CN106191267A - 筛选中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系多倍体植株的方法 - Google Patents

筛选中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系多倍体植株的方法 Download PDF

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Abstract

筛选中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系多倍体植株的方法，涉及植物优良品系多倍体的筛选。本发明步骤包括：提取组培苗叶片的总RNA；RNA反转录为cDNA；选择二倍体与多倍体植株转录组中呈上调趋势的差异基因1～2个，以持家基因Elongation factor EC为内参基因，萤光定量PCR，绘制差异基因的扩增曲线和溶解曲线；选择差异基因；计算相对表达量，以差异基因为二倍体差异基因2倍以上的组培苗作为多倍体组培苗。本发明创新了多倍体倍性变异植株筛选理论和方法，为中华猕猴桃多倍体植株筛选提供了一种高效可行的方法。

Description

筛选中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系多倍体植株的方法
技术领域
本发明属于植物遗传育种，涉及植物优良品系多倍体的筛选方法。
背景技术
猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属落叶藤本植物，原产我国。新西兰继海沃德后于20世纪90年代从中华猕猴桃类群中系统选育出中华猕猴桃‘Hort 16A’栽培品种，该品种是目前世界上公认的、可作为鲜食及加工两用的果实品质最佳品种，已申报国际专利。2010年西南林业大学林学院从‘Hort 16A’开放授粉后代实生苗中优选出了一批‘Hort 16A’后代高产优良品系，该品系挂果率高、生长势强、果实风味独特、储藏期长，是很有前景的自主知识产权的品系。
多倍体一般具有枝干粗壮、叶片厚、果实大、产量高、抗逆性强和适应性强等特点，通过多倍体育种培育具有果重、果径、耐贮性和抗逆性的‘Hort 16A’后代高产优良品系，提高其营养价值和经济价值。通常倍性筛选方法有两大类型：（一）直接筛选法：常规染色体制片法和去壁低渗法。（二）间接筛选法：细胞形态学筛选法、植株形态指标筛选、染色中心直径和异染色质数目筛选法、流式细胞分析法、条件筛选法、杂交筛选法和同工酶检定法等。对猕猴桃这一类染色体数多、表型变化大而致倍性鉴定困难的植物而言，前者操作繁琐、影响因素多、工作量大，要得到数量清楚的染色体片非常困难；后者的筛选结果受环境影响而改变多倍体的植物生理，通常只能作为参考，不具有确定性。因此，发展快捷、准确的多倍体植株筛选新技术十分必要。
发明内容
为了选育出产量高、抗逆性强和适应性强的多倍体猕猴桃品种，更好的满足现在市场需求，本发明旨在提供一种快捷、准确的中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系的多倍体植株筛选方法。
为实现以上目的，本发明的多倍体植株筛选方法包括以下步骤：
（1）提取中华猕猴桃组培苗叶片的总RNA；
（2）去除基因组DNA，再配制荧光定量PCR反应体系，将RNA反转录成cDNA，反转录产物用于PCR扩增；所述荧光定量PCR反应体系为：去除基因组DNA的反应液10μl、Oligo(dT)18(0.5ug/ul) 1μl、Random primer(0.1ug/ul)1μl、5×RT Reaction Mix 4μl、TUREscriptH-RTase/RI Mix0.8μl、RNase free H2O to final volume补充至20μl；反转录的反应条件设置为：25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min；
（3）选择该品系二倍体与多倍体植株转录组中呈上调趋势的差异基因1～2个，并以持家基因Elongation factor EC为内参基因，配制荧光定量PCR反应体系，进行萤光定量PCR分析，采集荧光信号，绘制差异基因的扩增曲线和溶解曲线；
（4）根据溶解曲线选择萤光定量PCR的差异基因；
（5）以Elongation factor EC作为内参基因，采用2-△△Ct法计算相对表达量，以差异基因为二倍体差异基因2倍以上的组培苗作为多倍体组培苗。
优选地或进一步地，所述步骤（3）荧光定量PCR反应体系的配制见表1，每个反应重复三次，反应程序：95℃ 10s，55℃ 30s，50个循环：
表1荧光定量PCR反应体系的配制
优选地或进一步地，所述步骤（4）选择该品系二倍体与多倍体植株转录组中Glucosidase 1或/和PAD4作为呈上调趋势的差异基因进行萤光定量PCR分析，内参基因Elongation factor EC和差异基因的引物见表2：
表2 萤光定量PCR的引物序列
