2)无机磷染色液最好配制成储存液(不含抗坏血酸)，需要染色的时候稀释到工作浓度并同时添加抗坏血酸，工作液最好不要超过2个工作日；(3)无机磷染色时应注意观察，可根据染色的深浅延长或缩短时间。
其中，所述植物组织和/或细胞可以为植物的任何组织和/或细胞。
在本发明的具体实施方式中，所述待测植物样本具体为叶片或根。
本发明还要求保护前文所述方法在原位检测单细胞生物中无机磷分布中的应用。
其中，所述单细胞生物可如衣藻。
另外，本发明还要求保护一种用于原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布的试剂盒(或者用于原位检测单细胞生物中无机磷分布的试剂盒)。
本发明所要求保护的用于原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布的试剂盒(或者用于原位检测单细胞生物中无机磷分布的试剂盒)，可含有前文所述的无机磷染色液、所述固定液、所述储存液、所述透明剂和记载有前文所述方法的可读性载体。
本发明将钼蓝染色法和水合氯醛法结合起来，在保持植物组织和细胞完整的情况下，在植物组织和细胞水平显示植物体内无机磷的分布，其具有周期短，操作简单，不需要昂贵设备的优点。
附图说明
图1为植物无机磷可视化检测方法。a为无机磷染色步骤；b-c为组织样本切片厚度的优化；d.染色步骤的优化，数字编号及顺序表示染色采取的步骤(与a中步骤对应)；e为组织样本的磷染色操作步骤及时间。b中第一排是根、第二排是叶；d中第一排是叶、第二排是根。
图2为本发明无机磷可视化检测方法(IPSA)与目前最先进的总磷可视化检测方法激光烧蚀电感耦合等离子体质谱仪(LA-ICP-MS)的图像比较。左侧图为日本马建峰(MaJianfeng)团队的实验结果(2019，the PlantJournal)；右侧为本发明的实验结果。
图3为本发明无机磷可视化检测方法(IPSA)可以反应植物样本的不同磷浓度差异。a为不同磷浓度培养条件下的水稻叶片无机磷染色分析(IPSA)；b为不同磷浓度培养条件下的水稻叶片无机磷测定(采用ICP-MS方法测定)以及本发明的IPSA无机磷染色的信号强弱分析(用软件Image-J进行分析)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的各试剂配方如下：
1、无机磷染色液：钼酸铵0.81mM，抗坏血酸17mM，酒石酸锑钾0.15mM，硫酸0.19M，余量为水。
2、固定液：甲醛5％体积百分含量，冰乙酸5％体积百分含量，甘油5％体积百分含量，无水乙醇60％体积百分含量，余量为水。
3、储存液：甲醛5％体积百分含量，冰乙酸5％体积百分含量，甘油5％体积百分含量，无水乙醇80％体积百分含量，余量为水。
4、透明剂：水合氯醛、甘油和水按照160g：20ml：30ml的比例混合而成。
实施例1、原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布方法的建立及其验证
一、本发明原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布方法的建立
供试植物样本为水稻的幼嫩无色素根或叶片。
将供试植物样本(根或叶片)包埋于琼脂糖凝胶(60℃，质量百分含量为3％)中，使用震动切片机制作成不同厚度的切片(20μm、40μm、60μm、80μm)，然后进行无机磷染色，最后镜检，将样本置于载玻片上，在显微镜下观察，含有无机磷的组织和/或细胞被染成蓝色(磷钼蓝)。
其中，进行无机磷染色的具体操作步骤大致如图1中a所示。包括：①侵染+真空；②侵染；③固定；④去除叶绿素(即脱色)；⑤透明。各步骤具体如下：
①侵染+真空：在抽真空条件下，将切片置于无机磷染色液中染色约30分钟(可先用比色法初步测得总样本中无机磷含量，含量越高染色时间相应延长)。
②侵染：在常压条件下，将切片置于无机磷染色液中染色约30分钟(可先用比色法初步测得总样本中无机磷含量，含量越高染色时间相应延长)。
③固定：将染色后的样本置于固定液中固定约30分钟。
④去除叶绿素(即脱色)：将固定后的样本置于储存液中进行脱色，脱色约1-2h，时间并不固定，根据样本情况，色素完全脱干净即可。期间可更换一次储存液。对于根等无色素或色素较少的组织可以不脱色或缩短脱色时间。
⑤透明：将脱色后的样本或固定后的样本置于透明剂中透明约30-60min，直至样本完全透明。期间可更换一次透明剂。
实验中，对无机磷染色的具体操作步骤、顺序进行了摸索，设置了如下几组：①③④、③①④⑤、②③④⑤、①③④⑤、②⑤。
