CN108048329A - 一种微藻细胞破壁的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种微藻细胞破壁方法。本发明提供了一种以经高压微射流处理破碎微藻细胞壁的方法，该方法不仅缩短了破碎时间，还提高了破碎率。实验表明，本发明提供方法能够在10min～20min时间内，将微藻的破碎率达到80％～88％。且以本发明提供方法制备的破壁微藻能够用于制备微藻提取物，从而提高有效成分的提取率。所述有效成分包括但不限于多糖、蛋白质、色素或脂类。例如，对藻油进行提取的效率与传统方法相比能够提高20％～30％。

Description

一种微藻细胞破壁的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种微藻细胞破壁方法。
背景技术
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素、脂类等丰富营养和多种生物活性物质，使其在食品、医药、基因工程等领域具有很好的开发前景。微藻的蛋白质含量很高，粗蛋白含量超过60％，是单细胞蛋白的一个重要来源。β-胡萝卜素含量高达14％，具有着色和营养的作用。藻多糖可作为免疫佐剂增强抗原性和机体免疫功能。丰富的油脂，尤其是不饱和脂肪酸可广泛用于保健、食用和医用。从微藻中提取功效活性成分并制备加工成具有经济效益的健康产品具有很大的研究开发价值。
微藻细胞破壁是提取胞内活性成分的关键步骤，且是长期以来困扰微藻产品高值化的瓶颈问题。分析认为：微藻存在细胞小(2～20μm)，细胞壁厚的特点，它们的细胞包膜通常比其他微生物或高等植物的细胞包膜更刚性。据报道微藻细胞壁的拉伸强度可以达到9.5MPa。微藻细胞壁通常是三层结构，主要由纤维素或硅质、果胶、甘露糖、木聚糖组成，细胞壁结构坚固，很难破除，必须借助外力才能破坏。
现有的微藻破壁方法有①物理法，如高压匀浆破碎法、超声波破碎法、脉冲电场、微波破碎法、反复冻融法等；②化学法，如酸热法、化学渗透法；③生物法，如酶溶细胞破壁法等。其中，物理破碎法的破碎率达到70％左右，但物理破壁法需要消耗较大能量，产生的热降低了胞内物质如蛋白质、胡萝卜素、脂肪酸的生物活性。化学法的破碎率在60％左右，但化学法易对功能成分造成污染，后续处理工艺繁琐。而生物破壁法，反应时间长、成本高，不利于工业化生产。
可见，现有对微藻的破碎方法皆存在一定的局限性，因此，进一步开发微藻细胞壁的破碎方法仍具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种微藻细胞破壁方法，该方法破壁效率高，对功能成分无污染，无损失。
本发明提供的微藻细胞破壁方法为，微藻预培养后，经高压微射流处理，获得破壁微藻；
所述高压微射流处理的温度为20℃～30℃，时间10min～20min；压力为70MPa～200MPa，流量为20mL/min～100mL/min。
一些实施例中，压力为70MPa，流量为20mL/min，处理15min。
一些实施例中，压力为200MPa，流量100mL/min，处理20min。
一些实施例中，压力为120MPa，流量为60mL/min，处理10min。
本发明实施例中，所述预培养的温度为20℃～30℃，时间1h～2h。
一些实施例中，所述预培养的温度为20℃，时间1h。
一些实施例中，所述预培养的温度为30℃，时间2h。
一些实施例中，所述预培养的温度为25℃，时间1.5h。
本发明实施例中，所述预培养微藻的初始密度为104ind/mL～107ind/mL。
一些实施例中，所述预培养微藻的初始密度为107ind/mL。
一些实施例中，所述预培养微藻的初始密度为104ind/mL。
一些实施例中，所述预培养微藻的初始密度为105ind/mL。
本发明实施例中，所述预培养采用BG11液体培养基，pH值为6～9。
一些实施例中，所述的pH值为6、9或7.5。
本发明实施例中，所述预培养前还包括扩大培养的步骤，具体为：将单一藻株接入BG11液体培养基中，温度为20℃～25℃，光照强度为2000lux～4000lux、光暗比L/D为(14～16)：(12～10)，培养20h～24h。
一些实施例中，扩大培养的温度为20℃，光照强度为2000lux、光暗比L/D为14:12，培养20h。
一些实施例中，扩大培养的温度为25℃，光照强度为4000lux、光暗比L/D为16:10，培养22。
一些实施例中，扩大培养的温度为23℃，光照强度为3000lux、光暗比L/D为13:11，培养24h。