扩增曲线的条件为：94℃ 30s；94℃ 10s，60℃ 12s，72℃ 30s循环45次，72℃单点检测信号；溶解曲线的条件为：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，连续检测信号。
进一步地，所述的多倍体筛选方法是：进一步用染色体制片法验证萤光定量PCR筛选多倍体植株的结果。
所需说明的是，以上步骤（3）呈上调趋势的1,118个差异基因中，不是都能适合萤光定量PCR分析。例如，根据内参基因的溶解曲线结果判断，基因ACO1的溶解曲线有双峰，可能有非特性扩增；CXE9基因的溶解曲线不正常，CT值很大，可能引物不合适或者目的基因含量低。
本发明具有下述有益效果：
本发明根据中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系二倍体与多倍体植株转录组测序结果，经基因差异表达分析，找到了1,589个差异基因，其中1,118个基因呈上调趋势，从上调的基因中随机挑选了ACO、CXE9、Glucosidase 1和PAD4共4个基因进行萤光定量PCR分析，并以持家基因Elongation factor EC作为内参基因，通过荧光定量PCR技术对诱导变异后的中华猕猴桃多倍体植株进行筛选，在转录水平上对中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良多倍体植株进行筛选，并可实现自动化、批量化筛选，相对现有技术而言，具有显著的进步和实质性特点。
本发明以植株叶片为材料，提取叶片中的总RNA后可直接用PCR反应仪进行分析测定，试验材料容易获取，不需特意培养生长旺盛的根尖和茎尖。
本发明为中华猕猴桃多倍体植株筛选提供一种高效可行的新方法，是对多倍体倍性变异植株筛选理论和方法，包括直接和间接筛选法，的完善、创新，具有重要的参考价值和应用价值。
本发明属于国家林业局948项目（2012-4-62）云南省教育厅科学研究基金项目（2014Y332）和云南省高校林木遗传与繁育重点实验室研究生开放基金项目（YNGB201508）的资助项目。
附图说明
图1是Elongation factor EC内参基因溶解曲线。
图2是Elongation factor EC内参基因扩增曲线。
图3是Glucosidase 1基因溶解曲线。
图4是Glucosidase 1基因扩增曲线。
图5是PAD4基因溶解曲线。
图6是PAD4基因扩增曲线。
图7是组培苗阶段Glucosidase 1基因的相对表达量示意图。
图8是组培苗阶段PAD4基因的相对表达量示意图。
图9 是二倍体染色体观察示意图。
图10 是四倍体染色体观察示意图。
以下结合附图及实施例对本发明进行进一步说明，以下所描述的具体实施例包括但不限制本发明保护范围。
具体实施方法
（1）使用植物RNA快速提取试剂盒提取中华猕猴桃组培苗叶片的总RNA。在1.0%琼脂糖凝胶，110V电压，电泳25min条件下，检测提取的总RNA的质量，观察条带是否清晰，有无降解，以及是否有DNA污染。
（2）配制反应液去除基因组DNA（见表4），再配制反应体系（混合液在冰上配制，见表5），将RNA反转录成cDNA，反转录产物用于PCR扩增：
表4去除基因组DNA反应体系
用移液器轻轻吹打混匀，37℃ 30 min；65℃ 10 min，灭活DNase I。
表5 RNA反转录成cDNA的反应体系
反转录反应条件的设置：25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min。
（3）选择该品系二倍体与多倍体植株转录组中呈上调趋势的差异基因1～2个，根据内参基因的溶解曲线结果判断，在正常反转录cDNA中，Glucosidase 1和PAD4的溶解曲线正常，适合做萤光定量PCR。
以持家基因Elongation factor EC为内参基因，配制荧光定量PCR反应体系见表6，引物见表7，扩增条件的设置为，扩增曲线：94℃ 30s，94℃ 10s，60℃ 12s，72℃ 30s循环45次，72℃单点检测信号；溶解曲线：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，连续检测信号；同时采集荧光信号，绘制各基因的扩增曲线和溶解曲线。
表6反应体系的配制
表7 萤光定量PCR的引物序列
萤光定量PCR，每个反应重复三次。反应程序：95℃ 10s，55℃ 30s，50个循环。
（4）使用定量PCR仪，以Elongation factor EC作为内参基因，采用2-△△Ct法计算相对表达量，以差异基因为二倍体差异基因2倍以上的组培苗作为多倍体组培苗。检测结果表明：在相同培养条件下、相同时期的二倍体和候选多倍体猕猴桃组培苗叶片Glucosidase 1基因的表达差异非常明显，所测的候选多倍体均比二倍体对照均高1倍以上；二倍体和候选多倍体猕猴桃组培苗叶片PAD4基因的表达差异也非常明显，所测的候选多倍体均比二倍体高1倍以上。
（5）染色体制片法验证萤光定量PCR筛选多倍体植株的结果，结果表明所筛选出来的植株均为多倍体植株。

