CN110423760A - 黄肉猕猴桃耐寒基因及其运用 - Google Patents

黄肉猕猴桃耐寒基因及其运用 Download PDF

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张汉尧
魏卓
张智铭
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    • C12Y302/01002—Beta-amylase (3.2.1.2)

Abstract

本发明属于农业育种技术领域，具体为黄肉猕猴桃组培苗耐寒突变体的诱导及耐寒基因运用的方法。本发明的黄肉猕猴桃耐寒基因为CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）和CEY00_Acc28966（β‑淀粉酶），其特征在于黄肉猕猴桃耐寒基因为CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，CEY00_Acc28966（β‑淀粉酶）的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。上述黄肉猕猴桃耐寒基因培育黄肉猕猴桃四倍体耐寒植株。

Description

黄肉猕猴桃耐寒基因及其运用
技术领域
本发明属于农业育种技术领域，具体为黄肉猕猴桃组培苗耐寒突变体的诱导及耐寒基因运用的方法。
背景技术
黄肉猕猴桃‘Hort 16A’(Actinidia chinensis‘Hort16A’)属中华猕猴桃(Actinidia Chinensis Planch)，是由新西兰选育出来的新品种，亲本是中华猕猴桃CK-01和 CK-15，现已取代海沃德品种。果实呈倒圆锥或梯形，果喙端尖，平均单果重80~140g，可溶性固形物含量15%~19%，维生素C含量1200~1630mg/kg，每100g鲜重约含有620mg的类胡萝卜素，对人体间接具有抗氧化的作用。果肉味甜具芳香，肉质细嫩，风味浓郁，果实硬度1.2~1.4kg/cm2，果实贮藏性中等，果肉呈黄色至金黄色。黄肉猕猴桃‘Hort 16A’可提高人的免疫功能，通常含有20%以上的抗坏血酸盐。综上所述，黄肉猕猴桃经济价值非常高。
黄肉猕猴桃抗冻性不强，遭遇到低温、霜冻、冻害时会使猕猴桃植株冻死或部分枝条受冻，造成减产，或植株的死亡，影响来年的生产。防治猕猴桃冻害除了提高栽培技术上外，从猕猴桃育种上诱导培育耐寒猕猴桃可以从根本上解决冻害问题。黄肉猕猴桃质量优秀，营养丰富，经济价值高，但是寒冻灾害是影响其生长的一大问题，所以我们以秋水仙碱诱导的黄肉猕猴桃多倍体为材料，筛选耐寒的黄肉猕猴桃多倍体，有利于猕猴桃抵耐寒冷的灾害天气，有助于猕猴桃的经济发展。
植物组织培养主要受外植体的采取、外植体的消毒、植物生长调节剂、培养条件等的影响。目前植物组织培养主要以悬浮细胞培养、愈伤组织培养、茎尖分生组织培养、器官培养、原生质体培养为主，使用胚、子房、花药、根、茎、叶植物等器官进行培养。国内外猕猴桃组织培养研究众多，猕猴桃基本培养基多以MS（Murashige and Skoog medium）基本培养基为主。1993年，朱德瑶用猕猴桃茎段进行组织培养。2004年，郭韩玲以早金猕猴桃茎尖为外植体，建立了其不定芽分化至生根炼苗的快繁体系。
猕猴桃组织培养，多采用种子胚乳、叶片、茎段、腋芽茎段作为外植体。通过外植体无菌体系的建立，诱导愈伤组织，分化不定芽，增殖培养，生根及移栽驯化建立起猕猴桃组培体系。赵丹丹以‘早金’猕猴桃种子胚乳作为组织培养的外植体，利用秋水仙碱其染色体加倍。张太奎选用‘Hort16A’后代播种实生苗优良单株的幼嫩叶片与茎段建立了‘Hort16A’无菌系培养系。黄宝菊用中华猕猴桃（回回1号带）带腋芽茎段为外植体建立其快繁体系。刘子花以‘Hort 16A’猕猴桃分别以叶片、顶芽为外植体建立‘Hort 16A’猕猴桃快繁体系。
