CN104762211A - 雨生红球藻的破壁方法 - Google Patents

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Abstract

雨生红球藻的破壁方法，涉及一种淡水藻细胞壁的破碎方法。藻种平板培养；通过血球计数板对藻液计数，接种至装有一级种子BBM+V培养基的三角瓶中培养，待藻体长至对数生长期，得一级种子液；取一级种子液接种至装有二级种子BBM+V培养基的三角瓶中培养，每天手摇2次，以防藻粘壁，得二级种子液；在三角瓶中装入发酵培养基，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接入二级种子液，放置于光照培养箱中培养，每天定期手动摇瓶2次，每组细胞做三个生物学重复；利用高压匀浆破碎法、高速珠磨法或手动研磨法对藻体进行破壁处理，取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析。

Description

雨生红球藻的破壁方法
技术领域
本发明涉及一种淡水藻细胞壁的破碎方法，具体是涉及从雨生红球藻(Haematococcuspluvialis H)中获得最大破孢率及虾青素产率的细胞壁破碎方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)是一种广泛存在于自然界中的酮式类胡萝卜素，具有很好的着色功能，在三文鱼、鲑鱼、甲壳类动物、磷虾等水产动物中分布广泛，但水产动物本身无法合成虾青素，因此虾青素在水产饲料添加剂方面有重要的应用价值。此外，虾青素具有“超级维生素E”之称，其抗氧化性能是维生素E的500倍。虾青素极强的抗氧化性和清除自由基能力使其对人类身体的健康起着重要的作用，可有效防止组织、细胞和DNA被氧化损伤[1]。超强的抗氧化能力、多样的生物活性以及艳丽的红色赋予了虾青素在水产、家禽养殖、食品、保健品、化妆品和医药等行业广泛的应用前景和市场潜力。
目前市场上的虾青素，大部分是化学合成的，化学合成虾青素过程复杂，且结构与天然虾青素不同，在动物体内不能转化成天然的反式结构，吸收效率较低[2]。随着天然虾青素的推广，人们越来越关注天然虾青素的功效。天然虾青素有三大类来源，分别是甲壳类动物中提取、红发夫酵母发酵生产以及雨生红球藻培养生产。甲壳类废弃物具有地域性限制及提取过程存在有机溶剂残留等问题，因此没有得到广泛应用。红法夫酵母是应用较多的虾青素生产菌种，易于实现高密度发酵，但是红法夫酵母的虾青素含量很低，无法满足产业化生产的需求。雨生红球藻是近年来被研究最多也是应用最广泛的一种，其体内的虾青素含量可达细胞干重的3.0％左右，最高可达4％，是虾青素含量最高的微生物，被看作是天然虾青素的“浓缩品”[3]，其虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高，且所含虾青素及其酯类的配比与水产养殖动物自身配比极为相似，这是通过化学合成和利用酵母菌等提取的虾青素所不具备的优势。因此，雨生红球藻被公认为是自然界中虾青素的最佳来源之一。
利用雨生红球藻生产虾青素引起了当前许多科研工作者的兴趣。目前主要研究内容集中在藻种诱变、培养条件优化、培养基成分和浓度优化、胁迫条件优化、虾青素分析的方法研究、提取工艺优化等几方面。但是如何获得最大细胞破碎率及虾青素提取率方面还有待研究，故本试验从破碎条件优化入手，寻求最优雨生红球藻破碎方法。细胞破碎常用的方法有酶解法、化学渗透法、高压匀浆法、超声破碎和高速珠磨法等。雨生红球藻中虾青素的提取一般采用物理的方法，以避免生物试剂和化学物质参入虾青素中，增加分离和纯化的难度。工业上多采用匀浆器，常用方法有单罐多次重复萃取和索氏提取法。专利CN 101381337A采用气流粉碎破壁，破壁率约为90％。专利CN 102012363A采用高压均质机在80～90Mpa(约13KPSI)压强下破壁。万庆家等[4]采用200～300Mpa(约40KPSI)超高压进行破壁，破壁率高。姜玲等[5]研采用超声破碎，提取率高，但需结合酸加热的方式，导致提取过程复杂。
参考文献：
[1]魏东,严小君.天然虾青素的超级抗氧化活性及其应用[J].中国海洋药物,2001,82:45-50.
