CN101646770A - 植物的胁迫耐受性的增强 - Google Patents
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Abstract
本发明提供从邓恩桉(Eucalyptus dunnii)和毛皮桉(Eucalyptus macarthurii)分离出的新颖脱水蛋白(dehydrin)启动子，其是冷诱导性启动子且可用于驱动包括树等植物的CBF基因增强对冰冻温度或水分胁迫的耐受性并且减少与CBF基因表达相关的不当效应。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术和转化植物中的基因表达的改变。更具体来说，本发明涉及通过调控编码C重复结合因子(C-repeat-binding factors，CBF)的基因的表达来增强工业上关注的植物的胁迫耐受性(stress tolerance)、同时减少与所需基因的表达相关的不当效应的方法。
本申请案主张2007年3月29日申请的美国临时申请案60/908,940的优先权。
背景技术
低温胁迫是不仅限制植物可生长的区域而且还影响作物的数量和品质的主要环境因素。每年全世界因低温损害造成的作物产量损失达到约20亿美元。在佛罗里达州(Florida)，偶尔的冰冻已迫使柑橘带迁移到更南的地方，而在加利福尼亚州(California)，近年来由于冬季冰冻，柑橘作物时常遭受严重损害。
植物暴露于水分胁迫减小植物膨压，导致叶子凋萎且减少光合作用，由此阻碍并最终阻止正常生长。植物基因表达受到凋萎强烈地影响(格雷罗(Guerrero)和马莱特(Mullet)，1988)。霜冻或水分胁迫期间的脱水引起淀粉和蛋白质的水解增加，随后导致酶活性降低。失水损伤的程度视土壤和大气因素的条件而定。
植物抵抗低温或水分胁迫的能力极大地不同。来源于热带地区的植物(诸如玉米、水稻和木薯)会在干旱期间或在暴露于低温(即使温度在冰点以上)时被杀死或受到严重损害。另一方面，来源于温带气候的植物受水分胁迫或冰冻温度的影响较低。
桉树(Eucalyptus)植物包含超过八百个物种，其生长于世界的热带和温带地区。桉树具有高生长速率，适应于多种环境，且显示极不易受虫害影响。除其杰出的生长性质外，桉树还提供用于造纸工业的纤维的最大来源。硬木物种(诸如桉树)的纤维一般比软木(诸如松木)的纤维短很多。由桉树产生的较短纤维可以制造具有合意表面特征(包括平滑度和亮度)但撕裂强度或拉伸强度较低的纸浆和纸。桉树木料用于胶合板和碎料板且制材在家具和地板工业中具有经济重要性并提供木柴和装饰和建筑材料(诸如梁和柱)的来源。来自桉树的木片可用于多种复合木材产品，诸如定向结构刨花板(oriented strand board，OSB)或中密度纤维板(medium density fiberboard，MDF)。作为生长快速的物种，桉树还可用作薪材，用于得到木炭，和用于其它能源生产应用，诸如生物燃料和生物产品制造的原料。桉树还种植用来产生林地覆盖物和提供用于美观和工业应用的防风林。来自桉树的精油还用于清洁、美容产品，诸如肥皂和香料，以及用于医学目的。此外，认为桉树种植园对制造碳中和和可再生的生物燃料很有价值，所述生物燃料可用作昂贵化石燃料的替代品。桉树生物质可转化为建筑材料、纸、燃料、食物、动物饲料和其它产品，诸如植物来源的化学品，如蜡和清洁剂。固体生物质还可用于产生工艺用热和电力。另外生物质加工还可用于生物精炼以产生燃料、化学品、新生物基材料和电力。生物燃料可使用快速热解工艺由桉树制造，所述工艺是一种在不存在空气的情况下将可再生的生物质快速加热到450℃-600℃的生物转化方法。
桉树是世界上最常种植的硬木。然而，桉树物种由于其对低温的高敏感性和其抵抗水分胁迫的能力有限而主要局限于气候温和的地区。虽然一些桉树物种对暴露于低温的耐受性比其它桉树物种好，但是突然的严重霜冻对大部分(如果不是全部)桉树物种的生存也会造成很大威胁。诱导出的对逐渐更低温度的耐受性(称为冷驯化(coldacclimation))可仅在暴露于锻炼冷处理伴随光强度降低和日照时间缩短之后获得，但其成功取决于数种因素，包括物种和其来源、锻炼期的持续时间和树的健康状况。大部分桉树物种抵抗水分胁迫的能力也极其有限。过量失水导致生长普遍减慢和叶面积比、比叶面积和叶根面积比显著降低。
对胁迫(包括冰冻胁迫和水分胁迫)的抗性更大的植物可生长于较大范围的地理区域且其作物将经受极少环境风险。然而，尽管持续努力，但传统育种仅在赋予作物植物较好胁迫耐受性方面取得了有限的成功。
植物遗传工程改造对于改良商业上重要的植物物种具有很大潜力。近年来，对树的遗传工程改造已用于改良应用于造纸和燃料工业中的木材品质。杨属(Populus genera)中的物种已用作遗传工程改造树的模型(金(Kim)等人1997)，且诸如抗虫性和除草剂耐受性的各种性状已工程改造到树物种中(克劳普芬斯坦(Klopfenstein)等人1993，迪布罗克(De Block)1990)。
近年来，数个研究小组已将其研究集中在鉴别负责植物的胁迫耐受性的机制中的胁迫调控基因和其功能上。植物中在冷处理后诱导出的基因统称为冷调控基因(Cold-Regulated Gene，COR)。在拟南芥属(Arabidopsis)中，冷驯化与由称为CRT(C重复)/DRE(脱水应答元件(dehydration responsive element))DNA调控元件的冷和脱水应答DNA调控元件介导的COR基因诱导相关。分别称为CBF1、CBF2和CBF3或DREB1b、DREB1c和DREB1a的冷应答转录活化因子的小家族识别存在于冷和脱水应答基因的启动子区中的CRT(C重复)/DRE序列。与CRT/DRE序列结合的拟南芥属CBF1(一种转录活化因子)的表达增加诱导COR基因表达且增强非驯化拟南芥属植物的耐冻性。在使植物暴露于低的非冰冻温度后15min内且在诱导含有CRT/DRE调控元件的冷调控基因2小时内CBF基因被诱导；出现通常所说的“CBF调节子”，使得在接下来几天内植物耐冻性增强(嘉格罗-奥托森(Jaglo-Ottosen)等人，1998)。CBF调节子表达还增强对干旱和高盐度胁迫的耐受性。(史托金(Stockinger)等人，1997；福勒(Fowler)和托马休(Thomashow)，2002；春日(Kasuga)等人，1999；哈克(Haak)等人，2002)。
CBF基因存在于包括玉米、大豆、小麦、水稻、大麦、番茄、苜蓿、芥花等若干作物物种以及诸如甘蓝型油菜(Brassica napus)等蔬菜和树中。已在四种不同桉树物种中证明CBF基因的存在：巨桉(Eucalyptus grandis)(阿伯基因公司(ArborGen)，egCBF1和egCBF3)；邓恩桉(Eucalyptus dunnii)(阿伯基因公司，ed7.1和ed8.1)；加柠桉(Eucalyptus gunnii)(基因库(GenBank)保藏编号ABB51638)；和蓝桉(Eucalyptusglobulus)(基因库保藏编号ABF70207)。
在过去几年中，开发胁迫耐受性改良的转基因植物已受到很大关注。然而，改良对寒冷、干旱和盐负荷的耐受性的同时，拟南芥属CBF1在转基因植物中的表达还伴有对正常生长条件下植物的生长和产量的负面影响。已报道CBF/DREB1的表达在拟南芥属和番茄中产生矮态(吉尔摩(Gilmour)等人，2000；谢(Hsieh)等人，2002b；春日(Kasuga)等人，1999；刘(Liu)等人，1998)。将小麦DREB2A同源基因引入水稻植物中也导致矮态(沈(Shen)等人，2003)。
因此，亟需开发更好的技术来改良商业上重要的树和植物的胁迫耐受性(包括耐冻性和失水耐受性)，所述树和植物包括热带树，诸如桉树、柑橘树、鳄梨树、番木瓜树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树，所述技术允许通过过表达转录活化因子(诸如CBF1)来调节胁迫反应和耐寒性和失水耐受性所涉及的基因的表达，同时减少与调控植物的胁迫耐受性的复杂机制相关的不当效应。
发明内容
本发明的目的在于提供可进行操作来增强植物的胁迫耐受性的基因。
本发明的目的还在于提供驱动增强植物的胁迫耐受性的基因表达的启动子序列。
本发明的另一目的在于提供与同一物种的非转化植物相比展现胁迫耐受性改良的转基因植物。
本发明的目的还在于提供通过改变植物的胁迫耐受性来调节其表型的方法。
本发明的又一目的在于提供由展现胁迫耐受性改良的转基因植物制造木材的方法。
本发明的又一目的在于提供由展现胁迫耐受性改良的转基因植物制造结构制材的方法。
本发明的又一目的在于提供由展现胁迫耐受性改良的转基因植物制造生物燃料的方法。
为实现这些和其它目标，本发明提供DNA构筑体，其包含可操作地连接于胁迫相关启动子序列的由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的CBF基因序列或CBF同源基因序列，所述启动子序列在经干燥、寒冷或高盐条件诱导后引起植物中的CBF基因或CBF同源基因表达，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应。
在一实施例中，本发明提供一种经DNA构筑体转化的树细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于胁迫相关基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)启动子RD29A的拟南芥CBF2基因。
在另一实施例中，本发明提供转基因植物，其与CBF2在同一物种的非转化植物中的表达相比展现CBF2表达增加，且与同一物种的非转化植物的表型相比具有特征为胁迫耐受性增强的表型。转基因植物可为双子叶植物或单子叶植物。优选地，所述转基因植物是被子植物。更优选地，转基因植物是硬木热带树，包括桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树。本发明的实施例中也包括转基因植物的器官，包含叶子、茎、花、子房、果实、种子和愈伤组织。
在另一实施例中，本发明提供产生转基因树的方法，其包含用包含可操作地连接于拟南芥RD29A启动子的拟南芥CBF2基因的DNA构筑体转化树细胞，以产生转化树细胞；和在促进与同一物种的非转化树相比展现胁迫耐受性改良的树生长的条件下培养所述转化树细胞。
在另一实施例中，本发明提供增强树的耐冻性的方法，其包含用包含可操作地连接于拟南芥RD29A启动子的拟南芥CBF2基因的DNA构筑体转化树细胞，以产生转化树细胞；和在促进树生长的条件下培养所述转化树细胞，其中由AtCBF2基因编码的多肽在转化树细胞中表达，且所述树是与同一物种的非转化树相比展现耐寒性改良的转基因树。
在又一实施例中，本发明提供由转基因树制造木材和木浆的方法，其包含用包含可操作地连接于拟南芥RD29A启动子的拟南芥CBF2基因的DNA构筑体转化树细胞，以产生转化树细胞；和在促进树生长的条件下培养所述转化树细胞，其中由AtCBF2基因编码的多肽在转化树细胞中表达，且所述树是与同一物种的非转化树相比展现胁迫耐受性改良的转基因树。
在又一实施例中，本发明提供由SEQ ID NO：9或10代表的脱水蛋白启动子序列，或其包含具有至少30个连续核苷酸且与具有SEQ ID NO：9或10的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。
在另一实施例中，本发明提供DNA构筑体，其包含可操作地连接于由SEQ ID NO：9或10代表的脱水蛋白启动子序列或其包含具有至少30个连续核苷酸的核酸序列且与具有SEQ ID NO：9或10的脱水蛋白启动子至少50％一致的片段或变异体的所需基因，其中所述启动子驱动植物中的所述所需基因在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与所需基因的表达相关的不当效应。优选地，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点的范围内。
在另一实施例中，本发明提供DNA构筑体，其包含可操作地连接于启动子的包含由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的经分离的聚核苷酸，或其包含与由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致的核苷酸序列的片段或变异体，其中所述启动子驱动植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应。优选地，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与包含SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。本发明的核酸序列可包括一个或一个以上碱基缺失、取代、插入和/或添加。
在另一实施例中，本发明提供一种经DNA构筑体转化的植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于启动子的包含由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的经分离的聚核苷酸，或其包含与由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致的核苷酸序列的片段或变异体，其中所述启动子驱动植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应。优选地，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与具有SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。
在另一实施例中，本发明提供与同一物种的非转化植物的胁迫耐受性程度相比展现胁迫耐受性增强的转基因植物。优选地，所述胁迫条件是0℃到-30℃的冰冻温度。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水。转基因植物可为双子叶植物或单子叶植物。优选地，转基因植物是被子植物。更优选地，转基因植物是硬木热带树，包括桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树。本发明的实施例中也包括转基因植物的器官，包含叶子、茎、花、子房、果实、种子和愈伤组织。
在另一实施例中，本发明提供产生转基因植物的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于启动子的包含由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的经分离的聚核苷酸，或其包含与由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致的核苷酸序列的片段或变异体，其中所述启动子驱动植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应，以产生转化植物细胞；和在促进与同一物种的非转化植物相比展现耐寒性改良的植物生长的条件下培养所述转化植物细胞。优选地，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与具有SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。
在另一实施例中，本发明提供增强被子植物的耐冻性的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于启动子的包含由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的经分离的聚核苷酸，或其包含与由SEQ IDNO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致的核苷酸序列的片段或变异体，其中所述启动子驱动植物中的植物转录因子在所述植物暴露于胁迫条件历时2小时到72小时范围内的时间段后表达，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应，以产生转化植物细胞；和在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中由所述经分离的聚核苷酸序列编码的多肽在转化植物细胞中表达，且所述植物是与同一物种的非转化植物相比展现耐寒性改良的转基因植物。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV35S启动子。更优选地，启动子是具有由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与包含SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。优选地，所述胁迫条件是0℃到-30℃的冰冻温度。
在又一实施例中，本发明提供一种由转基因植物制造木材和/或木浆的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于启动子的包含由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的经分离的聚核苷酸，或其包含与由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致的核苷酸序列的片段或变异体，其中所述启动子驱动植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应，以产生转化植物细胞；在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中由所述聚核苷酸序列编码的多肽在转化植物细胞中表达；和由所述转基因植物制造木材。优选地，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与包含SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。优选地，植物是与同一物种的非转化植物相比展现胁迫耐受性改良的转基因植物。
在又一实施例中，本发明提供一种由转基因植物制造薄板和/或妥尔油(tall oil)的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于启动子的包含由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的经分离的聚核苷酸，或其包含与由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致的核苷酸序列的片段或变异体，其中所述启动子驱动植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应，以产生转化植物细胞；在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中由所述聚核苷酸序列编码的多肽在转化植物细胞中表达；和由所述转基因植物制造薄板和/或妥尔油。优选地，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与包含SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。优选地，植物是与同一物种的非转化植物相比展现胁迫耐受性改良的转基因植物。
在另一实施例中，本发明提供一种由转基因植物制造生物燃料的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于启动子的包含由SEQID NO：1、3、5或7代表的CBF2基因序列或CBF同源基因序列的经分离的聚核苷酸，或其包含与由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致的核苷酸序列的片段或变异体，其中所述启动子驱动植物中的植物转录因子在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应，以产生转化植物细胞；在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中由所述聚核苷酸序列编码的多肽在转化植物细胞中表达；和由所述转基因植物制造生物燃料。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与具有SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段。优选地，在暴露于胁迫条件之前冷驯化转基因植物，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，转基因植物的表型的特征为与同一物种的非转化植物相比胁迫耐受性增强。
在另一实施例中，本发明提供DNA构筑体，其包含编码包含由SEQ ID NO：2、4、6或8代表的氨基酸序列的具有CBF活性的多肽或包含与由SEQ ID NO：2、4、6或8代表的氨基酸序列具有至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％序列一致性的氨基酸序列的具有CBF活性的多肽的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接于一个或一个以上引起核酸序列表达的合适启动子。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与具有SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。本发明的多肽可包括不会改变转录因子活性的氨基酸取代、添加和缺失。
在另一实施例中，本发明提供一种经分离的植物细胞，其表达由包含由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的CBF同源基因序列的聚核苷酸或其包含与由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致的核苷酸序列的片段或变异体编码的多肽，其中所述CBF同源基因的表达在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后由启动子驱动，同时减少与CBF基因的表达相关的不当效应。优选地，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与包含SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。优选地，所述多肽包含由SEQ ID NO：2、4、6或8代表的氨基酸序列，或是包含与由SEQ ID NO：2、4、6或8代表的氨基酸序列具有至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％序列一致性的氨基酸序列的具有CBF活性的多肽。
在又一实施例中，本发明提供一种转基因植物，其表达包含由SEQ ID NO：2、4、6或8代表的氨基酸序列的多肽，或包含与由SEQ ID NO：2、4、6或8代表的氨基酸序列具有至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％序列一致性的氨基酸序列的具有CBF活性的多肽，其中所述转基因植物展现的表型不同于同一物种的非转化植物的表型，且其中所述多肽的表达在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后被驱动，而无与具有CBF活性的多肽表达相关的不当效应。优选地，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，与同一物种的非转化植物相比，转基因植物展现胁迫耐受性改良。
在又一实施例中，本发明提供一种由转基因植物制造木材和/或木浆的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于一个或一个以上引起所需基因表达的合适启动子的所需基因，以产生转化植物细胞；在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中由所述所需基因编码的多肽在转化植物细胞中表达，且所述植物是展现的表型不同于同一物种的非转化植物的表型的转基因植物；和由所述转基因植物制造木材。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与具有SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。优选地，在暴露于胁迫条件之前冷驯化转基因植物，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，与同一物种的非转化植物相比，转基因植物展现胁迫耐受性改良。
在又一实施例中，本发明提供一种由转基因植物制造薄板和/或妥尔油的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于一个或一个以上引起所需基因表达的合适启动子的所需基因，以产生转化植物细胞；在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中由所述所需基因编码的多肽在转化植物细胞中表达，且所述植物是展现的表型不同于同一物种的非转化植物的表型的转基因植物；和由所述转基因植物制造薄板和/或妥尔油。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与包含SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。优选地，在暴露于胁迫条件之前冷驯化转基因植物，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，与同一物种的非转化植物相比，转基因植物展现胁迫耐受性改良。
在另一实施例中，本发明提供一种由转基因植物制造生物燃料的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于一个或一个以上引起所需基因表达的合适启动子的所需基因，以产生转化植物细胞；在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中所述所需基因的产物在转化植物细胞中表达，且所述植物是展现的表型不同于同一物种的非转化植物的表型的转基因植物；和由所述转基因植物制造生物燃料。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与包含SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。优选地，在暴露于胁迫条件之前冷驯化转基因植物，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，转基因植物的表型的特征为与同一物种的非转化植物相比胁迫耐受性增强。
在又一实施例中，本发明提供一种由转基因植物制造生物能量的方法，其包含用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含可操作地连接于一个或一个以上引起所需基因表达的合适启动子的所需基因，以产生转化植物细胞；在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中所述所需基因的产物在转化植物细胞中表达，且所述植物是展现的表型不同于同一物种的非转化植物的表型的转基因植物；和由所述转基因植物制造生物能量。优选地，所述启动子是拟南芥rd29A启动子或CaMV 35S启动子。更优选地，启动子是包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列的脱水蛋白启动子，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸且与包含SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。优选地，在暴露于胁迫条件之前冷驯化转基因植物，所述胁迫条件是0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段在2小时到约72小时范围内。在本发明的另一优选方面中，胁迫条件是缺水且时间段在1日到10日直到凋萎点范围内。优选地，转基因植物的表型的特征为与同一物种的非转化植物相比胁迫耐受性增强。
附图说明
图1A说明pABCTE01(SEQ ID NO：12)的质粒图谱。
图1B说明带有用于增强耐寒性的CBF2基因和用于减少桉树中木质素的基因的质粒pABCTE03B(SEQ ID NO：13)的图谱。
图2说明与非转化拟南芥属植物的0.0％的存活率相比，表达AtCBF2的rdCBF2-7拟南芥属植物在暴露于-10℃的冰冻胁迫8小时后展现69％的存活率。
图3说明当与野生型拟南芥属植物相比时，9个表达CBF2的拟南芥属品种中的8个在暴露于冰冻温度后显示电解质渗漏减少。rdCBF2-5是唯一在冰冻温度下显示电解质渗漏增加的表达CBF2的拟南芥属品种。
图4说明暴露于冰冻胁迫后带有AtCBF2基因的转基因桉树植物和野生型桉树植物。使所述植物在1加仑盆中生长20日且在转基因栅栏区中驯化25日，随后暴露于冰冻胁迫。对于冰冻胁迫测试来说，用塑料袋包裹所述盆以防止干燥且置于精确低温生长室(Precision Low Temperature Growth Chamber)中。使植物暴露于在-2℃与-6℃之间范围内的冰冻温度48小时，使其在4℃下恢复8小时，且接着转移到温室中。在温室中5日后对经历冰冻胁迫后存活的植物数目进行计分。放回转基因栅栏区后20日进行拍照。
图5说明从在暴露于冰冻胁迫后对拟南芥属植物的叶子执行的电解质渗漏检定获得的结果。与非转化拟南芥属植物的叶子相比，表达pd35SegCBF1的转基因拟南芥属植物的叶子显示电解质渗漏减少。
图6A说明含有邓恩桉启动子(SEQ ID NO：9)的pAGW14的质粒图谱。
图6B说明含有毛皮桉脱水蛋白启动子(SEQ ID NO 10)的pAGW15的质粒图谱。
图7说明暴露于低温(4℃)24小时的转基因拟南芥属植物中的邓恩桉启动子(SEQID NO：9)或毛皮桉脱水蛋白启动子(SEQ ID NO 10)的诱导。
图8说明pSrc-GUS(SEQ ID NO：11)的质粒图谱。
图9说明2个用pAGW16(SEQ ID NO：18)转化的转基因品种中的邓恩桉脱水蛋白启动子的倍数诱导和2个用pAGW17(SEQ ID NO：19)转化的转基因品种中的毛皮桉脱水蛋白启动子的倍数诱导。
图10说明暴露于低温(4℃)24小时的转基因拟南芥属植物中的Src2启动子(SEQID NO：11)的诱导。
图11说明4个带有驱动CBF2基因或CBF同源基因表达的启动子的质粒的图谱。图11A展示带有驱动CBF同源基因加柠桉CBF1(SEQ ID NO：5)表达的邓恩桉启动子(SEQ ID NO：9)的质粒pAGSM23。图11B展示带有驱动CBF同源基因邓恩桉8.1(SEQID NO：3)表达的邓恩桉启动子(SEQ ID NO：9)的质粒pAGSM24。图11C展示带有驱动CBF同源基因加柠桉CBF1(SEQ ID NO：5)表达的Src启动子(SEQ ID NO：11)的质粒pAGSM42。图11D展示带有驱动拟南芥CBF2基因表达的Src启动子(SEQ ID NO：11)的质粒pAGSM47。
图12A说明质粒pAGW16(SEQ ID NO：18)的图谱。
图12B说明质粒pAGW17(SEQ ID NO：19)的图谱。
图13呈现展示桉树CBF同源物edC7.1和edC8.1的表达回应于低温暴露而增加的DNA凝胶。使三棵盆栽IPB1植物在1加仑盆中生长到约2英尺高且暴露于低温(4℃)0.5小时、1小时、2小时或4小时。在每一时间点，对嫩叶取样且立即处理用于总RNA提取。也在暴露于寒冷之前从植物取得叶样品，且其称为零时样品。由从各叶样品制备的总RNA合成Poly(A)RNA和相应单链cDNA(sscDNA)。在25μl PCR反应中使用10ng sscDNA和10皮莫耳两种基因特异性引物。PCR后，在DNA凝胶上对10μl各反应液进行电泳。
图14说明在暴露于水分胁迫之前生长于2个单独1加仑盆中的转基因品种TUH000427和TUH000435的桉树IPB1树苗。各盆含有一棵转基因植物和一棵野生型(WT)植物。
图15说明8日不浇水的生长于2个单独1加仑盆中的转基因品种TUH000427和TUH000435的桉树IPB1树苗和WT植物的凋萎程度。各盆含有一棵转基因植物和一棵野生型(WT)植物。
图16说明在期间不对植物浇水的8日后，在期间对植物定期浇水的10日时间结束时，生长于2个单独1加仑盆中的转基因品种TUH000427和TUH000435的桉树IPB1树苗和WT植物的恢复情况。各盆含有一棵转基因植物和一棵野生型(WT)植物。
图17说明在暴露于水分胁迫之前生长于2个单独1加仑盆中的转基因品种TUH000427和TUH000435的桉树IPB1树苗。各盆含有一棵转基因植物和一棵野生型(WT)植物。
图18说明8日不浇水的生长于2个单独1加仑盆中的转基因品种TUH000427和TUH000435的桉树IPB1树苗和WT植物的凋萎程度。各盆含有一棵转基因植物和一棵野生型(WT)植物。
图19说明在期间不对植物浇水的8日后，在期间对植物定期浇水的10日时间结束时，生长于2个单独1加仑盆中的转基因品种TUH000427和TUH000435的桉树IPB1树苗和WT植物的恢复情况。各盆含有一棵转基因植物和一棵野生型(WT)植物。
具体实施方式
本发明涉及对植物的胁迫耐受性进行遗传操纵的方法，和展现胁迫耐受性增强的转基因植物。
植物经历冰冻温度和水分胁迫后存活的能力具有极大不同。大部分来源于热带地区的植物对冰冻温度具有极低耐受性且抵抗极端水分胁迫的能力有限，而许多来自温带地区的草本植物物种可经历水分胁迫和温度在-5℃到-30℃范围内的冰冻后存活，这视物种而定。耐寒性可通过使植物暴露于约10℃以下的低温而诱导出，这是一种称为“冷驯化”的现象(休斯(Hughes)和邓恩(Dunn)，1996；托马休(Thomashow)，1999)。
改良经济上重要的植物的胁迫耐受性具有显著实际应用，因为水分胁迫和冰冻温度是限制适合于作物和园艺植物生长的地理位置的主要因素且在周期性方面解释植物生产率的显著损失。
在一些情况下，通过暴露于若干水分胁迫循环来调节植物使得植物对缺水的敏感性降低。植物以活化多个使得胁迫耐受性增强的生物化学机制来应答驯化。使拟南芥属植物暴露于低温导致编码称为C重复(CRT)结合因子(CBF1、CBF2和CBF3)或脱水应答元件(DRE)结合因子(DREB1b、DREB1c和DREB1a)的转录活化因子的小基因家族的快速诱导。CBF表达活化冷调控基因(COR)，其转而又引发多个事件的级联反应级联反应，从而使得耐寒性增强。
