CN103053413A - 一种化学加倍玉米单倍体幼胚的处理方法 - Google Patents

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林海建
张志明
兰海
沈亚欧
潘光堂
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Abstract

本发明公开了一种化学加倍玉米单倍体幼胚的处理方法，挑选单倍体诱导系授粉后28天左右单倍体籽粒幼胚，将挑选的幼胚放置于甲基胺草磷、炔苯酰草胺在处理浓度为60μmol/L以下，处理2h。该技术在单倍体早期进行化学加倍，使得化学处理时间缩短，处理浓度降低，化学药品消耗减少，对处理人员人身伤害较小，最重要的是提高单倍体加倍效率。

Description

一种化学加倍玉米单倍体幼胚的处理方法
技术领域
本发明涉及农业技术领域，尤其涉及的是一种化学加倍玉米单倍体幼胚的处理方法。
背景技术
单倍体加倍技术是利用化学、物理方法使单倍体细胞染色体变为为二倍体细胞，目前，化学加倍方法应用得最为普遍，主要利用细胞有丝分类抑制剂抑制纺锤丝的形成过程。在玉米上，目前开展的研究主要集中在秋水仙素和4种除草剂(甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟乐灵和氨磺灵)加倍玉米单倍体。加倍方法包括浸芽、浸种和滴心处理等，涉及相应的化学试剂处理浓度和处理时间等因素也不相同，加倍效果也不尽一致。
参考陈绍江等，《玉米单倍体育种技术》，主要有以下缺点：1)处理时间较迟，加倍效果较差；2)处理浓度较大，药品耗量较多；3)加倍效果不明显。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种化学加倍玉米单倍体幼胚的处理方法。
本发明的技术方案如下：
一种化学加倍玉米单倍体幼胚的处理方法，挑选单倍体诱导系授粉后28天左右单倍体籽粒幼胚，将挑选的幼胚放置于甲基胺草磷、炔苯酰草胺在处理浓度为60μmol/L以下，处理2h。
该技术在单倍体早期进行化学加倍，使得化学处理时间缩短，处理浓度降低，化学药品消耗减少，对处理人员人身伤害较小，最重要的是提高单倍体加倍效率。
附图说明
图1为显微镜视野下确定二倍体细胞与单倍体细胞的数目。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1.幼胚显色及籽粒挑选
诱导系诱导母本产生单倍体过程，涉及到籽粒胚顶和胚的显色过程，只有在幼胚生长至一定时间，其显色才会明显和充分，否则将无法进行挑选和加倍处理。
本试验首先从授粉后15天开始取样观察、每隔2天观察一次，直到种子成熟。通过观察，我们发现在诱导系授粉后22天至25天，玉米籽粒开始显色，直到28天左右，显色较为充分，能够很明显地区分单倍体种子和非单倍体种子。因此，在材料选择上，我们选取诱导系授粉后27天左右的单倍体胚作为研究材料进行进一步的分析。
2.单倍体幼胚挑选(材料)
挑选单倍体诱导系授粉后28天左右单倍体籽粒幼胚，这个时候的胚还未完全成熟，分化能力较强，与非单倍体(紫色胚尖)区别明显(无紫色)，胚圆润光滑，便于挑选。
3.化学加倍试剂选择和处理浓度、时间的优化
(1)试剂类型
本试验采用了4种常用的玉米单倍体加倍除草剂，即甲基胺草磷(APM)、炔苯酰草胺、氟乐灵和胺磺灵。试剂均采购于美国西格玛(Sigma)公司，色谱纯标准品。
(2)试剂原液配制
称取相应除草剂标准品首先溶解于10ml二甲基亚砜(DMSO)溶液中，至固体粉术充分溶解后加入适量的蒸馏水配制为8000μmol/L的母液，装入棕色玻璃瓶中备用。
(3)处理浓度的选择
