CN109724976B - 基于纸层析的树木雌雄鉴别方法 - Google Patents

基于纸层析的树木雌雄鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，包括如下步骤：(1)蛋白提取；(2)点样；(3)层析：选用20％‑30％的乙醇溶液作为抑雄扬雌层析液；(4)染色；(5)雌雄鉴别。本发明方法简单、结果可靠、鉴别成本低廉且便于推广应用。

Description

基于纸层析的树木雌雄鉴别方法
技术领域
本发明涉及树木雌雄鉴别技术领域。具体地说是基于纸层析的树木雌雄鉴别方法。
背景技术
雌雄异株是指一类植物可以区分为雌树雄树，雌树仅开雌花，雄树仅有雄花。自然界约有5％的植物是雌雄异株，因为在结果等一些特征上的差异，人们在利用雌雄异株的植物时往往需要在苗期鉴别雌雄。早期人们是利用雌雄植株幼苗在形态上的细微特征来进行鉴别，但这些方法适用的种类非常有限，且准确性也非常低，目前探索使用的方法有同工酶法，SSR法，这些方法虽然准确性较高，但需要专门的仪器，仅能在实验室完成，且费用较大，仅具有实验室科研价值，难以推广到实际生活生产中应用。目前并没有方法简单、结果可靠、便于推广应用的树木雌雄鉴别方法。
在新疆，胡杨是一种常见的城市园林绿化和道路景观树种，其耐盐，耐旱，适应性广。但成年胡杨雌树在秋天果絮漫天飘，容易对行人和环境造成不良影响，且胡杨扦插技术因为成活率不高目前并不成熟，而未得到广泛的应用，所以胡杨繁殖方式仍以种子繁殖为主，在育苗时无法选择雌雄，需要在后期加以鉴别。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于方法简单、结果可靠且便于推广应用的基于纸层析的树木雌雄鉴别方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，包括如下步骤：
(1)蛋白提取；
(2)点样；
(3)层析：选用体积分数为20％-30％的乙醇溶液作为抑雄扬雌层析液；
(4)染色；
(5)雌雄鉴别。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，在步骤(1)中：在秋天叶子已经变黄时，取下叶片洗净，称取叶片，剪碎后加入蒸馏水迅速冰浴研磨成匀浆，得到的匀浆用纱布过滤，然后用离心管收集滤液。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，在步骤(1)中：在秋天叶子已经变黄时，取下叶片洗净后，称取0.5g叶片，剪碎后加入2mL蒸馏水迅速冰浴研磨成匀浆，得到的匀浆用纱布过滤，然后用5mL离心管收集滤液。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，在步骤(2)中：在滤纸条底部划点样线，将收集的滤液用移液器轻点到点样线上，待样品印记稍干即可层析。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，在步骤(2)中：在距离滤纸条底部1cm处划点样线，将收集的滤液用移液器轻点到点样线上，点样10-15uL，待样品印记稍干即可层析。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，在步骤(3)中：将抑雄扬雌层析液倒入培养皿中，液面刚好蔓延完培养皿底部，将滤纸条竖直插入培养皿中，点样线不能触碰到液面，然后用胶布竖直固定滤纸条，开始层析；等待60-90min后，当层析水线超过滤纸条的一半以上后即可取出染色。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，在步骤(4)中：配制醋酸-联苯胺染液，将其倒入喷壶中，均匀喷涂在水平放置的滤纸条上，待POD同工酶显色；5-10min后滤纸上出现蓝色印迹开始观察。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，在步骤(4)中：醋酸-联苯胺染液配制方法如下：称取1g联苯胺，先用18mL温热的冰醋酸溶解，再加入2mL蒸馏水，完全溶解后室温储存即为染色液母液。使用时取0.5mL母液，加入9.3mL蒸馏水，加入0.2mL、3wt％的H2O2溶液，混匀。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，在步骤(5)中：如果蓝色印迹呈现偏细长的纵向条带则为雌性树，如果蓝色印迹呈横向条带或条带很弱则为雄性树。