所述BG11培养基由以下物质组成：Na2EDTA1mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，柠檬酸6mg/L，CaCl2·2H2O36mg/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，K2HPO4·3H2O40mg/L，H3BO3 2.86mg/L，MnCl2·4H2O 1.81mg/L，ZnSO4·7H2O 0.222mg/L，CuSO4·5H2O 0.079mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.391mg/L，Na2CO3 20mg/L，NaNO3 1500mg/L。
本发明实施例中，所述微藻为小球藻。
本发明所述破壁方法制备的破壁微藻。
本发明提供方法能够在10min～20min时间内，将微藻的破碎率达到80％～88％，不仅缩短了破碎时间，还提高了破碎率。以本发明提供方法制备的破壁微藻能够用于制备微藻提取物，从而提高有效成分的提取率。所述有效成分包括但不限于多糖、蛋白质、色素或脂类。而以本发明提供方法制备的破壁微藻直接制备保健食品或药品也能够提高吸收效率，从而提高生物利用度。
本发明还提供了一种微藻提取物，其以本发明所述破壁方法制备的破壁微藻为原料经提取制得。
所述提取物为藻油，提取方法为，将所述破壁微藻与正己烷混合，摇床提取后，离心取得上清液，经干燥，获得藻油。
本发明中，所述破壁微藻与正己烷的体积比为1：(1～2)。
一些实施例中，所述破壁微藻与正己烷的体积比为1：1。
一些实施例中，所述破壁微藻与正己烷的体积比为1：1.5。
一些实施例中，所述破壁微藻与正己烷的体积比为1：2。
本发明中，所述摇床的转速为150～200r/min；提取时间为15～20h。
离心的转速为2000～3000r/min，时间为10～15min。
所述干燥为烘干，温度为95℃，时间为1～3h。
一些实施例中，所述摇床的转速为150r/min；提取时间为15h。
离心的转速为2000r/min，时间为15min。
所述干燥为烘干，温度为95℃，时间为1h。
一些实施例中，所述摇床的转速为200r/min；提取时间为20h。
离心的转速为3000r/min，时间为10min。
所述干燥为烘干，温度为95℃，时间为3h。
一些实施例中，所述摇床的转速为180r/min；提取时间为18h。
离心的转速为2500r/min，时间为12min。
所述干燥为烘干，温度为95℃，时间为2h。
以本发明提供的破壁微藻为原料，提取藻油的提取率为75％～80％。
本发明提供的破壁微藻或微藻提取物在制备保健食品或药物中的应用。
一种保健食品或药物，包括本发明提供的破壁微藻或微藻提取物。
本发明提供了一种以经高压微射流处理破碎微藻细胞壁的方法，该方法不仅缩短了破碎时间，还提高了破碎率。实验表明，本发明提供方法能够在10min～20min时间内，将微藻的破碎率达到80％～88％。且以本发明提供方法制备的破壁微藻能够用于制备微藻提取物，从而提高有效成分的提取率。所述有效成分包括但不限于多糖、蛋白质、色素或脂类。例如，对藻油进行提取的效率与传统方法相比能够提高20％～30％。
具体实施方式
本发明提供了一种微藻细胞破壁方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材和试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
在无菌条件下，挑选保存在平板上且生长良好的单一小球藻株接入BG11液体培养基中，维持温度在20℃，光照强度为2000lux、光暗比L/D为14：12。通过稀释方法，将微藻浓度调整在107ind/mL，利用HCL溶液，调节微藻pH为6，在20℃恒温培养箱1h。在高压微射流均质机中处理微藻，压力为70MPa,流量为20mL/min，处理15min，即得破壁微藻。
实施例2
在无菌条件下，挑选保存在平板上且生长良好的单一小球藻株接入BG11液体培养基中，维持温度在25℃，光照强度为4000lux、光暗比L/D为16：10。通过离心浓缩方法，将微藻浓度调整在104ind/mL，利用HCL溶液，调节微藻pH为9，在30℃恒温培养箱2h。在高压微射流均质机中处理微藻，压力为200MPa,流量100mL/min，处理20min，即得破壁微藻。
实施例3
在无菌条件下，挑选保存在平板上且生长良好的单一小球藻株接入BG11液体培养基中，维持温度在23℃，光照强度为3000lux、光暗比L/D为13：11。通过稀释方法，将微藻浓度调整在105ind/mL，利用HCL溶液，调节微藻pH为7.5，在25℃恒温培养箱1.5h。在高压微射流均质机中处理微藻，压力为120MPa，流量为60mL/min，处理10min，即得破壁微藻。
对比例1
在无菌条件下，挑选保存在平板上且生长良好的单一小球藻株接入BG11液体培养基中，维持温度在25℃，光照强度为4000lux、光暗比L/D为16：10。通过离心浓缩方法，将微藻浓度调整在105ind/mL，利用HCL溶液，调节微藻pH值为7.5，在30℃恒温培养箱1h。加入2倍体积氯仿∶甲醇(1∶1)混合液，在转速1000rpm下充分振荡10h，即得破壁微藻。