[2]Bowen J,L.S.Comparison of astaxanthin accumulation in rainbow trout(Oncorhvnchus mvkiss)fed algal and synthetic astaxanthin.Abstracts of the 12th.Intemational Carotenoid Symposium[J].Cairus,Australia,1999:201-208.
[3]蔡明刚,王杉霖.利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展[J].台湾海峡,2003,22(4):537-544.
[4]万庆家，饶高雄，史晓晨等.超高压一步法萃取雨生红球藻孢子中虾青素工艺研究[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(11):24～25.
[5]姜玲,董庆霖,邢向英等.雨生红球藻细胞破碎的工艺优化[J].食品研究与开发,2010,31(7):72～75.
发明内容
本发明的目的在于提供操作简单、破壁效果好、使用范围不同的雨生红球藻的破壁方法。
所述雨生红球藻可购自中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库；地址：武汉珞珈山东湖南路7号中科院水生生物研究所淡水藻种库；电话：027-68780871。
本发明包括以下步骤：
1)藻种平板培养；
在步骤1)中，所述藻种平板培养的具体方法可为：在BBM(Bold’s Basal Medium)平板培养基中按质量百分比加入15％琼脂粉，121℃灭菌20min后，冷却至50℃，倒入平板；使用接种环从该平板中挑取少量藻体，涂画于新平板中；将新平板置于温度为23.8℃、光照强度为20μmol photos m-2s-1的光照培养箱中，培养7～10天；最后，将新平板置于避光条件下保存，每2个重新涂画一次平板，进行传代培养后再保存，以保持藻种活性；
所述BBM平板培养基组成可为NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，琼脂15～20g/L，pH 6.8，121℃灭菌20min。
2)通过血球计数板对低温保存的藻液进行计数，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接种至装有一级种子BBM+V培养基的三角瓶中，放置于光照培养箱中培养，每天定期手动摇瓶2次，以防微藻粘壁，待藻体长至对数生长期(7-10d)，得一级种子液。
在步骤2)中，所述一级种子BBM+V培养基的用量可为10mL；一级种子BBM+V培养基组成可为NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B121.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min；所述培养的条件可于22℃，20μmol photos m-2s-1，12h光照/12h黑暗条件下培养。
3)取一级种子液接种至装有二级种子BBM+V培养基的三角瓶中培养，每天手摇2次，以防藻粘壁，得二级种子液；
在步骤3)中，所述一级种子液的用量可为5mL；所述二级种子BBM+V培养基的用量可为50mL；二级种子BBM+V培养基组成可为NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B121.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min；所述接种的量按质量百分比可为一级种子液的10％；所述培养的条件可于22℃，20μmol photos m-2s-1，12h光照/12h黑暗条件下培养4天。
4)在三角瓶中装入发酵培养基，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接入二级种子液，放置于光照培养箱中培养，每天定期手动摇瓶2次，每组细胞做三个生物学重复；
在步骤4)中，所述三角瓶的容积可为500mL，装入发酵培养基的量可为200mL；发酵培养基的组成可为NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B121.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min；所述培养的条件可于22℃，20μmol photos m-2s-1，12h光照/12h黑暗条件下培养7～10d。
5)利用高压匀浆破碎法、高速珠磨法或手动研磨法对藻体进行破壁处理，取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析。
在步骤5)中，利用高压匀浆破碎法对藻体进行破壁处理，可采用英国Constant Systems公司生产的One Shot Model型高压匀浆机进行细胞破碎，具体方法可为：取3mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，离心去上清，用等体积无水乙醇重悬藻体后加入至高压匀浆仪中，调节破碎压力(40KPSI)及循环破碎次数(3次)破碎细胞，取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析；
