CN109724977B - 一种简便的树木雌雄鉴别方法 - Google Patents

一种简便的树木雌雄鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种简便的树木雌雄鉴别方法，包括如下步骤：(1)脱蜡；(2)抑雄扬雌试剂处理：抑雄扬雌试剂为乙醇溶液，乙醇溶液的浓度为20‑30％；(3)染色；(4)雌雄鉴别：叶子染色较深，甚至接近黑色的是雌树；染色不明显的是雄树。本发明方法简单、结果可靠、鉴别成本低廉且便于推广应用；相比传统的电泳方法，鉴别成本极其低廉，操作非常简单，林业从业人员仅需经过简单的培训即可完全掌握。

Description

一种简便的树木雌雄鉴别方法
技术领域
本发明涉及树木雌雄鉴别技术领域。具体地说是简便的树木雌雄鉴别方法。
背景技术
雌雄异株是指一类植物可以区分为雌树雄树，雌树仅开雌花，雄树仅有雄花。自然界约有5％的植物是雌雄异株，因为在结果等一些特征上的差异，人们在利用雌雄异株的植物时往往需要在苗期鉴别雌雄。早期人们是利用雌雄植株幼苗在形态上的细微特征来进行鉴别，但这些方法适用的种类非常有限，且准确性也非常低，目前探索使用的方法有同工酶法，SSR法，这些方法虽然准确性较高，但需要专门的仪器，仅能在实验室完成，且费用较大，仅具有实验室科研价值，难以推广到实际生活生产中应用。目前并没有方法简单、结果可靠、便于推广应用的树木雌雄鉴别方法。
在新疆，胡杨是一种常见的城市园林绿化和道路景观树种，其耐盐，耐旱，适应性广。但成年胡杨雌树在秋天果絮漫天飘，容易对行人和环境造成不良影响，且胡杨扦插技术因为成活率不高目前并不成熟，而未得到广泛的应用，所以胡杨繁殖方式仍以种子繁殖为主，在育苗时无法选择雌雄，需要在后期加以鉴别。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种方法简单、结果可靠且便于推广应用的树木雌雄鉴别方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种简便的树木雌雄鉴别方法，包括如下步骤：
(1)脱蜡；
(2)抑雄扬雌试剂处理：抑雄扬雌试剂为乙醇溶液，乙醇溶液的浓度为20-30％；
(3)染色；
(4)雌雄鉴别：叶子染色较深，甚至接近黑色的是雌树；染色不明显的是雄树。
上述简便的树木雌雄鉴别方法，在步骤(2)中：脱蜡后的叶子在乙醇溶液中浸泡的时间不少于5分钟。
上述简便的树木雌雄鉴别方法，在步骤(2)中：脱蜡后的叶子在乙醇溶液中浸泡的时间为5分钟。
上述简便的树木雌雄鉴别方法，在步骤(1)中：在秋天叶子已经变黄时，将需要检测的树苗标记，排序；每棵树取一片叶子，取下的叶片洗净后，按顺序将叶片用一根细线或细绳从树叶与叶柄连接处穿起，然后放入密闭容器；往密闭容器中加入三氯甲烷，密封浸泡时间为2-5分钟。
上述简便的树木雌雄鉴别方法，在步骤(1)中：密封浸泡时间为3分钟。
上述简便的树木雌雄鉴别方法，在步骤(3)中：将叶子取下，按顺序摆放，然后将配制好的醋酸-联苯胺染液用喷壶均匀喷涂在叶子上，待3-5min后POD同工酶充分显色时开始观察；醋酸-联苯胺染液配制方法如下：称取1g联苯胺，先用18mL温热的冰醋酸溶解，再加入2mL蒸馏水，完全溶解后室温储存即为染色液母液；使用时取0.5mL母液，加入9.3mL蒸馏水，加入0.2mL、质量分数为3wt％的H2O2溶液，混匀。
上述简便的树木雌雄鉴别方法，在步骤(1)中：在秋天叶子已经变黄时，将需要检测的树苗标记，排序；每棵树取一片叶子，取下的叶片洗净后，按顺序将叶片用一根细线或细绳从树叶与叶柄连接处穿起，然后放入密闭容器；往密闭容器中加入三氯甲烷，密封浸泡时间为2-5分钟；在步骤(3)中：将叶子取下，按顺序摆放，然后将配制好的醋酸-联苯胺染液用喷壶均匀喷涂在叶子上，待3-5min后POD同工酶充分显色时开始观察。