国内猕猴桃多倍体育种还在发展中，早期人们对猕猴桃三倍体进行了研究，1980-1982年黄贞光通过中华猕猴桃胚乳诱导三倍体猕猴桃。1998年韩礼星等人在组培及田间条件下，诱导出美味称猴桃品种秦美和中华称猴桃品种琼露的多倍体，但产生大量嵌合体。在无菌快繁组织培养中，诱导猕猴桃多倍体主要是通过秋水仙碱浸泡法和秋水仙碱加入组培培养基里的方法。张弛成功诱导出红阳猕猴桃四倍体，发现秋水仙碱的最佳处理方式是浸渍法，最佳浓度和处理时间为0.2%浓度处理48h，诱导率为20%，通过筛选得到了抗病四倍体植株。刘丽等使用中华二倍体品种‘琼露’叶柄通过秋水仙碱不同浓度的浸泡处理诱导出四倍体与嵌合体，筛选出最佳诱导浓度为0.05%，最佳处理时间4h。在猕猴桃四倍体及多倍体基因组、转录组的研究上还有待继续研究。
发明内容
本发明的黄肉猕猴桃耐寒基因为CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）和CEY00_Acc28966（β-淀粉酶），其特征在于黄肉猕猴桃耐寒基因为CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，CEY00_Acc28966（β-淀粉酶）的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
上述黄肉猕猴桃耐寒基因的运用，其特征在于培育黄肉猕猴桃四倍体耐寒植株。
提取黄肉中华猕猴桃四倍体组培苗叶片的总RNA。去除基因组DNA，再配制反转录反应体系，将RNA反转录成cDNA，反转录产物用于PCR扩增。选择该品系四倍体植株转录组中耐寒相关并呈上调趋势的差异基因CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）和CEY00_Acc28966（β-淀粉酶），并以持家基因Elongation factor EC为内参基因，配制荧光定量PCR反应体系(CEY00_Acc03316 Primer1:TTCTGGTGAGGTTTCTCCA和CEY00_Acc03316Primer2:CGGCACATCTACTACAAAGG；CEY00_Acc28966 Primer1:GTGTTTGTGATGCTGCCA和CEY00_Acc28966 Primer2: GAATGGGTGTTCTTCCTCTAAG)，进行萤光定量PCR分析，退火温度设置为57℃，采集荧光信号，绘制差异基因的扩增曲线和溶解曲线。根据溶解曲线选择萤光定量PCR的差异基因。以Elongation factor EC作为内参基因，采用2-△△Ct法计算相对表达量，以差异基因为二倍体差异基因2倍以上的四倍体组培苗作为耐寒四倍体组培苗。把经qRT-PCR筛选的黄肉猕猴桃四倍体植株，放置于低温0℃条件下处理5h，结果表明这些植株均不会发生明显寒害症状（而对照植株则会发生明显的症状），这些植株均为耐寒植株。
本发明针对黄肉猕猴桃不耐低温、抗冻性不强的缺点，为加强黄肉猕猴桃耐寒能力，提高黄肉猕猴桃生产，以黄肉猕猴桃二倍体和四倍体为实验材料，采取叶片及叶柄进行组培实验，通过叶片直接再生和不定芽增殖培养基的筛选形成了黄肉猕猴桃快繁体系，以二倍体作为实验对照，用诱导并鉴定过的四倍体进行耐寒相关实验，把L-羟脯氨酸作为耐寒选择剂，筛选出耐寒突变体，对筛选出的耐寒突变体进行转录组分析，找到了黄肉猕猴桃耐寒基因，并且在培育黄肉猕猴桃四倍体耐寒植株中运用。
具体实施方式
1试验材料
试验材料为西南林业大学种植资源圃的黄肉猕猴桃后代优良株系二倍体植株和前期课题组李升星等人已诱导、鉴定并炼苗移栽的四倍体黄肉猕猴桃植株。
2黄肉猕猴桃快繁
(1)外植体消毒
于晴天采摘长势良好的黄肉猕猴桃二倍体和四倍体植株带叶柄的嫩叶，带回实验室用自来水轻轻冲洗，把带叶柄的嫩叶放入1000ml烧杯中，盖上干净纱布，瓶口用皮筋绑好，用自来水流水下冲洗40min。之后把纱布去掉，把烧杯连同烧杯中的带叶柄嫩叶一起放入超净工作台上，先用75%酒精浸泡15s，用已灭菌的蒸馏水浸泡并不断晃动冲洗4次，再用0.1%的升汞处理，时间为 4min，灭菌过程中不停地震荡摇晃，再用无菌蒸馏水清洗4次，而后进行转入培养瓶的工作。