Claims (5)

1.筛选中华猕猴桃‘Hort 16A’后代优良品系多倍体植株的方法，包括以下步骤：
（1）提取中华猕猴桃组培苗叶片的总RNA；
（2）去除基因组DNA，再配制荧光定量PCR反应体系，将RNA反转录成cDNA，反转录产物用于PCR扩增；所述荧光定量PCR反应体系为：去除基因组DNA的反应液10μl、Oligo(dT)18(0.5ug/ul) 1μl、Random primer(0.1ug/ul)1μl、5×RT Reaction Mix 4μl、TUREscriptH-RTase/RI Mix0.8μl、RNase free H2O to final volume补充至20μl；反转录的反应条件设置为：25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min；
（3）选择该品系二倍体与多倍体植株转录组中呈上调趋势的差异基因1～2个，并以持家基因Elongation factor EC为内参基因，配制荧光定量PCR反应体系，进行萤光定量PCR分析，采集荧光信号，绘制差异基因的扩增曲线和溶解曲线；
（4）根据溶解曲线选择萤光定量PCR的差异基因；
（5）以Elongation factor EC作为内参基因，采用2-△△Ct法计算相对表达量，以差异基因为二倍体差异基因2倍以上的组培苗为多倍体组培苗。
2.根据权利要求1所述的多倍体植株的筛选方法，其特征是：所述步骤（3）荧光定量PCR反应体系的配制见表1，每个反应重复三次，反应程序：95℃ 10s，55℃ 30s，50个循环：
表1荧光定量PCR反应体系的配制
。
3.根据权利要求1或2所述的多倍体植株的筛选方法，其特征是：所述步骤（3）选择该品系二倍体与多倍体植株转录组中Glucosidase 1或/和PAD4作为呈上调趋势的差异基因进行萤光定量PCR分析，内参基因Elongation factor EC和差异基因的引物见表2：
表2 萤光定量PCR的引物序列
扩增曲线的条件为：94℃ 30s；94℃ 10s，60℃ 12s，72℃ 30s循环45次，72℃单点检测信号；溶解曲线的条件为：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，连续检测信号。
4.根据权利要求1或2所述的多倍体植株的筛选方法，其特征是：进一步用染色体制片法验证萤光定量PCR筛选多倍体植株的结果。
5.根据权利要求3所述的多倍体植株的筛选方法，其特征是：进一步用染色体制片法验证萤光定量PCR筛选多倍体植株的结果。
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