上述基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，树木为胡杨或其它含有POD同工酶的树木。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：本发明方法简单、结果可靠、鉴别成本低廉且便于推广应用；传统的电泳方法虽然也可以利用联苯胺染色鉴别树木雌雄，但是代价高昂、操作复杂，不适宜在林业生产中推广应用。本发明通过筛选pH不同的多种盐溶液、多种有机溶剂、多种有机混合溶剂以及多种有机溶剂与水的混合溶剂，选定乙醇作为层析溶液液，并对体积浓度为1％-75％的乙醇溶液进行试验，筛选出体积浓度为20％-30％的乙醇溶液作为最终的抑雄扬雌层析液(试验过程中发现体积分数为20％-30％的乙醇溶液具有抑制雄树叶中POD同工酶活性的作用，而雌树叶POD同工酶活性不受抑制，相对雄树叶来说，其POD同工酶活性反而得到增强，因而发明人将体积分数为20％-30％的乙醇溶液命名为抑雄扬雌层析液)，使得雌雄树叶显色出现较大的差异，从而实现鉴别雌雄树木的目的；鉴别成本极其低廉，操作非常简单，林业从业人员仅需经过简单的培训即可完全掌握。
附图说明
图1成树雌雄树纸层析对比:每张层析纸上，左边为雄性，右边为雌性；
图2幼树纸层析染色检测结果:每一张层析纸上为一棵样树的层析结果。
具体实施方式
一、鉴定方法
1.1、仪器试剂
(1)仪器：研钵、纱布、烧杯、5mL离心管、层析滤纸条(长15cm，宽2.5cm)、毛细管、培养皿、移液器、量筒等。
(2)试剂：醋酸、联苯胺、双氧水、乙醇。
1.2、试剂配制
(1)醋酸-联苯胺染液：称取1g联苯胺，先用18mL温热的冰醋酸溶解，再加入2mL蒸馏水，完全溶解后室温储存即为染色液母液。使用时取0.5mL母液，加入9.3mL蒸馏水，加入0.2mL、3wt％的H2O2溶液，混匀。
(2)20％乙醇溶液：取20mL无水乙醇到烧杯中，加蒸馏水定容到100mL，装瓶备用。
1.3、鉴定方法
(1)蛋白提取:在秋天叶子已经变黄时，取下叶片洗净后，称取0.5g叶片，剪碎后加入2mL蒸馏水迅速冰浴研磨成匀浆，得到的匀浆用纱布过滤，然后用5mL离心管收集滤液。
(2)点样:在距离滤纸条底部1cm处划点样线，将收集的滤液用移液器轻点到点样线上，点样10-15uL即可，待样品印记稍干即可层析。
(3)层析:将层析展开剂倒入培养皿中，液面刚好蔓延完培养皿底部，将滤纸条竖直插入培养皿中，点样线不能触碰到液面，然后用胶布竖直固定滤纸条，开始层析。等待60-90min后，当层析水线超过滤纸条的一半以上后即可取出染色。
(4)染色:配制适量的醋酸-联苯胺染液，将其倒入喷壶中，均匀喷涂在水平放置的滤纸条上，待POD同工酶显色。5-10min后滤纸上出现蓝色印迹开始观察。
(5)雌雄鉴别:如果蓝色印迹呈现偏细长的纵向条带(倒水滴形)则为雌性树，如果蓝色印迹呈横向条带或条带很弱则为雄性树。
二、胡杨树雌雄鉴定
2.1、实验过程
(1)取材:根据春季开花时期以及夏秋季飘絮时期对胡杨成树性别进行鉴定与标记，在秋季共取胡杨成树叶片样品34个，其中雄性样品17个，雌性样品17个，胡杨幼树叶片样品38个。并对每个样品叶片进行封装、标记，并放入4℃冰箱保存备用。
(2)蛋白提取：称取0.5g叶片，剪碎后加入2mL蒸馏水迅速研磨成匀浆，得到的匀浆用纱布过滤，然后用5mL离心管收集滤液，并放入4℃冰箱保存。共提取胡杨雌树叶片样品14个，胡杨雄树叶片样品14个，胡杨幼树叶片样品38个。
(3)层析：在距离滤纸条底部1cm处划点样线，将样品用毛细管轻点到点样线上，点样10-15uL即可，待样品印记稍干后将滤纸条未点样的一端朝上，点样端朝下，竖直插入培养皿中(可用胶带将将滤纸条上端固定在一架子上)，将体积分数为20％的乙醇溶液倒入培养皿中，液面刚好蔓延完培养皿底部，注意滤纸条点样线不能触碰到液面，开始层析。等待60-90min后，当层析水线超过滤纸条的一半以上后即可取出染色。
(4)染色：配制适量的醋酸-联苯胺染液，将其倒入空培养皿中，将滤纸条取出后，在醋酸-联苯胺染液中浸没两次，然后竖直放置，待5-10min后POD同工酶显色最佳时进行观察。
2.2、结果
从图1可以看出，以体积分数为20％的乙醇溶液为抑雄扬雌层析液，在染色后，雌树的蓝色条带在综向上更长(1、3、7、10，2、8)，表明酶谱范围更宽，雄树的条带在综向上较窄，条带斑点也没有雌性明显，表明其有活性的同工酶种类较少，且活性低于雌性的。对17棵雌树和雄树的检测表明，雌树的正确鉴别率为83％，雄树鉴定的正确鉴别率为73％，对已知雌雄植株的根孽苗的叶进行鉴定表明，该法可以对苗期胡杨进才鉴定。对幼树检测表明，幼树的条带与成树略有差异，但根据成树得到的规律，可以认定标号为1、3、4、5、11、12、13、16、24、28、29等11个样品符合雌性树的特征，可以判定是胡杨雌性幼树，而另外的19个样品符合雄性树的特征，则判断为胡杨雄性幼树(图2)。上述结构表明其可用于雌雄树的鉴别。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

