CN110749489B - 一种快速检测葛仙米种子活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)葛仙米种子预处理；(2)匀浆处理；(3)果胶酶处理：取一定量藻丝匀浆，加入果胶酶至果胶酶的最终浓度为200～400ul/ml，混匀后在30℃水浴锅中反应3～10min，然后离心，弃去上层清液终止反应，收集藻丝匀浆沉淀，之后于藻丝匀浆沉淀中加入稀释10倍后的BG‑110培养液，涡旋混匀器混匀；(4)染色处理；(5)显微观察。本发明方法克服了现有方法中需对葛仙米种子分级扩大培养后统计生长速度并观察生长状态而用时较长的技术难题，具有操作方便、快速、省时省力的特点，适合规模化生产。

Description

一种快速检测葛仙米种子活性的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种快速检测葛仙米种子活性的方法。
背景技术
葛仙米，又名天仙米、黑珍珠，是地球上淡水资源中最高级的一种藻类生物，在生物学分类中属于蓝藻纲，念珠藻科，学名：拟球状念珠藻(Nostoc sphaeroids)。形态方面，葛仙米细胞呈球形，由多数细胞连成念珠状群体，外包胶质，形成胶质状、球状或其他不规则形状颗粒，蓝绿色或黄褐色。野生葛仙米附生于水中的沙石间或阴湿的泥土上，原产湖北鹤峰，目前由于化肥、农药等的大量使用以及环境的污染和恶化，导致该物种几乎绝迹。葛仙米的化学成分分析表明：其干物质总蛋白含量高达56％左右，含18种氨基酸，其中含人体必需的8种氨基酸，粗脂肪含量为8.11％，主要分布在细胞膜，含不饱和脂肪酸；含有丰富的VC、VE和B族维生素；含矿物质l5种，最丰富的有磷、硫、钙、钾、铁等，微量元素有锌、铜、锰，其含钙量高于一般蔬菜；葛仙米还含有叶绿素、β-胡萝卜素、藻蓝素和藻胆蛋白等优质生物活性成分。应用方面葛仙米可应用于名贵食材、功能性保健食品、潜在药物原料及美容护肤产品等领域，开发潜力广阔。
葛仙米为我国特有藻种，国外未见相关报道。为了保护资源并满足市场日益增长的需求，许多研究人员和院所对葛仙米的人工培养方法进行了研究，但在研究过程中发现，葛仙米种子的活性对葛仙米的培养过程的影响非常大。如果种子活性低，葛仙米培养所需的光、温等条件也要求较高，随之培养周期也拉长，且成品产量不高，品相也较差。相反，种子活性力高，则葛仙米在培养过程中生长周期短，易于分级扩大培养，成品品质较高。因此，在培养初期筛选高活力的葛仙米种子显得尤为重要。
传统的葛仙米种子活力的测定方法需要将葛仙米种子液加入分级扩大培养液中一步一步地扩大培养，通过统计葛仙米生长速度、取样观察葛仙米生长状态的手段来确定种子的质量，不仅耗时、耗力，还造成资源的浪费和成本的增加，不利于在大规模培养中应用。
曲利本蓝拒染法是利用曲利本蓝只能将死细胞染成蓝色而活力强的细胞不能被染上的方法检测细胞活性的一种快速简便的方法。活性强的细胞具有完整的细胞膜结构，而死亡或活性低的细胞其细胞膜结构损伤或被破坏，曲利本蓝无法通过正常的细胞膜因而正常的细胞不被曲利本蓝染上，而死细胞则可被曲利本蓝染成蓝色。由于葛仙米细胞壁外表面有一层胶质衣鞘，胶质衣鞘主要成分为果胶质，会阻碍染色剂进入细胞，因此，常规条件下无论葛仙米有无活性，均无法使曲利本蓝进入葛仙米细胞体，自然不能通过染色的方法进行检测。因此，本发明通过实验探索，选用果胶酶对葛仙米种子液进行处理，再使用曲利本蓝染色液进行染色，最后通过显微镜下直接计数观察或显微镜下拍照后计数观察，可以非常简便、快速地对葛仙米种子活性进行准确的界定和评价，进而为大规模生产奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测葛仙米种子活性的方法。
本发明通过下述技术方案实现。
一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)葛仙米种子预处理：取葛仙米种子用双氧水消毒，之后再用纯净水冲洗，然后转移至稀释后的BG-110培养液中，使葛仙米的质量与稀释后的BG-110培养液的质量体积比为1:5～12g/mL；
(2)匀浆处理：将葛仙米和培养液一同倒入匀浆器中处理2～3min，制备成藻丝匀浆；