已显示CBF基因在转基因植物中的表达改良对干旱、高盐和低温胁迫的耐受性，但其也伴有不当效应，诸如在正常生长条件下的生长停滞和矮态(伊藤(Ito)等人植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology)47(1)：141-153(2006)；李(Lee)等人植物、细胞和环境(Plant，Cell & Environment)26(7)：1181-90(2003))。
对CBF基因在转基因植物中的表达的先前工作不能预示本发明者的发现：CBF基因和CBF同源基因可在转基因植物中表达，同时减少与CBF表达相关的不当效应。
因此，提供改良植物、植物细胞和植物组织的胁迫耐受性的方法。根据本发明的这一方面，用CBF或CBF同源基因转化植物细胞和整个植物，所述基因在植物细胞或整个植物中表达时引起胁迫耐受性增强而不会引起任何先前报道的与CBF表达相关的不当效应。在一优选实施例中，用CBF或CBF同源基因转化的植物或植物细胞是被子植物。优选地，用CBF或CBF同源基因转化的植物或植物细胞是桉树植物。
本文所使用的所有技术术语是生物化学、分子生物学和农业学中常用的术语，且可由本发明所属领域的普通技术人员所了解。技术术语可见于以下文献中：分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第3版，第1-3卷，萨姆布鲁克(Sambrook)和拉塞尔(Russell)编，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)，2001；最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)，阿苏贝尔(Ausubel)等人编，纽约格林出版协会和威利出版社(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，New York)，1988(定期更新)；精编分子生物学实验指南：最新分子生物学实验方法汇编的方法概要(ShortProtocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology)，第5版，第1-2卷，阿苏贝尔(Ausubel)等人编，约翰威利父子公司(John Wiley & Sons，Inc.)，2002；基因组分析：实验室手册(Genome Analysis：ALaboratory Manual)，第1-2卷，格林(Green)等人编，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)，1997。本文描述涉及植物生物学技术的方法且其详细地描述于诸如以下的论文集中：植物分子生物学方法：实验室教程手册(Methods in Plant Molecular Biology：A Laboratory Course Manual)，玛丽嘉(Maliga)等人编，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)，1995。使用PCR的各种技术描述于以下文献中：英尼斯(Innis)等人，PCR实验方法：方法与应用指导(PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applications)，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，1990，和迪芬巴克(Dieffenbach)和德维克思勒(Dveksler)，PCR引物：实验室手册(PCR Primer：A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)，2003。PCR引物对可通过欲用于所述目的的已知技术从已知序列获得，诸如使用计算机程序，引物(Primer)，0.5版，1991，怀特黑德生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)，马萨诸塞州坎布里奇(Cambridge，MA)。化学合成核酸的方法例如论述于以下文献中：博卡吉(Beaucage)和凯鲁瑟斯(Caruthers)，1981，四面体通讯(Tetra.Letts.)22：1859-1862和麦特兹(Matteucci)和凯鲁瑟斯(Caruthers)，1981美国化学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)103：3185。
限制酶消化、磷酸化、连接和转化如以下文献中所述进行：萨姆布鲁克(Sambrook)等人，实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。除非另外规定，否则用于细菌细胞生长和维持的所有试剂和材料都从以下公司获得：奥尔德里奇化学品公司(AldrichChemicals)(威斯康星州密尔沃基(Milwaukee，WI))、DIFCO实验室(密歇根底特律(Detroit，MI))、英杰公司(Invitrogen)((Gaithersburg，MD))或西格马化学公司(SigmaChemical Company)(密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))。
术语“编码”是指基因通过转录和翻译的机制向细胞提供信息的过程，通过所述信息，一系列氨基酸可组装成特定氨基酸序列以产生活性酶。由于遗传密码子的简并性，DNA序列的某些碱基变化不会改变蛋白质的氨基酸序列。因此，应了解，涵盖编码转录因子的DNA序列中不会实质上影响蛋白质的功能性质的修饰。
术语“表达”表示由基因编码的蛋白质产物的产生。术语“过表达”是指基因产物在转基因生物体中的产生超过正常或非转化生物体的产生量。
C重复结合因子序列
短语“CBF基因”是指编码与存在于包括称为COR(冷调控)等许多冷和干旱诱导性基因的启动子中的CRT(C重复)/DRE(脱水应答元件)DNA调控元件结合的编码转录活化因子的基因。短语“同源CBF基因”是指与CBF基因共有高序列一致性或相似性且具有CBF功能的基因。
在本说明书中，短语“CBF基因序列”和“CBF同源基因序列”表示赋予胁迫相关植物C重复结合因子(CBF)活性的任何核酸、基因、聚核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子。包含由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的序列且编码显示CBF活性的多肽的聚核苷酸说明这一类别。
适合于本发明的CBF或同源CBF聚核苷酸序列可从特征为存在CBF基因的无数植物中鉴别出。尽管本文揭示上述核苷酸序列，但其不应视为对本发明的限制。可使用基于本文所揭示的DNA或蛋白质序列的寡核苷酸引物或探针，以cDNA或基因组DNA形式从任何合适的植物物种分离出CBF DNA序列。可分离出CBF基因的植物物种的特定实例包括双子叶植物，诸如葫芦科(Cucurbitaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、芸香科(Rutaceae)、蝶形花科(Papilionaceae)(诸如苜蓿和豇豆(Vignaunguiculata))、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)、金虎尾科(Malpighiaceae)(诸如杨属)、桃金娘科(Myrtaceae)(诸如桉树属)；和单子叶植物，诸如禾本科(gramineae)，包括小麦、大麦和玉米。出于本发明的目的，优选地CBF基因是从拟南芥分离，且优选地CBF同源基因是从桉树分离。
在本说明书中，短语“CBF聚核苷酸序列”和“CBF同源聚核苷酸序列”也指具有能够在严格条件下与本文所揭示的任何序列杂交且编码具有等效于包含本文以SEQ IDNO：2、4、6或8揭示的氨基酸序列的多肽的胁迫相关转录因子活性的多肽的核苷酸序列的任何核酸分子。所述短语还包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7交叉杂交的序列，其与由SEQ ID NO：1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70％一致。本发明的核苷酸序列可编码与本文所揭示包含由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8代表的氨基酸序列的多肽同源的多肽。此外，本发明的核苷酸序列包括那些编码具有胁迫相关转录因子活性并具有与本文以SEQ ID NO：2、4、6或8揭示的氨基酸序列具有至少55％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽的序列。
如本文所提及，“严格条件”的意思是以下条件：仅编码具有等效于由CBF基因序列或CBF同源基因序列编码的转录因子的胁迫相关转录因子活性的多肽的碱基序列与特异性CBF或CBF同源序列形成杂交体(称为特异性杂交体)，而编码无所述等效活性的多肽的碱基序列不会与特异性序列形成杂交体(称为非特异性杂交体)。所属领域的普通技术人员可易于通过改变杂交反应和洗涤过程中的温度或杂交反应和洗涤过程中的盐浓度来选择所述条件。特定实例包括(但不限于)以下条件：在65℃下在3.5×SSC、1×邓哈特氏溶液(Denhardt′s solution)、25mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、0.5％SDS和2mM EDTA中历时18小时达成杂交，随后在65℃下用2×SSC、0.1％SDS洗涤过滤器4次历时20分钟，和用0.5×SSC、0.1％SDS，或对于更高严格度来说用0.3×SSC和0.1％SDS，和对于甚至更高严格度来说用0.1×SSC、0.1％SDS进行最后洗涤历时多达20分钟。可用其它条件替代，只要严格度等于本文所提供的使用0.5×SSC最后洗涤的严格度即可。
另外，CBF同源基因序列包括由SEQ ID NO：1或3、5或7代表的聚核苷酸的片段和变异体，其具有一个或一个以上碱基缺失、取代、插入或添加且编码具有胁迫相关转录因子活性的多肽。所属领域的普通技术人员普遍了解，本文所提及的“具有一个或一个以上碱基缺失、取代、插入或添加的碱基序列”保留生理活性，即使一般具有生理活性的蛋白质的氨基酸序列具有一个或一个以上氨基酸取代、缺失、插入或添加。举例来说，可缺失poly A尾或5′或3′末端非翻译区，且可缺失碱基达到使氨基酸缺失的程度。也可取代碱基，只要不导致读框移位(frame shift)即可。也可“添加”碱基，只要所述修饰不会导致损失胁迫相关转录因子活性即可。在本文中，经修饰的DNA可通过经由如卓乐(Zoller)和史密斯(Smith)，1982，核酸研究(Nucleic Acid Res.)10：6487-6500中所述的定点突变来修饰本发明的DNA碱基序列以使特定位点处的氨基酸被取代、缺失、插入或添加来获得。
启动子
本发明提供引起转化植物的胁迫耐受性改良的核酸分子。本发明的一重要方面是使用DNA构筑体，其中CBF基因或同源CBF基因核苷酸序列可操作地连接于一个或一个以上驱动所述CBF基因序列或CBF同源基因序列以组成性方式或在某些细胞类型、器官或组织中表达或驱动CBF基因序列或CBF同源基因回应于胁迫(诸如水分胁迫和低温)暴露而短暂表达的启动子，以便改良转化植物的胁迫耐受性而不会不适当地影响其正常发育或生理。
根据本发明，所选启动子应引起CBF基因或CBF同源基因的表达，以调节宿主植物细胞或宿主植物的胁迫耐受性。
合适的启动子由以下(但不限于)说明：组成性启动子，诸如花椰菜花叶病毒CaMV35S、基于玉米Adh1的pEmu、水稻Act1和玉蜀黍Ubi启动子；胁迫应答启动子，诸如拟南芥rd29A启动子；和本文所揭示的脱水蛋白启动子，包含由SEQ ID No：9、10或11代表的核酸序列，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少个40连续核苷酸且与具有SEQ ID NO：9、10或11的脱水蛋白启动子至少50％一致的核酸序列的片段或变异体。其它合适的启动子揭示于美国专利6,380,459、美国专利申请案第10/702319号、美国专利申请案第10/717897号和美国专利申请案第10/703091号中，所述专利以引用的方式并入本文中。
用于遗传工程改造的植物
本发明包含通过驱动CBF基因或CBF同源基因表达(优选在如上文所述的启动子的控制下)对植物进行遗传操纵以增强其胁迫耐受性。结果是胁迫耐受性增强。
术语“植物”表示可进行遗传操纵的任何含有纤维的植物材料，包括(但不限于)已分化或未分化植物细胞、原生质体、全株植物、植物组织或植物器官，或植物的任何组分，诸如叶子、茎、根、芽、块茎、果实、根状茎等。
可根据本发明进行工程改造的植物包括(但不限于)树，诸如桉树属物种和其杂交种(白桉(E.alba)、白厚皮桉(E.albens)、广叶桉(E.amplifolia)、杏仁桉(E.amygdalina)、香油桉(E.aromaphloia)、比利桉(E.baileyana)、球冠桉(E.balladoniensis)、孟加拉桉(E.benjensis)、边沁桉(E.benthamii)、双肋桉(E.bicostata)、葡萄桉(E.botryoides)、短蕊桉(E.brachyandra)、褐斑桉(E.brassiana)、短柱桉(E.brevistylis)、布罗维桉(E.brockwayi)、赤桉(E.calmaldulensis)、蜡桉(E.ceracea)、昆斯兰桉(E.cloeziana)、聚果桉(E.coccifera)、圆叶桉(E.cordata)、耶桉(E.cornuta)、粗皮桉(E.corticosa)、常桉(E.crebra)、科罗阿津高桉(E.croajingolensis)、柯氏桉(E.curtisii)、山桉(E.dalrympleana)、剥桉(E.deglupta)、大桉(E.delegatensis)、美脉桉(E.delicata)、异色桉(E.diversicolor)、异叶桉(E.diversifolia)、丰桉(E.dives)、长果桉(E.dolichocarpa)、多里高桉(E.dorrigoensis)、邓达司桉(E.dundasii)、邓恩桉(E.dunnii)、滨河白桉(E.elata)、红盔桉(E.erythrocorys)、红血桉(E.erythrophloia)、垂枝桉(E.eudesmoides)、银油桉(E.falcata)、合叶桉(E.gamophylla)、苍赤桉(E.glaucina)、蓝桉(E.globulus)、蓝桉双肋桉亚种(E.globulus su bsp.bicostata)、蓝桉蓝桉亚种(E.globulus subsp.globulus)、石桉(E.gongylocarpa)、巨桉(E.grandis)、巨桉×尾叶桉(E.grandis xurophylla)、黄刺桉(E.guilfoylei)、加柠桉(E.gunnii)、好木桉(E.hallii)、金伯利白桉(E.houseana)、杰克森桉(E.jacksonii)、红花小桉(E.lansdowneana)、莱替斯桉(E.latisinensis)、鳞皮桉(E.leucophloia)、白木桉(E.leucoxylon)、落基桉(E.lockyeri)、卢卡斯桉(E.lucasii)、毛皮桉(E.macarihurii)、直干桉(E.maidenii)、加拉桉(E.marginata)、大果桉(E.megacarpa)、蜜味桉(E.melliodora)、斑点桉(E.michaeliana)、小帽桉(E.microcorys)、小套桉(E.microtheca)、粘皮桉(E.muelleriana)、亮果桉(E.nitens)、亮叶桉(E.nitida)、斜叶桉(E.obliqua)、宽花桉(E.obtusiflora)、西方桉(E.occidentalis)、优桉(E.optima)、卵叶桉(E.ovata)、厚叶桉(E.pachyphylla)、雪桉(E.pauciflora)、少花桉(E.pellita)、穿叶桉(E.perriniana)、水蓝桉(E.petiolaris)、弹丸桉(E.pilularis)、壶果桉(E.piperita)、阔叶桉(E.platyphylla)、多花桉(E.polyanthemos)、白杨桉(E.populnea)、钟果桉(E.preissiana)、假蓝桉(E.pseudoglobulus)、窄叶桉(E.pulchella)、放射桉(E.radiata)、放射桉放射桉亚种(E.radiata subsp.radiata)、王桉(E.regnans)、利生桉(E.risdonii)、罗伯特尼桉(E.robertsonii)、罗德威桉(E.rodwayi)、河红桉(E.rubida)、赤褐桉(E.rubiginosa)、柳叶桉(E.saligna)、红皮桉(E.salmonophloia)、扫帚桉(E.scoparia)、银顶白蜡桉(E.sieberi)、湿地桉(E.spathulata)、斯待尔桉(E.staeri)、猩红桉(E.stoatei)、窄叶白桉(E.tenuipes)、银桉(E.tenuiramis)、细叶桉(E.tereticornis)、四棱果桉(E.tetragona)、澳大利亚红桉(E.tetrodonta)、廷达莱斯桉(E.tindaliae)、珊瑚桉(E.torquata)、宽叶白桉(E.umbra)、尾叶桉(E.urophylla)、漆桉(E.vernicosa)、多枝桉(E.viminalis)、鞣桉(E.wandoo)、韦塔桉(E.wetarensis)、威力斯桉(E.willisii)、威力斯桉镰桉亚种(E.willisii subsp.falciformis)、威力斯桉威力斯桉亚种(E.willisii subsp.willisii)、黄花桉(E.woodwardii)；杨属物种和其杂交种(银白杨(P.alba)、银白杨×大齿杨(P.alba x P.grandidentata)、银白杨×欧洲山杨(P.alba x P.tremula)、银白杨×欧洲山杨腺毛杨变种(P.alba x P.tremula var.glandulosa)、银白杨×美洲山杨(P.alba x P.tremuloides)、香脂杨(P.balsamifera)、香脂杨毛果杨亚种(P.balsamifera subsp.trichocarpa)、香脂杨毛果杨亚种×美洲黑杨(P.balsamifera subsp.trichocarpa x P.deltoides)、缘毛杨(P.ciliata)、美洲黑杨(P.deltoides)、胡杨(P.euphratica)、欧美杨(P.euramericana)、颤杨(P.kitakamiensis)、大叶杨(P.lasiocarpa)、苦杨(P.laurifolia)、辽杨(P.maximowiczii)、辽杨×香脂杨毛果杨亚种(P.maximowiczii x P.balsamifera subsp.trichocarpa)、黑杨(P.nigra)、日本山杨×大齿杨(P.sieboldii x P.grandidentata)、甜杨(P.suaveolens)、川杨(P.szechuanica)、毛白杨(P.tomentosa)、欧洲山杨(P.tremula)、欧洲山杨×美洲山杨(P.tremula x P.tremuloides)、美洲山杨(P.tremuloides)、椅杨(P.wilsonii)、加拿大杨(P.canadensis)、滇杨(P.yunnanensis)；针叶树，诸如火炬松(火炬松(Pinus taeda))、湿地松(湿地松(Pinus elliotii))、美国西部黄松(美国西部黄松(Pinus ponderosa))、扭叶松(扭叶松(Pinus contorta))和辐射松(辐射松(Pinus radiata))；花旗松((Pseudotsuga menziesii))；加州铁杉(加州铁杉(Tsuga canadensis))；美洲云杉(美洲云杉(Picea glauca))；红杉(红杉(Sequoia sempervirens))；真冷杉，诸如银冷杉(银冷杉(Abies amabilis))和香脂冷杉(香脂冷杉(Abies balsamea))；雪松，诸如红雪松(红雪松(Thuja plicatd))和黄扁柏(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))；柑橘树物种，包括香橼(C.medica)、莱檬(C.aurantifolia)、卡西大翼橙(C.latipes)、柠檬(C.limon)、柑橘(C.reticulata)、脐橙(C.sinensis)、葡萄柚(C.paradisi)、酸橙(C.aurantium)、粗柠檬(C.jambhiri)、柚(C.grandis)、野橘(C.indica)、宜昌橙(C.ichangensis)、番橘(C.tachibana)、小花苦橙(C.micrantha)；柑橘树杂交种，包括巴勒斯坦甜莱檬(Palestine sweet lime)、香柠檬和沃尔卡默柠檬(Volkamer lemon)、兰卜莱檬(Rangpurlime)和粗皮柠檬(Rough lemon)；鳄梨树(鳄梨(Persea americana Mill))、番木瓜树(番木瓜(Carica papaya))、肉豆蔻树(肉豆蔻(Myristica insipida))、阿月浑子树(阿月浑子(Pistacio vera))、猕猴桃树(猕猴桃(Actinidia deliciosa A.Chev.))和荷荷芭树(荷荷芭(Simmondsia chinensis))。
产纤维植物也包括在本文中。说明性作物是棉(棉属(Gossipium spp.))、亚麻(亚麻(Linum usitatissimum))、小荨麻(异株荨麻(Urtica dioica))、啤酒花(啤酒花(Humuluslupulus))、椴树(心叶椴(Tilia cordata)、荷兰椴树(T.x.europaea)和欧椴大叶椴(T.platyphyllus))、鹰爪豆(鹰爪豆(Spartium junceum))、苎麻(苎麻(Boehmeria nivea))、构树(构树(Broussonetya papyrifera))、新西兰麻(New Zealand flax)(新西兰麻(Phormium tenax))、罗布麻(罗布麻(Apocynum cannabinum))、鸢尾属(Iris)物种(道格拉斯鸢尾(I.douglasiana)、长管鸢尾(I.macrosiphon)和佩地鸢尾(I.purdyi))、马利筋(马利筋属(Asclepia)物种)、菠萝和香蕉。
短语“转基因植物”是指并有包括(但不限于)以下的DNA序列的植物：通常不存在于宿主植物基因组中的基因，通常不转录为RNA或翻译为蛋白质(“表达”)的DNA序列，或通常存在于非转化植物中、经遗传工程改造或表达改变的任何其它基因或DNA序列。短语“转基因植物”涵盖由从转化植物细胞获得的愈伤组织再生的初级转化体(R0植物)，以及从其种子得到的R1与R2后代，和R0植物与R1和R2后代的无性繁殖衍生体。本发明还涵盖使用R0、R1或R2植物作为亲本产生杂交种。
预期在一些情况下，将通过稳定引入转基因使本发明的转基因植物的基因组规模增加。然而，在其它情况下，所引入的基因将置换内源性序列。根据本发明，在这点上，优选基因是CBF基因或CBF同源基因。
DNA构筑体
根据本发明的一个方面，将CBF基因或CBF同源基因序列并入适合于植物转化的DNA构筑体中。如上文所述，所述DNA构筑体可用于调节CBF在植物中的表达。
因此，提供DNA构筑体，其包含受启动子(诸如任何那些上文所述的启动子)控制的CBF基因序列或CBF同源基因序列以使所述构筑体可在宿主植物细胞中产生RNA。
重组DNA构筑体可使用标准技术来制造。举例来说，用于转录的DNA序列可通过用限制酶处理含有所述序列的载体以切除适当区段来获得。用于转录的DNA序列也可通过使合成寡核苷酸退火和连接或通过在聚合酶链反应(PCR)中使用合成寡核苷酸以在各末端产生合适的限制性位点来产生。接着将DNA序列克隆到含有上游启动子和下游终止子序列的载体中。
本发明的表达载体也可含有终止序列，其位于本发明的核酸分子的下游，以使mRNA的转录终止；和所添加的polyA序列。所述终止子的实例是花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子和胭脂碱合成酶基因Tnos终止子。表达载体也可含有增强子、起始密码子、拼接信号序列和靶向序列。
本发明的表达载体也可含有可在培养物中鉴别转化植物细胞的选择标记。所述标记可与异源性核酸分子，即可操作地连接于启动子的基因相关。如本文中所使用，术语“标记”是指编码允许选择或筛选含有所述标记的植物或植物细胞的性状或表型的基因。通常标记基因将编码抗生素或除草剂抗性。这允许从未转化或转染的细胞中选择转化细胞。
合适的可选择标记的实例包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素(hygromycin)-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、草甘膦(glyphosate)和草铵膦(glufosinate)抗性和氨基-糖苷3′-O-磷酸转移酶(卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)和G418抗性)。这些标记包括对G418、潮霉素、博来霉素(bleomycin)、卡那霉素和庆大霉素(gentamicin)的抗性。构筑体也可含有赋予对除草性草胺膦(phosphinothricin)类似物(如草丁膦铵(ammonium gluphosinate))的抗性的可选择标记基因Bar(汤姆逊(Thompson)等人，1987，欧洲分子生物学组织会刊(EMBO J.)9：2519-2523)。其它合适的选择标记为所属领域的技术人员所已知。
也可包括细菌或病毒来源的复制序列以允许将载体克隆到细菌或噬菌体宿主中。优选地，使用广泛宿主范围原核复制起点。可包括用于细菌的可选择标记以允许选择带有所需构筑体的细菌细胞。合适的原核可选择标记也包括对诸如卡那霉素或四环素(tetracycline)等抗生素的抗性。
如所属领域中所已知，其它编码另外功能的DNA序列也可存在于载体中。举例来说，当土壤杆菌属(Agrobacterium)是宿主时，可包括T-DNA序列以促进随后转移和并入到植物染色体中。植物转化
本发明的构筑体可用于使用合适的转化技术转化任何植物细胞。单子叶植物与双子叶被子植物或裸子植物的植物细胞都可以所属领域已知的多种方式来转化。举例来说，参见克莱因(Klein)等人，1993，生物技术(Biotechnology)4：583-590；贝专纳(Bechtold)等人，1993，法国巴黎科学院报告辑(C.R.Acad.Sci.Paris)316：1194-1199；本特(Bent)等人，1986，分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)204：383-396；帕组夫斯基(Paszowski)等人，1984，欧洲分子生物学组织会刊(EMBO J.)3：2717-2722；萨基(Sagi)等人，1994，植物细胞报告(Plant Cell Rep.)13：262-266。
根据内格尔(Nagel)等人，1990，Microbiol Lett 67：325，可使用例如诸如根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)等土壤杆菌属物种。土壤杆菌属可通过电穿孔用植物表达载体转化，随后通过熟知叶盘方法将土壤杆菌属引入植物细胞中。其它方法包括(但不限于)粒子枪轰击、磷酸钙沉淀、聚乙二醇融合、转移到正萌发的花粉粒中、直接转化(罗兹(Lorz)等人，1985，分子遗传学(Mol.Genet.)199：179-182)和所属领域已知的其它方法。使用诸如卡那霉素抗性等选择标记允许快速鉴别成功转化的细胞。
已知上述土壤杆菌属转化方法适用于转化双子叶植物。对于转化谷类单子叶植物来说，参见德拉佩纳(de la Pena)等人，1987，自然(Nature)325：274-276；罗得斯(Rhodes)等人，1988，科学(Science)240：204-207；和岛本(Shimamato)等人，1989，自然(Nature)328：274-276，所述文献全部都以引用的方式并入本文中，已使用土壤杆菌属进行转化。又参见贝专纳(Bechtold)等人，1994，法国巴黎科学院报告辑(C.R.Acad.Sci.Paris)316，其展示使用真空侵入来进行土壤杆菌属介导的转化。
可根据所属领域中熟知的方法测量特定细胞中蛋白质、多肽或核酸分子的存在以确定例如细胞是否已被成功地转化或转染。
胁迫耐受性
本发明的转基因植物的特征为胁迫耐受性增强。短语“胁迫耐受性增强”是指当与经历水分胁迫或冰冻胁迫后不存活或显示显著失水或冻伤的同一物种的野生型或非转化植物相比时，转基因植物经历水分胁迫或冰冻胁迫暴露后存活且存活后维持其正常表型。术语“锻炼”或“驯化”是指植物在低于最佳水分供应的条件下生长。术语“冷驯化”是指植物暴露于冷锻炼处理5到25日，其在于使所述植物暴露于高于冰点的低温，同时降低光强度和减少日照时间。短语“水分胁迫”表示使未锻炼的植物暴露于干燥条件(缺水)1到10日或直到凋萎点，随后浇水和在室温下24小时的恢复期，随后转移到22℃的温室中。短语“干燥条件”或“缺水”是指可引起叶子开始、暂时或持久凋萎而不引起不可逆凋萎的条件。短语“开始凋萎”是指不易引起注意的叶子的凋萎阶段。短语“暂时凋萎”是指特征为白天叶子明显下垂、晚上植物恢复的凋萎阶段。短语“持久凋萎””是指植物在整夜期间不会恢复的凋萎阶段。当将水加到土壤中时，持久凋萎的植物可恢复原状。除凋萎外，叶子还可能会卷曲或扭曲，变皱，沿边缘变成棕色(枯黄)，变黄，变成棕色和/或从树上掉下。短语“长期持久凋萎”是指植物已达到凋萎点且在加水后不会恢复的阶段。术语“凋萎点”是指植物需要不会不可逆地凋萎的土壤水分最小点且表示植物凋萎并在置于饱和氛围中12小时时不会再恢复其膨胀度的水分减少极限。水分胁迫耐受性的增强可通过与同一物种的野生型或非转化植物数目相比，在温室中10日后对经历水分胁迫后存活的转基因植物数目进行计分来评估。水分胁迫耐受性的增强也可通过对暴露于水分胁迫后芽和叶子的凋萎程度进行计分来评估。
短语“冰冻胁迫”表示冷驯化的植物暴露于在0℃与-30℃之间范围内的温度2到72小时，随后为4℃下的4到8小时恢复期，随后转移到22℃的温室中。耐寒性的增强可通过与同一物种的野生型或非转化植物数目相比，在温室中1到5日后对经历冰冻胁迫后存活的转基因植物数目进行计分来评估。耐寒性的增强也可通过对在暴露于冰冻胁迫后叶子和芽的冻伤进行计分来评估。
以下呈现获得包含CBF基因或CBF同源基因序列的DNA构筑体以及通过土壤杆菌属引入目标基因以产生植物转化体的方法的特定实例。这些实例旨在举例且不对本发明作限制。
实例1
制备含有拟南芥属CBF2基因的DNA构筑体
含有拟南芥属CBF2(AtCBF2)基因(基因库保藏编号AF074601)和驱动AtCBF2表达的拟南芥属rd29A启动子的质粒pMEN068是从孟德尔生物技术公司(MendelBiotechnology，Inc)获得。将pMEN68质粒中的rd29A::CBF2::E9ter片段克隆到阿伯基因公司(ArborGen)主链pWVR5中。所述主链载体pWVR5是移除了35S启动子GUS序列且NOS启动子被来自拟南芥属的UBQ10启动子置换的pBI121载体(克隆技术实验室公司(Clontech laboratories)，加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto CA))(孙C.W(Sun，C.W)和J卡利思(Callis，J)(1997)植物杂志(Plant J.)，11：101-111)。接着获得pABTV14质粒。接着用Kpn I//Pst I将rd29A::CBF2::E9ter序列从pABTV14质粒中消化出来且亚克隆到pAGF243质粒(美国专利申请案第10/946622号)中以获得pABCTE01质粒(图1A，SEQ ID NO：12)，其带有阿伯基因公司(ArborGen)花粉控制序列盒PRMC2::芽孢杆菌RNA酶(barnase)H102E(美国专利申请案第10/946622号)。用Not I将4CLRNAi序列从pARB599(美国专利申请案第11/229856号)质粒中消化出来且亚克隆到pABCTE01质粒(SEQ ID NO：12)中以获得pABCTE03B质粒(图1B，SEQ ID NO：13)。这种质粒含有三个序列盒：rd29A::CBF2序列、花粉控制序列盒和4CLRNAi序列盒。使用pABCTE01和pABCTE03B两种质粒进行桉树转化。
实例2
表达CBF2基因的转基因拟南芥属植物具有增强的耐冻性
使用如P.J.格林(Green P.J.)植物生理学(Plant Physiol.)119：331-342(1999)所述的真空侵入，用含有rd29A启动子和AtCBF2基因的质粒pMEN068转化拟南芥属植物。在室温下使转基因拟南芥属植物的T2种子在皮氏培养皿(Petri dish)的含有1×MS盐和0.5％蔗糖加卡那霉素(35μg/ml)的琼脂上发芽。在野生型对照拟南芥属种子发芽的情况下，琼脂中不添加卡那霉素。在22℃下在恒定光照下生长21日后，在4℃下在光照下培育在皮氏培养皿的琼脂上生长的新植物幼苗以诱导rd29A启动子，且接着在黑暗中暴露于-10℃历时8小时。冰冻胁迫后，将所述植物转移到生长室(22℃)中以使其恢复。在22℃下恢复2日后，对经历冰冻胁迫后存活的植物数目进行计分。
9种带有含有rd29A::AtCBF2序列的pMEN068的拟南芥属转基因植物中的8种显示耐冻性增强。具体来说，rdCBF2-7植物在冰冻胁迫后维持其正常表型且显示最佳存活率，其中69％的个别植物显示耐冻性。相比之下，0.0％的野生型拟南芥属植物经历冰冻胁迫后存活。(参见图2)。表1总结结果。
表1
带有AtCBF2基因的转基因拟南芥属植物具有增强的耐冻性。
＊转基因植物的总数是从单个皮氏培养皿(150×100mm)收集，而相同数目的WT是从两个皮氏培养皿收集。
另外，当与野生型拟南芥属植物相比时，9种带有含有rd29A::AtCBF2序列的pMEN068的拟南芥属转基因植物中的8种显示在暴露于冰冻温度后电解质渗漏减少。rdCBF2-5是唯一在冰冻温度下显示电解质渗漏增加的表达CBF2的拟南芥属品种(参见图3)。
实例3
桉树IPB1克隆的转化
根据美国专利申请案第10/981742号中所述的方案，用质粒pABCTE01(SEQ ID NO：12)和pABCTE03B(SEQ ID NO：13)转化桉树IPB1克隆。
实例4
表达CBF2基因的转基因桉树植物具有增强的耐冻性
测试带有pABCTE01质粒的桉树植物的增强的耐冻性。使带有AtCBF2基因的转基因桉树植物和野生型桉树植物在1加仑盆中生长20日。在转基因栅栏区中驯化所述植物25日，随后暴露于冰冻胁迫。对于冰冻胁迫测试来说，用塑料袋包裹所述盆以防止干燥且置于精确低温生长室中。使植物暴露于在-2℃与-6℃之间范围内的冰冻温度48小时，使其在4℃下恢复8小时，且接着转移到温室中。在温室中5日后，对经历冰冻胁迫后存活的植物数目和叶子和芽的冻伤进行计分。图4说明与非转化桉树植物相比显示耐冻性增强的转基因桉树植物。