因用叶片和叶柄两种材料，把叶片和叶柄分别进行切分的操作，将消毒过的叶片用无菌手术刀去除叶片边缘和叶片顶端叶柄，切成1.5×1.5cm2大小的叶片，在叶片背部叶脉上垂直轻轻划一些伤口不划破叶子，有益于之后愈伤组织的生成。叶片正面朝上接种在培养基上MS空白培养基上进行培养。每个培养瓶接2片叶片，每个消毒处理接10瓶培养基，3次重复。将进行消毒过的叶柄，把顶端与底端切掉，切成0.5~1.0cm的小段，纵剖成两半，垂直接种于MS空白培养基上。每个培养瓶接2个叶柄，每个消毒处理接10瓶，3次重复。
因为是叶片和叶柄两种材料，把叶片与叶柄分别接种于MS空白培养基中，使之分开培养与统计。记录外植体的接种总数，每个消毒处理接种10瓶，每个培养瓶接2片叶片，叶柄每个培养基接种2个，设置三次的重复。遮光暗培养7d后揭开遮盖物，之后在光照强度3200lx，每天光照时间15h、温度25℃、相对湿度80%的培养室培养15d。
(2)诱导愈伤
分别把在MS空白培养基里培养15d的外植体的叶片和叶柄转入到MS+2.5mg/L ZT+0.3mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂的培养基中。每升培养基加入蔗糖30g和琼脂4.5~5g，PH用氢氧化钠和盐酸调至值5.8。根据存活叶片和叶柄的情况决定处理接种数，一瓶接1-2个，每个浓度接种15瓶，将每个处理组合重复3次，在培养架上采用随机摆放的方法，培养30d。
(3)不定芽分化
把叶片愈伤和叶柄愈伤组织，分别转入含有2.0mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA激素浓度组合的MS培养基里进行继代培养，每升加入30g蔗糖，4.5g琼脂，PH调至5.8。每瓶转3个长势基本相同的愈伤组织，叶片愈伤和叶柄愈伤分别做90瓶。继续放入光照强度3200lx，每天光照时间是15 h、温度25℃、相对湿度80%的培养室培养培养，培养15d。
(4)不定芽增殖培养
使用2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA激素浓度组合的MS培养基，蔗糖30g/L，琼脂4.5~5g/L，PH值5.8，每瓶接种3颗，每个处理5瓶，3个重复，在光照时间15 h/d、光照强度3200lx，25℃条件培养室中下培养。接种后观察并记录不定芽增殖及生长情况，培养30d。
(5)生根培养
以1/2MS培养基作为基本培养基，添加0.5mg/LIBA。每升培养基加入蔗糖15g、琼脂4.5g和100mg碳粉，PH用氢氧化钠和盐酸调至值5.8。将生长高度超过2cm的猕猴桃不定芽转接到生根培养基中，每个处理接种30瓶，每瓶1颗植株，做3次重复。放置于光照时间15 h/d、光照强度3200lx，25℃条件培养室中下培养30d。
(6)炼苗与移栽
将经过生根诱导过的组培苗从组培室取出30瓶放置于室温的实验室，放置2天。再拧松瓶盖不打开培养瓶，放置3d后，再把瓶盖打开斜放于在瓶子上放置2天，经过7天的炼苗，把植株取出，用流水清洗根部的培养基，去掉根部愈伤组织，用稀释过的25g/L多菌灵处理植株根部2min，进行冲洗后用生根粉浸泡7分钟，再移栽于泥炭土与珍珠岩体积比为2:1的土壤中，移栽前使用多菌灵进行灭菌。经常对植株和土壤进行喷水保持土壤湿度，记录其存活率。
3黄肉猕猴桃四倍体耐寒突变体诱导及筛选
(1) 用L-羟脯氨酸进行耐寒筛选
对纯化的黄肉猕猴桃四倍体组培苗进行扩繁，将倍性已鉴定为四倍体的黄肉猕猴桃四倍体组培苗接入到加入8mmol/LL-羟脯氨酸(L-Hyp)的基本培养基中，三次重复，测量处理前后不定芽存活率及鲜重、叶片总数、不定芽高这些数据，在光强38mmol/(m2·s)，光照15h/d，温度（25±3）℃，培养7d，7d后观察这些指标的变化。
同时，将黄肉猕猴桃二倍体组培苗接入到加入8mmol/LL-Hyp基本培养基中，三次重复，同样测量处理前后不定芽存活率及鲜重、叶片总数、不定芽高这些数据。在与上述相同的环境下培养7d，观察指标的变化。再转到不含L-Hyp的正常培养基上，重复三次，筛选耐寒四倍体猕猴桃不定芽组织。
(2)低温处理定向筛选黄肉猕猴桃耐寒突变体
把黄肉猕猴桃二倍体植株和用L-羟脯氨酸进行耐寒筛选过且扩繁的部分四倍体植株作为实验材料。放置在低温0℃条件下处理12h，3次重复。观察四倍体与二倍体无菌苗不同处理时间的萎蔫程度、存活率和死亡率，进而筛选出耐寒突变体。
4黄肉猕猴桃四倍体转录组分析