上述简便的树木雌雄鉴别方法，在步骤(1)中：在秋天叶子已经变黄时，将需要检测的树苗标记，排序；每棵树取一片叶子，取下的叶片洗净后，按顺序将叶片用一根细线或细绳从树叶与叶柄连接处穿起，然后放入密闭容器；往密闭容器中加入三氯甲烷，密封浸泡时间为3分钟；在步骤(2)中：脱蜡后的叶子在乙醇溶液中浸泡的时间为5分钟；在步骤(3)中：将叶子取下，按顺序摆放，然后将配制好的醋酸-联苯胺染液用喷壶均匀喷涂在叶子上，待3-5min后POD同工酶充分显色时开始观察；醋酸-联苯胺染液配制方法如下：称取1g联苯胺，先用18mL温热的冰醋酸溶解，再加入2mL蒸馏水，完全溶解后室温储存即为染色液母液；使用时取0.5mL母液，加入9.3mL蒸馏水，加入0.2mL、质量分数为3wt％的H2O2溶液，混匀。
上述简便的树木雌雄鉴别方法，树木为胡杨或其它含有POD同工酶的树木。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：本发明方法简单、结果可靠、鉴别成本低廉且便于推广应用；传统的电泳方法虽然也可以利用联苯胺染色鉴别树木雌雄，但是代价高昂、操作复杂，不适宜在林业生产中推广应用。本发明通过筛选pH不同的多种盐溶液、多种有机溶剂、多种有机混合溶剂以及多种有机溶剂与水的混合溶剂，选定乙醇作为浸泡试剂，并对体积浓度为1％-75％的乙醇溶液进行试验，筛选出体积浓度为20％-30％的乙醇溶液作为最终的抑雄扬雌试剂(试验过程中发现体积分数为20％-30％的乙醇溶液具有抑制雄树叶中POD同工酶活性的作用，而雌树叶POD同工酶活性不受抑制，相对雄树叶来说，其POD同工酶活性反而得到增强，因而发明人将体积分数为20％-30％的乙醇溶液命名为抑雄扬雌试剂)，使得雌雄树叶显色出现较大的差异，从而实现鉴别雌雄树木的目的；鉴别成本极其低廉，操作非常简单，林业从业人员仅需经过简单的培训即可完全掌握。
对于雌雄树叶脱蜡来说，虽然可供作为脱蜡的有机溶剂有很多，但是发明人在试验中发现：正丁醇、乙醚和石油醚等有机溶剂作为脱蜡溶剂，最终并不能实现雌雄树木鉴别的目的，这可能是由于正丁醇、乙醚和石油醚等作为脱蜡溶剂破坏了雌雄树叶中特定POD同工酶的活性，导致使用体积分数为20％-30％的乙醇溶液浸泡并不能起到抑雄扬雌的作用。另外，脱蜡时间要控制在2-5分钟，太短则不能实现有效脱蜡，太长则三氯甲烷会破坏POD同工酶的活性，导致无法实现鉴别雌雄树木的目的。
附图说明
图1为脱蜡、乙醇浸泡及染色前的叶子；
图2为脱蜡、乙醇浸泡及染色后的叶子；
图3为脱蜡、乙醇浸泡及染色前的幼树叶子；
图4为脱蜡、乙醇浸泡及染色后的幼树叶子。
具体实施方式
一、鉴定方法
1.1、仪器和试剂
仪器：密闭性容器(如有盖的玻璃茶杯)、喷壶等。
试剂：醋酸、联苯胺、H2O2、三氯甲烷(氯仿)、乙醇。
试剂配制：
醋酸-联苯胺染液：称取1g联苯胺，先用18mL温热的冰醋酸溶解，再加入2mL蒸馏水，完全溶解后室温储存即为染色液母液。使用时取0.5mL母液，加入9.3mL蒸馏水，加入0.2mL、质量分数为3wt％的H2O2溶液，混匀。
抑雄扬雌试剂：20％乙醇溶液，取20mL无水乙醇到烧杯中，加蒸馏水定容到100mL，装瓶备用。
1.2、鉴定方法
脱蜡：在秋天叶子已经变黄时，将需要检测的树苗标记，排序。每棵树取一片叶子，取下叶片洗净后，按顺序将叶片用一根细线或细绳从树叶与叶柄连接处穿起(以防在操作过程中顺序混乱)，然后放入密闭性容器，加入三氯甲烷，盖上盖子，浸泡3分钟。
乙醇处理：将脱蜡后的叶子放入20％乙醇溶液中，浸泡5分钟。
染色：将叶子从线绳上取下，按顺序摆放，然后将配制好的醋酸-联苯胺染液用喷壶均匀喷涂在叶子上，待3-5min后POD同工酶充分显色时开始观察。
雌雄鉴别：叶子染色较深，甚至接近黑色的是雌树，反之，染色不明显的是雄树。
二、胡杨雌雄鉴定实例
2.1、实验过程
取材：根据春季开花时期以及夏秋季飘絮时期对胡杨成树性别进行鉴定与标记，在秋季共取胡杨成树叶片样品34个，其中雄性样品17个，雌性样品17个，胡杨幼树叶片样品38个。并对每个样品叶片进行封装、标记，并放入4℃冰箱保存备用。
试剂准备：参见“一、鉴定方法中1.1、仪器和试剂”。
