CN104604682A - 中华猕猴桃Hort 16A后代优良品系组培苗多倍体诱导方法 - Google Patents

Abstract

中华猕猴桃Hort 16A 后代优良品系组培苗多倍体诱导方法，本发明步骤包括将 Hort 16A后代品系组培苗的叶片浸泡于秋水仙碱水溶液中诱导多倍体，洗净叶片，按步骤接种到愈伤分化增值培养基及继代培养基中光照培养等。本发明操作简单，诱导定向性好、诱导成功率高，成本低，培养周期较短，诱变率较高，为中华猕猴桃多倍体育种提供一种高效可行的新方法，具有重要的应用价值，推广本发明多倍体育种方法将给果农种植带来经济收益，满足更多消费者需求。

Description

中华猕猴桃Hort 16A后代优良品系组培苗多倍体诱导方法

技术领域

本发明属于植物遗传育种，涉及植物优良品系多倍体诱导方法。

背景技术

猕猴桃（kiwifruit）是猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia spp.）落叶藤本植物，是一种重要的经济林木和果树。猕猴桃富含Vc、矿物质和花青苷等营养成分和药用成分，这些成分位居其他水果的前列，且其综合经济价值通常比一般水果高出3～5倍以上。近年来，作为一种新的经济类型水果，被广泛用于鲜果、饮料、保健用品等食用形式，需求量增大。伴随这种发展，对猕猴桃优良品种苗需求量急剧增加，同时要求越来越高，包括水果风味，新颖性，大小，肉色，贮存时间，环境适应性和适宜生产等方面。

多倍体植物通常具有更高的遗传和形态多样性，面对变化的生态环境可表现出更强的生

态环境适应能力，而猕猴桃属植物的一个显著特征是种内和种间具丰富的倍性变异，包含从

二倍体到八倍体，直至十倍体的连续变异，并且有报道称在美味猕猴桃海沃德中检测到其DNA含量达到十二倍体水平，因而在理论上，猕猴桃属植物利用多倍体育种的机会较多。目前获得猕猴桃属植物的多倍体有用胚乳培养的方法及体染色体加倍的方法。前者之胚乳培养的方法因胚乳组织培养与植物其他组织培养相比，胚乳本身为三倍体难以分化，且猕猴桃种子较小，不宜操作，可参考的文献如Organogenesis in endosperm of Actinidia deliciosa cv. Hayward cultured in vitro（Góralski G，Popielarska M，lesak H et al，Acta Biol Cracov Ser Bot[J]，2005, 47:121-128）；后者之体染色体加倍的方法一般采用秋水仙素诱导法达到使植物多倍体化的目的，但据今文献上报导的诱变率及纯化得到的多倍体数量少，且因物种基因型差异性，不同的物种不同的材料诱导的方法不一样，效果也存在较大差异。

‘Hort 16A’是新西兰于20世纪90年代从中华猕猴桃类群中经多年系统选育出的继海沃德后新一代特优中华猕猴桃栽培品种，也是目前国际上公认的、可作为鲜食及加工两用的果实品质最佳品种，品种已申报国际专利，该果实价格较高，新西兰用改接的方法已发展1000多公顷。新西兰的Wu J-H等人用秋水仙素诱导‘Hort 16A’，该过程包括用叶片组培出愈伤后再截取 0.2-0.3cm长的叶柄，在愈伤和继代培养而使其多倍体化（參见Wu J-H，Ferguson AR，Murray BG，Manipulation of ploidy for kiwifruit breeding: in vitro chromosome doubling in diploidActinidia chinensis Planch[J]，Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC),2011, 106(3):503-511.）。但该方法外植体为叶片组培出愈伤后的叶柄，且培养基需利用价格昂贵的玉米素为激素，每步培养周期为6周所需时间较长。在国内，本发明人—西南林业大学林学院从‘Hort 16A’的种子实生苗中优选出‘Hort 16A’后代高产优良品系，该品种挂果率高，生长势强，果实风味独特，储藏期长，深受消费者青睐，市场需求量高。同时，该品系除了适合于云南本地生态环境种植外，也适合于中国南方各地类似的或接近的生态环境种植。

发明内容

为了提高猕猴桃品种的耐贮性、抗逆性和增大果实等方面特性，更好的满足现在市场的巨大需求，本发明目的旨在通过多倍体的育种方法提供一种中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系的多倍体诱导方法，直接用组培苗叶片做为外植体，取材简单方便。