利用高速珠磨法对藻体进行破壁处理，可采用美国Biospec公司生产的Minibeadbeater-16破碎仪进行细胞破碎，具体方法可为：取1mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，离心去上清，用等体积无水乙醇重悬藻体。将重悬后的藻液以及0.5g0.5mm的研磨珠加入至2mL离心管中，在3450rpm条件下分别振荡破碎7min后，取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析；
利用手动研磨法对藻体进行破壁处理，可取3mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入5mL超纯水洗涤，重复两次，加无水乙醇重悬后用玛瑙研钵研磨1min，10000rpm低温离心15min，保留上清液，继续研磨藻体，重复以上操作3～5次，直至沉淀呈白色，所加入的无水乙醇总体积为2mL，取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析。
上述各培养基中的微量元素及维生素可配成浓缩液，以0.2μm无菌膜过滤除菌。
本发明采用研磨法、高压匀浆法、高速珠磨法等破碎方法对雨生红球藻(Haematococcuspluvialis H)厚壁孢子进行破碎，以提取藻体虾青素。最终优化结果表明高压匀浆法及高速珠磨法这两种方法在适当的条件下对雨生红球藻厚壁孢子都具有良好的破壁效果，其中在压强为为40KPSI、匀浆次数为3次时，高压匀浆的破孢率和虾青素产率分别为94.55％和23.40mg/L；高速珠磨法在振荡时间为7min时，破孢率和虾青素产率分别为94.32％和26.98mg/L。而由于高速珠磨虽操作简便、但每次能够处理的样品量比较少，因此较适合实验室小规模破壁。高压匀浆法破壁不仅操作简便，而且耗时短，生产成本低，生产工艺简单，这都满足了工业化生产的要求，具有很大的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中利用高压匀浆破碎藻体细胞中压强和匀浆次数对破壁效果及虾青素产率的影响过程曲线。在图1中，横坐标为匀浆次数，左纵坐标为破孢率(％)右纵坐标为虾青素产率(mg/L)(●)。
图2为实施例2中利用高速研磨法破碎藻体细胞中研磨处理时间对破壁效果及虾青素产率的影响过程曲线。在图2中，横坐标为研磨处理时间(min)，左纵坐标为破孢率(％)右纵坐标为虾青素产率(●)。
图3为实施例1、2和3中三种破壁方法破孢率及虾青素产率的比较。横坐标为三种破碎方法，左纵坐标为破孢率(％)(□)，右纵坐标为虾青素产率(mg/L)(■)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作详细说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
1)藻种平板培养及保存：1、在BBM(Bold’s Basal Medium)培养基中加入15％琼脂粉，121℃灭菌20min后，冷却至50℃，倒入平板约0.5cm厚；2、使用接种环从旧平板中挑取少量藻体，涂画于新平板中；3、将平板置于温度为23.8℃、光照强度为20μmol photos m-2s-1的光照培养箱中，培养7～10天；4、最后，将平板置于室温、避光条件下保存，每2个重新涂画一次平板，进行传代培养后再保存，以保持藻种活性。BBM平板培养基组成为NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，琼脂15～20g/L，pH 6.8，121℃灭菌20min。
2)一级种子：通过血球计数板对低温保存的藻液进行计数，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接种至装有10mL BBM+V培养基的50mL三角瓶中，放置于光照培养箱中，于22℃，20μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养，每天定期手动摇瓶2次(以防微藻粘壁)，待藻体长至对数生长期(7～10d)，此为一级种子。一级种子培养基组成为BBM+V培养基：NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B121.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min。
3)二级种子：取上述藻液(即一级种子液)5mL接种至装有50mL BBM+V培养基的250mL三角瓶中(接种量10％)，于22℃，20μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养4天，每手摇2次(以防藻粘壁)，此为二级种子。二级种子培养基组成为BBM+V培养基。
4)摇瓶培养：500mL三角瓶中装入BBM+V培养基200mL，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接入二级种子液，放置于光照培养箱中，于22℃，20μmol photosm-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养(7-10d)，每天定期手动摇瓶2次。待藻细胞密度为4×105cells/ml时将光照培养箱调至120μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养(7-10d，光胁迫处理)，每组细胞做三个生物学重复。摇瓶培养培养基组成为BBM+V培养基。