在测试条件下42棵带有含有AtCBF2基因的pABCTE01质粒的桉树转基因植物中的31棵显示耐冻性增强。总的说来，74％带有CBF2基因的转基因桉树植物显示耐冻性增强。相比之下，GUS或野生型桉树对照植物遭受显著损伤。表2总结测试的结果。
表2
带有AtCBF2基因的转基因桉树植物具有增强的耐冻性。
| 转基因品种编号 | 耐冻性等级＊ |
| 1 | + |
| 2 | - |
| 3 | + |
| 4 | + |
| 5 | - |
| 6 | - |
| 7 | ++ |
| 8 | + |
| 9 | + |
| 10 | ++ |
| 11 | + |
| 12 | ++ |
| 13 | ++ |
| 14 | + |
| 15 | ++ |
| 16 | ++ |
| 17 | - |
| 18 | ++ |
| 19 | - |
| 20 | - |
| 21 | - |
| 22 | - |
| 23 | ++ |
| 24 | + |
| 25 | + |
| 26 | ++ |
| 27 | + |
| 28 | - |
| 29 | ++ |
| 30 | + |
| 31 | + |
| 32 | ++ |
| 33 | - |
| 34 | ++ |
| 35 | ++ |
| 36 | ++ |
| 37 | - |
| 38 | + |
| 39 | + |
| 40 | + |
| 41 | + |
| 42 | + |
转基因桉树植物的耐冻性等级是基于在冰冻胁迫测试期间所记录的结果和观测结果。++符号表示在冰冻胁迫期期间无损伤或轻微损伤。+符号表示在测试期间显著损伤，但损伤比相应对照植物小。-符号表示植物遭受与对照植物同样多的损伤且缺乏耐冻性。
实例5
从桉树植物分离和鉴别CBF基因同源物
使用酵母单杂交系统(Clonetech Matchmaker酵母单杂交试剂盒(ClonetechMatchmaker Yeast One-Hybrid Kit)(方案号PT1031-1，PR71132版)；克隆技术公司(Clontech)，目录号K1603-1)用干旱应答元件(DRE)序列作为饵，从邓恩桉分离CBF同源基因Ed7.1(SEQ ID NO：1)和Ed8.1(SEQ ID NO：3)。从所述系统回收30个初级克隆。其中20个被证实与4×DRE报道基因以1∶1相互作用。使用序列和Blast分析，20个克隆中的9个与拟南芥属和番茄CBF转录因子显示显著同源性，且鉴别出Ed 7.1和Ed 8.1基因。
根据临时美国专利申请案第60/742926号中所用的方案，其中修改为在基于与来自其它植物物种的已知序列的相似性将经分离的聚核苷酸序列鉴别为编码CBF同源物的情况下，从巨桉分离CBF同源基因EgCBF1(SEQ ID NO：5)和EgCBF2(SEQ ID NO：7)。使用这种方法分离的EgCBF1 cDNA是截短形式且丢失编码EgCBF1蛋白质的N端的13个氨基酸的39个碱基对。合成寡核苷酸(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)且使用PCR技术获得EgCBF1 cDNA的全长(SEQ ID NO：5)。也使用PCR技术合成全长EgCBF3 cDNA(SEQ ID NO：7)和具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的寡核苷酸。
接着用限制酶Sal I和Not I消化PCR产物且直接克隆到含有CaMV 35S启动子的pMEN203(由孟德尔生物技术公司(Mendel Biotechnology)提供)中，产生pd35SEgCBF1和pd35SEgCBF3的构筑体。这两个构筑体适合于转化拟南芥属，但不适合于转化桉树。使用限制酶Pst I切除pd35SEgCBF3所带有的35S::EgCBF3片段且将所得片段克隆到pWVCZ2，即使用pWVR5主链(参见实例1)且添加PRAG1启动子(美国专利申请案第10/946,622号)和从密歇根技术大学(Michigan Technology University)获得的RNS2cDNA制造的质粒中，，从而产生适合于转化桉树的pAB35SegCBF3。
实例6
赤桉(Eucalyptus calmaldulensis)克隆的转化
使用美国专利申请案第09/153,320号中所述的方案，用质粒pAB35SegCBF3转化赤桉克隆。
实例7
来自桉树的CBF基因同源物增强拟南芥属和桉树的耐冻性
测试使用格林(Green)植物生理学(Plant Physiol.)119：331-342(1999)中所述的方法转化的带有pdS35EgCBF1质粒(35S::EgCBF1)的转基因拟南芥属植物的增强的耐冻性。如实例2中所述，使T2种子在皮氏培养皿的琼脂上发芽且测试植物幼苗的耐冻性。
带有pdS35EgCBF1质粒的拟南芥属转基因植物显示耐冻性增强。具体来说，egcbf1-5和egcbf1-6植物显示最佳存活率，其中43％的个别植物经历冰冻胁迫后存活。相比之下，0.0％的野生型拟南芥属植物经历冰冻胁迫后存活。表3总结结果。
表3
带有EgCBF1基因的转基因拟南芥属植物具有增强的耐冻性。
| 植物编号 | 植物的总数 | 存活植物的数目 | 存活率％ |
| WT(a) | 84 | 0 | 0 |
| WT(b) | 113 | 0 | 0 |
| egcbf1-4 | 71 | 18 | 25 |
| egebf1-5 | 68 | 29 | 43 |
| egcbf1-6 | 77 | 33 | 43 |
| egcbf1-7 | 66 | 7 | 11 |
| egcbf1-10 | 49 | 6 | 12 |
| egcbf1-11 | 96 | 25 | 26 |
| egcbf1-12 | 96 | 21 | 22 |
另外，对暴露于冰冻胁迫后拟南芥属植物的叶子执行的电解质渗漏测定显示，与非转化拟南芥属植物的叶子相比，表达pd35SegCBF1的转基因拟南芥属植物的叶子显示电解质渗漏减少(参见图5)。
如实例4中所述，在一些微小改动下，测试如实例6中所述转化且并有pAB35SegCBF3的转基因赤桉植物的增强的耐冻性。在-3.5℃下使植物经受胁迫24小时，且接着将温度升到4℃整夜以使其恢复，随后转移到温室中。转移到温室后3日记录结果且展示于表4中。
结果显示当与未转化的对照植物或GUS对照植物相比时，过表达EgCBF3基因的6棵转基因赤桉植物中的4棵(67％)具有增强的耐寒性。
表4
| 植物编号 | 分生株数目 | 所带有的构筑体 | 植物高度(英寸) | 顶梢枯萎(英寸) | 顶梢枯萎％ | 植物体表型 |
| CTE520291GUS | 31 | pAB35SegCBF3GUS | 23.017.0 | 13.010.0 | 5759 | 正常正常 |
| CTE520293对照组 | 72 | pAB35SegCBF3无 | 10.018.0 | 0.08.0 | 044 | 半矮正常 |
| CTE520295对照组 | 93 | pAB35SegCBF3无 | 17.520.0 | 0.04.5 | 023 | 正常正常 |
| CTE520303对照组 | 74 | pAB35SegCBF3无 | 4.527.0 | 0.011.0 | 041 | 矮小正常 |
| CTE520307GUS | 59 | pAB35SegCBF3GUS | 4.516.5 | 0.03.0 | 018 | 矮小正常 |
| CTE520310GUS | 88 | pAB35SegCBF3GUS | 17.520.0 | 6.09.0 | 3445 | 正常正常 |
实例8
桉树CBF基因ed8.1的过表达增强转基因拟南芥属的耐冻性。
如实例2中所述，使含有质粒pABTV20(rd29A::ed8.1)的T2种子在皮氏培养皿的琼脂上发芽且测试植物幼苗的增强的耐冻性。如通过冰冻胁迫后存活植物的数目所指示，当与野生型(WT)相比时，10个测试转基因品种中的6个具有更佳耐冻性。所有非转化(WT)拟南芥属植物在相同冰冻胁迫条件下都死亡(表5)。
表5
表达ed8.1的转基因拟南芥属植物具有增强的耐冻性。
| 品种编号 | 受胁迫植物的数目 | 胁迫后存活的植物数目 | 存活率％ |
| WT | 399 | 0 | 0 |
| pABTV20-1 | 125 | 25 | 20 |
| pABTV20-6 | 183 | 68 | 37 |
| pABTV20-9 | 268 | 0 | 0 |
| pABTV20-10 | 209 | 0 | 0 |
| pABTV20-13 | 196 | 19 | 10 |
| pABTV20-17 | 170 | 38 | 22 |
| pABTV20-21 | 168 | 30 | 18 |
| pABTV20-25 | 142 | 83 | 58 |
| pABTV20-28 | 113 | 72 | 64 |
| pABTV20-29 | 139 | 7 | 5 |
实例9
桉树CBF基因ed8.1的过表达增强转基因桉树的耐冻性。
如实例4中所述，在一些微小改动下，测试如实例3中所述转化且并有质粒pAGSM24(图11B)的转基因IPB1植物的增强的耐冻性。在-5℃下使植物经受胁迫24小时，转移到4℃下整夜，且接着移到温室中。在温室中5日后，对经历冰冻胁迫后存活的植物数目和叶子和芽的冻伤进行计分。结果显示在室中测试的13个转基因品种中的4个(31％)具有增强的耐冻性(表6)。
表6
对带有pAGSM24的IPB1植物耐冻性增强的室测试的结果
| 转基因品种编号 | 构筑体 | 耐冻性增强(是/否) |
| TGU529930 | pAGSM24 | 否 |
| TGU529931 | pAGSM24 | 否 |
| TGU529932 | pAGSM24 | 是 |
| TGU529933 | pAGSM24 | 否 |
| TGU529934 | pAGSM24 | 是 |
| TGU529935 | pAGSM24 | 是 |
| TGU529936 | pAGSM24 | 是 |
| TGU529937 | pAGSM24 | 否 |
| TGU529938 | pAGSM24 | 否 |
| TGU529939 | pAGSM24 | 否 |
| TGU529941 | pAGSM24 | 否 |
| TGU529942 | pAGSM24 | 否 |
| TGU529943 | pAGSM24 | 否 |
实例10
桉树CBF同源物edC7.1和edC8.1、egCBF1和egCBF3回应于寒冷而在桉树中表达
这些实验设定成研究桉树CBF同源物edC7.1、edC8.1、egCBF1和egCBF3回应于寒冷而在桉树中的表达。使三棵盆栽IPB1植物在1加仑盆中生长直到约2英尺高且接着暴露于低温(4℃)0.5小时、1小时、2小时或4小时。在每一时间点，对嫩叶取样且立即处理用于总RNA提取。也在暴露于寒冷之前从植物取得叶样品，且其称为零时样品。由从各叶样品制备的总RNA合成Poly(A)RNA和相应单链cDNA(sscDNA)。在25μl PCR反应中使用10ng sscDNA和10皮摩尔两种基因特异性引物。PCR后，用DNA凝胶对10μl各反应液进行电泳(参见图13)。将这一实验重复两次。以下列出PCR产物的预期大小。
表7
桉树CBF同源物回应于冷处理而在IPB1植物中的表达
*-，凝胶上无明显PCR产物；+/-，凝胶上观察到微量PCR产物；+，凝胶上观察到低含量的PCR产物；++，凝胶上观察到中等含量的PCR产物；+++，凝胶上观察到高含量的PCR产物；++++，凝胶上观察到极高含量的PCR产物。
结果显示桉树CBF同源物edC7.1和edC8.1应答低温，且其表达受寒冷诱导。暴露于寒冷的最初30分钟和直到4小时时观察到冷诱导。egCBF1和egCBF3基因不受低温诱导。
实例11
从桉树植物分离和鉴别脱水蛋白启动子
从未经处理或已经受低温驯化处理、随后暴露于冰冻温度胁迫的邓恩桉和毛皮桉幼苗的叶子提取总RNA。低温驯化处理方案由在11℃下8小时光照和在2.5℃下16小时黑暗历时5日组成。在这5日时间结束时，在-5℃下使植物经受冰冻胁迫2小时。从4个不同物种/处理组合收集植物材料，于液氮中速冻，且转移到-80℃下以在RNA提取之前进行储存。使用标准技术从植物材料中提取总RNA。
使用总RNA制剂产生富集各桉树物种的冷诱导性基因的cDNA文库。如本文所定义的冷诱导性基因是由于使植物暴露于低温(4℃)而上调的基因。使用克隆技术公司(Clontech)PCR选择cDNA扣减试剂盒(目录号637401，克隆技术实验室公司(ClontechLaboratories Inc)，加利福尼亚州芒廷维尤(Mountain View CA)，宝生物公司(Takara BioInc)的分公司)产生扣减cDNA文库。对于两个桉树植物物种，从未经处理的植物与低温处理的植物获得的cDNA文库的比较允许从cDNA文库扣减两个不受植物暴露于低温所影响的处理组共有的那些基因。接着将基因富集池中的其余cDNA分子克隆到高拷贝质粒中且差示筛选冷诱导的基因。
从各桉树文库中选择出100个群落且分离质粒DNA。由DNA制剂进行两次点印迹法。使用96孔点印迹装置将各DNA样品的等分试样点到尼龙(nylon)膜滤器上。将各DNA样品涂覆于两个单独膜滤器上。通过UV交联使DNA固定于膜滤器上，随后探测印迹。对于各样品，用从未经处理的样品分离的cDNA文库探测1个膜滤器，且用从经受低温的植物获得的cDNA文库探测第二个膜滤器。这种差示筛选方法允许鉴别和分离经冷诱导的基因。认为与从低温处理的植物获得的cDNA文库强烈杂交、但不与从未经处理的植物分离的cDNA文库杂交的基因可能是冷诱导性的。认为与来自低温处理和未经处理的植物的cDNA文库同等良好杂交的那些基因不受低温处理影响且因此不受关注。认为与未经处理的植物的cDNA文库强烈杂交、但不与从低温处理的植物获得的cDNA文库强烈杂交的基因受冷处理而下调，且因此不受关注。从各物种选择约10-15个含有推定冷诱导性基因的克隆以作进一步分析。
使所选克隆经受序列分析，且使用序列数据搜索Entrez数据库中的类似序列。发现所述克隆与若干个不同基因类似。具体来说，一些克隆的序列与脱水蛋白基因的序列同源。因为已知脱水蛋白基因是冷诱导性的，所以这一情况备受关注。从邓恩桉(SEQ IDNO：9)和毛皮桉(SEQ ID NO：10)分离的脱水蛋白同源片段在核苷酸水平上显示相互极高程度的一致性(＞98％)；尽管其并不100％一致。选择来自各物种的单一克隆以作进一步分析。
对从各物种分离的脱水蛋白同源DNA克隆进行的基因组步移(genome walking)导致克隆约600bp的启动子片段。来自两个不同桉树物种的DNA片段显示相互极高程度的一致性，其中两个片段之间仅有偶尔单个碱基差异。DNA片段还含有两个保守性CBF结合基序，此表明启动子很可能是冷诱导性的。
实例12
通过暴露于低温来在转基因拟南芥属和桉树植物中诱导邓恩桉和毛皮桉脱水蛋白启动子的活性
为了研究推定脱水蛋白启动子的活性，将如实例6中所述获得的启动子片段克隆到pBlueScript II SK(+)主链(斯曲特基因公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla，CA))的GUS基因的上游。接着将这些启动子::GUSIN序列盒克隆到pMEN20335S-CBF2(从孟德尔公司(Mendel)获得；用启动子::GUSIN序列盒置换35S::CBF2序列盒)中的E9ter的上游，产生拟南芥属表达载体，含有从邓恩桉分离的启动子(SEQ ID NO：9)的pAGW14(图6A)和含有从毛皮桉分离的启动子(SEQ ID NO：10)的pAGW15质粒(图6B)。将这些载体转化到土壤杆菌属中，且使用土壤杆菌属克隆转化拟南芥属。
从带有pAGW14或pAGW15质粒DNA的若干个品种产生T1植物、T1种子、T2植物和T2种子。使T2种子发芽且将所得幼苗转移到9″×4″盆中。使用由此获得的植物幼苗研究推定脱水蛋白启动子的活性。
对9个pAGW14的转基因品种和10个pAGW15的转基因品种分析低温对启动子活性的诱导。使各转基因品种的个别盆暴露于4℃历时24小时。接着沿土壤线从根部切下个别植物，置于管中，于液氮中速冻，且储存于-80℃下以作进一步分析。也收集、储存尚未暴露于低温处理的植物且用作对照组。
通过实时逆转录酶QRT-PCR分析，使用TaqMan化学反应，按照试剂盒制造商的说明书(斯曲特基因公司(Stratagene)QPCR母混合物，目录号600549；斯曲特基因公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla CA))来测定所收集的组织样品中的GUS表达。用斯曲特基因公司(Stratagene)Mx3000P实时PCR仪，在如下循环条件下进行反应：95℃下2分钟一个循环，随后为40个循环(95℃、10秒+58℃、30秒)。
两个经分离的脱水蛋白启动子在所有转基因品种中的活性都受低温诱导。当与未经处理的转基因植物相比时，在低温处理的转基因拟南芥属植物中，从邓恩桉分离的脱水蛋白启动子的活性增加10到194倍，且从毛皮桉分离的脱水蛋白启动子的活性增加3到50倍。(参见图7)。这些结果清楚地显示经分离的脱水蛋白启动子片段具有冷诱导活性。
也通过使用实例6中所述的方案将质粒pAGW16(SEQ ID NO：18)和pAGW17(SEQID NO：19)转化到赤桉中来在桉树中测试来自邓恩桉和毛皮桉的脱水蛋白启动子。通过将脱水蛋白启动子片段克隆到pABTV16中的GUSIN::E9ter的上游来形成pAGW16和pAGW17，由此用脱水蛋白启动子置换rd29A::GUSin序列盒的rd29A启动子。
使带有pAGW16或pAGW17的赤桉植物各两个品种经受驯化条件5日，包含在18℃下光照9小时，随后在4℃下遮光15小时。
在临起始冷驯化处理之前以及在5日实验期结束时，对于各品种收集叶样品。使用标准技术从叶子分离RNA。如上文所述，通过QPCR，使用TaqMan化学反应来分析GUS表达量。
对于各转基因品种，将GUS表达的基础量(即，非冷处理样品中的GUS表达量)指定值1，且相对于1计算出那个品种的冷处理样品的倍数诱导。用pAGW16(SEQ IDNO：18)转化的两个测试品种具有邓恩桉脱水蛋白启动子的24和57倍诱导且用pAGW17(SEQ ID NO：19)转化的两个品种具有毛皮桉脱水蛋白启动子的19和18倍诱导(参见图9)。
实例13
通过暴露于低温而在转基因拟南芥属中诱导美洲黑杨Src2启动子的活性
通过PCR从三角叶杨(美洲黑杨)克隆WV94分离SRC2同源启动子序列PdSrc(SEQID NO：11)且与GUS序列融合。亚克隆所得序列盒PdSrc::GUS质粒DNA以获得pSrc-GUS载体。将这一载体用于拟南芥属转化。
使含有pSrc-GUS载体的两个拟南芥属转基因品种暴露于低温(4℃)24小时。通过使转基因植物暴露于低温而增强Src2启动子的活性(参见图10)。
实例14
带有AtCBF1基因的转基因桉树植物在田野中显示耐寒性增强
在2005年11月，将44棵带有AtCBF2基因(pABCTE01)的转基因桉树IPB1品种植物、2棵带有GUS载体的IPB1品种植物和若干棵非转基因IPB1植物种在亚拉巴马州洛克斯利(Loxley，Alabama)的田野中。测试中包括各转基因和非转基因品种的8个复本。
在2005-2006年冬季期间两次评估由于暴露于冰冻温度所引起的损伤。在2005年12月14日所执行的第一次调查中，所有转基因和非转基因植物看上去都生长良好且长有新芽和叶子。植物高度在7英寸到15英寸范围内。因为植物尚未暴露于低温，所以没有植物显示任何寒冷损伤迹象。
在2005年11月15日与2006年2月15日之间，测试田中的温度计记录到21个冰冻事件，在所述事件期间环境温度等于或低于0℃(32°F)。最长冰冻事件持续11小时且最短冰冻事件持续0.25小时。在这些事件中的3个事件期间，还记录到环境温度低于或等于-3.89℃(25°F)，但高于-6.67℃(20°F)，总共10.25小时，最长事件持续5小时且最短事件持续1小时。总的说来，在21个冰冻事件期间累积有113.75小时冰冻。2006年2月15日后，未记录到冰冻事件。在2005年11月15日与2006年2月15日之间，根据地下气象(Weather Underground)的网站，在亚拉巴马州(Alabama)的莫比尔机场(Mobil Airport)有52日平均温度低于12℃(53.6°F)。所述机场位于田野测试场以西约15英里。介于0℃与12℃(32.0°F与53.6°F)之间的温度施加寒冷胁迫，但不是冰冻胁迫。
在2006年3月3日执行的第二次调查中，所有非转基因植物和一些带有AtCBF1基因的IPB1植物出现顶梢枯萎，即主茎顶部的部分死亡。下表8总结从2006年3月3日的寒冷损伤调查获得的结果。
表8
*顶梢枯萎百分数是指植物主茎顶部的死亡部分相对于植物从土壤到芽尖的总高度的百分数。顶梢枯萎百分数的平均值是8个复本的平均值。某一植物品种的顶梢枯萎百分数的平均值为值100的意思是所有8棵转基因品种植物在调查时都已死亡。
**使用对成对两个样品的平均值进行的t-检验，以统计学方式分析非转基因IPB1品种与转基因IPB1品种之间的顶梢枯萎百分数的平均值的比较。如果样品缺少1个复本，那么通过假定方差相等对两个样品进行t-检验来进行分析。如果转基因植物品种的顶梢枯萎百分数的平均值大于非转基因IPB1品种的值，那么不应用t-检验且将样品标记为“na”(未应用)。
在2005-2006年冬季期间从田野测试获得的结果表明，当暴露于寒冷和/或冰冻温度时，带有AtCBF2基因的桉树IPB1品种植物具有增强的耐受性。在如上文所述的冬季条件下，当与非转基因IPB1品种相比时，66％带有AtCBF2基因的桉树IPB1品种植物(44棵中的29棵)显示高度显著(p≤0.01)的主芽顶梢枯萎减少，且59％(44棵中的26棵)显示极高度显著(p≤0.001)的顶梢枯萎减少。在田野中，一些带有AtCBF1基因的桉树IPB1品种植物完全没有顶梢枯萎，而100％的非转基因IPB1植物出现顶梢枯萎。
再过21个月后再次分析上述品种中的5个。从2006年3月到2007年12月，测试田中的温度计记录到37个冰冻事件，在所述事件期间环境温度等于或低于0℃(32°F)。最长冰冻事件持续14.75小时且最短冰冻事件持续0.25小时。在这些事件中的5个事件期间，还记录到环境温度低于或等于-3.89℃(25°F)，但高于-6.67℃(20°F)，总共28小时，最长事件持续10.75小时且最短事件持续2.25小时。总的说来，在37个冰冻事件期间累积有197小时冰冻。
下表9总结在2007年12月所评估的5个转基因品种和对照品种的存活率、高度和生长数据。
表9
在2006年7月和8月将以上5个品种种在亚拉巴马州洛克斯利(Loxley，Alabama)的同一地点的另2个盆中且在2007年12月分析其存活率和生长。在亚拉巴马州洛克斯利(Loxley，Alabama)记录到的冰冻事件与上文对于2006年3月到2007年12月时期所列的事件相同，在3月与8月之间未记录到冰冻事件。
下表10(2006年7月种植)和表11(2006年8月种植)总结在2007年12月所评估的转基因品种和对照品种的存活率、高度和生长数据。
表10
表11
这些结果显示在亚拉巴马州洛克斯利(Loxley，Alabama)所经历的条件下的存活率对于对照组和转基因组都是良好的，但如上文所述，非转基因植物上的顶梢枯萎较大。
也在温度降得更低且因此遇到更大冰冻胁迫的许多其它地点测试相同品种。在路易斯安那州华盛顿(Washington，LA)，从2006年7月到2007年11月，从路易斯安那州立大学农业中心(Louisiana State University Agricultural Center，LSU Ag Center)下载温度数据，其记录到20个冰冻事件，在所述事件期间环境温度等于或低于0℃(32°F)。最长冰冻事件持续11.5小时且最短冰冻事件持续0.5小时。在这些事件中的3个事件期间，还记录到环境温度低于或等于-3.89℃(25°F)，但高于-6.67℃(20°F)，总共19小时，最长事件持续8小时且最短事件持续3小时。在这些事件中的1个事件中，还记录到环境温度低于或等于-6.67℃(20°F)，但高于-9.44℃(15°F)，总共2小时。总的说来，在20个冰冻事件期间累积有108小时冰冻。
下表12总结在2007年11月所评估的5个转基因品种和对照品种的存活率、高度和生长数据。
表12
在南卡罗来纳州萨默维尔(Summerville，SC)，在2006年7月种植以上测试的相同品种且在2007年12月进行评估。从2006年7月到2007年12月，测试田中的温度计记录到27个冰冻事件，在所述事件期间环境温度等于或低于0℃(32°F)。最长冰冻事件持续16.25小时且最短冰冻事件持续0.5小时。在这些事件中的3个事件期间，还记录到环境温度低于或等于-3.89℃(25°F)，但高于-6.67℃(20°F)，总共21.5小时，最长事件持续11.5小时且最短事件持续2小时。在这些事件中的1个事件中，还记录到环境温度低于或等于-6.67℃(20°F)，但高于-9.44℃(15°F)，总共5.5小时。总的说来，在27个冰冻事件期间累积有188.75小时冰冻。
下表13总结在2007年12月所评估的5个转基因品种和对照品种的存活率、高度和生长数据。
表13
在南卡罗来纳州布驰纤维农场(Burch Fiber Farm，SC)，在2006年7月种植以上测试的相同品种且在2007年11月进行评估。从2006年7月到2007年11月，测试田中的温度计记录到47个冰冻事件，在所述事件期间环境温度等于或低于0℃(32°F)。最长冰冻事件持续15.25小时且最短冰冻事件持续0.25小时。在这些事件中的18个事件期间，还记录到环境温度低于或等于-3.89℃(25°F)，但高于-6.67℃(20°F)，总共94小时，最长事件持续14.25小时且最短事件持续1.5小时。在这些事件中的5个事件期间，还记录到环境温度低于或等于-6.67℃(20°F)，但高于-9.44℃(15°F)，总共27.25小时，最长事件持续11.75小时且最短事件持续2.25小时。在这些事件中的1个事件期间，还记录到环境温度低于或等于-9.44℃(15°F)，总共4.25小时。总的说来，在47个冰冻事件期间累积有327小时冰冻。
下表14总结在2007年11月所评估的5个转基因品种和对照品种的存活率、高度和生长数据。
表14
从田野测试获得的结果有力地表明，当暴露于寒冷和/或冰冻温度时，带有AtCBF2基因的桉树IPB1品种植物具有提高的存活率。
实例15
盆栽桉树植物的冷胁迫揭露桉树物种具有不同程度的耐寒性。
冷胁迫是指介于0℃与12℃之间的低温胁迫。因为桉树物种在耐冻性方面无差异，所以执行冷胁迫以检验寒冷而非冰冻对不同桉树物种的影响。在0℃下使盆栽植物经受胁迫6日且接着放回温室。所测试的物种是毛皮桉、邓恩桉、巨桉和赤桉。各盆含有两棵或三棵植物。实验结果显示在0℃胁迫条件下6日观察到寒冷损害或损伤。在所有情况下，赤桉植物受到严重损伤，而毛皮桉和邓恩桉显示在相同条件下无损伤(参见表15)。巨桉的耐寒性优于赤桉，但劣于邓恩桉。
表15
实例16
表达CBF2基因的转基因桉树植物对水分胁迫的抗性增强
测试表达CBF2基因的转基因IPB1桉树植物对水分胁迫的耐受性。测试2个转基因品种，TUH000427和TUH000435。使一棵转基因IPB1树苗和一棵野生型(WT)IPB1树苗在1加仑盆中生长(参见图14)。在测试时，盆中的植物高约3英尺。温度和相对湿度分别维持在70°F和65％。8日不对植物浇水。在8日时间结束时，植物上的所有叶子凋萎指示，盆中的植物严重脱水(参见图15)。转基因与WT植物之间未观察到显著差异。盆中的土壤非常干燥。接着对植物浇水。浇水后24小时，植物恢复不显著且在WT与转基因植物之间未检测到差异。接着将盆转移到温室中且定期浇水历时10日。在10日时间结束时，TUH000427转基因品种植物已从水分胁迫完全恢复且大小有所生长。相比之下，同一盆中的WT植物以及生长于不同盆中的TUH000435转基因品种植物已死亡(参见图16)。
再用两盆相同植物重复实验(参见图17)。8日不对植物浇水。在8日时间结束时，植物凋萎(参见图18)。接着对植物浇水且24小时后转移到温室中。生长于同一盆中的TUH000427转基因植物与WT植物都经历胁迫后存活且恢复原状。TUH000427转基因植物恢复较快且遭受的叶子损伤比同一盆中的WT植物小(参见图19)。10日后生长于同一盆中的TUH000435转基因植物与WT植物都死亡，不过转基因植物的叶子较长时间保持绿色且当与WT植物相比较时凋萎迹象出现较迟(参见图19)。
这些结果表明表达CBF2基因的IPB1桉树植物对水分胁迫的耐受性增强。
序列表
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atggacttct ccgacaagga agtgcagctc gcgtccgacc acccgaagaa gcccgccggg 60
aggaagaagt tccgggagac ccgccacccc gtgtaccgcg gggtgcgtct gcgcgactcg 120
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<210>2
<211>190
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>2
Met Asp Phe Ser Asp Lys Glu Val Gln Leu Ala Ser Asp His Pro Lys
1 5 10 15
Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr
20 25 30
Arg Gly Val Arg Leu Arg Asp Ser Gly Lys Trp Val Cys Glu Val Arg
35 40 45
Glu Pro Lys Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Val
50 55 60
Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Glu Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gln Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu Pro Lys
85 90 95
Pro Ala Ser Ala Asp Pro Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Lys Ala
100 105 110
Ala Glu Ala Phe Gln Pro Leu Glu Ser Glu Asp Ile Met Ser Gly Asp
115 120 125
Glu Lys Lys Leu His Ser Glu Glu Gly Val Ser Tyr Asp Glu Glu Asp
130 135 140
Ile Leu Gly Met Pro Gly Leu Ile Ala Asp Met Ala Glu Gly Met Leu
145 150 155 160
Leu Ser Pro Pro Gln Cys Gly Glu Asp Ile Tyr Gly Gly Glu Asp Asp
165 170 175
Gly Asn Leu Asp Ala Tyr Ala Ser Leu Trp Ser His Ser Ile
180 185 190
<210>3
<211>989
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成核苷酸构筑体
<400>3
atggactctt cctcttatat ctcccacccc aactccttta gcttcgactt cgccgagccg 60
cctttctcgt tgctgctgtc ccacgaccgg agcgcagcgc ccgggaactt ctctggggag 120
gaggtgcgcc tcgcgtccga ccacccgaag aagcccgccg gcaggaagaa gttccgggag 180
acacgccacc ccgtgtaccg tggggtgcgg ctgcgcgact cgggaaagtg ggtctgcgag 240
gtccgcgaac ccagaaagaa gtcgaggatc tggcttggca ccttccccac cgcagacatg 300
gcagcgaggg cgcacgatgt ggcggcgctc gcactaaggg gccagtccgc ctgcctcaac 360
ttcgcagact ccgcgtggcg gctgccggtg ccggcgtcac ccaacaccaa agacatacag 420
aaggcagcaa ccaaggccgc ggaggcattc cagctgctgg aatccgagga tgtgatgtcg 480
gggaacgaga agaagttgca ttcggaagag ggagtgttgt acgacgagga ggacatcttc 540
gggatgccgg ggttgctcgc caatatggcg gaggggatgc tcttgtctcc accggaatgc 600
agcggagatt tatatgccgg actggacgac gggaacttgg acgcatacgc gtcattatgg 660
agctattcca tgtgaccatt tctcaatttc actttaagtg ttttgtcatt agggacgact 720
ttgatgcccc acttagtaag tgttttaata gagtgcggat aaaagttgaa gcgtatgaac 780
acagatattt tcggaagcca tttttgtgga gtgccattag ataaaaaggc tgtgttcacc 840
gcaacatcgg gcgtttgcat atagttaata aagaaactgc ccgagtcaac atgaatttaa 900
gagaagtggt tttcagactt acccaattta tcttcgaatg tatcatgtct atggcaaagg 960
tgcgccaacg aaattcgtat gggttcttt 989
<210>4
<211>224
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>4
Met Asp Ser Ser Ser Tyr Ile Ser His Pro Asn Ser Phe Ser Phe Asp
1 5 10 15
Phe Ala Glu Pro Pro Phe Ser Leu Leu Leu Ser His Asp Arg Ser Ala
20 25 30
Ala Pro Gly Asn Phe Ser Gly Glu Glu Val Arg Leu Ala Ser Asp His