为实现以上目的，本发明的多倍体诱导方法包括以下步骤：

（1）在无菌工作台上，将生长良好的无菌苗取下叶片，并切成1cm²的小块，常温下浸泡在经灭菌且浓度为20-100mg/L的秋水仙碱水溶液中诱变多倍体，6-30小时后取出，用无菌水洗净；

（2）将步骤（1）浸渍后的叶片转接到不含秋水仙碱的愈伤分化增殖培养基中，叶片露在培养基上，且平铺整齐使其与培养基充分接触，叶片光照培养20天，待长出愈伤后转瓶到新的增殖培养基中，新的增殖培养基与上述增殖培养基组份相同，所述增殖培养基为：

MS+0.5 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA+ 30 g/L蔗糖+ 5 g/L琼脂，pH5.8；

所用试剂全称：

NAA，1-naphthyla-cetic acid，萘乙酸；

6-BA，6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤；

培养条件：培养室温度25±1℃，光周期：16h光照/8h黑暗，相对湿度40%-80%；待发芽并长成小植株时进行筛选，继代到步骤（3）新鲜的继代培养基中。

（3）将步骤（2）长成的小植株在新鲜的继代培养基上培养2-4次后，从中选择变异形态比较明显的植株进行鉴定，然后对鉴定为多倍体的植株进行扩繁；所述继代培养基为：

MS+0.5 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA+ 30 g/L蔗糖+ 5g/L琼脂，pH5.8；

      培养条件：培养室温度25±1℃，光周期：16h光照/8h黑暗，相对湿度40%-80%。

优选的，所述的诱导方法是所述步骤（1）优选的秋水仙碱浓度为60mg/L，优选的浸泡时间为30小时。

优选的，所述的诱导方法是将所述步骤（3）继代培养后的多倍体壮苗进行生根培养。

本发明通过不同浓度及不同的处理时间两个因素（表1））的不同水平设计相应的实验方案对中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系的无菌苗叶片及愈伤组织进行不同的处理，探讨以上因素在中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系多倍体诱导中的作用，并通过正交试验设计的多次实验综合分析找出最适合中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系多倍体诱导的最佳的处理方案组合为A3+B5，即秋水仙碱浓度为60mg/L，处理时间为30h，将 ‘Hort 16A’后代品系组培苗的叶片浸泡于秋水仙碱水溶液中诱导多倍体，在常温下优选浸泡处理时间和秋水仙碱溶液浓度，洗净浸泡后的叶片，按步骤接种到愈伤分化增值培养基及继代培养基中光照培养。上述过程中，秋水仙碱浓度过低诱变率较低，而浓度过高致死率偏高，处理时间短诱变率也较低。

表1 试验的因素水平表

通过上述方法，本发明产生了下述有益效果：

本发明人通过化学诱导和组织培养技术加倍方法相结合，用秋水仙素在离体组织水平上诱导中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系细胞内染色体加倍，这种方法很容易控制实验条件，实验结果也可重复，同时减少了嵌合体提高的诱导率，相对现有技术而言，具有明显优势。

本发明针对猕猴桃的具体遗传特征，采用特定浓度的化学诱变剂秋水仙碱对其叶片进行处理，得到保持了遗传稳定性的组培苗叶片诱导变异获得稳定的多倍体植株。与文献上报导的诱变率及纯化得到的多倍体数量相比，本发明以‘Hort 16A’后代品系叶片为母本，直接将秋水仙碱处理的叶片平铺与培养基充分接触，通过低价的原料作为组培激素，继代二次的多倍体数量约占植株总数的73.2%，继代三次的多倍体数量约占植株总数的80.4%，不但高于文献上报导的诱变率，而且每步培养周期为4周，明显缩短了培养周期。

本发明操作简单、成本低、诱导定向性好，诱导成功率高，为中华猕猴桃多倍体育种提供一种可行的新方法，推广本发明多倍体育种方法将给果农种植带来一定经济收益，满足更多消费者需求。

本发明研究受到国家林业局948项目(2012-4-62)，国家星火计划项目(2013GA105005)，云南省省院省校教育合作咨询共建重点学科 (211015)的资助。