把3瓶经低温处理定向筛选的黄肉猕猴桃四倍体植株经过0℃处理5h（每瓶有3颗不定芽无菌苗），与3瓶25℃处理5h下的四倍体植株（每瓶有3颗不定芽无菌苗），把组培瓶放置在超净工作台上，分别在常温对照和低温处理组中取3株不定芽植株（每瓶取1株），用锡箔纸分别包装并标号，常温对照组设置C-1、C-1、C-2，低温处理组设置T-1、T-2、T-3。取样后迅速放置在低温液氮中冷却，之后放置在干冰中，将6个样品寄至安徽微分基因科技有限公司进行转录组测序分析。
  根据物种的参考基因组和基因信息，将RNA-Seq测序所产生的数据比对到中华猕猴桃参考基因组上。基于比对结果，对转录组文库质量进行评估；进行基因表达定量分析；并基于表达定量结果进行样品间差异信息筛选。筛选阈值为FDR (false discoveryrate) <0.05，log2FC (fold change (condition 2 / condition 1) for a gene) >2或log2FC<-2的基因作为最终的差异表达结果。把差异表达基因在KEGG Pathway数据库上进行功能注释。对注释到GO和KEGG的差异基因数据进行分析，并根据前人对耐寒基因及相关通路的研究，筛选猕猴桃耐寒相关基因。
在植物激素信号转导及淀粉、蔗糖代谢两个通路找到的耐寒基因为CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）、CEY00_Acc28966（β-淀粉酶）。
5 qRT-PCR筛选
提取黄肉猕猴桃四倍体组培苗叶片的总RNA。去除基因组DNA，再配制反转录反应体系，将RNA反转录成cDNA，反转录产物用于PCR扩增；所述反转录PCR反应体系为：去除基因组DNA的反应液10μl、Oligo(dT)18(0.5ug/ul) 1μl、Random primer(0.1ug/ul)1μl、5×RTReaction Mix 4μl、TUREscript H-RTase/RI Mix0.8μl、RNase free H2O to finalvolume补充至20μl。反转录的反应条件设置为：25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min。选择该品系四倍体植株转录组中耐寒相关并呈上调趋势的差异基因CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）和CEY00_Acc28966（β-淀粉酶），并以持家基因Elongation factor EC为内参基因，配制荧光定量PCR反应体系(CEY00_Acc03316 Primer1:TTCTGGTGAGGTTTCTCCA和CEY00_Acc03316Primer2:CGGCACATCTACTACAAAGGA；CEY00_Acc28966 Primer1:GTGTTTGTGATGCTGCCA和CEY00_Acc28966 Primer2: GAATGGGTGTTCTTCCTCTAAG)，进行萤光定量PCR分析，退火温度设置为57℃，采集荧光信号，绘制差异基因的扩增曲线和溶解曲线。根据溶解曲线选择萤光定量PCR的差异基因。以Elongation factor EC作为内参基因，采用2-△△Ct法计算相对表达量，以差异基因为二倍体差异基因2倍以上的组培苗作为耐寒多倍体组培苗。
6低温筛选验证
把经qRT-PCR筛选的黄肉猕猴桃四倍体植株，放置于低温0℃条件下处理5h，结果表明这些植株均不会发生明显寒害症状（而对照植株则会发生明显的症状），这些植株均为耐寒植株。
47个四倍体植株和3个二倍体植株用于qRT-PCR分析，其中31个植株CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）和CEY00_Acc28966（β-淀粉酶）的相对表达量均至少2倍于二倍体植株的平均值；而9个植株CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）基因表达量大于2倍，但CEY00_Acc28966（β-淀粉酶）基因表达量小于2，大于1倍；7个植株CEY00_Acc03316（脱落酸受体PYL）基因表达量大于2倍，但CEY00_Acc28966（β-淀粉酶）基因表达量小于2倍，大于1倍；另外有2个植株这两个基因的表达量均小于2倍，但大于1倍。
