KR101845248B1 - 노화가 억제된 형질전환 식물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자가 도입되어 노화가 억제된 형질전환 식물, 상기 형질전환 식물의 제조방법, 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자를 포함하는 식물체의 노화 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 식물체의 노화 억제용 키트 및 상기 조성물을 식물체에 도입하여 발현시키는 단계를 포함하는 식물체에서 노화를 억제시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 식물체의 노화를 억제시키는 방법을 이용하면, 식물체의 잎에 포함된 엽록소의 수준이 증가되고, 이로 인하여 광합성 효율이 향상될 수 있으므로, 식물의 노화연구에 활용될 수 있을 것이다.

Description

노화가 억제된 형질전환 식물{Transgenic plants for inhibiting senescence}

본 발명은 노화가 억제된 형질전환 식물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자가 도입되어 노화가 억제된 형질전환 식물, 상기 형질전환 식물의 제조방법, 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자를 포함하는 식물체의 노화 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 식물체의 노화 억제용 키트 및 상기 조성물을 식물체에 도입하여 발현시키는 단계를 포함하는 식물체에서 노화를 억제시키는 방법에 관한 것이다.

최근에 들어, 세포 배양 기술과 유전공학 등 첨단기술의 발전과 함께 식물의 산업적 응용이 보다 활발하게 이루어지고 있다. 식물이 생산하는 유용 물질들은 대부분 알칼로이드, 스테로이드, 터프로티드, 석탄산과 같은 이차 대사 산물로서 의약품, 염료, 색소, 향료, 식품 첨가제 등에 이용된다. 그러나, 식물에서 유용 물질을 얻기 위하여 식물 재배를 할 경우, 유용물질 생산에 사용 가능한 식물의 양이 한정되어 있으며, 물질 생산에 맞는 기후 풍토의 특이성 때문에 번식이 어렵고, 외부 인자에 의한 영향에 민감하며, 생장 속도가 느려 대량생산이 어려운 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 유전공학적인 방법을 이용한 형질전환 식물체를 사용하는 방법이 개발되고 있으나, 상기 형질전환 식물체는 외부환경에 의하여 크게 영향을 받아, 생장기간이 단축되거나 쉽게 노화되는 등의 단점이 나타나고 있다. 그러나, 이같은 단점을 극복하려는 연구는 그리 활발히 진행되지 않고 있는데, 그 이유는 식물의 성장을 촉진시켜서 식물체로부터 얻을 수 있는 산물의 생산속도를 증가시키는 방향의 연구가 주류를 이루고 있기 때문이다. 생장 및 스트레스 저항성을 향상시켜서, 식물체로부터 얻을 수 있는 산물의 생산속도를 증가시키기 위한 노력은 농작물의 생산성과 품질 확보 측면에서 중요하기 때문에 미국과 유럽 등의 거대 농업 기업에서 지속적인 연구가 이루어지고 있다.

한편, 식물이 병균, 해충, 바이러스 등의 생물학적 스트레스뿐만 아니라 고온, 저온, 염해, 건조, 중금속, 농약 등의 각종 환경(무생물적) 스트레스를 받게 되면, 생명유지에 필요한 필수 원소이지만 반응성이 높은 산소가 심각한 생리적인 장해 등을 유발하는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼, 과산화수소, 수산화 라디칼 등의 활성산소종으로 변하게 되어, 결과적으로는 식물체로부터 얻을 수 있는 산물의 생산성이 저하된다는 점이 확인됨에 따라, 점차적으로 식물체의 노화에 대한 연구에 대한 관심이 증가되고 있다.

지금까지 연구된 바에 의하면, 식물의 노화는 식물 발생의 마지막 단계로서, 세포, 조직, 기관 혹은 생물체 수준에서 나이-의존적 붕괴 과정이며, 생장 및 발생 단계를 거쳐 치사 단계를 유도한다. 식물은 노화가 진행됨에 따라 점차적으로 합성능력이 저하되고 세포 내 구조물과 거대분자들이 순차적으로 분해되면서 세포의 항상성을 잃게 되고, 결국 죽음에 이르게 된다. 이러한 식물의 노화는 일련의 연속된 생화학적 및 생리학적 현상으로 유전적으로 계획되어 있어 세포, 조직 및 기관의 수준에서 매우 정교하고, 능동적으로 진행되는데 식물 호르몬 등과 같은 내적 환경요인 및 외부 환경 스트레스의 영향을 받게 된다. 따라서, 식물의 노화 억제는 그 자체로서의 학문적 중요성뿐만 아니라 작물의 생산성이나 수확 후 저장 효율에 있어서의 개량 가능성 때문에 산업적으로도 중요성이 높다고 할 수 있다.

