CN104206272A - 一种猕猴桃游离花粉培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种猕猴桃游离花粉培养方法，包括取单核靠边期的花药进行消毒处理；接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；接种分化培养基，培养获得试管小苗；接种生根培养基，筛选获得单体植株，经过上述培养的猕猴桃愈伤组织的诱导率达到68～70％，生根率达到80～82％，移栽成活率达到95％以上。

Description

一种猕猴桃游离花粉培养方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种猕猴桃游离花粉培养方法。
背景技术
猕猴桃，是中华猕猴桃栽培种水果的称谓。也称猕猴梨、藤梨、羊桃、阳桃、木子与毛木果等，原产于中国南方。一般是椭圆形的。深褐色并带毛的表皮一般不食用，而其内则是呈亮绿色的果肉和一排黑色的种子。猕猴桃的质地柔软，味道有时被描述为草莓、香蕉、凤梨三者的混合。因猕猴喜食，故名猕猴桃；亦有说法是因为果皮覆毛，貌似猕猴而得名。由于猕猴桃营养价值丰富，含有人体不可缺少的重要物质，因此食用猕猴桃对保持健康、防治疾病具有重要作用。经实践证明，多食用猕猴桃可以预防老年骨质疏松；抑制胆固醇在动脉内壁沉积，防止动脉硬化；改善心肌功能，防治心脏病；抑制肠道内亚硝酸胺对组织的诱变作用；减轻癌病患者作X线照射和化疗中产生的副作用或毒性反应；阻止体内产生过多的氧化物，具有滋补强身、清热利尿、健胃、润燥，防止老年斑的形成，延缓人体衰老等，因此猕猴桃的市场需求量很大。
随着植物组织培养技术的发展，植物细胞具有“全能性”得到了广泛证实，因此，在离体的条件下用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过器官发生或胚发生的途径，形成完整的植株。传统生产中多使用嫁接苗或者少量扦插苗，现尚无成熟的可以用于大量生产猕猴桃的组织培养育苗方法。但通过嫁接繁殖优良苗木的速度较慢，而扦插繁殖成活率相对较低并易使植株带菌，种子播种繁殖的实生苗其性状不稳定极不适合园艺作物商业化栽培，同时，长期进行上述常规繁殖会造成品种退化。而利用组织培养技术则可以有效的克服上述缺点。目前关于猕猴桃花粉离体培育的报道很少。
发明内容
针对毛花猕猴桃传统嫁接繁殖、扦插繁殖及种子播种繁殖分别存在的，繁殖速度较慢和成活率较低、植株易带菌及性状不稳定、易造成品种退化等缺陷，提出一种繁殖系数高，生产周期短、程序简单、成本低廉的猕猴桃游离花粉培养方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种猕猴桃游离花粉培养方法，包括
1)取单核靠边期的花药进行消毒处理；
2)接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；
3)接种分化培养基，培养获得试管小苗；
4)接种生根培养基，筛选获得单体植株。
所述的消毒处理是将花药用无菌纱布包裹浸入70‐75％浓度的酒精中消毒10‐15s，快速取出立即浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒6min以上，在消毒过程中轻轻晃动使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次。
所述的愈伤组织诱导培养基：MS+6‐BA1.0mg/L+2，4‐D 0.2mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+琼脂1000～2000mg/L+蔗糖800～900mg/L。
所述的分化培养基为MS+6‐BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+9％蔗糖。
所述的生根培养基为1/2MS+IAA 0.1～0.3mg/L+琼脂900～1000mg/L+蔗糖2000～3000mg/L+活性炭质量比0.1％～0.3％。
培养条件：培养条件采用光照培养和暗培养相结合的方法，光照培养光源采用日光灯，培养室内白天温度为24℃‐28℃，照明12h‐14h，光照强度10μmol.m‐2.s‐1‐13μmol.m‐2.s‐1，暗培养温度控制在20℃‐23℃。
还包括幼苗移栽：待猕猴桃苗健壮且有5‐7片真叶、6‐8cm高时，敞开瓶口炼苗2‐3d，然后将猕猴桃苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，便移栽到温室的花钵中假植或者于猕猴桃苗移栽季节直接栽种于大田中。
本发明的有益效果是：本发明采用猕猴桃花药为外植体，进行花药愈伤组织的诱导，采用光照培养和暗培养相结合的方法交替培养，获得花粉植株。对培养基的PH值、培养的温度和光照强度、培养时间等影响萌发的因素全部进行了筛选和优化组合，从而更加适合于猕猴桃花药的离体萌发和花粉管的正常生长；本发明培养基愈伤组织增殖明显，易形成花粉植株。关键是找到了适宜的培养方法，用本发明的方法对猕猴桃的离体花粉进行培养，具有花粉萌发成胚时间短、加倍效率高、产量大及较容易获得优良变异育种中间材料等优点，在育种材料提纯复壮、种质资源创新、多倍体育种及花粉发育进程研究等方面内容，具有较大的实用价值。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明实施例包括：
实施例1
一种“徐香”猕猴桃游离花粉培养方法，包括
1)取单核靠边期的花药进行消毒处理，即将花药用无菌纱布包裹浸入70％浓度的酒精中消毒13s，快速取出立即浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒6min以上，在消毒过程中轻轻晃动使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次；
