CN103548680A

CN103548680A - 一种中华猕猴桃的组培快繁方法

Info

Publication number: CN103548680A
Application number: CN201310520758.3A
Authority: CN
Inventors: 张汉尧; 张太奎; 刘小珍
Original assignee: Southwest Forestry University
Current assignee: Southwest Forestry University
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: CN103548680B

Abstract

一种中华猕猴桃的组培快繁方法，涉及猕猴桃种苗组织培养快速繁殖方法。本发明用当年生幼嫩叶片为外植体，接种在愈伤诱导及丛生芽分化培养基MS+0.3mg/LZT+0.05mg/LNAA上；本发明还提供了改良MS，待丛生芽分化后，转入改良MS+2mg/LZT增殖培养基进行继代，根据苗高转入改良MS+0.015mg/LTDZ增壮培养基中，将符合生根的小苗转入1/2改良MS+0.7mg/LIBA+0.1g/LAC生根培养基中，生根后移栽驯化。本发明愈伤诱导率达96.4%，丛生芽芽高达1.67cm，丛生芽增值系数达3.67，生根率达98.12%，且培养基成本低，繁殖周期短，可实现工厂化生产。

Description

一种中华猕猴桃的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及植物种苗组织培养快速繁殖方法，尤其涉及中华猕猴桃种苗组织培养快速繁殖方法。

背景技术

猕猴桃（kiwifruit）属猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia spp.）落叶藤本植物，是一种重要的经济林木和果树。猕猴桃富含Vc、矿物质和花青苷等营养物质（Singletary，2012），营养价值和药用价值高。近年来，被广泛用于鲜果、饮料、保健用品等食用形式，市场需求量较大（段冬洋等.猕猴桃食疗价值及加工过程中变色机理和控制措施的研究[C].//中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集.2006:433-436.）。中华猕猴桃是猕猴桃属的一种，与其它种类的猕猴桃如美味猕猴桃、毛花猕猴桃、葛枣猕猴桃等相比，其抗氧化能力最强，Vc含量更高（宋美晶，不同品种猕猴桃的成分研究[D].辽宁师范大学,2012.），经济价值高于其它同类产品，市场需求量大，2013年出口价格平均为772.8美元/吨（黄琳琳、新西兰猕猴桃产业发展与营销模式[J].中国果业信息,2013,02:32-34.），推广种植可满足更多消费者的需求，增加果农的经济收益。然而，其播种繁殖生长周期长、始花年龄长，不利于快速形成猕猴桃的市场价值。

组织培养是一种无性系快速繁殖方法，具有繁殖周期短、遗传稳定性好、繁殖系数大等特点。已有研究表明，ZT（玉米素）是猕猴桃属植物组培愈伤诱导和增殖的最佳细胞分裂素，已在美味猕猴桃（González等，1995）、葛枣猕猴桃（Takahashi等，2004）、毛花猕猴桃（Wu等，2011）中成功诱导出愈伤组织。MS培养基为植物组培通用培养基，无机盐浓度高，但上述文献均未注意能否通过改善MS培养基，降低其硝态盐及钙离子浓度，提高猕猴桃组培苗的生长发育水平。对于猕猴桃丛生芽的增殖，玉米素的综合效应较其他激素好，且变异少。TDZ具有双重效应：低浓度时促进腋芽的增殖，高浓度时促进不定芽和愈伤的增殖（Murthy B N S, Murch S J, Saxena P K. Thidiazuron: A potent regulator of in vitro plant morphogenesis[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 1998,34(4): 267-275.），然而，TDZ浓度未涉及不定芽增壮影响。在猕猴桃生根培养中，IBA综合表现最佳，Wu等（2011）认为诱导毛花猕猴桃（A.eriantha）生根最佳的IBA浓度为0.6 mgL^-1。Prado等（2005）提出诱导美味猕猴桃生根的最佳的IBA浓度为0.5 mgL^-1。在植物组织培养中，活性炭具有吸附有毒物质和刺激生根的双重作用，多用于生根诱导培养。

发明内容

本发明旨在提供一种中华猕猴桃的组培快繁方法，该方法根据物种基因型差异性，而与改良MS培养基和不同阶段的组分和浓度联系起来，以提高在各阶段中猕猴桃组培苗的生长发育水平。