35 40 45
Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro
50 55 60
Val Tyr Arg Gly Val Arg Leu Arg Asp Ser Gly Lys Trp Val Cys Glu
65 70 75 80
Val Arg Glu Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro
85 90 95
Thr Ala Asp Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Leu
100 105 110
Arg Gly Gln Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu
115 120 125
Pro Val Pro Ala Ser Pro Asn Thr Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Thr
130 135 140
Lys Ala Ala Glu Ala Phe Gln Leu Leu Glu Ser Glu Asp Val Met Ser
145 150 155 160
Gly Asn Glu Lys Lys Leu His Ser Glu Glu Gly Val Leu Tyr Asp Glu
165 170 175
Glu Asp Ile Phe Gly Met Pro Gly Leu Leu Ala Asn Met Ala Glu Gly
180 185 190
Met Leu Leu Ser Pro Pro Glu Cys Ser Gly Asp Leu Tyr Ala Gly Leu
195 200 205
Asp Asp Gly Asn Leu Asp Ala Tyr Ala Ser Leu Trp Ser Tyr Ser Met
210 215 220
<210>5
<211>690
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成聚核苷酸
<400>5
atggaccact tcttctcttc ttactccgat cccagctcct gcagcctcga ctttgctgaa 60
gcgtcgtcct cctcgtcgcc gctgtccgat ggcaggagtg ctatggtgcc cgggaacttt 120
tctgatgagg aggtgctcct ggcgtcgcac cagccgaaga agcgcgccgg gcggaagaag 180
ttccaggaga cgcgccaccc cgtgtaccgc ggggtgcggc ggcgaagctc gggcaagtgg 240
gtctgcgagg tccgcgagcc caacaagaag tcgaggatct ggctgggcac cttccccacc 300
gcggagatgg ctgcgagggc gcacgacgtg gcggcgctcg cgctgagggg ccggtccgcc 360
tgcctcaact tcgcggactc cgcgtggcgg ctgcccgcgc cggcgtcggc ggacgcaaag 420
gacatacagc aggcggcggc ccaggctgcg gaggcgttcc ggccggcgga gtccgaggct 480
gaggacgtga tgtcggggta cgagaagaag tcgccttcgg aggagggaat gctgtacgac 540
gacgaggacg tcttcgggat gccggggtta ctcacgaata tggcggaggg gatgctcttg 600
cctccaccac aatgcggcgg agatgggtac ggcggagagg acgacgggaa tctggatgca 660
tacgtgtcgt tatggaacta ttccatgtag 690
<210>6
<211>229
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>6
Met Asp His Phe Phe Ser Ser Tyr Ser Asp Pro Ser Ser Cys Ser Leu
1 5 10 15
Asp Phe Ala Glu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu Ser Asp Gly Arg
20 25 30
Ser Ala Met Val Pro Gly Asn Phe Ser Asp Glu Glu Val Leu Leu Ala
35 40 45
Ser His Gln Pro Lys Lys Arg Ala Gly Arg Lys Lys Phe Gln Glu Thr
50 55 60
Arg His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Ser Ser Gly Lys Trp
65 70 75 80
Val Cys Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly
85 90 95
Thr Phe Pro Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala
100 105 110
Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala
115 120 125
Trp Arg Leu Pro Ala Pro Ala Ser Ala Asp Ala Lys Asp Ile Gln Gln
130 135 140
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Glu Ala Phe Arg Pro Ala Glu Ser Glu Ala
145 150 155 160
Glu Asp Val Met Ser Gly Tyr Glu Lys Lys Ser Pro Ser Glu Glu Gly
165 170 175
Met Leu Tyr Asp Asp Glu Asp Val Phe Gly Met Pro Gly Leu Leu Thr
180 185 190
Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro Pro Pro Gln Cys Gly Gly Asp
195 200 205
Gly Tyr Gly Gly Glu Asp Asp Gly Asn Leu Asp Ala Tyr Val Ser Leu
210 215 220
Trp Asn Tyr Ser Met
225
<210>7
<211>989
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成核苷酸构筑体
<400>7
atggcagccc ccgggaactt ctccgacgag gaggcgcgcc tcgcgtccca ccacccaaag 60
aagcgcgccg ggaggaagaa gttccgggag acgcgccacc ccgtgtaccg gggagtgcgg 120
ctgcgtgact cgggcaagtg ggtctgcgag gtccgcgagc ccagaaagaa gtcgaggatc 180
tggctcggca ccttccctac tgtggagatg gcggcgaggg cgcacgatgt ggcagcgctc 240
gcgctgaggg gccggtctgc ctgcctcaac ttcgcagact ccgcgtggcg gctgcccgtg 300
ccagcgtcgg cagacaccaa ggacatacag aaggcggcgg ccaaggccgc ggaggcattc 360
cagccagtgg agtccgagtc cgaggacgtg atgtcggggg acgagaagaa gtcgccttcg 420
gaggagggaa tgctgtacga cgacgaggac gtcttcggga tgccggggtt gctcatgaat 480
atggcggagg ggatgctctt gcctccacca cgatgcggcg gagatgggta cggcggagag 540
gacgacggga atctggatgc atacgtgtcg ttatggagct attccatgta gtcatttctc 600
aagttcagtt atactttttg tggttaggga cgactgggat gccgtactaa aatatttttt 660
gatggagtgc ggatgaaagg cgaaggtggg tacgaaagca gaaggtattt tcggaagcca 720
atttttgggg catgccgtta ggtagataat agagactgca cggctcttct gatgttgggc 780
ctctgatgga agaataaaag taggccatgt tcacggcagc atcgggcgtt gcatatagtt 840
gataaagaga ctgcccgagt catcatgatc ttcgaatgta aatcatgtac catgtacaag 900
gcaaagagtg tgctcttgta attcttatgg tttgtttggg ttcaaatgct ttttgctctg 960
gcccattaag acgataaatt gaccatccc 989
<210>8
<211>196
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成多肽
<400>8
Met Ala Ala Pro Gly Asn Phe Ser Asp Glu Glu Ala Arg Leu Ala Ser
1 5 10 15
His His Pro Lys Lys Arg Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg
20 25 30
His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg Leu Arg Asp Ser Gly Lys Trp Val
35 40 45
Cys Glu Val Arg Glu Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr
50 55 60
Phe Pro Thr Val Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu
65 70 75 80
Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp
85 90 95
Arg Leu Pro Val Pro Ala Ser Ala Asp Thr Lys Asp Ile Gln Lys Ala
100 105 110
Ala Ala Lys Ala Ala Glu Ala Phe Gln Pro Val Glu Ser Glu Ser Glu
115 120 125
Asp Val Met Ser Gly Asp Glu Lys Lys Ser Pro Ser Glu Glu Gly Met
130 135 140
Leu Tyr Asp Asp Glu Asp Val Phe Gly Met Pro Gly Leu Leu Met Asn
145 150 155 160
Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro Pro Pro Arg Cys Gly Gly Asp Gly
165 170 175
Tyr Gly Gly Glu Asp Asp Gly Asn Leu Asp Ala Tyr Val Ser Leu Trp
180 185 190
Ser Tyr Ser Met
195
<210>9
<211>620
<212>DNA
<213>邓恩桉
<400>9
agcttctaat acgactcact ataggggtcc gatcaaggac atccatccaa cgacgcaatt 60
ccacgtttcc ccttcctagt ggctaggaca gcgccaccca cctcccctcg cctccctctc 120
tctctactac tttctctctc cttctttttc ccaccgtttg accgtgcctt tccagctccc 180
ctcgctcgcg tacaccgtaa gctcacgcgc catccgacga aagcggggcc gctcgtcgag 240
agcagcgcgg gcgcgtgcgt tccctcggcg cgtcggcccg tggcgatacc ctttttgggt 300
cggctgtccg acttcctctc ttaacgcacc acgtcggtta agaagcggga gcggattggc 360
cgccccctct aggtgggccc acttcagatc tctcccagaa ttccttcctt cttcatgctt 420
aatcgcgtca tttccgtgtc aattctatgc tataaaaacc gcccaaactc actcctcagc 480
atcatcacac agaaaaccca tcgagaaaca ccagaaaaag ctccgaggaa tacgtctgtc 540
gtcttttatc attcgcatta ccgcatactt cgaagatcgc cggtcgttga tcgcagcagc 600
ggtgtgtgtt gagagccatg 620
<210>10
<211>620
<212>DNA
<213>毛皮桉
<400>10
agcttctaat acgactcact atagggctta gatcaaggac atccatccaa cgacgcaatt 60
ccacgtttcc ccttcctagt ggctaggaca gcgccaccca cctcccctcg cctccctctc 120
tctctactac tttctctctc cttctttttc ccaccgtttg actgtgcctt tccagctccc 180
ctcgctcgcg tacaccgtaa gctcacgcgc catccgacga aagcggggcc gctcgtcgag 240
agcagcgcgg gcgcgtgcgt tccctcggcg cgtcggcccg tggcgatacc ctttttgggt 300
cggctgtccg acttcctctc ttaacgcacc acgtcggtta agaagcggga gcggattggc 360
cggggggtct aggtgggccc acttcagatc tctcccagaa ttccttcctt cttcatgctt 420
aatcgcgtcg tttccgcgtc aaatctatgc tataaaaacc gcccaaactc actcctcagc 480
atcatcacac agaaaaccca tcgagaaaca ccagaaaaag ctccgaggaa tacgtctgtc 540
gtcttttatc attcgcatta ccgcatactt cgaagatcgc cggtcgttga tcgcagcagc 600
ggtgtgtgtt gagagccatg 620
<210>11
<211>918
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成核苷酸构筑体
<400>11
gtggagccat catgtcaatt ccaggtttta attaatgcta ctaagggtca tgctataaag 60
ccgttaacaa atcgttgtga tgatagaaag aggctgctgt aatattaata ctgctcagtt 120
tcaaggagac gtgtgccttt acgtgtctat agcgttcatc tccgtccttc tagaagaata 180
cttttttttt ccttcgaggg taaggaaaag gcaaataaaa attacatatt taatcttaat 240
tagcaatagt tactttccta ttaaatacag acacggggat tccaagcatt tgcccgacgg 300
ccaaaaaaaa gatattatcc accattctat cttaattatt acctctaatt attatgctta 360
tcctcctaca agataattaa cgaattatat ttcttttatg aatacacatt taacttgaat 420
tacttgaata gattgtatat gattatccga tcaagaggaa ggtactgtta atattaatat 480
tttatctgat ttatttatta taatttgtca aattattaat cattatactg atttatcaag 540
ttatatttaa aaaataataa attttgttta gcataaattt taaaaaataa ttttgatata 600
tatattttat agagcttata gataactatt gcttttgggg aaaaaaacgc gtaggatatt 660
attcatagag aatctaaaaa aagggaaacc tcttgaaccc ctcatttaaa gtctccatgt 720
aaaagacggc tcgcgcggct caggaatttt cctgtcactt tccttcgaac caaacagaat 780
tgtatatata cccaacgttt ctcaattgac tcttatagaa aacccccgaa aaagaacaat 840
ctttaaggaa aaaattctct cttattcttg ataacaatac cttgatcgtt tttgtttgtt 900
tgtagaggaa aatagtac 918
<210>12
<211>11078
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成核苷酸构筑体
<400>12
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aacttttaat taaggtaccg 60
ggccccccct cgaggtcgac ggtatcgata agcttggttg ctatggtagg gactatgggg 120
ttttcggatt ccggtggaag tgagttggga ggcagtggcg gaggtaaggg agttcaagat 180
tctgggaact gaagatttgg ggttttgctt ttgaatgttt gtgtttttgt atgatgcctc 240
tgtttgtgaa ctttgatgta ttttatcttt gtgtgaaaaa gagattgggt taataaaata 300
tttgcttttt tggataagaa actcttttag cggcccatta ataaaggtta caaatgcaaa 360
atcacgttag cgtcagatat ttaattattc gaagatgatt gtgatagatt taaaattatc 420
ctagtcaaaa agaaagagta ggttgagcca gaaacagtga catctgttgt ttgtaccata 480
caaattagtt tagattattg gttaacatgt taaatggcta tgcatgtgac atttagacct 540
tatcggaatt aatttgtaga attattaatt aagatgttga ttagttcaaa caaaaatttt 600
atattaaaaa atgtaaacga atattttgta tgttcagtga aagtaaaaca aattaaatta 660
acaagaaact tatagaagaa aatttttact atttaagaga aagaaaaaaa tctatcattt 720
aatctgagtc ctaaaaactg ttatacttaa cagttaacgc atgatttgat ggaggagcca 780
tagatgcaat tcaatcaaac tgaaatttct gcaagaatct caaacacgga gatctcaaag 840
tttgaaagaa aatttatttc ttcgactcaa aacaaactta cgaaatttag gtagaactta 900
tatacattat attgtaattt tttgtaacaa aatgttttta ttattattat agaattttac 960
tggttaaatt aaaaatgaat agaaaaggtg aattaagagg agagaggagg taaacatttt 1020
cttctatttt ttcatatttt cgggataaat tattgtaaaa gtttacaaga tttccatttg 1080
actagtgtaa atgaggaata ttctctagta agatcattat ttcatctact tcttttatct 1140
tctaccagta gaggaataaa caatatttag ctcctttgta aatacaaatt aattttcgtt 1200
cttgacatca ttcaatttta attttacgta taaaataaaa gatcatacct attagaacga 1260
ttaaggagaa atacaattcg aatgagaagg atgtgccgtt tgttataata aacagtcaca 1320
cgacgtaaac gtaaaatgac cacatgatgg gccaatagac atggaccgac tactaataat 1380
agtaagttac attttaggat ggaataaata tcataccgac atcagtttga aagaaaaggg 1440
aaaaaaagaa aaaataaata aaagatatac taccgacatg agttccaaaa agcaaaaaaa 1500
aagatcaagc cgacacagac acgcgtagag agcaaaatga ctttggcgtc acaccacgaa 1560
aacagacgct tcatacgtgt ccctttatct ctctcagtct ctctataaac ttagtgagac 1620
cctcctctgt tttactcaca aatatgcaaa ctagaaaaca atcatcagga ataaagggtt 1680
tgattacttc tattggaaag aaaaaaatct ttggaccatg gactcatttt ctgccttttc 1740
tgaaatgttt ggctccgatt acgagtctcc ggtttcctca ggcggtgatt acagtccgaa 1800
gcttgccacg agctgcccca agaaaccagc gggaaggaag aagtttcgtg agactcgtca 1860
cccaatttac agaggagttc gtcaaagaaa ctccggtaag tgggtgtgtg agttgagaga 1920
gccaaacaag aaaacgagga tttggctcgg gactttccaa accgctgaga tggcagctcg 1980
tgctcacgac gtcgccgcca tagctctccg tggcagatct gcctgtctca atttcgctga 2040
ctcggcttgg cggctacgaa tcccggaatc aacctgtgcc aaggaaatcc aaaaggcggc 2100
ggctgaagcc gcgttgaatt ttcaagatga gatgtgtcat atgacgacgg atgctcatgg 2160
tcttgacatg gaggagacct tggtggaggc tatttatacg ccggaacaga gccaagatgc 2220
gttttatatg gatgaagagg cgatgttggg gatgtctagt ttgttggata acatggccga 2280
agggatgctt ttaccgtcgc cgtcggttca atggaactat aattttgatg tcgagggaga 2340
tgatgacgtg tccttatgga gctattaaaa ttcgattttt atttccattt ttggtattat 2400
agctttttat acatttgatc cttttttaga atggatcttc ttcttttttt ggttgtgaga 2460
aacgaatgta aatggtgcgg ccgctctaga caggcctcgt accggatcct ctagctagag 2520
ctttcgttcg tatcatcggt ttcgacaacg ttcgtcaagt tcaatgcatc agtttcattg 2580
cgcacacacc agaatcctac tgagtttgag tattatggca ttgggaaaac tgtttttctt 2640
gtaccatttg ttgtgcttgt aatttactgg tgttttttat tcggttttcg ctatcgaact 2700
gtgaaatgga aatggatgga gaagagttaa tgaatgatat ggtccttttg ttcattctca 2760
aattaatatt atttgttttt tctcttattt gttgtgtgtt gaatttgaaa ttataagaga 2820
tatgcaaaca ttttgttttg agtaaaaatg tgtcaaatcg tggcctctaa tgaccgaagt 2880
taatatgagg agtaaaacac ttgtagttgt accattatgc ttattcacta ggcaacaaat 2940
atattttcag acctagaaaa gctgcaaatg ttactgaata caagtatgtc ctcttgtgtt 3000
ttagacattt atgaactttc ctttatgtaa ttttccagaa tccttgtcag attctaatca 3060
ttgctttata attatagtta tactcatgga tttgtagttg agtatgaaaa tattttttaa 3120
tgcattttat gacttgccaa ttgattgaca acatgcatca atcgacctgc aggagcccgg 3180
gctctcgagt aaaacataat tttggcagta aaaaagtgaa ttctattgtt ttgaaaacaa 3240
aacaaaatac aggaagcgtg attgtggggt tgttgttgaa cttgcccggg caaaagaaga 3300
atgattagcg gtagaggagt tagtagttac gttcaactaa atgcgtgact aaattattta 3360
tcctccgcca tggaagcagg tgattcacac acaacttgct gcacacattg ctctcaaacc 3420
tttcctataa atatccgtag caggggctgc gatgatacac aacgcattta atcaaactac 3480
tttgattact ttctgtgggt tctactttct ttgaatagtc agttctgctg tttttagaag 3540
atttatggca caggttatca acacgtttga cggggttgcg gattatcttc agacatatca 3600
taagctacct gataattaca ttacaaaatc agaagcacaa gccctcggct gggtggcatc 3660
aaaagggaac cttgcagacg tcgctccggg gaaaagcatc ggcggagaca tcttctcaaa 3720
cagggaaggc aaactcccgg gcaaaagcgg acgaacatgg cgtgaagcgg atattaacta 3780
tacatcaggc ttcagaaatt cagaccggat tctttactca agcgactggc tgatttacaa 3840
aacaacggac gagtatcaga cctttacaaa aatcagataa cgaaaaaaac ggcttccctg 3900
cgggaggccg tttttttcag ctttacataa agtgtgtaat aaatttttct tcaaactctg 3960
atcggtcaag agctcttctg agagacaata catacatgtc tctgatgttg taactttact 4020
accaaaacct ataaagattg gcttatttcg ttctattgga tatgtatcat cattactggt 4080
aaatcaagtt tctttctaat aatgtagaag atcagaaaat ccataagaag atatcaacat 4140
ttgagttcta tggtaaattg aattatatca acttagttgc aatgattcat tcttgactga 4200
tgcattgatg gcttatcaaa ccagtttcaa aattcgatta gatagggccc atttaaatgc 4260
ggccgcttgg cgcgccgtca acggatcagg atatccttgt ttaagatgtt gaactctatg 4320
gaggtttgta tgaactgatg atctaggacc ggataagttc ccttcttcat agcgaactta 4380
ttcaaagaat gttttgtgta tcattcttgt tacattgtta ttaatgaaaa aatattattg 4440
gtcattggac tgaacacgag tgttaaatat ggaccaggcc ccaaataaga tccattgata 4500
tatgaattaa ataacaagaa taaatcgagt caccaaacca cttgcctttt ttaacgagac 4560
ttgttcacca acttgataca aaagtcatta tcctatgcaa atcaataatc atacaaaaat 4620
atccaataac actaaaaaat taaaagaaat ggataatttc acaatatgtt atacgataaa 4680
gaagttactt ttccaagaaa ttcactgatt ttataagccc acttgcatta gataaatggc 4740
aaaaaaaaac aaaaaggaaa agaaataaag cacgaagaat tctagaaaat acgaaatacg 4800
cttcaatgca gtgggaccca cggttcaatt attgccaatt ttcagctcca ccgtatattt 4860
aaaaaataaa acgataatgc taaaaaaata taaatcgtaa cgatcgttaa atctcaacgg 4920
ctggatctta tgacgaccgt tagaaattgt ggttgtcgac gagtcagtaa taaacggcgt 4980
caaagtggtt gcagccggca cacacgagtc gtgtttatca actcaaagca caaatacttt 5040
tcctcaacct aaaaataagg caattagcca aaaacaactt tgcgtgtaaa caacgctcaa 5100
tacacgtgtc attttattat tagctattgc ttcaccgcct tagctttctc gtgacctagt 5160
cgtcctcgtc ttttcttctt cttcttctat aaaacaatac ccaaagagct cttcttcttc 5220
acaattcaga tttcaatttc tcaaaatctt aaaaactttc tctcaattct ctctaccgtg 5280
atcaaggtaa atttctgtgt tccttattct ctcaaaatct tcgattttgt tttcgttcga 5340
tcccaatttc gtatatgttc tttggtttag attctgttaa tcttagatcg aagacgattt 5400
tctgggtttg atcgttagat atcatcttaa ttctcgatta gggtttcata aatatcatcc 5460
gatttgttca aataatttga gttttgtcga ataattactc ttcgatttgt gatttctatc 5520
tagatctggt gttagtttct agtttgtgcg atcgaatttg tcgattaatc tgagtttttc 5580
tgattaacag atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 5640
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 5700
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 5760
gaatgaactc caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 5820
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 5880
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 5940
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 6000
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 6060
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 6120
catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 6180