结果显示：对于根部组织，切片厚度控制在60μm左右最为合适，叶片组织的切片厚度控制在40μm左右最为合适(如图1中b和c，图b和c中，根进行无机磷染色的具体操作顺序为②③④⑤，叶进行无机磷染色的具体操作顺序为①③④⑤)。另外，研究发现进行无机磷染色的具体操作顺序最佳为②③④⑤和①③④⑤，即将切片依次在真空条件下或常压条件下进行浸染、固定、脱色(无色素组织可以不脱色)和透明(如图1中d，图d中根的切片厚度是60μm，叶片是40μm)。另外，对于幼嫩无色素根系可以不固定脱色直接透明，如图1中d的“进行无机磷染色的具体操作顺序②⑤”，效果也尚可。
最终确定，本发明无机磷可视化检测方法(IPSA)全流程可如图1中e所示。
二、本发明原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布方法的验证
1、本发明无机磷可视化检测方法(IPSA)与目前最先进的总磷可视化检测方法激光烧蚀电感耦合等离子体质谱仪(LA-ICP-MS)的图像比较
采用步骤一确定的本发明无机磷可视化检测方法(IPSA)对水稻的根或叶片进行无机磷分布检测。将所得结果与目前最先进的总磷可视化检测方法激光烧蚀电感耦合等离子体质谱仪(LA-ICP-MS)的图像进行比较。
如图2所示。左侧图为日本马建峰(Ma Jianfeng)团队的实验结果(2019，thePlantJournal)；右侧为本发明无机磷可视化检测方法(IPSA)的实验结果。由图可见，IPSA的细胞分辨率显著高于LA-ICP-MS，且能有效分辨不同细胞的磷浓度差异(根据染色深浅分辨)。
2、本发明无机磷可视化检测方法(IPSA)可以反应植物样本的不同磷浓度差异
将萌发的水稻种子在不同无机磷浓度(0、5、10、20、50、100、150、200、400、800μM)条件下进行培养，培养15天后，一方面采用本发明方法检测各组水稻叶片中无机磷的含量及分布情况，并用软件Image-J对各组样本无机磷染色的信号强弱进行分析。另一方面，采用ICP-MS方法测定不同磷浓度培养条件下的水稻叶片无机磷的含量。
图3中a为不同磷浓度培养条件下的水稻叶片无机磷染色分析(IPSA)结果；图3中b为不同磷浓度培养条件下的水稻叶片无机磷测定(采用ICP-MS方法测定)以及本发明无机磷染色的信号强弱分析(用软件Image-J进行分析)。由图可见，IPSA的染色结果信号强度差异与实际测得磷含量差异一致，说明IPSA可以准确反应植物体内的磷浓度差异。
Claims (8)
1.一种原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布的方法，包括如下步骤：
(1)将待测植物样本制作成切片；
(2)将切片置于无机磷染色液中进行染色；所述无机磷染色液的组成如下：钼酸铵0.81mM，抗坏血酸17mM，酒石酸锑钾0.15mM，硫酸0.19M，余量为水；
(3)将染色后的样本置于固定液中进行固定或不固定；
(4)将步骤(3)样本置于储存液中进行脱色或不脱色；
(5)将步骤(4)样本置于透明剂中进行透明；所述透明剂是水合氯醛、甘油和水按照160g：20ml：30ml的比例混合而成的；
(6)镜检；
步骤(1)中，将所述待测植物样本制作成切片是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述待测植物样本包埋于琼脂糖凝胶中然后制作成切片；
将所述待测植物样本包埋于琼脂糖凝胶中时的温度为：60℃；所述琼脂糖凝胶的质量百分含量为2～4％；
步骤(1)中，所述切片的厚度为30～80μm；
步骤(2)中，所述染色的时间为30min至12h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述固定的时长为15min～30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，更换一次所述储存液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，更换一次所述透明剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中，将步骤(5)处理后的样本置于载玻片上，在显微镜下观察，含有无机磷的组织和/或细胞被染成蓝色。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述固定液的组成如下：甲醛5％体积百分含量，冰乙酸5％体积百分含量，甘油5％体积百分含量，无水乙醇60％体积百分含量，余量为水。
7.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述储存液的组成如下：甲醛5％体积百分含量，冰乙酸5％体积百分含量，甘油5％体积百分含量，无水乙醇80％体积百分含量，余量为水。
8.权利要求1-7中任一所述的方法在原位检测单细胞生物中无机磷分布中的应用。
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