5)藻体细胞破碎：利用高压匀浆破碎法进行藻体破壁处理，采用英国Constant Systems公司生产的One Shot Model型高压匀浆机进行细胞破碎。取3mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，离心去上清，用等体积无水乙醇重悬藻体后加入至高压匀浆仪中，调节破碎压力及循环破碎次数(设计方案如表1)，取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析(如表2及图1所示)。
表1为实施例1中利用高压匀浆破碎藻体细胞的具体实施方案。
表2为实施例1中利用高压匀浆破碎藻体细胞中压强和匀浆次数对破壁效果及虾青素产率的影响。
表1
表2
综合破孢率和虾青素产率两方面来看，选择高压匀浆压强为40KPSI，匀浆次数3次。此条件下破孢率达到92.95％，虾青素产率可达24.88mg/L。
实施例2
1)藻种平板培养及保存：1、在BBM(Bold’s Basal Medium)培养基中加入15％琼脂粉，121℃灭菌20min后，冷却至50℃，倒入平板约0.5cm厚；2、使用接种环从旧平板中挑取少量藻体，涂画于新平板中；3、将平板置于温度为23.8℃、光照强度为20μmol photos m-2s-1的光照培养箱中，培养7～10天；4、最后，将平板置于室温、避光条件下保存，每2个重新涂画一次平板，进行传代培养后再保存，以保持藻种活性。BBM平板培养基组成为NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，琼脂15～20g/L，pH 6.8，121℃灭菌20min。
2)一级种子：通过血球计数板对低温保存的藻液进行计数，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接种至装有10mL BBM+V培养基的50mL三角瓶中，放置于光照培养箱中，于22℃，20μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养，每天定期手动摇瓶2次(以防微藻粘壁)，待藻体长至对数生长期(7-10d)，此为一级种子。一级种子培养基组成为BBM+V培养基：NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B121.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min。
3)二级种子：取上述藻液(即一级种子液)5mL接种至装有50mL BBM+V培养基的250mL三角瓶中(接种量10％)，于22℃，20μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养4天，每手摇2次(以防藻粘壁)，此为二级种子。二级种子培养基组成为BBM+V培养基。
4)摇瓶培养：500mL三角瓶中装入BBM+V培养基200mL，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接入二级种子液，放置于光照培养箱中，于22℃，20μmol photosm-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养(7-10d)，每天定期手动摇瓶2次。待藻细胞密度为4×105cells/ml时将光照培养箱调至120μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养(7-10d，光胁迫处理)，每组细胞做三个生物学重复。摇瓶培养培养基组成为BBM+V培养基。
5)藻体细胞破碎：利用高速珠磨法进行藻体破壁处理，采用美国Biospec公司生产的Minibeadbeater-16破碎仪进行细胞破碎。取1mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，离心去上清，用等体积无水乙醇重悬藻体。将重悬后的藻液以及0.5g 0.5mm的研磨珠加入至2mL离心管中，在3450rpm条件下分别破碎1、2、3、4、5、6、7、8min后，取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析。(如表3及图2所示)
表3为实施例2中利用高速研磨法破碎藻体细胞中研磨处理时间对破壁效果及虾青素产率的影响。
表3
综合破孢率和虾青素产率两方面来看，选择在3450rpm条件下破碎7min为最优条件。此条件下破孢率达到94.32％，虾青素产率可达26.98mg/L。
实施例3
1)藻种平板培养及保存：1、在BBM(Bold’s Basal Medium)培养基中加入15％琼脂粉，121℃灭菌20min后，冷却至50℃，倒入平板约0.5cm厚；2、使用接种环从旧平板中挑取少量藻体，涂画于新平板中；3、将平板置于温度为23.8℃、光照强度为20μmol photos m-2s-1的光照培养箱中，培养7-10天；4、最后，将平板置于室温、避光条件下保存，每2个重新涂画一次平板，进行传代培养后再保存，以保持藻种活性。BBM平板培养基组成为NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，琼脂15～20g/L，pH 6.8，121℃灭菌20min。