实现上述目的的方法包括叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段，而且：

愈伤诱导及丛生芽分化的培养基为MS +0.3mg/L ZT+0.05 mg/L NAA；

丛生芽增殖的培养基为改良MS +2mg/L ZT；

丛生芽增壮的培养基为改良MS +0.015mg/L TDZ；

生根培养的培养基为1/2改良MS +0.7mg/L IBA+0.1g/L AC。

上述改良MS 培养基除具有一般MS培养基的组分外，其无机盐中含400mgL^-1NH₄NO₃、1010mgL^-1KNO₃、320mgL^-1CaCl₂·2H₂O。

所述叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段，培养室均可为光照16h/d，光强2000LX，温度24℃，湿度70%。

所述叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段培养时间根据调查愈伤诱导率及丛生芽分化率、丛生芽增殖率、丛生芽增壮效果和生根率确定。

本发明所用试剂全称：NAA，1-naphthyla-cetic acid，萘乙酸；IBA，Indole-3-butytric acid，吲哚丁酸；6-BA，6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤；ZT，Zeatin，玉米素；TDZ，Thidiazuron，噻重氮苯基脲；AC，Active carbon，活性炭。

上述改良MS 培养基除了无机盐中含400mgL^-1NH₄NO₃、1010mgL^-1KNO₃、320mgL^-1CaCl₂·2H₂O外，与一般MS培养基的相同组分为：370mgL^-1MgSO₄·7H₂O、170 mgL^-1KH₂PO₄、22.3mgL^-1MnSO₄·H₂O、8.6mgL^-1ZnSO₄·7H₂O、6.2 mgL^-1H₃BO₃、0.83mgL^-1KI、0.25mgL^-1Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mgL^-1CoCl₂·6H₂O、0.025mgL^-1CuSO₄·5H₂O、37.3mgL^-1Na₂-EDTA、27.8 mgL^-1FeSO₄·7H₂O、2 mgL^-1甘氨酸、0.5 mgL^-1VB₆、0.1 mgL^-1VB₁、0.5 mgL^-1VB₃和100 mgL^-1肌醇。

在本发明中，发明人通过长期观察猕猴桃组培苗的生长发育，发现降低硝态盐及钙离子浓度，更利于其生长。一般MS与本发明改良MS组分对比见表1：

表1 MS与本发明改良MS组分对比表

对于丛生芽增壮阶段，发明人发现：低浓度的TDZ可有效促进中华猕猴桃的增壮生长，其培养基为改良MS +0.015mg/L TDZ。

综合上述，本发明组织培养根据物种基因型差异性，调节各阶段配方。在愈伤诱导及丛生芽分化阶段，使用MS +0.3mg/L ZT+0.05 mg/L NAA；丛生芽增殖时，使用改良MS +2mg/L ZT；丛生芽增壮时，培养基为改良MS +0.015mg/L TDZ；生根培养时，培养基为1/2改良MS +0.7mg/L IBA+0.1g/L AC。

本发明具有较为显著的进步和有益效果：

本发明以叶片为外植体使用0.3mg/L ZT和0.05mg/L NAA诱导出愈伤组织，并分化出丛生芽（图1，图2），诱导率达96.4%，分化率达90%，该结果比尚霄丽、马春华、冯建灿等（中华猕猴桃叶片再生体系的建立[J].江西农业学报, 2010(4):50-52.）提出的1.0mg/L ZT和0.3mg/LNAA诱导愈伤方案成本低，诱导率高（96.4%>87.5%）。对中华猕猴桃‘Hort16A’及从中选育出的优良品系‘西林选1号’的愈伤分化率进行比较，Hort16A’与‘西林选1号两者的愈伤分化率分别为97.4%和95.7%，两者间无显著差异（P>0.05），如表2比较结果。

表2 猕猴桃‘Hort16A’及‘西林选1号’品系的愈伤分化率比较

本发明在丛生芽增殖、增壮和生根阶段所使用的低硝态盐及钙离子的MS培养基，即改良MS培养基，较为明显地降低了无机盐浓度，结果却有效地促进了中华猕猴桃丛生芽的生长（图3，图4，图5）。以无机盐浓度较高的MS与改良MS培养基进行对比，结果表明：经改良MS培养基，猕猴桃丛生芽增值倍数、株高、平均生根条数和生根率显著高于MS培养基（表3）。

表3 MS与本发明改良MS培养基在组培各阶段效果比较

培养基	增值倍数	株高/cm	平均生根条数	生根率/%
					MS	4.19±0.17	2.53±0.06	6.37±0.15	97.22±1.21
本发明MS	4.67±0.33	3.67±0.06	7.07±0.25	98.12±1.10