(3)果胶酶处理：取一定量藻丝匀浆，加入果胶酶至果胶酶的最终浓度为200～400ul/ml，混匀后在30℃水浴锅中反应3～10min，然后离心，弃去上层清液终止反应，收集藻丝匀浆沉淀，之后于藻丝匀浆沉淀中加入稀释10倍后的BG-110培养液，涡旋混匀器混匀；
(4)染色处理：将0.4％曲利本蓝溶液加入到处理好的藻丝匀浆中混匀，染色4～5min；
(5)显微观察：染色完成后制作装片，显微镜下观察染色情况，判断葛仙米种子活性。
作为优选技术方案，所述步骤(1)葛仙米种子预处理中，将葛仙米种子用稀释100倍的双氧水消毒2～3次，每次30～40s，之后再用纯净水冲洗2～3次。
作为优选技术方案，所述步骤(1)葛仙米种子预处理中，葛仙米的质量与稀释后的BG-110培养液的质量体积比为1:10g/mL。
作为优选技术方案，所述步骤(3)果胶酶处理中，加入果胶酶至果胶酶的最终浓度为300ul/ml。
作为优选技术方案，所述步骤(3)果胶酶处理中，藻丝匀浆沉淀与稀释10倍后的BG-110培养液的质量体积比为1:100g/mL。
作为优选技术方案，所述步骤(3)果胶酶处理中，离心的条件为5000～9000r/min离心0.5～3min。
作为优选技术方案，所述步骤(3)果胶酶处理中，离心的条件为7000r/min离心1min。
作为优选技术方案，所述步骤(4)染色处理中，0.4％曲利本蓝溶液与藻丝匀浆的质量比为1:10g/g。
本发明有益效果：本发明所提供的检测葛仙米种子活力的方法，克服了现有方法中需对葛仙米种子分级扩大培养后统计生长速度并观察生长状态而用时较长的技术难题，具有操作方便、快速、省时省力的特点，适合规模化生产。
附图说明
图1为灭活葛仙米不同果胶酶浓度处理后染色情况图；图1中A为无处理组；B为50ul/1ml酶处理组；C为150ul/1ml酶处理组；D为300ul/1ml酶处理组；
图2为活性葛仙米不同果胶酶浓度处理后染色情况图；图2中E为无处理组；F为50ul/1ml酶处理组；G为150ul/1ml酶处理组；H为300ul/1ml酶处理组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
果胶酶溶液按如下方法配置：0.5g果胶酶溶于pH＝3.6NaH2PO4(0.2mol/L)-柠檬酸(0.1mol/L)缓冲液100ml，4℃冰箱保存。
生理盐水：0.9g NaCl溶于100ml蒸馏水，室温保存。
曲利本蓝工作溶液：称取0.2g曲利本蓝粉末置于研钵加入5ml双蒸水研磨至不见颗粒且细腻的深蓝色溶液，滤纸过滤，得4％曲利本蓝溶液，装入细口试剂瓶4℃保存，使用时再用生理盐水稀释十倍成0.4％曲利本蓝溶液，现配现用。
实施例2
葛仙米种子预处理。取葛仙米种子用稀释100倍的双氧水消毒2～3次，每次30～40s，之后再用纯净水冲洗2～3次，然后转移至稀释10倍的BG-110培养液中，使葛仙米的质量与稀释10倍后的培养液的质量体积比为1:10g/mL。
实施例3
果胶酶处理参数确定。取实施例2中制备的匀浆藻丝体50ml，115℃/10min高温高压灭菌杀死葛仙米细胞，置于显微镜下观察，细胞形态完整与有活性的葛仙米细胞一样。查得果胶酶最适pH为3.0～6.0，最适温度为40～65℃。设置温度梯度10℃，30℃，50℃和酶浓度梯度0ul/ml，50ul/ml，150ul/ml，300ul/ml分别作用于活性和灭活葛仙米匀浆。
表1 有活性和灭活的葛仙米匀浆不同处理条件
Figure BDA0002282478460000041
Figure BDA0002282478460000051
一共24个处理，于1.5ml离心管中混匀后水浴锅中反应4min，然后7000r/min离心1min，弃去上层清液终止反应，按藻丝匀浆沉淀与稀释10倍后的BG-110培养液的质量体积比为1:100g/mL，加入稀释10倍后的BG-110培养液，涡旋混匀器混匀待染色。
实施例4
曲利本蓝染色。将0.4％曲利本蓝工作溶液与实施例3所得葛仙米匀浆按1:10g/g混合，稀释成0.04％工作溶液染色3～5min，然后在显微镜下观察，结果见图1、图2。由图1、图2可知，当葛仙米未经果胶酶处理时(图1中A图和图2中E图)，不管葛仙米有无活性，曲利本蓝溶液都根本无法进入葛仙米细胞内部，葛仙米仍然保持翠绿的天然颜色。而经过不同浓度的果胶酶处理后，具有活性的葛仙米因细胞膜完好无损，依然无法被染上色(图1中B、C、D图)，而被灭活的葛仙米则因细胞膜受损而被不同程度的染上颜色(图2中E、F、G图)。