将31个经qRT-PCR筛选的黄肉猕猴桃四倍体植株和3株二倍体植株（对照），放置于低温0℃条件下处理5h。结果表明这31个植株均不会发生明显寒害症状，冻害等级为无或轻微冻害，这些植株均为耐寒植株。而对照植株的冻害等级均为重度冻害，常温培养7天后对照植株均死亡。
<110> 西南林业大学
<120> 黄肉猕猴桃耐寒基因及其运用
<160> 2
<210> 1
<211> 975
<212> DNA
<213> 黄肉猕猴桃Actinidia chinensis
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ttta 1924
1 IleSerSerGluAsnProGluGlu***AsnMETAlaLeuThrLeuHisCysSerThrSer
21 PheSerAsnLeuLysAspLysArgSerLeuLysThrLeuAspAspPheSerArgIleVal
41 CysPheAlaGlnIleArgSerSerCysHisLeuGlnLeuLysSerLeuMETGlnGluThr
61 GlnLeuAlaCysGluArgAsnLeuAsnLeuGluAspArgArgAspGluMETTrpGluLys
81 LeuHisGlnLeuSerAspThrHisGlyLysSerAspSerArgValProValPheValMET
101 LeuProLeuAspThrIleSerPheGlyGlyAsnLeuAsnLysProArgAlaMETAsnAla
121 SerLeuMETAlaLeuLysSerAlaGlyValGluGlyValMETValAspAlaTrpTrpGly
141 LeuValGluLysAspGlyProMETLysTyrAsnTrpGluGlyTyrAlaGluLeuValLys
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201 AsnProAspLeuValTyrThrAspArgSerGlyArgArgAsnProGluTyrIleSerLeu
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241 METArgSerPheHisAspArgPheLysAspAspLeuGlyGluValIleValGluIleGln
261 ValGlyMETGlyProCysGlyGluLeuArgTyrProSerTyrProGluSerAsnGlyThr
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541 PheIleLysLysLysAsnValLysThrThrLysGluAlaAlaPheVal***ThrTyrSer
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601 ValHisAsnLysLysArgAsnPheAsnMETHisAsnPro***AsnProProTyrGluAla
621 AspLysSerSerLeuLeuTyrArgTyr***GlyProMETGluAsn******IleAsnCys
641 SerLeu

Claims (2)

1.黄肉猕猴桃耐寒基因CEY00_Acc03316、CEY00_Acc28966，其特征在于黄肉猕猴桃耐寒基因CEY00_Acc03316的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，CEY00_Acc28966的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
2.如权利要求1所说的黄肉猕猴桃耐寒基因的运用，其特征在于培育黄肉猕猴桃四倍体耐寒植株。
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