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 6240
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 6300
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 6360
tcgccttctt gacgagttct tctgagggat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 6420
agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 6480
aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 6540
agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 6600
gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gcacgtaggg gggatccact 6660
agttctagag cggccgtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6720
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 6780
cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggaaccacca tcaaacagga 6840
ttttcgcctg ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg caactctctc agggccaggc 6900
ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa agaaaaacca ccccagtaca 6960
ttaaaaacgt ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat 7020
atatcctgcc accagccagc caacagctcc ccgaccggca gctcggcaca aaatcaccac 7080
tcgatacagg cagcccatca gtccgggacg gcgtcagcgg gagagccgtt gtaaggcggc 7140
agactttgct catgttaccg atgctattcg gaagaacggc aactaagctg ccgggtttga 7200
aacacggatg atctcgcgga gggtagcatg ttgattgtaa cgatgacaga gcgttgctgc 7260
ctgtgatcaa atatcatctc cctcgcagag atccgaatta tcagccttct tattcatttc 7320
tcgcttaacc gtgacagttg tctatcggca gttcgtagag cgcgccgtgc gtcccgagcg 7380
atactgagcg aagcaagtgc gtcgagcagt gcccgcttgt tcctgaaatg ccagtaaagc 7440
gctggctgct gaacccccag ccggaactga ccccacaagg ccctagcgtt tgcaatgcac 7500
caggtcatca ttgacccagg cgtgttccac caggccgctg cctcgcaact cttcgcaggc 7560
ttcgccgacc tgctcgcgcc acttcttcac gcgggtggaa tccgatccgc acatgaggcg 7620
gaaggtttcc agcttgagcg ggtacggctc ccggtgcgag ctgaaatagt cgaacatccg 7680
tcgggccgtc ggcgacagct tgcggtactt ctcccatatg aatttcgtgt agtggtcgcc 7740
agcaaacagc acgacgattt cctcgtcgat caggacctgg caacgggacg ttttcttgcc 7800
acggtccagg acgcggaagc ggtgcagcag cgacaccgat tccaggtgcc caacgcggtc 7860
ggacgtgaag cccatcgccg tcgcctgtag gcgcgacagg cattcctcgg ccttcgtgta 7920
ataccggcca ttgatcgacc agcccaggtc ctggcaaagc tcgtagaacg tgaaggtgat 7980
cggctcgccg ataggggtgc gcttcgcgta ctccaacacc tgctgccaca ccagttcgtc 8040
atcgtcggcc cgcagctcga cgccggtgta ggtgatcttc acgtccttgt tgacgtggaa 8100
aatgaccttg ttttgcagcg cctcgcgcgg gattttcttg ttgcgcgtgg tgaacagggc 8160
agagcgggcc gtgtcgtttg gcatcgctcg catcgtgtcc ggccacggcg caatatcgaa 8220
caaggaaagc tgcatttcct tgatctgctg cttcgtgtgt ttcagcaacg cggcctgctt 8280
ggcctcgctg acctgttttg ccaggtcctc gccggcggtt tttcgcttct tggtcgtcat 8340
agttcctcgc gtgtcgatgg tcatcgactt cgccaaacct gccgcctcct gttcgagacg 8400
acgcgaacgc tccacggcgg ccgatggcgc gggcagggca gggggagcca gttgcacgct 8460
gtcgcgctcg atcttggccg tagcttgctg gaccatcgag ccgacggact ggaaggtttc 8520
gcggggcgca cgcatgacgg tgcggcttgc gatggtttcg gcatcctcgg cggaaaaccc 8580
cgcgtcgatc agttcttgcc tgtatgcctt ccggtcaaac gtccgattca ttcaccctcc 8640
ttgcgggatt gccccgactc acgccggggc aatgtgccct tattcctgat ttgacccgcc 8700
tggtgccttg gtgtccagat aatccacctt atcggcaatg aagtcggtcc cgtagaccgt 8760
ctggccgtcc ttctcgtact tggtattccg aatcttgccc tgcacgaata ccagcgaccc 8820
cttgcccaaa tacttgccgt gggcctcggc ctgagagcca aaacacttga tgcggaagaa 8880
gtcggtgcgc tcctgcttgt cgccggcatc gttgcgccac atctaggtac taaaacaatt 8940
catccagtaa aatataatat tttattttct cccaatcagg cttgatcccc agtaagtcaa 9000
aaaatagctc gacatactgt tcttccccga tatcctccct gatcgaccgg acgcagaagg 9060
caatgtcata ccacttgtcc gccctgccgc ttctcccaag atcaataaag ccacttactt 9120
tgccatcttt cacaaagatg ttgctgtctc ccaggtcgcc gtgggaaaag acaagttcct 9180
cttcgggctt ttccgtcttt aaaaaatcat acagctcgcg cggatcttta aatggagtgt 9240
cttcttccca gttttcgcaa tccacatcgg ccagatcgtt attcagtaag taatccaatt 9300
cggctaagcg gctgtctaag ctattcgtat agggacaatc cgatatgtcg atggagtgaa 9360
agagcctgat gcactccgca tacagctcga taatcttttc agggctttgt tcatcttcat 9420
actcttccga gcaaaggacg ccatcggcct cactcatgag cagattgctc cagccatcat 9480
gccgttcaaa gtgcaggacc tttggaacag gcagctttcc ttccagccat agcatcatgt 9540
ccttttcccg ttccacatca taggtggtcc ctttataccg gctgtccgtc atttttaaat 9600
ataggttttc attttctccc accagcttat ataccttagc aggagacatt ccttccgtat 9660
cttttacgca gcggtatttt tcgatcagtt ttttcaattc cggtgatatt ctcattttag 9720
ccatttatta tttccttcct cttttctaca gtatttaaag ataccccaag aagctaatta 9780
taacaagacg aactccaatt cactgttcct tgcattctaa aaccttaaat accagaaaac 9840
agctttttca aagttgtttt caaagttggc gtataacata gtatcgacgg agccgatttt 9900
gaaaccacaa ttgtggtttg tgtttccata ttgttcctct cccattgatc gtattaagaa 9960
agtatgatgg tgatgtcgca gccttccgct ttcgcttcac ggaaaacctg aagcacactc 10020
tcggcgccat tttcagtcag ctgcttgctt tgttcaaact gcctccattc caaaacgagc 10080
gggtactcca cccatccggt cagacaatcc cataaagcgt ccaggttttc accgtagtat 10140
tccggaaggg caagctcctt tttcaatgtc tggtggaggt cgctgatact tctgatttgt 10200
tccccgttaa tgactgcttt tttcatgtgc ggctcctttc ttatgatttt attctatcag 10260
tttaccattt ttctcttcag aaatggccgg attctgcccc ggtttcagct ggacgatgtc 10320
ctcctgtctc ggacggctgc aaattggacc acaattatgg actgccagcg ctgccatttt 10380
tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg cagcccctgg ggggatggga ggcccgcgtt 10440
agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg cacccccctt cggcgtgcgc ggtcacgcgc 10500
acagggcgca gccctggtta aaaacaaggt ttataaatat tggtttaaaa gcaggttaaa 10560
agacaggtta gcggtggccg aaaaacgggc ggaaaccctt gcaaatgctg gattttctgc 10620
ctgtggacag cccctcaaat gtcaataggt gcgcccctca tctgtcagca ctctgcccct 10680
caagtgtcaa ggatcgcgcc cctcatctgt cagtagtcgc gcccctcaag tgtcaatacc 10740
gcagggcact tatccccagg cttgtccaca tcatctgtgg gaaactcgcg taaaatcagg 10800
cgttttcgcc gatttgcgag gctggccagc tccacgtcgc cggccgaaat cgagcctgcc 10860
cctcatctgt caacgccgcg ccgggtgagt cggcccctca agtgtcaacg tccgcccctc 10920
atctgtcagt gagggccaag ttttccgcga ggtatccaca acgccggcgg atctggggaa 10980
ccctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga cgaacggata aaccttttca cgccctttta 11040
aatatccgat tattctaata aacgctcttt tctcttag 11078
<210>13
<211>14947
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成核苷酸构筑体
<400>13
cgccggcgtt gtggatacct cgcggaaaac ttggccctca ctgacagatg aggggcggac 60
gttgacactt gaggggccga ctcacccggc gcggcgttga cagatgaggg gcaggctcga 120
tttcggccgg cgacgtggag ctggccagcc tcgcaaatcg gcgaaaacgc ctgattttac 180
gcgagtttcc cacagatgat gtggacaagc ctggggataa gtgccctgcg gtattgacac 240
ttgaggggcg cgactactga cagatgaggg gcgcgatcct tgacacttga ggggcagagt 300
gctgacagat gaggggcgca cctattgaca tttgaggggc tgtccacagg cagaaaatcc 360
agcatttgca agggtttccg cccgtttttc ggccaccgct aacctgtctt ttaacctgct 420
tttaaaccaa tatttataaa ccttgttttt aaccagggct gcgccctgtg cgcgtgaccg 480
cgcacgccga aggggggtgc ccccccttct cgaaccctcc cggcccgcta acgcgggcct 540
cccatccccc caggggctgc gcccctcggc cgcgaacggc ctcaccccaa aaatggcagc 600
gctggcagtc cataattgtg gtccaatttg cagccgtccg agacaggagg acatcgtcca 660
gctgaaaccg gggcagaatc cggccatttc tgaagagaaa aatggtaaac tgatagaata 720
aaatcataag aaaggagccg cacatgaaaa aagcagtcat taacggggaa caaatcagaa 780
gtatcagcga cctccaccag acattgaaaa aggagcttgc ccttccggaa tactacggtg 840
aaaacctgga cgctttatgg gattgtctga ccggatgggt ggagtacccg ctcgttttgg 900
aatggaggca gtttgaacaa agcaagcagc tgactgaaaa tggcgccgag agtgtgcttc 960
aggttttccg tgaagcgaaa gcggaaggct gcgacatcac catcatactt tcttaatacg 1020
atcaatggga gaggaacaat atggaaacac aaaccacaat tgtggtttca aaatcggctc 1080
cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta 1140
tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc 1200
ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga 1260
atatcaccgg aattgaaaaa actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga tacggaagga 1320
atgtctcctg ctaaggtata taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata tttaaaaatg 1380
acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga catgatgcta 1440
tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg 1500
agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa 1560
caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt tcactccatc 1620
gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga attggattac 1680
ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga cactccattt 1740
aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga ggaacttgtc 1800
ttttcccacg gcgacctggg agacagcaac atctttgtga aagatggcaa agtaagtggc 1860
tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc cttctgcgtc 1920
cggtcgatca gggaggatat cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt tgacttactg 1980
gggatcaagc ctgattggga gaaaataaaa tattatattt tactggatga attgttttag 2040
tacctagatg tggcgcaacg atgccggcga caagcaggag cgcaccgact tcttccgcat 2100
caagtgtttt ggctctcagg ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg ggtcgctggt 2160
attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga cggtctacgg 2220
gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag gcgggtcaaa 2280
tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag gagggtgaat 2340
gaatcggacg tttgaccgga aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg ggttttccgc 2400
cgaggatgcc gaaaccatcg caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg aaaccttcca 2460
gtccgtcggc tcgatggtcc agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca gcgtgcaact 2520
ggctccccct gccctgcccg cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc gtctcgaaca 2580
ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta tgacgaccaa 2640
gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca agcaggccgc 2700
gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt tcgatattgc 2760
gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg ccctgttcac 2820
cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt tccacgtcaa 2880
caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg acgaactggt 2940
gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga tcaccttcac 3000
gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt acacgaaggc 3060
cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg accgcgttgg 3120
gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg gcaagaaaac 3180
gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg gcgaccacta 3240
cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac ggatgttcga 3300
ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc gcctcatgtg 3360
cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag cctgcgaaga 3420
gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg tgcattgcaa 3480
acgctagggc cttgtggggt cagttccggc tgggggttca gcagccagcg ctttactggc 3540
atttcaggaa caagcgggca ctgctcgacg cacttgcttc gctcagtatc gctcgggacg 3600
cacggcgcgc tctacgaact gccgatagac aactgtcacg gttaagcgag aaatgaataa 3660
gaaggctgat aattcggatc tctgcgaggg agatgatatt tgatcacagg cagcaacgct 3720
ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt caaacccggc 3780
agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg ccgccttaca 3840
acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag tggtgatttt 3900
gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta 3960
aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactggggt 4020
ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg cccttcaccg cctggccctg 4080
agagagttgc agcaagcggt ccacgctggt ttgccccagc aggcgaaaat cctgtttgat 4140
ggtggttccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagcccga gatagggttg 4200
agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa 4260
gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccacggccgc tctagaacta gtggatcccc 4320
cctacgtgcg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc 4380
gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa 4440
cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca 4500
acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 4560
attgccaaat gtttgaacga tccctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat 4620
gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc 4680
gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac 4740
acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg 4800
caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag 4860
cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc 4920
gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc 4980
gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga 5040
tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa 5100
tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc 5160
cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgg agttcattca gggcaccgga 5220
caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc 5280
atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc 5340
ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatc tgttaatcag aaaaactcag 5400
attaatcgac aaattcgatc gcacaaacta gaaactaaca ccagatctag atagaaatca 5460
caaatcgaag agtaattatt cgacaaaact caaattattt gaacaaatcg gatgatattt 5520
atgaaaccct aatcgagaat taagatgata tctaacgatc aaacccagaa aatcgtcttc 5580
gatctaagat taacagaatc taaaccaaag aacatatacg aaattgggat cgaacgaaaa 5640
caaaatcgaa gattttgaga gaataaggaa cacagaaatt taccttgatc acggtagaga 5700
gaattgagag aaagttttta agattttgag aaattgaaat ctgaattgtg aagaagaaga 5760
gctctttggg tattgtttta tagaagaaga agaagaaaag acgaggacga ctaggtcacg 5820
agaaagctaa ggcggtgaag caatagctaa taataaaatg acacgtgtat tgagcgttgt 5880
ttacacgcaa agttgttttt ggctaattgc cttattttta ggttgaggaa aagtatttgt 5940
gctttgagtt gataaacacg actcgtgtgt gccggctgca accactttga cgccgtttat 6000
tactgactcg tcgacaacca caatttctaa cggtcgtcat aagatccagc cgttgagatt 6060
taacgatcgt tacgatttat atttttttag cattatcgtt ttatttttta aatatacggt 6120
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acatattgtg aaattatcca tttcttttaa ttttttagtg ttattggata tttttgtatg 6360
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gatcggggaa attcgagctc acggataaca gagtctttat attaaacgaa atggtattgc 7020
agtgccggcc aggacaccag tattggcttc aactgaccga cgaaaagaaa aatataacat 7080
aagagggtct gaaacagaca aacaacacta acacatacat aaacacaatt tattcgtgag 7140
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cgatatttga tttcacatgc tattgtaatg tatttattgt ttcaattccg aattagacaa 7260
agtgcttaaa gctctctttt cggatttttt ttttcattaa tgtataataa ttgcggacat 7320
tacaatatac tgtacaacgt gatttgagct tgatgaatta caagattgga agaacttcga 7380
agacaaaaaa aaaatcgatc gatactagtg ggcccctcga gatcgatact agtgggcccc 7440
tcgagatcga taagcttcca gatttcgatt tcgaacccgg aaagtgtgcc cactacaaag 7500
tgtgaaccca atttaatcag aatattacta aatctagttt tcttcaaaga tgtcaaagcc 7560
caatctttta tcagagttgt ataaatttaa gatcatataa ttattcttat ttttaattta 7620
aaattggtac ccgtgattaa ctttctacac aactcgtatg agtgactcga tataaactta 7680
ttagaaaatt atatatatac ctataatatt taaatcctag agaatagagt taaatttatt 7740
tatttacaaa tttgttaaga atgttctcta cgtgtttagt cttaaaatat gttttcaaac 7800
acaactcata aaattaaatg gagtatcttc caaatcataa ggtctccaag tcgaatttgt 7860
aaaaaactat aaaaaaataa aaaataataa taataaaaaa aacatctact atgacatatg 7920
tactataatt aaataaggag gccgcaataa ttctttattg gttactaaaa cttaagatat 7980
ttcttttggc taaaaaaagc ttatagtact ttataaaact gtttgaacat ataaaagaaa 8040
taaaaactta cattcttggc agcagtgctg atcaggggta ccgaattact gctggacgaa 8100
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ctcaaatcac gttgtacagt atattgtaat gtccgcaatt attatacatt aatgaaaaaa 8220
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ccggcgatcg aaatactgaa aataaaaacc tttcaattga ttcaatccca atccgaacct 8400
gatcaaattc tccgcagaaa caggcgaaaa atggcggaaa acgtgtctga caaatgtagc 8460
ctgcagtggg aagaattgaa tgagctgggg gctactgaga aggaagcaga ggccggcttt 8520
ttatattgga ttttcctgtg cagtacattg tatagaaagc cggcctggaa ttgttggtga 8580