脱蜡：在秋天叶子已经变黄时，将需要检测的树苗标记，排序。每棵树取一片叶子，取下叶片洗净后，按顺序将叶片用一根从细线从树叶与叶柄连接处穿起(以防在操作过程中顺序混乱)，然后放入密闭性容器，加入三氯甲烷，盖上盖子，浸泡3分钟。
乙醇处理：将脱蜡后的叶子放入20％乙醇溶液中，浸泡5分钟。
染色：将叶子从线绳上取下，按顺序摆放，然后将配制好的醋酸-联苯胺染液用喷壶均匀喷涂在叶子上，待3-5min后POD同工酶充分显色时开始观察。
雌雄鉴别：叶子染色较深，甚至接近黑色的是雌树，反之，染色不明显的是雄树。
2.2、实验结果
从图1和图2可以看出，在脱蜡、乙醇浸泡及染色后，成树雌树叶子染色面积较大，颜色较深，多呈黑色，而雄树叶颜色较浅，差异非常明显。对17棵雌树、17棵雄树的检测表明，用该方法，雌树的鉴别准确率94.1％，雄树的鉴别准确率88.2％，总准确率达到91.2％，对已知雌雄植株的根孽苗的叶进行鉴定表明，该法可以对苗期胡杨进才鉴定。
同时，发明人也用这个方法对种子繁育的胡杨幼苗做了鉴定，从图3和图4可以看出胡杨幼树的叶子(胡杨有异形叶性，成树为宽卵形叶，小树为条形或披针形叶)因为本身较绿，没有成树容易观察，但处理后染色也有明显差异，可以看出1、2和8是雄树，而3、4、5、6、7是雌树。充分说明本方法是一种高效，简便的树木雌雄鉴定方法。
发明人以胡杨为样本，发明了一种简便宜行的树木雌雄鉴别方法，并用事先标记好雌雄的胡杨树，对这个方法进行了验证，证明此方法可以鉴别树木的雌雄。
本发明方法简单、结果可靠、鉴别成本低廉且便于推广应用；相比传统的电泳方法，鉴别成本极其低廉，操作非常简单，林业从业人员仅需经过简单的培训即可完全掌握。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种简便的树木雌雄鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）脱蜡：在秋天叶子已经变黄时，将需要检测的树苗标记，排序；每棵树取一片叶子，取下的叶片洗净后，按顺序将叶片用一根细线或细绳从树叶与叶柄连接处穿起，然后放入密闭容器；往密闭容器中加入三氯甲烷，密封浸泡时间为2-5分钟；
（2）抑雄扬雌试剂处理：抑雄扬雌试剂为乙醇溶液，乙醇溶液的浓度为20-30%；脱蜡后的叶子在乙醇溶液中浸泡的时间不少于5分钟；
（3）染色：将叶子取下，按顺序摆放，然后将配制好的醋酸-联苯胺染液用喷壶均匀喷涂在叶子上，待3-5min后POD同工酶充分显色时开始观察；醋酸-联苯胺染液配制方法如下：称取1g联苯胺，先用18mL温热的冰醋酸溶解，再加入2mL蒸馏水，完全溶解后室温储存即为染色液母液；使用时取0.5 mL母液，加入9.3mL蒸馏水，加入0.2 mL、质量分数为3wt%的H2O2溶液，混匀；
（4）雌雄鉴别：叶子染色较深，甚至接近黑色的是雌树；染色不明显的是雄树；树木为胡杨或其它含有POD同工酶的树木。
2.根据权利要求1所述的简便的树木雌雄鉴别方法，其特征在于，在步骤（2）中：脱蜡后的叶子在乙醇溶液中浸泡的时间为5分钟。
3.根据权利要求1所述的简便的树木雌雄鉴别方法，其特征在于，在步骤（1）中：密封浸泡时间为3分钟。
4.根据权利要求1所述的简便的树木雌雄鉴别方法，其特征在于，在步骤（1）中：在秋天叶子已经变黄时，将需要检测的树苗标记，排序；每棵树取一片叶子，取下的叶片洗净后，按顺序将叶片用一根细线或细绳从树叶与叶柄连接处穿起，然后放入密闭容器；往密闭容器中加入三氯甲烷，密封浸泡时间为3分钟；在步骤（2）中：脱蜡后的叶子在乙醇溶液中浸泡的时间为5分钟；在步骤（3）中：将叶子取下，按顺序摆放，然后将配制好的醋酸-联苯胺染液用喷壶均匀喷涂在叶子上，待3-5min后POD同工酶充分显色时开始观察；醋酸-联苯胺染液配制方法如下：称取1g联苯胺，先用18mL温热的冰醋酸溶解，再加入2mL蒸馏水，完全溶解后室温储存即为染色液母液；使用时取0.5 mL母液，加入9.3mL蒸馏水，加入0.2 mL、质量分数为3wt%的H2O2溶液，混匀。
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