2)一级种子：通过血球计数板对低温保存的藻液进行计数，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接种至装有10mL BBM+V培养基的50mL三角瓶中，放置于光照培养箱中，于22℃，20μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养，每天定期手动摇瓶2次(以防微藻粘壁)，待藻体长至对数生长期(7-10d)，此为一级种子。一级种子培养基组成为BBM+V培养基：NaNO32.9mM，MgSO40.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO41.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO30.18mM，EDTA-Na20.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B121.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min。
3)二级种子：取上述藻液(即一级种子液)5mL接种至装有50mL BBM+V培养基的250mL三角瓶中(接种量10％)，于22℃，20μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养4天，每手摇2次(以防藻粘壁)，此为二级种子。二级种子培养基组成为BBM+V培养基。
4)摇瓶培养：500mL三角瓶中装入BBM+V培养基200mL，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接入二级种子液，放置于光照培养箱中，于22℃，20μmol photosm-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养(7-10d)，每天定期手动摇瓶2次。待藻细胞密度为4×105cells/ml时将光照培养箱调至120μmol photos m-2s-1(12h光照/12h黑暗)条件下培养(7-10d，光胁迫处理)，每组细胞做三个生物学重复。摇瓶培养培养基组成为BBM+V培养基。
5)藻体细胞破碎：利用手动研磨法进行藻体破壁处理，取3mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入5mL超纯水洗涤，重复两次。加乙醇重悬后用玛瑙研钵研磨1min，10000rpm低温离心15min，保留上清液，继续研磨藻体，重复以上操作3-5次直至沉淀呈白色，所加入的无水乙醇总体积为2mL。取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析(由于手动研磨法的条件设置与个人的操作方式和习惯有关，因此只用作对照。实验时将研磨最彻底，沉淀颜色最白的一组作为对照。对照如图3所示。
本发明公开了一种高效破碎藻体细胞，提取藻体细胞关键物质的工艺：首先进行雨生红球藻培养，然后将单藻细胞接种于一级摇瓶种子培养基培养，一级种子再接种于种子培养基培，最后二级种子接种于发酵培养基中发酵。待藻细胞密度为4×105cells/ml时进行光胁迫处理。收集发酵液，采用研磨法、高压匀浆法、高速珠磨法对雨生红球藻厚壁孢子进行破碎，提取藻体虾青素。优化结果表明高压匀浆法及高速珠磨法这两种方法在适当的条件下对雨生红球藻厚壁孢子都具有良好的破壁效果。高速珠磨操作简便、但单次处理的样品量较少，适合实验室小规模破壁。高压匀浆法操作简便同时耗时短，生产成本低、工艺简单，满足了工业化生产的要求，具有很大的应用前景。

Claims (10)

1.雨生红球藻的破壁方法，其特征在于包括以下步骤：
1)藻种平板培养；
2)通过血球计数板对低温保存的藻液进行计数，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接种至装有一级种子BBM+V培养基的三角瓶中，放置于光照培养箱中培养，每天定期手动摇瓶2次，待藻体长至对数生长期7～10d，得一级种子液；
3)取一级种子液接种至装有二级种子BBM+V培养基的三角瓶中培养，每天手摇2次，得二级种子液；
4)在三角瓶中装入发酵培养基，按初始藻细胞密度为5×104cells/ml的细胞密度接入二级种子液，放置于光照培养箱中培养，每天定期手动摇瓶2次，每组细胞做三个生物学重复；
5)利用高压匀浆破碎法、高速珠磨法或手动研磨法对藻体进行破壁处理，取样用于类胡萝卜素释放量及细胞破碎率等参数的分析。
2.如权利要求1所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于在步骤1)中，所述藻种平板培养的具体方法为：在BBM平板培养基中按质量百分比加入15％琼脂粉，121℃灭菌20min后，冷却至50℃，倒入平板；使用接种环从该平板中挑取少量藻体，涂画于新平板中；将新平板置于温度为23.8℃、光照强度为20μmol photos m-2s-1的光照培养箱中，培养7～10天；最后，将新平板置于避光条件下保存，每2个重新涂画一次平板，进行传代培养后再保存，以保持藻种活性。
3.如权利要求2所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于所述BBM平板培养基组成为NaNO3 2.9mM，MgSO4 0.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO4 1.29mM，CaCl2·2H2O0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO3 0.18mM，EDTA-Na2 0.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+1.8mM，琼脂15～20g/L，pH 6.8，121℃灭菌20min。