agagtcaagt ggcgtatggt tgaataatgg gcaaccacgg caggcgatcg agtgagtggg 8640
tggagggtcc cgtggccacc aactctgcga tgtgaaggag cggttggatt tttgacggag 8700
attatgactt tttccattga cgtctacgtt actacctacc ccgaaaactc cattcggaca 8760
actcgccggt aatacgccgt ctacctaccc ccatcccggc taggccaaca cccgcgctct 8820
ctcgcccacc gcttgtttga ccgatcaccc agacatttca ttcgctgttt tcggaccgca 8880
tttgtcagtc agttcacacc agggtggaaa ttagaattgg ttagattaca ataagaaaaa 8940
tgccttagcc aatagcatgg gatacaaatc tgaaatccca ttaaattggt gtttaaaatg 9000
tgtttttatt atataatgga tttagtatct tcaaaaaccg aagatacttg gattactgaa 9060
agtttataac tcaaaccttc attccaataa atcccagagc aaatatgtct ggaaaatctc 9120
taaaatgtat aaaaaaatat attattgggt aaaaaaattc tcaatttcca aaaatatgga 9180
gttcgaacta tattttggga gattgagaga aatatttggg attttttttg tctaatttcc 9240
aatccacaaa tgacatgatg agctttaatg taatgatttt gaaatttgtt tggaaattaa 9300
tagtccctag acgagaacat tctatatttc tcttatacaa tataatttcc aatccacaaa 9360
tgacatgatg agctttaatg taatgatttt gaaacttgtt tggagattaa tagtccctgg 9420
acgagaacat tctatatttc ttggatacga tataaagata ttttctatgt aaaaaaatta 9480
aaaaataaga attaattaat gagatcttaa ttacgggcca tgaggttttt tattttattg 9540
gaaactggtt attgtctttc ttgaaatcat aatgttgata atgttttgta atttaaattt 9600
tatttgagat ttttggtttt tatacaaatt ggttaatcta ttccatgaag ttttattatt 9660
taaattgtat tttgaatgca aaatagattt aatattttgg aaaatatttg gaatatttga 9720
cttcaaaagt ttattaattt aaaattaatt ttttctaaat tttaactaaa tataagataa 9780
aatttaccaa caaatttttt aaaaataata gtgtttaatt attttagatt ttgaaatttt 9840
tactctaaat ttaacaaaac aattttttat ccaattataa tttttgttat tcaaaataaa 9900
attttaatta catatataaa tttaacatct taaaaaatcc ataaaacact cattcacaac 9960
tcaatttata gttcttacca accttttcca aattttaagt aaactcaacc caaaaatata 10020
tatatatata tatattttta aaaactccat aacatatcac aaataaatta ctaaaaaaat 10080
cccaaaatca cttattaaaa cacccttatt ccataaaata aaagatacgt taattggatt 10140
cgaactataa aactaatgag ttaatgagac gacaaactca ttcttaaaag gtagagtttc 10200
aagtttgttt atgttttcaa aatttttgtg atcagcgtcc ttttaaatgt actcacattt 10260
tcagtgttta gctttatttt aaagttttga tgaattttgt ataaaaagtt tgtttatttt 10320
gaagttttaa taaattttgt ataatatttt tttttaaata gttaagttta tttatttatt 10380
aatctatttt aattttgttg gaggaggttg tgattgaaga agttgtgatt aaagtgtatt 10440
gttgaaagaa attctttata ttaagggttt aagtttgaat tttgtgaaca caattataat 10500
tatgttaaag atgaaaattt tgttttcttt tatttttgta aatccttctt gttttgagat 10560
gaatttatga ataaatgtca ccacccggcc gcggccgcat ttaaatgggc cctatctaat 10620
cgaattttgt aaactggttt gataagccat caatgcatca gtcaagaatg aatcattgca 10680
actaagttga tataattcaa tttaccatag aactcaaatg ttgatatctt cttatggatt 10740
ttctgatctt ctacattatt agaaagaaac ttgatttacc agtaatgatg atacatatcc 10800
aatagaacga aataagccaa tctttatagg ttttggtagt aaagttacaa catcagagac 10860
atgtatgtat tgtctctcag aagagctctt gaccgatcag agtttgaaga aaaatttatt 10920
acacacttta tgtaaagctg aaaaaaacgg cctcccgcag ggaagccgtt tttttcgtta 10980
tctgattttt gtaaaggtct gatactcgtc cgttgttttg taaatcagcc agtcgcttga 11040
gtaaagaatc cggtctgaat ttctgaagcc tgatgtatag ttaatatccg cttcacgcca 11100
tgttcgtccg cttttgcccg ggagtttgcc ttccctgttt gagaagatgt ctccgccgat 11160
gcttttcccc ggagcgacgt ctgcaaggtt cccttttgat gccacccagc cgagggcttg 11220
tgcttctgat tttgtaatgt aattatcagg tagcttatga tatgtctgaa gataatccgc 11280
aaccccgtca aacgtgttga taacctgtgc cataaatctt ctaaaaacag cagaactgac 11340
tattcaaaga aagtagaacc cacagaaagt aatcaaagta gtttgattaa atgcgttgtg 11400
tatcatcgca gcccctgcta cggatattta taggaaaggt ttgagagcaa tgtgtgcagc 11460
aagttgtgtg tgaatcacct gcttccatgg cggaggataa ataatttagt cacgcattta 11520
gttgaacgta actactaact cctctaccgc taatcattct tcttttgccc gggcaagttc 11580
aacaacaacc ccacaatcac gcttcctgta ttttgttttg ttttcaaaac aatagaattc 11640
actttttact gccaaaatta tgttttactc gagagcccgg gctcctgcag gcgttgtcaa 11700
tcaattggca agtcataaaa tgcattaaaa aatattttca tactcaacta caaatccatg 11760
agtataacta taattataaa gcaatgatta gaatctgaca aggattctgg aaaattacat 11820
aaaggaaagt tcataaatgt ctaaaacaca agaggacata cttgtattca gtaacatttg 11880
cagcttttct aggtctgaaa atatatttgt tgcctagtga ataagcataa tggtacaact 11940
acaagtgttt tactcctcat attaacttcg gtcattagag gccacgattt gacacatttt 12000
tactcaaaac aaaatgtttg catatctctt ataatttcaa attcaacaca caacaaataa 12060
gagaaaaaac aaataatatt aatttgagaa tgaacaaaag gaccatatca ttcattaact 12120
cttctccatc catttccatt tcacagttcg atagcgaaaa ccgaataaaa aacacagtaa 12180
attacaagca caacaaatgg tacaagaaaa acagttttcc caatgccata atactcaaac 12240
tcagtaggat tctggtgtgt gcgcaatgaa actgatgcat tgaacttgac gaacgttgtc 12300
gaaaccgatg atacgaacga aagctctagc tagaggatcc ggtacgaggc ctgtctagag 12360
cgcaccattt acattcgttt ctcacaacca aaaaaagaag aagatccatt ctaaaaaagg 12420
atcaaatgta taaaaagcta taataccaaa aatggaaata aaaatcgaat tttaatagct 12480
ccataaggac acgtcatcat ctccctcgac atcaaaatta tagttccatt gaaccgacgg 12540
cgacggtaaa agcatccctt cggccatgtt atccaacaaa ctagacatcc ccaacatcgc 12600
ctcttcatcc atataaaacg catcttggct ctgttccggc gtataaatag cctccaccaa 12660
ggtctcctcc atgtcaagac catgagcatc cgtcgtcata tgacacatct catcttgaaa 12720
attcaacgcg gcttcagccg ccgccttttg gatttccttg gcacaggttg attccgggat 12780
tcgtagccgc caagccgagt cagcgaaatt gagacaggca gatctgccac ggagagctat 12840
ggcggcgacg tcgtgagcac gagctgccat ctcagcggtt tggaaagtcc cgagccaaat 12900
cctcgttttc ttgtttggct ctctcaactc acacacccac ttaccggagt ttctttgacg 12960
aactcctctg taaattgggt gacgagtctc acgaaacttc ttccttcccg ctggtttctt 13020
ggggcagctc gtggcaagct tcggactgta atcaccgcct gaggaaaccg gagactcgta 13080
atcggagcca aacatttcag aaaaggcaga aaatgagtcc atggtccaaa gatttttttc 13140
tttccaatag aagtaatcaa accctttatt cctgatgatt gttttctagt ttgcatattt 13200
gtgagtaaaa cagaggaggg tctcactaag tttatagaga gactgagaga gataaaggga 13260
cacgtatgaa gcgtctgttt tcgtggtgtg acgccaaagt cattttgctc tctacgcgtg 13320
tctgtgtcgg cttgatcttt ttttttgctt tttggaactc atgtcggtag tatatctttt 13380
atttattttt tctttttttc ccttttcttt caaactgatg tcggtatgat atttattcca 13440
tcctaaaatg taacttacta ttattagtag tcggtccatg tctattggcc catcatgtgg 13500
tcattttacg tttacgtcgt gtgactgttt attataacaa acggcacatc cttctcattc 13560
gaattgtatt tctccttaat cgttctaata ggtatgatct tttattttat acgtaaaatt 13620
aaaattgaat gatgtcaaga acgaaaatta atttgtattt acaaaggagc taaatattgt 13680
ttattcctct actggtagaa gataaaagaa gtagatgaaa taatgatctt actagagaat 13740
attcctcatt tacactagtc aaatggaaat cttgtaaact tttacaataa tttatcccga 13800
aaatatgaaa aaatagaaga aaatgtttac ctcctctctc ctcttaattc accttttcta 13860
ttcattttta atttaaccag taaaattcta taataataat aaaaacattt tgttacaaaa 13920
aattacaata taatgtatat aagttctacc taaatttcgt aagtttgttt tgagtcgaag 13980
aaataaattt tctttcaaac tttgagatct ccgtgtttga gattcttgca gaaatttcag 14040
tttgattgaa ttgcatctat ggctcctcca tcaaatcatg cgttaactgt taagtataac 14100
agtttttagg actcagatta aatgatagat ttttttcttt ctcttaaata gtaaaaattt 14160
tcttctataa gtttcttgtt aatttaattt gttttacttt cactgaacat acaaaatatt 14220
cgtttacatt ttttaatata aaatttttgt ttgaactaat caacatctta attaataatt 14280
ctacaaatta attccgataa ggtctaaatg tcacatgcat agccatttaa catgttaacc 14340
aataatctaa actaatttgt atggtacaaa caacagatgt cactgtttct gctcaaccta 14400
ctctttcttt ttgactagga taattttaaa tctatcacaa tcatcttcga ataattaaat 14460
atctgacgct aacgtgattt tgcatttgta acctttatta atgggccgct aaaagagttt 14520
cttatccaaa aaagcaaata ttttattaac ccaatctctt tttcacacaa agataaaata 14580
catcaaagtt cacaaacaga ggcatcatac aaaaacacaa acattcaaaa gcaaaacccc 14640
aaatcttcag ttcccagaat cttgaactcc cttacctccg ccactgcctc ccaactcact 14700
tccaccggaa tccgaaaacc ccatagtccc taccatagca accaagctta tcgatgccgt 14760
cgacctcgag ggggggcccg gtaccttaat taaaagttta aactatcagt gtttgacagg 14820
atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt agaataatcg gatatttaaa 14880
agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc 14940
ccagatc 14947
<210>14
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400>14
tttgtcgacg tcgacaatgg accacttctt ctcttcttac tccgatccca gctcctgcag 60
cctcgacttt gctg 74
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400>15
aaagcggccg cgcggccgcg catttaaacc taaacaaccc 40
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400>16
tttgtcgacg tcgaccatgg cagcccccgg gaactt 36
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400>17
aaagcggccg cgcggccgcg ggatggtcaa tttatcgtc 39
<210>18
<211>9833
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成核苷酸构筑体
<400>18
cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga taagcttcta atacgactca ctataggggt 60
ccgatcaagg acatccatcc aacgacgcaa ttccacgttt ccccttccta gtggctagga 120
cagcgccacc cacctcccct cgcctccctc tctctctact actttctctc tccttctttt 180
tcccaccgtt tgaccgtgcc tttccagctc ccctcgctcg cgtacaccgt aagctcacgc 240
gccatccgac gaaagcgggg ccgctcgtcg agagcagcgc gggcgcgtgc gttccctcgg 300
cgcgtcggcc cgtggcgata ccctttttgg gtcggctgtc cgacttcctc tcttaacgca 360
ccacgtcggt taagaagcgg gagcggattg gccgccccct ctaggtgggc ccacttcaga 420
tctctcccag aattccttcc ttcttcatgc ttaatcgcgt catttccgtg tcaattctat 480
gctataaaaa ccgcccaaac tcactcctca gcatcatcac acagaaaacc catcgagaaa 540
caccagaaaa agctccgagg aatacgtctg tcgtctttta tcattcgcat taccgcatac 600
ttcgaagatc gccggtcgtt gatcgcagca gcggtgtgtg ttgagagcca tggatccagt 660
agaaacccca acccgtgaaa tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg 720
cgaaaactgt ggaattggtc agcgttggtg ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat 780
tgctgtgcca ggcagtttta acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta attatgcggg 840
caacgtctgg tatcagcgcg aagtctttat accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt 900
gctgcgtttc gatgcggtca ctcattacgg caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat 960
ggagcatcag ggcggctata cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg 1020
gaaaagtgta cgtaagtttc tgcttctacc tttgatatat atataataat tatcattaat 1080
tagtagtaat ataatatttc aaatattttt ttcaaaataa aagaatgtag tatatagcaa 1140
ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta taacttttct aatatatgac 1200
caaaatttgt tgatgtgcag gtatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac 1260
tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca 1320
tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac 1380
ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt 1440
tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca 1500
ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg 1560
gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg 1620
tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcg aacagttcct 1680
gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt catgaagatg cggacttgcg 1740
tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt gcacgaccac gcattaatgg actggattgg 1800
ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga 1860
tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac tgctgctgtc ggctttaacc tctctttagg 1920
cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa agaactgtac agcgaagagg cagtcaacgg 1980
ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat taaagagctg atagcgcgtg acaaaaacca 2040
cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaccggat acccgtccgc aaggtgcacg 2100
ggaatatttc gcgccactgg cggaagcaac gcgtaaactc gacccgacgc gtccgatcac 2160
ctgcgtcaat gtaatgttct gcgacgctca caccgatacc atcagcgatc tctttgatgt 2220
gctgtgcctg aaccgttatt acggatggta tgtccaaagc ggcgatttgg aaacggcaga 2280
gaaggtactg gaaaaagaac ttctggcctg gcaggagaaa ctgcatcagc cgattatcat 2340
caccgaatac ggcgtggata cgttagccgg gctgcactca atgtacaccg acatgtggag 2400
tgaagagtat cagtgtgcat ggctggatat gtatcaccgc gtctttgatc gcgtcagcgc 2460
cgtcgtcggt gaacaggtat ggaatttcgc cgattttgcg acctcgcaag gcatattgcg 2520
cgttggcggt aacaagaaag ggatcttcac tcgcgaccgc aaaccgaagt cggcggcttt 2580
tctgctgcaa aaacgctgga ctggcatgaa cttcggtgaa aaaccgcagc agggaggcaa 2640
acaatgaatc aacaactctc ctggcgcacc atcgtcggct acagcctcgg gaattgctac 2700
cgagctcgga tcctctagct agagctttcg ttcgtatcat cggtttcgac aacgttcgtc 2760
aagttcaatg catcagtttc attgcgcaca caccagaatc ctactgagtt tgagtattat 2820
ggcattggga aaactgtttt tcttgtacca tttgttgtgc ttgtaattta ctgtgttttt 2880
tattcggttt tcgctatcga actgtgaaat ggaaatggat ggagaagagt taatgaatga 2940
tatggtcctt ttgttcattc tcaaattaat attatttgtt ttttctctta tttgttgtgt 3000
gttgaatttg aaattataag agatatgcaa acattttgtt ttgagtaaaa atgtgtcaaa 3060
tcgtggcctc taatgaccga agttaatatg aggagtaaaa cacttgtagt tgtaccatta 3120
tgcttattca ctaggcaaca aatatatttt cagacctaga aaagctgcaa atgttactga 3180
atacaagtat gtcctcttgt gttttagaca tttatgaact ttcctttatg taattttcca 3240
gaatccttgt cagattctaa tcattgcttt ataattatag ttatactcat ggatttgtag 3300
ttgagtatga aaatattttt taatgcattt tatgacttgc caattgattg acaacatgca 3360
tcaatcgacc tgcagcccgg gggatccact agttctagag cggccgcttg gcgcgccgtc 3420
aacggatcag gatatccttg tttaagatgt tgaactctat ggaggtttgt atgaactgat 3480
gatctaggac cggataagtt cccttcttca tagcgaactt attcaaagaa tgttttgtgt 3540
atcattcttg ttacattgtt attaatgaaa aaatattatt ggtcattgga ctgaacacga 3600
gtgttaaata tggaccaggc cccaaataag atccattgat atatgaatta aataacaaga 3660
ataaatcgag tcaccaaacc acttgccttt tttaacgaga cttgttcacc aacttgatac 3720
aaaagtcatt atcctatgca aatcaataat catacaaaaa tatccaataa cactaaaaaa 3780
ttaaaagaaa tggataattt cacaatatgt tatacgataa agaagttact tttccaagaa 3840
attcactgat tttataagcc cacttgcatt agataaatgg caaaaaaaaa caaaaaggaa 3900
aagaaataaa gcacgaagaa ttctagaaaa tacgaaatac gcttcaatgc agtgggaccc 3960
acggttcaat tattgccaat tttcagctcc accgtatatt taaaaaataa aacgataatg 4020
ctaaaaaaat ataaatcgta acgatcgtta aatctcaacg gctggatctt atgacgaccg 4080
ttagaaattg tggttgtcga cgagtcagta ataaacggcg tcaaagtggt tgcagccggc 4140
acacacgagt cgtgtttatc aactcaaagc acaaatactt ttcctcaacc taaaaataag 4200
gcaattagcc aaaaacaact ttgcgtgtaa acaacgctca atacacgtgt cattttatta 4260
ttagctattg cttcaccgcc ttagctttct cgtgacctag tcgtcctcgt cttttcttct 4320
tcttcttcta taaaacaata cccaaagagc tcttcttctt cacaattcag atttcaattt 4380
ctcaaaatct taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt gatcaaggta aatttctgtg 4440
ttccttattc tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg atcccaattt cgtatatgtt 4500
ctttggttta gattctgtta atcttagatc gaagacgatt ttctgggttt gatcgttaga 4560
tatcatctta attctcgatt agggtttcat aaatatcatc cgatttgttc aaataatttg 4620
agttttgtcg aataattact cttcgatttg tgatttctat ctagatctgg tgttagtttc 4680
tagtttgtgc gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt ctgattaaca gatgattgaa 4740
caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac 4800
tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg 4860
cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact ccaggacgag 4920
gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt 4980
gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg 5040
tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg 5100
catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga 5160
gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag 5220
gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat 5280
ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt 5340
tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg 5400
gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt 5460
tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc 5520
ttctgaggga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg 5580
gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 5640
tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 5700
tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 5760
tgtcatctat gttactagat cgcacgtagg ggggatccac tagttctaga gcggccgtgg 5820
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 5880
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt 5940