注：在增殖培养后第21d采集增值倍数的数据。在增壮培养后第21d采集株高的数据。在生根培养后第30d采集平均生根条数与生根率的数据。数据=平均值±标准差。

增值倍数=转出丛生芽数/接入丛生芽数。

生根率(%)=(生根的无菌苗株数/接入无菌苗总数)× 100%。

因而，本发明具有的显著进步在于：愈伤诱导率达96.4%，丛生芽芽高达1.67cm，丛生芽增值系数达3.67，生根率达98.12%，可在短期内快速繁殖猕猴桃，达到工厂化生产的目的。

附图说明

图1是本发明猕猴桃组培的愈伤诱导及分化初期示意图。

图2是本发明猕猴桃组培的丛生芽分化阶段示意图。

图3是本发明猕猴桃组培的丛生芽增殖阶段示意图。

图4是本发明猕猴桃组培的丛生芽增壮阶段示意图。

图5是本发明猕猴桃组培的无菌苗生根示意图。

以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。

具体实施方式

以下分别用中华猕猴桃‘Hort16A’及从中选育出的优良品系‘西林选1号的叶片作为组培原料。由于工艺步骤和培养基等条件一致，两种品种的叶片组培工艺不再做单独说明。

将叶片在含有2滴吐温、0.1%的洗涤液中浸泡1min，然后用流水冲洗2h待用。在

超净工作台上，用75%的酒精浸泡60s，然后浸入到0.1%的升汞中，20min后取出，用无菌水反复浸洗4次待用。将叶片沿主叶脉切成1cm×1cm的块状，平接于愈伤诱导及分化培养基中，该培养基为MS +0.3mg/L ZT+0.05 mg/L NAA；先暗培养3周，再光照2周。培养室光照16h/d，光强2000LX，温度24℃，湿度70%。

将大于1cm的丛生芽转移至丛生芽增殖培养基中，该培养基为改良MS +2mg/L

ZT；培养3周后，可进行丛生芽增壮培养。培养室光照16h/d，光强2000LX，温度24℃，湿度70%。

将大于2cm的丛生芽转入丛生芽增壮培养基中，该培养基为改良MS +0.015mg/L

TDZ；培养3周后，可进行生根诱导培养。培养室光照16h/d，光强2000LX，温度24℃，湿度70%。

将大于4cm的无菌苗转入生根培养基中，该培养基为1/2改良MS +0.7mg/L

IBA+0.1g/L AC。培养室光照16h/d，光强2000LX，温度24℃，湿度70%。30d后，可进行移栽炼苗。

在本实施方式中，改良MS 培养基的组分为：400mgL^-1NH₄NO₃、1010mgL^-1KNO₃、320mgL^-1CaCl₂·2H₂O、370mgL^-1MgSO₄·7H₂O、170 mgL^-1KH₂PO₄、22.3mgL^-1MnSO₄·H₂O、8.6mgL^-1ZnSO₄·7H₂O、6.2 mgL^-1H₃BO₃、0.83mgL^-1KI、0.25mgL^-1Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mgL^-1CoCl₂·6H₂O、0.025mgL^-1CuSO₄·5H₂O、37.3mgL^-1Na₂-EDTA、27.8 mgL^-1FeSO₄·7H₂O、2 mgL^-1甘氨酸、0.5 mgL^-1VB₆、0.1 mgL^-1VB₁、0.5 mgL^-1VB₃和100 mgL^-1肌醇。

Claims

1.一种中华猕猴桃组培快繁方法，包括叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段，其特征是：

愈伤诱导及丛生芽分化的培养基为MS +0.3mg/L ZT+0.05 mg/L NAA；

丛生芽增殖的培养基为改良MS +2mg/L ZT；

丛生芽增壮的培养基为改良MS +0.015mg/L TDZ；

生根培养的培养基为1/2改良MS +0.7mg/L IBA+0.1g/L AC；

上述改良MS 培养基除与具有一般MS培养基的组分外，其无机盐中含400mg.L^-

¹NH₄NO₃、1010mg.L^-1KNO₃、320mg.L^-1CaCl₂·2H₂O。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽

增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段，培养室均可为光照16h/d，光强2000LX，温度24℃，湿度70%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段培养时间分别根据所调查的愈伤诱导率及丛生芽分化率、丛生芽增殖率、丛生芽增壮效果和生根率确定。