对比例2
在无菌条件下，挑选保存在平板上且生长良好的单一小球藻株接入BG11液体培养基中，维持温度在25℃，光照强度为4000lux、光暗比L/D为16：10。通过离心浓缩方法，将微藻浓度调整在105ind/mL，利用HCL溶液，调节微藻pH为7.5，在30℃恒温培养箱1h。在高压微射流均质机中处理微藻，压力为50MPa,流量30mL/min，处理10min，即得破壁微藻。
实施例4
取实施例1制备的含有破壁微藻的藻液100mL与正己烷按体积比为1：1混合后，在150r/min摇床过夜，15h后，以2000r/min的速度离心15min，收集上清液。将收集的上清液在95℃烘箱中干燥1h后称量。
实施例5
取实施例2制备的含有破壁微藻的藻液100mL与正己烷按体积比为1：2混合后，在200r/min摇床过夜，20h后，以3000r/min的速度离心10min，收集上清液。将收集的上清液在95℃烘箱中干燥3h后称量。
实施例6
取实施例3制备的含有破壁微藻的藻液100mL与正己烷按体积比为1：1.5混合后，在180r/min摇床过夜，18h后，以2500r/min的速度离心12min，收集上清液。将收集的上清液在95℃烘箱中干燥2h后称量。
对比例3
取对比例1制备的含有破壁微藻的藻液100mL与正己烷按体积比为1：2混合后，在200r/min摇床过夜，20h后，以3000r/min的速度离心10min，收集上清液。将收集的上清液在95℃烘箱中干燥3h后称量。
对比例4
取对比例2制备的含有破壁微藻的藻液100mL与正己烷按体积比为1：2混合后，在200r/min摇床过夜，20h后，以3000r/min的速度离心10min，收集上清液。将收集的上清液在95℃烘箱中干燥3h后称量。
效果验证
(1)测定细胞破碎率：通过血球计数板进行计算后获得藻细胞个数，细胞破碎率计算公式为：
Ni为藻细胞原始个数；Nf为经过细胞破碎后藻细胞个数
对破碎率的检测结果如表1：
表1破碎率检测结果
结果表明，相对于传统的化学提取法(对比例1)，实施例1～3的破碎效率有着极显著的提高(p<0.01)，说明本发明提供的方法能够快速、高效的完成对微藻的破碎。相对于参数设置不当的对比例2，实施例1～3的破碎效率也有着显著性的提高(p<0.05)。
(2)油脂提取率测定：油脂的提取率计算公式为：
W为烘干后的油脂质量；WD为每毫升藻液藻粉干重；V为藻液体积。
对提取率的检测结果如表2：
表2提取率检测结果
提取率
实施例1 78％
实施例2 80％
实施例3 75％
对比例1 58.25％
对比例2 60.34％
结果表明，相对于以传统的化学提取法(对比例1)制备的破壁微藻为原料，实施例1～3的制备的破壁微藻的提取率有着极显著的提高(p<0.01)，相对于参数设置不当的对比例2，实施例1～3的制备的破壁微藻制备藻油的提取率也有着显著性的提高(p<0.05)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微藻细胞破壁方法，其特征在于，微藻预培养后，经高压微射流处理，获得破壁微藻；
所述高压微射流处理的温度为20℃～30℃，时间10min～20min；压力为70MPa～200MPa，流量为20mL/min～100mL/min。
2.根据权利要求1所述的破壁方法，其特征在于，所述预培养的温度为20℃～30℃，时间1h～2h；微藻的初始密度为104ind/mL～107ind/mL。
3.根据权利要求1所述的破壁方法，其特征在于，所述预培养采用BG11液体培养基，pH值为6～9。
4.根据权利要求1所述的破壁方法，其特征在于，所述预培养前还包括扩大培养的步骤，具体为：将单一藻株接入BG11液体培养基中，温度为20℃～25℃，光照强度为2000lux～4000lux、光暗比L/D为(14～16)：(12～10)，培养20h～24h。
5.根据权利要求1～4任一项所述的破壁方法，其特征在于，所述微藻为小球藻。
6.权利要求1～5任一项所述破壁方法制备的破壁微藻。
7.一种微藻提取物，其特征在于，以权利要求1～5任一项所述破壁方法制备的破壁微藻为原料经提取制得。
8.根据权利要求7所述的提取物，其特征在于，所述提取物为藻油，提取方法为，将权利要求7所述的破壁微藻与正己烷混合，摇床提取后，离心取得上清液，经干燥，获得藻油。
9.权利要求6所述的破壁微藻或权利要求7或8所述的微藻提取物在制备保健食品或药物中的应用。
10.一种保健食品或药物，其特征在于，包括权利要求6所述的破壁微藻或权利要求7或8所述的微藻提取物。
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