附图说明

图1 浸渍了秋水仙碱的叶片 。

图2 叶片在培养瓶中生长了15天。

图3 带有单叶片变异继代分化培养 。

图4 二倍体与多倍体叶片比较，其中A为多倍体叶片，B为二倍体叶片。

图5 继代一次的二倍体与多倍体，其中A为多倍体叶片，B为二倍体叶片。      

 图6 继代三次的二倍体与多倍体，其中A为多倍体叶片，B为二倍体叶片。

以下结合附图及实施例对本发明进行进一步说明，以下所描述的具体实施例包括但不限制本发明保护范围。

具体实施方式

实例1：

（1）取中华猕猴桃品种‘Hort 16A’后代优良品系的组培苗在超净工作台上将生长良好的无菌苗取下叶片，并切成1cm²的小块，浸泡在经高压灭菌的60mg/L的秋水仙碱水溶液中（如图1），处理30小时，处理完毕后无菌水清洗一次。

所述中华猕猴桃品种‘Hort 16A’后代优良品系的组培苗由西南林业大学西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室所培育。

（2）将浸泡处理好的叶片转接到不含秋水仙碱的增殖培养基中，叶片要平铺整齐使其与培养基充分接触，并注意叶片要露在培养基上，光照培养20天，待长出愈伤后转瓶到组份相同的新的增殖培养基中，把发芽且变异的叶片或植株继代到新鲜的继代培养基中（如图3）。

所述的增殖培养基为：MS+0.5 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA+ 30g/L蔗糖+ 5g/L琼脂，pH5.8；培养条件：培养室温度25±1℃，光周期：16h光照/8h黑暗，相对湿度40%-80%，培养4周。

（3）在新鲜的继代培养基上培养1次后，所得‘Hort 16A’后代优良品系变异组培苗与未处理的‘Hort 16A’后代优良品系组培苗的外观形态有较为明显的差异（如图5）；继代培养基上培养3次或3次以上后，变异植株相对粗壮，茎布膨大明显，叶脉变粗，叶片较大，叶片颜色较深（如图6）。所述继代培养基：MS+0.5 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA+ 30 g/L蔗糖+ 5 g/L琼脂，pH5.8；培养条件：培养室温度25±1℃，光周期（光照/黑暗）为16/18h，相对湿度40%-80%，培养4周。

（4）继代3~4次后，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，然后对鉴定为多倍体的植株进行扩繁。

实例2：

将所述步骤（3）继代培养后的多倍体壮苗进行生根培养，其它步骤与实例1相同。

Claims (3)

1.中华猕猴桃Hort 16A 后代优良品系组培苗多倍体诱导方法，包括以秋水仙碱水溶液作为多倍体诱变剂，进行愈伤分化增殖培养以及继代培养，其特征是：

（1）将生长良好的无菌苗取下叶片，并切成1cm²的小块，常温下浸泡在经过滤灭菌且浓度为20-100mg/L的秋水仙碱水溶液中诱变多倍体，6-30小时后取出，用无菌水洗净；

（2）将步骤（1）浸渍后的叶片转接到不含秋水仙碱的愈伤分化增殖培养基中，叶片露在培养基上，且平铺整齐使其与培养基充分接触，叶片光照培养20天，待长出愈伤后转瓶到新的增殖培养基中，新的增殖培养基与上述增殖培养基组份相同，所述增殖培养基为：

MS+0.5 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA+蔗糖30g/L +琼脂 5 g/L，pH5.8；

所用试剂全称：

NAA，1-naphthyla-cetic acid，萘乙酸；

6-BA，6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤；

培养条件：培养室温度25±1℃，光周期：16h光照/8h黑暗，相对湿度40%-80%；

培养4周，待发芽并长成小植株时进行筛选，继代到步骤（3）新鲜的继代培养基中；

（3）将步骤（2）长成的小植株在新鲜的继代培养基上培养2-4次后，从中选择变异形态比较明显的植株进行鉴定，然后对鉴定为多倍体的植株进行扩繁，该继代培养基为：

MS+0.5 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA+蔗糖30 mg/L +琼脂 5 mg/L，pH5.8；

      培养条件：培养室温度25±1℃，光周期：16h光照/8h黑暗，相对湿度40%-80%，培养4周。

2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征是优选的所述步骤（1）秋水仙碱浓度为60-80 mg/L，优选的浸泡时间为18-30小时。

3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征是优选的将所述步骤（3）继代培养后的多倍体壮苗进行生根培养。