Claims (4)

1.基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)蛋白提取：在秋天叶子已经变黄时，取下叶片洗净，称取叶片，剪碎后加入蒸馏水迅速冰浴研磨成匀浆，得到的匀浆用纱布过滤，然后用离心管收集滤液；
(2)点样：在滤纸条底部划点样线，将收集的滤液用移液器轻点到点样线上，待样品印记稍干即可层析；
(3)层析：选用体积分数为20％-30％的乙醇溶液作为抑雄扬雌层析液，将抑雄扬雌层析液倒入培养皿中，液面刚好蔓延完培养皿底部，将滤纸条竖直插入培养皿中，点样线不能触碰到液面，然后用胶布竖直固定滤纸条，开始层析；等待60-90min后，当层析水线超过滤纸条的一半以上后即可取出染色；
(4)染色：配制醋酸-联苯胺染液，将其倒入喷壶中，均匀喷涂在水平放置的滤纸条上，待POD同工酶显色；5-10min后滤纸上出现蓝色印迹开始观察；
(5)雌雄鉴别：如果蓝色印迹呈现偏细长的纵向条带则为雌性树，如果蓝色印迹呈横向条带或条带很弱则为雄性树；
树木为胡杨或其它含有POD同工酶的树木。
2.根据权利要求1所述的基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，其特征在于，在步骤(1)中：在秋天叶子已经变黄时，取下叶片洗净后，称取0.5g叶片，剪碎后加入2mL蒸馏水迅速冰浴研磨成匀浆，得到的匀浆用纱布过滤，然后用5mL离心管收集滤液。
3.根据权利要求1所述的基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，其特征在于，在步骤(2)中：在距离滤纸条底部1cm处划点样线，将收集的滤液用移液器轻点到点样线上，点样10-15uL，待样品印记稍干即可层析。
4.根据权利要求1所述的基于纸层析的树木雌雄鉴别方法，其特征在于，在步骤(4)中：醋酸-联苯胺染液配制方法如下：称取1g联苯胺，先用18mL温热的冰醋酸溶解，再加入2mL蒸馏水，完全溶解后室温储存即为染色液母液；使用时取0.5mL母液，加入9.3mL蒸馏水，加入0.2mL、3wt％的H2O2溶液，混匀。
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