4.如权利要求1所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于在步骤2)中，所述一级种子BBM+V培养基的用量为10mL；
在步骤3)中，所述一级种子液的用量为5mL；所述二级种子BBM+V培养基的用量可为50mL。
5.如权利要求1所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于在步骤2)中，所述一级种子BBM+V培养基的组成为NaNO3 2.9mM，MgSO4 0.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO4 1.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO3 0.18mM，EDTA-Na2 0.12mM，ZnSO4·7H2O0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O0.0017mM，EDTA-Fe3+ 1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B12 1.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min；
在步骤3)中，所述二级种子BBM+V培养基的组成为NaNO3 2.9mM，MgSO4 0.3mM，NaCl0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO4 1.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO3 0.18mM，EDTA-Na2 0.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+ 1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B121.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min；
在步骤4)中，所述发酵培养基的组成为NaNO3 2.9mM，MgSO4 0.3mM，NaCl 0.43mM，K2HPO4·3H2O 0.43mM，KH2PO4 1.29mM，CaCl2·2H2O 0.17mM，KOH 0.55mM，H3BO3 0.18mM，EDTA-Na2 0.12mM，ZnSO4·7H2O 0.0307mM，MnCl2·4H2O 0.0073mM，冰钼酸钠0.0049mM，CuSO4·5H2O 0.0063mM，Co(NO3)2·6H2O 0.0017mM，EDTA-Fe3+ 1.8mM，thiamine 1.0ppm，biotin 2.5bpm，Vitamin B12 1.5bpm，pH 6.8，121℃灭菌20min。
6.如权利要求1所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于在步骤2)和3)中，所述培养的条件均是于22℃，20μmol photos m-2s-1，12h光照/12h黑暗条件下培养。
7.如权利要求1所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于在步骤4)中，所述三角瓶的容积为500mL，装入发酵培养基的量为200mL；所述培养的条件可于22℃，20μmol photosm-2s-1，12h光照/12h黑暗条件下培养7～10d。
8.如权利要求1所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于在步骤5)中，利用高压匀浆破碎法对藻体进行破壁处理，采用英国Constant Systems公司生产的One Shot Model型高压匀浆机进行细胞破碎，具体方法为：取3mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，离心去上清，用等体积无水乙醇重悬藻体后加入至高压匀浆仪中，调节破碎压力及循环破碎次数破碎细胞。
9.如权利要求1所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于在步骤5)中，利用高速珠磨法对藻体进行破壁处理，采用美国Biospec公司生产的Minibeadbeater-16破碎仪进行细胞破碎，具体方法为：取1mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，离心去上清，用等体积无水乙醇重悬藻体，将重悬后的藻液以及0.5g 0.5mm的研磨珠加入至2mL离心管中，在3450rpm条件下分别振荡破碎7min。
10.如权利要求1所述雨生红球藻的破壁方法，其特征在于在步骤5)中，利用手动研磨法对藻体进行破壁处理，是取3mL 50L培养结束后的藻液，藻体浓度约为2g/L，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入5mL超纯水洗涤，重复两次，加无水乙醇重悬后用玛瑙研钵研磨1min，10000rpm低温离心15min，保留上清液，继续研磨藻体，重复以上操作3～5次，直至沉淀呈白色，所加入的无水乙醇总体积为2mL。
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