ataagggatt ttgccgattt cggaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 6000
accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 6060
ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accccagtac attaaaaacg tccgcaatgt 6120
gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcctgc caccagccag 6180
ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca ctcgatacag gcagcccatc 6240
agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg cagactttgc tcatgttacc 6300
gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg aaacacggat gatctcgcgg 6360
agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg cctgtgatca aatatcatct 6420
ccctcgcaga gatccgaatt atcagccttc ttattcattt ctcgcttaac cgtgacagtt 6480
gtctatcggc agttcgtaga gcgcgccgtg cgtcccgagc gatactgagc gaagcaagtg 6540
cgtcgagcag tgcccgcttg ttcctgaaat gccagtaaag cgctggctgc tgaaccccca 6600
gccggaactg accccacaag gccctagcgt ttgcaatgca ccaggtcatc attgacccag 6660
gcgtgttcca ccaggccgct gcctcgcaac tcttcgcagg cttcgccgac ctgctcgcgc 6720
cacttcttca cgcgggtgga atccgatccg cacatgaggc ggaaggtttc cagcttgagc 6780
gggtacggct cccggtgcga gctgaaatag tcgaacatcc gtcgggccgt cggcgacagc 6840
ttgcggtact tctcccatat gaatttcgtg tagtggtcgc cagcaaacag cacgacgatt 6900
tcctcgtcga tcaggacctg gcaacgggac gttttcttgc cacggtccag gacgcggaag 6960
cggtgcagca gcgacaccga ttccaggtgc ccaacgcggt cggacgtgaa gcccatcgcc 7020
gtcgcctgta ggcgcgacag gcattcctcg gccttcgtgt aataccggcc attgatcgac 7080
cagcccaggt cctggcaaag ctcgtagaac gtgaaggtga tcggctcgcc gataggggtg 7140
cgcttcgcgt actccaacac ctgctgccac accagttcgt catcgtcggc ccgcagctcg 7200
acgccggtgt aggtgatctt cacgtccttg ttgacgtgga aaatgacctt gttttgcagc 7260
gcctcgcgcg ggattttctt gttgcgcgtg gtgaacaggg cagagcgggc cgtgtcgttt 7320
ggcatcgctc gcatcgtgtc cggccacggc gcaatatcga acaaggaaag ctgcatttcc 7380
ttgatctgct gcttcgtgtg tttcagcaac gcggcctgct tggcctcgct gacctgtttt 7440
gccaggtcct cgccggcggt ttttcgcttc ttggtcgtca tagttcctcg cgtgtcgatg 7500
gtcatcgact tcgccaaacc tgccgcctcc tgttcgagac gacgcgaacg ctccacggcg 7560
gccgatggcg cgggcagggc agggggagcc agttgcacgc tgtcgcgctc gatcttggcc 7620
gtagcttgct ggaccatcga gccgacggac tggaaggttt cgcggggcgc acgcatgacg 7680
gtgcggcttg cgatggtttc ggcatcctcg gcggaaaacc ccgcgtcgat cagttcttgc 7740
ctgtatgcct tccggtcaaa cgtccgattc attcaccctc cttgcgggat tgccccgact 7800
cacgccgggg caatgtgccc ttattcctga tttgacccgc ctggtgcctt ggtgtccaga 7860
taatccacct tatcggcaat gaagtcggtc ccgtagaccg tctggccgtc cttctcgtac 7920
ttggtattcc gaatcttgcc ctgcacgaat accagcgacc ccttgcccaa atacttgccg 7980
tgggcctcgg cctgagagcc aaaacacttg atgcggaaga agtcggtgcg ctcctgcttg 8040
tcgccggcat cgttgcgcca catctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata 8100
ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg 8160
ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc 8220
cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat 8280
gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt 8340
taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca 8400
atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa 8460
gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc 8520
atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac 8580
｛
gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac 8640
ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc 8700
ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc 8760
caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt 8820
ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc 8880
tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat 8940
tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt 9000
tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccaca attatggact 9060
gccagcgctg ccatttttgg ggtgaggccg ttcgcggccg aggggcgcag cccctggggg 9120
gatgggaggc ccgcgttagc gggccgggag ggttcgagaa gggggggcac cccccttcgg 9180
cgtgcgcggt cacgcgcaca gggcgcagcc ctggttaaaa acaaggttta taaatattgg 9240
tttaaaagca ggttaaaaga caggttagcg gtggccgaaa aacgggcgga aacccttgca 9300
aatgctggat tttctgcctg tggacagccc ctcaaatgtc aataggtgcg cccctcatct 9360
gtcagcactc tgcccctcaa gtgtcaagga tcgcgcccct catctgtcag tagtcgcgcc 9420
cctcaagtgt caataccgca gggcacttat ccccaggctt gtccacatca tctgtgggaa 9480
actcgcgtaa aatcaggcgt tttcgccgat ttgcgaggct ggccagctcc acgtcgccgg 9540
ccgaaatcga gcctgcccct catctgtcaa cgccgcgccg ggtgagtcgg cccctcaagt 9600
gtcaacgtcc gcccctcatc tgtcagtgag ggccaagttt tccgcgaggt atccacaacg 9660
ccggcggatc tggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac 9720
cttttcacgc ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttaggttta 9780
cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactt ttaattaagg tac 9833
<210>19
<211>9833
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成核苷酸构筑体
<400>19
cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga taagcttcta atacgactca ctatagggct 60
tagatcaagg acatccatcc aacgacgcaa ttccacgttt ccccttccta gtggctagga 120
cagcgccacc cacctcccct cgcctccctc tctctctact actttctctc tccttctttt 180
tcccaccgtt tgactgtgcc tttccagctc ccctcgctcg cgtacaccgt aagctcacgc 240
gccatccgac gaaagcgggg ccgctcgtcg agagcagcgc gggcgcgtgc gttccctcgg 300
cgcgtcggcc cgtggcgata ccctttttgg gtcggctgtc cgacttcctc tcttaacgca 360
ccacgtcggt taagaagcgg gagcggattg gccgccccct ctaggtgggc ccacttcaga 420
tctctcccag aattccttcc ttcttcatgc ttaatcgcgt cgtttccgcg tcaaatctat 480
gctataaaaa ccgcccaaac tcactcctca gcatcatcac acagaaaacc catcgagaaa 540
caccagaaaa agctccgagg aatacgtctg tcgtctttta tcattcgcat taccgcatac 600
ttcgaagatc gccggtcgtt gatcgcagca gcggtgtgtg ttgagagcca tggatccagt 660
agaaacccca acccgtgaaa tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg 720
cgaaaactgt ggaattggtc agcgttggtg ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat 780
tgctgtgcca ggcagtttta acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta attatgcggg 840
caacgtctgg tatcagcgcg aagtctttat accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt 900
gctgcgtttc gatgcggtca ctcattacgg caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat 960
ggagcatcag ggcggctata cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg 1020
gaaaagtgta cgtaagtttc tgcttctacc tttgatatat atataataat tatcattaat 1080
tagtagtaat ataatatttc aaatattttt ttcaaaataa aagaatgtag tatatagcaa 1140
ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta taacttttct aatatatgac 1200
caaaatttgt tgatgtgcag gtatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac 1260
tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca 1320
tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac 1380
ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt 1440
tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca 1500
ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg 1560
gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg 1620
tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcg aacagttcct 1680
gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt catgaagatg cggacttgcg 1740
tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt gcacgaccac gcattaatgg actggattgg 1800
ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga 1860
tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac tgctgctgtc ggctttaacc tctctttagg 1920
cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa agaactgtac agcgaagagg cagtcaacgg 1980
ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat taaagagctg atagcgcgtg acaaaaacca 2040
cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaccggat acccgtccgc aaggtgcacg 2100
ggaatatttc gcgccactgg cggaagcaac gcgtaaactc gacccgacgc gtccgatcac 2160
ctgcgtcaat gtaatgttct gcgacgctca caccgatacc atcagcgatc tctttgatgt 2220
gctgtgcctg aaccgttatt acggatggta tgtccaaagc ggcgatttgg aaacggcaga 2280
gaaggtactg gaaaaagaac ttctggcctg gcaggagaaa ctgcatcagc cgattatcat 2340
caccgaatac ggcgtggata cgttagccgg gctgcactca atgtacaccg acatgtggag 2400
tgaagagtat cagtgtgcat ggctggatat gtatcaccgc gtctttgatc gcgtcagcgc 2460
cgtcgtcggt gaacaggtat ggaatttcgc cgattttgcg acctcgcaag gcatattgcg 2520
cgttggcggt aacaagaaag ggatcttcac tcgcgaccgc aaaccgaagt cggcggcttt 2580
tctgctgcaa aaacgctgga ctggcatgaa cttcggtgaa aaaccgcagc agggaggcaa 2640
acaatgaatc aacaactctc ctggcgcacc atcgtcggct acagcctcgg gaattgctac 2700
cgagctcgga tcctctagct agagctttcg ttcgtatcat cggtttcgac aacgttcgtc 2760
aagttcaatg catcagtttc attgcgcaca caccagaatc ctactgagtt tgagtattat 2820
ggcattggga aaactgtttt tcttgtacca tttgttgtgc ttgtaattta ctgtgttttt 2880
tattcggttt tcgctatcga actgtgaaat ggaaatggat ggagaagagt taatgaatga 2940
tatggtcctt ttgttcattc tcaaattaat attatttgtt ttttctctta tttgttgtgt 3000
gttgaatttg aaattataag agatatgcaa acattttgtt ttgagtaaaa atgtgtcaaa 3060
tcgtggcctc taatgaccga agttaatatg aggagtaaaa cacttgtagt tgtaccatta 3120
tgcttattca ctaggcaaca aatatatttt cagacctaga aaagctgcaa atgttactga 3180
atacaagtat gtcctcttgt gttttagaca tttatgaact ttcctttatg taattttcca 3240
gaatccttgt cagattctaa tcattgcttt ataattatag ttatactcat ggatttgtag 3300
ttgagtatga aaatattttt taatgcattt tatgacttgc caattgattg acaacatgca 3360
tcaatcgacc tgcagcccgg gggatccact agttctagag cggccgcttg gcgcgccgtc 3420
aacggatcag gatatccttg tttaagatgt tgaactctat ggaggtttgt atgaactgat 3480
gatctaggac cggataagtt cccttcttca tagcgaactt attcaaagaa tgttttgtgt 3540
atcattcttg ttacattgtt attaatgaaa aaatattatt ggtcattgga ctgaacacga 3600
gtgttaaata tggaccaggc cccaaataag atccattgat atatgaatta aataacaaga 3660
ataaatcgag tcaccaaacc acttgccttt tttaacgaga cttgttcacc aacttgatac 3720
aaaagtcatt atcctatgca aatcaataat catacaaaaa tatccaataa cactaaaaaa 3780
ttaaaagaaa tggataattt cacaatatgt tatacgataa agaagttact tttccaagaa 3840
attcactgat tttataagcc cacttgcatt agataaatgg caaaaaaaaa caaaaaggaa 3900
aagaaataaa gcacgaagaa ttctagaaaa tacgaaatac gcttcaatgc agtgggaccc 3960
acggttcaat tattgccaat tttcagctcc accgtatatt taaaaaataa aacgataatg 4020
ctaaaaaaat ataaatcgta acgatcgtta aatctcaacg gctggatctt atgacgaccg 4080
ttagaaattg tggttgtcga cgagtcagta ataaacggcg tcaaagtggt tgcagccggc 4140
acacacgagt cgtgtttatc aactcaaagc acaaatactt ttcctcaacc taaaaataag 4200
gcaattagcc aaaaacaact ttgcgtgtaa acaacgctca atacacgtgt cattttatta 4260
ttagctattg cttcaccgcc ttagctttct cgtgacctag tcgtcctcgt cttttcttct 4320
tcttcttcta taaaacaata cccaaagagc tcttcttctt cacaattcag atttcaattt 4380
ctcaaaatct taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt gatcaaggta aatttctgtg 4440
ttccttattc tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg atcccaattt cgtatatgtt 4500
ctttggttta gattctgtta atcttagatc gaagacgatt ttctgggttt gatcgttaga 4560
tatcatctta attctcgatt agggtttcat aaatatcatc cgatttgttc aaataatttg 4620
agttttgtcg aataattact cttcgatttg tgatttctat ctagatctgg tgttagtttc 4680
tagtttgtgc gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt ctgattaaca gatgattgaa 4740
caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac 4800
tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg 4860
cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact ccaggacgag 4920
gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt 4980
gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg 5040
tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg 5100
catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga 5160
gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag 5220
gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat 5280
ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt 5340
tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg 5400
gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt 5460
tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc 5520
ttctgaggga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg 5580
gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 5640
tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 5700
tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 5760
tgtcatctat gttactagat cgcacgtagg ggggatccac tagttctaga gcggccgtgg 5820
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 5880
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt 5940
ataagggatt ttgccgattt cggaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 6000
accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 6060
ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accccagtac attaaaaacg tccgcaatgt 6120
gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcctgc caccagccag 6180
ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca ctcgatacag gcagcccatc 6240
agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg cagactttgc tcatgttacc 6300
gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg aaacacggat gatctcgcgg 6360
agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg cctgtgatca aatatcatct 6420
ccctcgcaga gatccgaatt atcagccttc ttattcattt ctcgcttaac cgtgacagtt 6480
gtctatcggc agttcgtaga gcgcgccgtg cgtcccgagc gatactgagc gaagcaagtg 6540
cgtcgagcag tgcccgcttg ttcctgaaat gccagtaaag cgctggctgc tgaaccccca 6600
gccggaactg accccacaag gccctagcgt ttgcaatgca ccaggtcatc attgacccag 6660
gcgtgttcca ccaggccgct gcctcgcaac tcttcgcagg cttcgccgac ctgctcgcgc 6720
cacttcttca cgcgggtgga atccgatccg cacatgaggc ggaaggtttc cagcttgagc 6780
gggtacggct cccggtgcga gctgaaatag tcgaacatcc gtcgggccgt cggcgacagc 6840
ttgcggtact tctcccatat gaatttcgtg tagtggtcgc cagcaaacag cacgacgatt 6900
tcctcgtcga tcaggacctg gcaacgggac gttttcttgc cacggtccag gacgcggaag 6960
cggtgcagca gcgacaccga ttccaggtgc ccaacgcggt cggacgtgaa gcccatcgcc 7020
gtcgcctgta ggcgcgacag gcattcctcg gccttcgtgt aataccggcc attgatcgac 7080
cagcccaggt cctggcaaag ctcgtagaac gtgaaggtga tcggctcgcc gataggggtg 7140
cgcttcgcgt actccaacac ctgctgccac accagttcgt catcgtcggc ccgcagctcg 7200
acgccggtgt aggtgatctt cacgtccttg ttgacgtgga aaatgacctt gttttgcagc 7260
gcctcgcgcg ggattttctt gttgcgcgtg gtgaacaggg cagagcgggc cgtgtcgttt 7320
ggcatcgctc gcatcgtgtc cggccacggc gcaatatcga acaaggaaag ctgcatttcc 7380
ttgatctgct gcttcgtgtg tttcagcaac gcggcctgct tggcctcgct gacctgtttt 7440
gccaggtcct cgccggcggt ttttcgcttc ttggtcgtca tagttcctcg cgtgtcgatg 7500
gtcatcgact tcgccaaacc tgccgcctcc tgttcgagac gacgcgaacg ctccacggcg 7560
gccgatggcg cgggcagggc agggggagcc agttgcacgc tgtcgcgctc gatcttggcc 7620
gtagcttgct ggaccatcga gccgacggac tggaaggttt cgcggggcgc acgcatgacg 7680
gtgcggcttg cgatggtttc ggcatcctcg gcggaaaacc ccgcgtcgat cagttcttgc 7740
ctgtatgcct tccggtcaaa cgtccgattc attcaccctc cttgcgggat tgccccgact 7800
cacgccgggg caatgtgccc ttattcctga tttgacccgc ctggtgcctt ggtgtccaga 7860
taatccacct tatcggcaat gaagtcggtc ccgtagaccg tctggccgtc cttctcgtac 7920
ttggtattcc gaatcttgcc ctgcacgaat accagcgacc ccttgcccaa atacttgccg 7980
tgggcctcgg cctgagagcc aaaacacttg atgcggaaga agtcggtgcg ctcctgcttg 8040
tcgccggcat cgttgcgcca catctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata 8100
ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg 8160
ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc 8220
cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat 8280
gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt 8340
taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca 8400
atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa 8460
gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc 8520
atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac 8580
gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac 8640
ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc 8700
ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc 8760
caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt 8820
ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc 8880
tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat 8940
tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt 9000
tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccaca attatggact 9060
gccagcgctg ccatttttgg ggtgaggccg ttcgcggccg aggggcgcag cccctggggg 9120
gatgggaggc ccgcgttagc gggccgggag ggttcgagaa gggggggcac cccccttcgg 9180
cgtgcgcggt cacgcgcaca gggcgcagcc ctggttaaaa acaaggttta taaatattgg 9240
tttaaaagca ggttaaaaga caggttagcg gtggccgaaa aacgggcgga aacccttgca 9300
aatgctggat tttctgcctg tggacagccc ctcaaatgtc aataggtgcg cccctcatct 9360
gtcagcactc tgcccctcaa gtgtcaagga tcgcgcccct catctgtcag tagtcgcgcc 9420
cctcaagtgt caataccgca gggcacttat ccccaggctt gtccacatca tctgtgggaa 9480
actcgcgtaa aatcaggcgt tttcgccgat ttgcgaggct ggccagctcc acgtcgccgg 9540
ccgaaatcga gcctgcccct catctgtcaa cgccgcgccg ggtgagtcgg cccctcaagt 9600
gtcaacgtcc gcccctcatc tgtcagtgag ggccaagttt tccgcgaggt atccacaacg 9660
ccggcggatc tggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac 9720
cttttcacgc ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttaggttta 9780
cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactt ttaattaagg tac 9833
Claims (159)
1.一种包含启动子和所需基因的DNA构筑体，其中所述启动子驱动树中的所述所需基因在所述树暴露于胁迫条件后表达，同时减少与所述树中的所述所需基因表达相关的不当效应。
2.根据权利要求1所述的DNA构筑体，其中所述所需基因是AtCBF2。
3.根据权利要求1所述的DNA构筑体，其中所述启动子是拟南芥(Arabidopsisthaliana)rd29A启动子。
4.根据权利要求1所述的DNA构筑体，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子且所述所需基因是AtCBF2。
5.根据权利要求1所述的DNA构筑体，其中所述树是选自由桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
6.一种包含含有启动子和所需基因的DNA构筑体的经分离的树细胞，其中所述启动子驱动树中的所述所需基因在所述树暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与所述树中的所述所需基因表达相关的不当效应。
7.根据权利要求6所述的经分离的树细胞，其中所述所需基因是AtCBF2。
8.根据权利要求7所述的经分离的树细胞，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
9.根据权利要求6所述的经分离的树细胞，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子且所述所需基因是AtCBF2。
10.根据权利要求6所述的经分离的树细胞，其中所述胁迫条件是冰冻温度。
11.根据权利要求6所述的经分离的树细胞，其中所述胁迫条件是约0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段是约2小时到约72小时。
12.根据权利要求6所述的经分离的树细胞，其中所述树是选自由桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
13.一种转基因树，其包含根据权利要求6所述的经分离的树细胞。
14.根据权利要求13所述的转基因树，其中所述树是选自由桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
15.一种从根据权利要求13所述的转基因树获得的木浆。
16.一种从根据权利要求13所述的转基因树获得的薄板。
17.一种从根据权利要求13所述的转基因树获得的妥尔油(tall oil)。
18.一种从根据权利要求13所述的转基因树获得的生物燃料。
19.一种产生根据权利要求13所述的转基因树的方法，其包含：(a)用包含可操作地连接于启动子的所需基因的DNA构筑体转化树细胞，以产生转化树细胞，其中所述启动子驱动所述所需基因表达且减少与所述树中的所述所需基因表达相关的不当效应；(b)在促进树生长的条件下培养所述转化树细胞，其中所述所需基因的产物在所述转化树细胞中表达，且其中所述树是在暴露于胁迫条件一段时间后展现不同于同一物种的非转化树的表型的转基因树。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述所需基因是AtCBF2。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子且所述所需基因是AtCBF2。
23.根据权利要求19所述的方法，其还包含(c)在暴露于所述胁迫条件之前冷驯化所述转基因树。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述胁迫条件是冰冻温度。
25.根据权利要求19所述的方法，其中所述胁迫条件是约0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段是约2小时到约72小时。
26.根据权利要求19所述的方法，其中所述树是选自由桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
27.根据权利要求19所述的方法，其中与同一物种的非转化树相比，所述转基因树展现特征为耐寒性增强的表型。
28.一种增强树的耐冻性的方法，其包含：(a)用包含可操作地连接于启动子的所需基因的DNA构筑体转化树细胞，以产生转化树细胞，其中所述启动子驱动所述所需基因表达且减少与所述树中的所述所需基因表达相关的不当效应；(b)在促进树生长的条件下培养所述转化树细胞以产生转基因树；(c)使所述转基因树经受冷驯化；(d)使所述转基因树暴露于冰冻温度一段时间；和(e)使所述转基因树在促进所述转基因树生长的条件下恢复。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述所需基因是AtCBF2。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子且所述所需基因是AtCBF2。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述冰冻温度是约0℃到约-30℃且所述时间段是约2小时到约72小时。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述树是选自由桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
34.根据权利要求28所述的方法，其中与同一物种的非转化树相比，所述转基因树展现特征为耐寒性增强的表型。
35.一种由根据权利要求13所述的转基因树制造木浆的方法，其包含：(a)从所述转基因树的木材上移除树皮；(b)分离所述木材中的纤维素纤维；和(c)溶解所述木材中的木质素以获得木浆。
36.根据权利要求35所述的方法，其还包含漂白所述木浆以产生纸的步骤(d)。
37.一种由根据权利要求13所述的转基因树制造薄板的方法，其包含：(a)将所述转基因树切割成原木；(b)从所述转基因树的所述原木上移除树皮；(c)使所述原木暴露于高湿度48小时；和(d)将所述原木切成薄板以获得切制薄板。
38.一种由根据权利要求13所述的转基因树制造妥尔油的方法，其包含：(a)在压力下用氢氧化钠和硫化钠消化木材；(b)冷凝所挥发的气体以得到硫酸盐松节油；(c)浓缩由此获得的制浆溶液使得从表面上撇取不溶性皂；和(d)酸化所撇取的皂以产生粗妥尔油。
39.一种由根据权利要求13所述的转基因树制造生物燃料的方法，其包含将所述转基因树的生物质转化为燃料的步骤。
40.一种经分离的聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：9的核酸序列。
41.一种根据权利要求40所述的经分离的聚核苷酸的经分离的片段或变异体，其包含具有至少30个连续核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO：9至少50％一致。
42.一种经分离的聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：10的核酸序列。
43.一种根据权利要求42所述的经分离的聚核苷酸的经分离的片段或变异体，其包含具有至少30个连续核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO：10至少50％一致。
44.一种DNA构筑体，其包含可操作地连接于选自由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10组成的群组的核酸序列或其包含具有至少30个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体的所需基因，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10组成的群组的核酸序列至少50％一致，其中所述核酸序列、其片段或变异体驱动植物中的所述所需基因在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与所述植物中的所述所需基因表达相关的不当效应。
45.根据权利要求44所述的DNA构筑体，其中所述胁迫条件是冰冻温度。
46.根据权利要求44所述的DNA构筑体，其中所述胁迫条件是约0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段是约2小时到约72小时。
47.根据权利要求44所述的DNA构筑体，其中所述所需基因在选自由桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组的树中表达。
48.根据权利要求44所述的DNA构筑体，其中所述所需基因在桉树中表达。
49.根据权利要求48所述的DNA构筑体，其中所述所需基因在邓恩桉(Eucalyptusdunnii)中表达。
50.根据权利要求48所述的DNA构筑体，其中所述所需基因在毛皮桉(Eucalyptusmacarthurii)中表达。
51.根据权利要求44所述的DNA构筑体，其中所述所需基因在杨树中表达。
52.根据权利要求51所述的DNA构筑体，其中所述所需基因在美洲黑杨(Populusdeltoids)中表达。
53.一种DNA构筑体，其包含至少一个可操作地连接于启动子的包含选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7组成的群组的序列的经分离的聚核苷酸，或其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列至少70％一致的片段或变异体，其中所述经分离的聚核苷酸、片段或变异体编码CBF多肽且其中所述启动子驱动植物中的所述CBF多肽在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与所述植物中的所述CBF多肽表达相关的不当效应。
54.根据权利要求53所述的DNA构筑体，其中所述胁迫条件是冰冻温度。
55.根据权利要求53所述的DNA构筑体，其中所述胁迫条件是约0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段是约2小时到约72小时。
56.根据权利要求53所述的DNA构筑体，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
57.根据权利要求53所述的DNA构筑体，其中所述启动子是CaMV 35S启动子。
58.根据权利要求53所述的DNA构筑体，其中所述启动子是包含选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
59.一种经分离的植物细胞，其包含根据权利要求53所述的DNA构筑体。
60.根据权利要求59所述的经分离的植物细胞，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
61.根据权利要求59所述的经分离的植物细胞，其中所述启动子是CaMV 35S启动子。
62.根据权利要求59所述的经分离的植物细胞，其中所述启动子是包含选自由SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
63.根据权利要求59所述的经分离的植物细胞，其中所述植物是选自由拟南芥属(Arabidopsis)、桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
64.一种转基因植物，其包含根据权利要求59所述的经分离的植物细胞。
65.根据权利要求64所述的转基因植物，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
66.根据权利要求64所述的转基因植物，其中所述启动子是CaMV 35S启动子。
67.根据权利要求64所述的转基因植物，其中所述启动子是包含选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核酸序列的片段或变异体，所述核酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
68.根据权利要求64所述的转基因转基因植物，其中所述转基因植物是选自由拟南芥属、桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
69.一种产生根据权利要求64所述的转基因植物的方法，其包含：(a)用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含至少一个可操作地连接于启动子的包含选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7组成的群组的序列的经分离的聚核苷酸，或其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列至少70％一致的片段或变异体，其中所述经分离的聚核苷酸、片段或变异体编码植物转录因子且其中所述启动子驱动植物中的所述植物转录因子在所述植物暴露于胁迫条件一段时间后表达，同时减少与所述植物中的所述转录因子表达相关的不当效应，以产生转化植物细胞；(b)在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中所述转录因子在所述转化植物细胞中表达，且其中所述植物是在暴露于胁迫条件一段时间后展现不同于同一物种的非转化植物的表型的转基因植物。
70.根据权利要求69所述的方法，其中在暴露于所述胁迫条件之前冷驯化所述转基因植物。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述表型是耐冻性且所述胁迫条件是冰冻温度。
72.根据权利要求69所述的方法，其中所述冰冻温度是约0℃到约-30℃且所述时间段是约2小时到约72小时。
73.根据权利要求69所述的方法，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
74.根据权利要求69所述的方法，其中所述启动子是CaMV 35S启动子。
75.根据权利要求69所述的方法，其中所述启动子是包含选自由SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
76.根据权利要求69所述的方法，其中所述转基因植物是选自由拟南芥属、桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
77.一种由根据权利要求64所述的转基因植物制造木浆的方法，其包含：(a)从所述转基因植物的木材上移除树皮；(b)分离所述木材中的纤维素纤维；和(c)溶解所述木材中的木质素以获得木浆。
78.根据权利要求77所述的方法，其还包含漂白所述木浆以产生纸的步骤(d)。
79.一种由根据权利要求64所述的转基因植物制造薄板的方法，其包含：(a)将所述转基因树切割成原木；(b)从所述转基因树的所述原木上移除树皮；(c)使所述原木暴露于高湿度48小时；和(d)将所述原木切成薄板以获得切制薄板。
80.一种由根据权利要求64所述的转基因植物制造妥尔油的方法，其包含：(a)在压力下用氢氧化钠和硫化钠消化木材；(b)冷凝所挥发的气体以得到硫酸盐松节油；(c)浓缩由此获得的制浆溶液使得从表面上撇取不溶性皂；和(d)酸化所撇取的皂以产生粗妥尔油。
81.一种由根据权利要求64所述的转基因植物制造生物燃料的方法，其包含将所述转基因树的生物质转化为燃料的步骤。
82.一种增强植物的耐冻性的方法，其包含：(a)用DNA构筑体转化植物细胞，所述DNA构筑体包含至少一个可操作地连接于启动子的包含选自由SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7组成的群组的序列的经分离的聚核苷酸，或其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列至少70％一致的片段或变异体，其中所述经分离的聚核苷酸、其片段或变异体编码植物转录因子且其中所述启动子驱动植物中的所述植物转录因子在所述植物暴露于胁迫条件后表达，同时减少与所述植物中的所述转录因子表达相关的不当效应，以产生转化植物细胞；(b)在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞以产生转基因植物；(c)使所述转基因植物经受冷驯化；(d)使所述转基因植物暴露于冰冻温度一段时间；和(e)使所述转基因植物在促进所述转基因植物生长的条件下恢复。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述冰冻温度是约0℃到约-30℃且所述时间段是约2小时到约72小时。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
85.根据权利要求82所述的方法，其中所述启动子是CaMV 35S启动子。
86.根据权利要求82所述的方法，其中所述启动子是包含选自由SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
87.根据权利要求82所述的方法，其中所述转基因植物是选自由拟南芥属、桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
88.根据权利要求82所述的方法，其中与同一物种的非转化植物相比，所述转基因植物展现特征为耐寒性增强的表型。
89.一种经分离的植物细胞，其表达由可操作地连接于启动子的包含选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7组成的群组的序列的聚核苷酸或其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列至少70％一致的片段或变异体编码的植物转录因子，其中所述植物转录因子的表达在所述植物细胞暴露于胁迫条件一段时间后由所述启动子驱动，所述启动子减少与所述经分离的植物细胞中的所述转录因子表达相关的不当效应。
90.根据权利要求89所述的经分离的植物细胞，其中所述胁迫条件是冰冻温度。
91.根据权利要求89所述的经分离的植物细胞，其中所述胁迫条件是约0℃到约-30℃的冰冻温度且所述时间段是约2小时到约72小时。
92.根据权利要求89所述的经分离的植物细胞，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
93.根据权利要求89所述的经分离的植物细胞，其中所述启动子是CaMV 35S启动子。
94.根据权利要求89所述的经分离的植物细胞，其中所述启动子是包含选自由SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
95.根据权利要求89所述的经分离的植物细胞，其中所述植物转录因子包含选自由SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8组成的群组的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的核苷酸序列至少70％一致的片段或变异体。
96.一种转基因植物，其包含根据权利要求89所述的经分离的植物细胞。
97.根据权利要求96所述的转基因植物，其中所述植物是选自由拟南芥属、桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
98.一种由根据权利要求96所述的转基因植物制造木浆的方法，其包含：(a)从所述转基因树的木材上移除树皮；(b)分离所述木材中的纤维素纤维；和(c)溶解所述木材中的木质素以获得木浆。
99.根据权利要求98所述的方法，其还包含漂白所述木浆以产生纸的步骤(d)。
100.一种由根据权利要求96所述的转基因植物制造薄板的方法，其包含：(a)将所述转基因树切割成原木；(b)从所述转基因树的所述原木上移除树皮；(c)使所述原木暴露于高湿度48小时；和(d)将所述原木切成薄板以获得切制薄板。
101.一种由根据权利要求96所述的转基因植物制造妥尔油的方法，其包含：(a)在压力下用氢氧化钠和硫化钠消化木材；(b)冷凝所挥发的气体以得到硫酸盐松节油；(c)浓缩由此获得的制浆溶液使得从表面上撇取不溶性皂；和(d)酸化所撇取的皂以产生粗妥尔油。
102.一种由根据权利要求96所述的转基因植物制造生物燃料的方法，其包含将所述转基因树的生物质转化为燃料的步骤。
103.一种转基因植物，其表达包含选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8组成的群组的氨基酸序列或其与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少70％一致的变异体或片段的转录因子，其中所述植物转录因子的表达在所述植物细胞暴露于胁迫条件一段时间后由启动子驱动，所述启动子减少与所述植物中的所述转录因子表达相关的不当效应，且其中与同一物种的非转化植物相比，所述转录因子赋予所述转基因植物增强的耐冻性。
104.根据权利要求103所述的转基因植物，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
105.根据权利要求103所述的转基因植物，其中所述启动子是CaMV 35S启动子。
106.根据权利要求103所述的转基因植物，其中所述启动子是包含选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
107.一种由根据权利要求103所述的转基因植物制造木浆的方法，其包含：(a)从所述转基因植物的木材上移除树皮；(b)分离所述木材中的纤维素纤维；和(c)溶解所述木材中的木质素以获得木浆。
108.根据权利要求107所述的方法，其还包含漂白所述木浆以产生纸的步骤(d)。
109.一种由根据权利要求103所述的转基因植物制造薄板的方法，其包含：(a)将所述转基因树切割成原木；(b)从所述转基因树的所述原木上移除树皮；(c)使所述原木暴露于高湿度48小时；和(d)将所述原木切成薄板以获得切制薄板。
110.一种由根据权利要求103所述的转基因植物制造妥尔油的方法，其包含：(a)在压力下用氢氧化钠和硫化钠消化木材；(b)冷凝所挥发的气体以得到硫酸盐松节油；(c)浓缩由此获得的制浆溶液使得从表面上撇取不溶性皂；和(d)酸化所撇取的皂以产生粗妥尔油。
111.一种由根据权利要求103所述的转基因植物制造生物燃料的方法，其包含将所述转基因植物的生物质转化为燃料的步骤。
112.一种由转基因植物制造木材的方法，其包含：(a)用包含可操作地连接于启动子的所需基因的DNA构筑体转化植物细胞，以产生转化植物细胞，其中所述启动子驱动所述所需基因表达且减少与所述植物中的所述所需基因表达相关的不当效应；(b)在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中所述所需基因的产物在所述转化植物细胞中表达，且其中所述植物是在暴露于胁迫条件一段时间后展现不同于同一物种的非转化植物的表型的转基因植物；和(c)由所述转基因植物制造木材。
113.根据权利要求112所述的方法，其中在暴露于所述胁迫条件之前冷驯化所述转基因植物。
114.根据权利要求112所述的方法，其中所述表型是耐冻性且所述胁迫条件是冰冻温度。
115.根据权利要求112所述的方法，其中所述冰冻温度是约0℃到约-30℃且所述时间段是约2小时到约72小时。
116.根据权利要求112所述的方法，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
117.根据权利要求112所述的方法，其中所述启动子是CaMV 35S启动子。
118.根据权利要求112所述的方法，其中所述启动子是包含选自由SEQ ID NO：9、SEQID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
119.根据权利要求112所述的方法，其中所述所需基因是AtCBF2。
120.根据权利要求112所述的方法，其中所述所需基因是包含选自由SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7组成的群组的序列的经分离的聚核苷酸，或其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列至少70％一致的片段或变异体。
121.根据权利要求112所述的方法，其中所述所需基因编码包含选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8组成的群组的氨基酸序列或其与SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少70％一致的变异体或片段的转录因子，且其中与同一物种的非转化植物相比，所述转录因子赋予所述转基因植物增强的耐冻性。
122.根据权利要求112所述的方法，其中所述转基因植物是根据权利要求13所述的转基因树。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述转基因树是转基因桉树或其杂交种。
124.根据权利要求112所述的方法，其中所述转基因植物是根据权利要求64所述的转基因植物。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述转基因植物是转基因桉树或其杂交种。
126.根据权利要求122所述的方法，其中所述转基因植物是根据权利要求96所述的转基因植物。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述转基因植物是转基因桉树或其杂交种。
128.根据权利要求112所述的方法，其中所述转基因植物是根据权利要求103所述的转基因植物。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述转基因植物是转基因桉树或其杂交种。
130.根据权利要求112所述的转基因方法，其中所述转基因植物是选自由桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述转基因植物是转基因桉树或其杂交种。
132.一种由转基因植物产生生物能量的方法，其包含：(a)用包含可操作地连接于启动子的所需基因的DNA构筑体转化植物细胞，以产生转化植物细胞，其中所述启动子驱动所述所需基因表达且减少与所述植物中的所述所需基因表达相关的不当效应；(b)在促进植物生长的条件下培养所述转化植物细胞，其中所述所需基因的产物在所述转化植物细胞中表达，且其中所述植物是在暴露于胁迫条件一段时间后展现不同于同一物种的非转化植物的表型的转基因植物；和(c)由所述转基因植物产生生物能量。
133.根据权利要求132所述的方法，其中在暴露于所述胁迫条件之前冷驯化所述转基因植物。
134.根据权利要求132所述的方法，其中所述表型是耐冻性且所述胁迫条件是冰冻温度。
135.根据权利要求132所述的方法，其中所述冰冻温度是约0℃到约-30℃且所述时间段是约2小时到约72小时。
136.根据权利要求132所述的方法，其中所述启动子是拟南芥rd29A启动子。
137.根据权利要求132所述的方法，其中所述启动子是包含选自由SEQ ID NO：9、SEQID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30个连续核苷酸且优选至少40个连续核苷酸的核苷酸序列的片段或变异体，所述核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的群组的核酸序列至少50％一致。
138.根据权利要求132所述的方法，其中所述所需基因是AtCBF2。
139.根据权利要求132所述的方法，其中所述所需基因是包含选自由SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7组成的群组的序列的经分离的聚核苷酸，或其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列至少70％一致的片段或变异体。
140.根据权利要求132所述的方法，其中所述所需基因编码包含选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8组成的群组的氨基酸序列或其与SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少70％一致的变异体或片段的转录因子，且其中与同一物种的非转化植物相比，所述转录因子赋予所述转基因植物增强的耐冻性。
141.根据权利要求132所述的方法，其中所述转基因植物是根据权利要求13所述的转基因树。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述转基因树是转基因桉树或其杂交种。
143.根据权利要求132所述的方法，其中所述转基因植物是根据权利要求64所述的转基因植物。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述转基因植物是转基因桉树或其杂交种。
145.根据权利要求132所述的方法，其中所述转基因植物是根据权利要求96所述的转基因植物。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述转基因植物是转基因桉树或其杂交种。
147.根据权利要求132所述的方法，其中所述转基因植物是根据权利要求103所述的转基因植物。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述转基因植物是转基因桉树或其杂交种。
149.根据权利要求132所述的转基因方法，其中所述转基因植物是选自由桉树、白杨树、柑橘树、番木瓜树、鳄梨树、肉豆蔻树、阿月浑子树、猕猴桃树和荷荷芭树组成的群组。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述转基因植物是转基因桉树或其杂交种。
151.根据权利要求14所述的转基因树，其中所述桉树是选自由以下组成的群组的桉树物种：广叶桉(Eucalyptus amplifolia)、孟加拉桉(Eucalyptus benjensis)、边沁桉(Eucalyptus benthamii)、赤桉(Eucalyptus calmaldulensis)、多里高桉(Eucalyptusdorrigoensis)、邓恩桉、蓝桉(Eucalyptus globulus)、巨桉(Eucalyptus grandis)、加柠桉(Eucalyptus gunnii)、毛皮桉、亮果桉(Eucalyptus nitens)、尾叶桉(Eucalyptusurophylla)、多枝桉(Eucalyptus viminali)、巨桉×尾叶桉(Eucalyptus grandis xEucalyptus urophylla)及其杂交种。
152.根据权利要求68所述的转基因植物，其中所述桉树是选自由以下组成的群组的桉树物种：广叶桉、孟加拉桉、边沁桉、赤桉、多里高桉、邓恩桉、蓝桉、巨桉、加柠桉、毛皮桉、亮果桉、尾叶桉、多枝桉、巨桉×尾叶桉及其杂交种。
153.根据权利要求97所述的转基因植物，其中所述桉树是选自由以下组成的群组的桉树物种：广叶桉、孟加拉桉、边沁桉、赤桉、多里高桉、邓恩桉、蓝桉、巨桉、加柠桉、毛皮桉、亮果桉、尾叶桉、多枝桉、巨桉×尾叶桉及其杂交种。
154.根据权利要求6所述的经分离的树细胞，其中所述胁迫条件是水分胁迫且所述时间段是约1日到约10日或直到凋萎点。
155.根据权利要求19、69、112或132所述的方法，其中所述胁迫条件是水分胁迫且所述时间段是约1日到约10日或直到凋萎点。
156.根据权利要求44或53所述的DNA构筑体，其中所述胁迫条件是水分胁迫且所述时间段是约1日到约10日或直到凋萎点。
157.根据权利要求13所述的转基因树，其中所述胁迫条件是水分胁迫且所述时间段是约1日到约10日或直到凋萎点。
158.根据权利要求59或89所述的经分离的植物细胞，其中所述胁迫条件是水分胁迫且所述时间段是约1日到约10日或直到凋萎点。
159.根据权利要求64、96或103所述的转基因植物，其中所述胁迫条件是水分胁迫且所述时间段是约1日到约10日或直到凋萎点。
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