实施例5
葛仙米细胞染色情况统计与结果。
表2 葛仙米细胞染色情况
反应温度 10℃ 30℃ 50℃
染色效果 细胞颜色 细胞颜色 细胞颜色
活性0ul 绿色 绿色 绿色
活性50ul 绿色 绿色 绿色
活性150ul 绿色 绿色 绿色
活性300ul 绿色 绿色 绿色
灭活0ul 绿色 绿色 绿色
灭活50ul 绿色 蓝绿色 绿色
灭活150ul 深偏蓝绿色 蓝黑色 蓝绿色
灭活300ul 蓝黑色 深蓝色 蓝黑色
根据以上实施例结果，选择酶浓度、处理温度为考查因素，以葛仙米藻丝染色情况最佳、检测活性最快为考查指标，确定检测葛仙米种子活性最佳参数为果胶酶浓度300ul/1ml，最佳反应温度为30℃。
以上实施例研究结果表明：当葛仙米未经果胶酶处理时，不管葛仙米有无活性，曲利本蓝溶液都无法进入葛仙米细胞内部，葛仙米仍然保持翠绿的天然颜色。而经过不同浓度的果胶酶处理后，有活性的藻丝细胞膜结构完整，具有选择透过性，所以曲利本蓝很难进入细胞；失去活性的藻丝体，细胞膜结构遭到破坏且葛仙米表面的多糖等物质被果胶酶降解，曲利本蓝很容易进入细胞中，使死细胞呈深蓝色，与藻丝原本的绿色对比明显，清晰易辨。
采用本发明方法对葛仙米活性进行检测，操作简便易行，结果准确可靠，在规模化的葛仙米生产过程中，既能避免传统选种方法的盲目性和滞后性，又大大节约了产业化中的时间成本和人力成本，提升了生产效率。

Claims (8)

1.一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)葛仙米种子预处理：取葛仙米种子用双氧水消毒，之后再用纯净水冲洗，然后转移至稀释后的BG-110培养液中，使葛仙米的质量与稀释后的BG-110培养液的质量体积比为1:5～12g/mL；
(2)匀浆处理：将葛仙米和培养液一同倒入匀浆器中处理2～3min，制备成藻丝匀浆；
(3)果胶酶处理：取一定量藻丝匀浆，加入果胶酶至果胶酶的最终浓度为200～400ul/ml，混匀后在30℃水浴锅中反应3～10min，然后离心，弃去上层清液终止反应，收集藻丝匀浆沉淀，之后于藻丝匀浆沉淀中加入稀释10倍后的BG-110培养液，涡旋混匀器混匀；
(4)染色处理：将0.4％曲利本蓝溶液加入到处理好的藻丝匀浆中混匀，染色4～5min；
(5)显微观察：染色完成后制作装片，显微镜下观察染色情况，判断葛仙米种子活性。
2.如权利要求1所述的一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于所述步骤(1)葛仙米种子预处理中，将葛仙米种子用稀释100倍的双氧水消毒2～3次，每次30～40s，之后再用纯净水冲洗2～3次。
3.如权利要求1所述的一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于所述步骤(1)葛仙米种子预处理中，葛仙米的质量与稀释后的BG-110培养液的质量体积比为1:10g/mL。
4.如权利要求1所述的一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于所述步骤(3)果胶酶处理中，加入果胶酶至果胶酶的最终浓度为300ul/ml。
5.如权利要求1所述的一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于所述步骤(3)果胶酶处理中，藻丝匀浆沉淀与稀释10倍后的BG-110培养液的质量体积比为1:100g/mL。
6.如权利要求1所述的一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于所述步骤(3)果胶酶处理中，离心的条件为5000～9000r/min离心0.5～3min。
7.如权利要求6所述的一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于所述步骤(3)果胶酶处理中，离心的条件为7000r/min离心1min。
8.如权利要求1～7任一所述的一种快速检测葛仙米种子活性的方法，其特征在于所述步骤(4)染色处理中，0.4％曲利本蓝溶液与藻丝匀浆的质量比为1:10g/g。
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