2)取1000粒消毒的花粉接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织，所述的愈伤组织诱导培养基：MS+6‐BA1.0mg/L+2，4‐D 0.2mg/L+NAA 0.4mg/L+琼脂1500mg/L+蔗糖850mg/L；
3)接种分化培养基，培养获得试管小苗，所述的分化培养基为MS+6‐BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+9％蔗糖；
4)接种生根培养基，筛选获得单体植株，所述的生根培养基为1/2MS+IAA0.2mg/L+琼脂950mg/L+蔗糖2500mg/L+活性炭质量比0.2％。
培养条件：培养条件采用光照培养和暗培养相结合的方法，光照培养光源采用日光灯，培养室内白天温度为26℃，照明13h，光照强度12μmol.m‐2.s‐1，暗培养温度控制在22℃。
幼苗移栽：待猕猴桃苗健壮且有6片真叶、7cm高时，敞开瓶口炼苗3d，然后将猕猴桃苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，便移栽到温室的花钵中假植或者于猕猴桃苗移栽季节直接栽种于大田中。
经过上述培养的结果为，愈伤组织的诱导率达到68％，生根率达到80％，移栽成活率达到95％。
实施例2
1、一种“红香”猕猴桃游离花粉培养方法，包括
1)取单核靠边期的花药进行消毒处理；将花药用无菌纱布包裹浸入75％浓度的酒精中消毒15s，快速取出立即浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒6min以上，在消毒过程中轻轻晃动使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次。
2)取1000粒消毒的花粉接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织，所述的愈伤组织诱导培养基：MS+6‐BA1.0mg/L+2，4‐D 0.2mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂2000mg/L+蔗糖800mg/L。
3)接种分化培养基，培养获得试管小苗；所述的分化培养基为MS+6‐BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+9％蔗糖。
4)接种生根培养基，筛选获得单体植株，所述的生根培养基为1/2MS+IAA0.3mg/L+琼脂900mg/L+蔗糖3000mg/L+活性炭质量比0.1％。
培养条件：培养条件采用光照培养和暗培养相结合的方法，光照培养光源采用日光灯，培养室内白天温度为28℃，照明12h，光照强度11μmol.m‐2.s‐1，暗培养温度控制在23℃。
括幼苗移栽：待猕猴桃苗健壮且有6‐7片真叶、7‐8cm高时，敞开瓶口炼苗3d，然后将猕猴桃苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，便移栽到温室的花钵中假植或者于猕猴桃苗移栽季节直接栽种于大田中。
经过上述培养的结果为，愈伤组织的诱导率达到70％，生根率达到82％，移栽成活率达到96％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种猕猴桃游离花粉培养方法，其特征在于，
1)取单核靠边期的花药进行消毒处理；
2)接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；
3)接种分化培养基，培养获得试管小苗；
4)接种生根培养基，筛选获得单体植株。
2.根据权利要求1所述的猕猴桃游离花粉培养方法，其特征在于，所述的消毒处理是将花药用无菌纱布包裹浸入70‐75％浓度的酒精中消毒10‐15s，快速取出立即浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒6min以上，在消毒过程中轻轻晃动使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次。
3.根据权利要求1或2所述的猕猴桃游离花粉培养方法，其特征在于，所述的愈伤组织诱导培养基：MS+6‐BA1.0mg/L+2，4‐D 0.2mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+琼脂1000～2000mg/L+蔗糖800～900mg/L。
4.如权利要求1‐3任一项所述的猕猴桃游离花粉培养方法，其特征在于，所述的分化培养基为MS+6‐BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+9％蔗糖。
5.如权利要求1‐4任一项所述的提高猕猴桃花粉萌发率的组织培养方法，其特征在于，所述的生根培养基为1/2MS+IAA 0.1～0.3mg/L+琼脂900～1000mg/L+蔗糖2000～3000mg/L+活性炭质量比0.1％～0.3％。
6.如权利要求1‐5任一项所述的猕猴桃游离花粉培养方法，其特征在于，培养条件：培养条件采用光照培养和暗培养相结合的方法，光照培养光源采用日光灯，培养室内白天温度为24℃‐28℃，照明12h‐14h，光照强度10μmol.m‐2.s‐1‐13μmol.m‐2.s‐1，暗培养温度控制在20℃‐23℃。
7.如权利要求1-6任一项所述的猕猴桃游离花粉培养方法，其特征在于，还包括幼苗移栽：待猕猴桃苗健壮且有5-7片真叶、6-8cm高时，敞开瓶口炼苗2-3d，然后将猕猴桃苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，便移栽到温室的花钵中假植或者于猕猴桃苗移栽季节直接栽种于大田中。
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