将上述4中除草剂母液配制成浓度5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L和80μmol/L的浓度，分别装入棕色玻璃瓶中备用。
(4)处理时间的设置
设置处理5min、30min、60min(1h)和2h 4个处理时间。每个试剂、每种处理浓度均按照7个处理时间进行设置。
4.幼胚处理
将挑选的幼胚放置于不同除草剂、不同处理浓度和不同处理时间下的培养皿中进行浸泡，浸泡完毕后用无菌水冲洗1～2小时，冲洗后接种于装有全营养培养基的培养皿或培养瓶中进行催芽。
5.细胞学检测
待单倍体处理后的胚生长至1～2cm长时，取牙尖检测细胞染色体数目，在一个显微镜视野下确定二倍体细胞与单倍体细胞的数目(参考图1，图1中为一个视野下的细胞数目，其中包含有加倍成功的二倍细胞(20条染色体，右下角)和未加倍成功的单倍体细胞(10条染色体，右中)，统计二倍体细胞占整个视野细胞的比例，可以在一方面反映出该处理的加倍效果。)，从而计算二倍体细胞占整个视野细胞的比例。从一定水平上反映出各处理试剂在不同浓度和处理时间下的染色体加倍效果。
6.散粉情况和结实率统计
玉米单倍体加倍成功与否，在很大程度取决于雄花的散粉情况和结实率，因此，判断某种处理是否优劣，需要通过单倍体收获后的籽粒结实率来反应。将上述(4幼胚处理)处理后的幼苗移栽至大田，管理措施与其他加倍方法一致，以浸芽法和滴心法为对照，通过结实率对比以上方法在加倍玉米单倍体中的效果。
应用效果
1.各处理对玉米胚的致死率
通过对不同除草剂类型、处理浓度和处理时间下的优化设计，我们发现在甲基胺草磷、炔苯酰草胺在处理浓度为60μmol/L以下，处理2h均对幼胚不造成伤害，而氟乐灵和胺磺灵在浓度40μmol/L以上，处理30分钟后便会对幼胚造成伤害，致死率较高。具体情况见下表：
表1：正交优化设计处理下对幼胚生长的影响(致死率，％)
2.细胞学倍性观察
通过致死率分析，结合后期在生产实际中的应用潜力，我们初步筛选三个优化组合进行下一步细胞学染色体倍性分析，即甲基胺草磷浓度60μmol/L处理2小时、炔苯酰草胺浓度60μmol/L处理1h和氟乐灵20μmol/L处理2h。研究发现，甲基胺草磷浓度60μmol/L处理2小时后，在处理后生长6天的幼芽芽尖细胞中有二倍体细胞的存在，初步统计在一个显微视野中所占的比例为17.2％～41.5％不等，其次为炔苯酰草胺浓度60μmol/L处理1h，二倍体细胞在显微视野中所占的比例为16.4％(平均数)，最后为氟乐灵20μmol/L处理2h，二倍体细胞在显微视野中所占的比例为5.4％。由此表明，甲基胺草磷浓度60μmol/L处理2小时后的效果最佳。
3.成熟期散粉率和结实率统计
将上述2中的最优组合，即甲基胺草磷浓度60μmol/L 2小时浸胚处理后的幼苗种植于大田(云南西双版纳)，按照常规单倍体管理进行，以常用的成熟化学加倍方法(浸种法、浸芽法和苗期滴心法及相应的最优浓度和处理时间)为对照，统计单倍体结实情况。最终比较上述方法的优劣。试验结果表明：本发明的方法要明显优于其他化学方法和自然加倍，单倍体加倍率(结实率)可达31.2％～43.7％(因材料不同有所差异)，均高于其他加倍方法(浸芽法加倍率为30，3％，浸种法为15.2％，滴心法为16.7％，自然加倍结实率为11.2％)。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种化学加倍玉米单倍体幼胚的处理方法，其特征在于，挑选单倍体诱导系授粉后28天左右单倍体籽粒幼胚，将挑选的幼胚放置于甲基胺草磷、炔苯酰草胺在处理浓度为60μmol/L以下，处理2h。
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