이처럼 식물의 노화를 억제하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있는데, 예를 들어, 한국등록특허 제10-1369350호에는 고추 유래의 CaRLK1(Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 유전자를 이용하여 식물의 노화를 억제하는 기술이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2015-0003099호에는 ATPG6 유전자를 이용하여 식물체의 노화를 지연시키는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 상기 개발된 기술만으로는 식물체의 노화를 효과적으로 억제하기에 부족하므로, 식물체의 노화를 억제할 수 있는 보다 다양한 인자에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 식물체의 노화를 억제할 수 있는 기술을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 식물체에 MYC2 유전자를 도입할 경우, 식물체 잎의 엽록소의 수준과 광합성 효율을 향상시켜서, 결과적으로는 식물체의 노화를 억제시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자가 도입되어 노화가 억제된 형질전환 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 식물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자를 포함하는 식물체의 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 식물체의 노화 억제용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 식물체에 도입하여 발현시키는 단계를 포함하는 식물체에서 노화를 억제시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 식물체의 노화를 억제시키고자 다양한 연구를 수행하던 중, 병해충 및 산화스트레스 내성과 관련된 자스모네이트 반응 유전자(jasmonate response gene)로 알려진 MYC2 유전자에 주목하게 되었다. 상기 유전자를 도입한 형질전환 식물체에서 상기 유전자의 발현과 식물체의 노화 간의 연관성에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, 상기 유전자를 도입한 형질전환 식물체에서 상기 유전자의 발현수준이 증가할수록 잎에 포함된 엽록소의 수준이 증가하고, 광합성 효율이 증가하여, 상기 유전자가 식물체의 노화를 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

이처럼, MYC2 유전자의 과발현을 통해, 식물체의 노화를 억제하는 기술은 지금까지 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자가 도입되어 노화가 억제된 형질전환 식물을 제공한다.

본 발명의 용어 "프로모터"란, 전사조절인자들이 결합할수 있는 DNA 염기서열을 의미하는데, 상기 프로모터는 전사조절인자를 매개로 하여 RNA 중합효소와 결합함으로써, 그의 하류에 위치한 개방해독틀(ORF)의 전사를 유도할 수 있다. 본 발명에서는 일 예로서, 35S 프로모터를 사용하였다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "MYC2 유전자"란, 전사조절인자(basic helix-loop-helix Leu zipper transcription factor)로 알려진 유전자로서, 자스모네이트(jasmonate) 신호전달 경로에 있어서, 하류 유전자들의 발현을 조절하는 주요 조절인자를 의미한다. 자스모네이트 신호가 없을 때는 MYC2가 음성조절인자인 JAZ에 의해 비활성화된 상태로 유지되지만, 자스모네이트 신호가 전달되면, 이의 수용체인 COI1에 의해 전달된 신호에 의하여 SCF 복합체가 JAZ에 결합하여 JAZ가 분해되고, 이에 따라 MYC2가 활성화되며 이하의 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 또는 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: AF110197.1, EU621843.1 등). 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 MYC2 유전자를 과발현시켜서 노화가 억제된 형질전환 식물을 제작하였다.

상기 MYC2 유전자는 목적하는 식물에 도입되어 과발현될 경우, 식물체의 잎에 포함된 엽록소의 수준을 증가시키고, 광합성 효율을 향상시켜서, 식물체의 노화를 억제시킬 수 있으므로, 상기 MYC2 유전자가 발현될 수 있도록 프로모터에 작동가능하게 연결된 형태를 포함하는 조성물은 식물체의 노화를 억제시킬 수 있는 조성물로 사용될 수 있다. 일 예로서, 상기 조성물은 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자를 포함하는 발현벡터가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 본 발명에서는 35S 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 MYC2 유전자를 pH2GW7 벡터에 도입하여 제작된 발현벡터를 이용하여 노화가 억제된 형질전환 식물을 제작하였다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

본 발명의 용어 "형질전환"이란, DNA를 숙주에 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서는 상기에서 서술한 MYC2 유전자를 숙주에 도입하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 용어 "형질전환 식물"이란, 숙주로서 식물을 사용하여 상기 형질전환으로 인해 생성된 식물을 의미한다.

본 발명에서 숙주세포로의 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 식물에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 전기충격 핵산분자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 침전, 염화칼슘 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로박테리아로 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트 리포멕타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않으며, 아그로박테리아로 매개된 형질전환법이 바람직하다.

본 발명의 목적상, 상기 형질전환 식물은 MYC2 유전자의 과발현에 의하여 노화가 억제될 수 있는 한, 초본 및 목본 식물 모두가 제한 없이 포함할 수 있다.

일 예로서, 초본 식물로는 애기장대(Arabidopsis thaliana), 오리자 사티바(Oryza sativa; 벼), 제아 메이즈(Zea mays; 옥수수), 미스칸투스(Miscanthus) 종 또는 페니세툼 풀푸레움(Pennisetum purpureum) 등을 포함할 수 있고, 목본 식물로는 유칼립투스(Eucalyptus) 종(예를 들면 E. alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. balladoniensis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. brevistylis, E. brockwayi E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E. cordata, E. cornuta, E. corticosa, E. crebra, E. croajingoleisis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E. diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E. dunnii, E. elata, E. erythrocoiys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp. globulus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis×urophylla, E. guilfoylei, E. gunnii, E. hallii, E. houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia, E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtusiflora, E. occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petiolaris, E. pilularis, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. populnea, E. preissiana, E. pseudoglobulus, E. pulchella, E. radiata, E. radiata subsp. radiata, E. regnans, E. risdoni, E. robertsonii E. rodwayi, E. rubida, E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spathulata, E. staeri E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. tetragona, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisii subsp. falciformis, E. willisii subsp. willisii, E. woodwardii), 포플러스(Populus) 종(예를 들면, P. alba, P. alba×P. grandidentata, P. alba×P. tremula, P. alba×P. glandulosa, P. alba×P. tremuloides, P. balsamifera, P. balsamifera subsp. trichocarpa, P. balsamifera subsp. trichocarpa×P. deltoides, P. ciliata, P. deltoides, P. euphratica, P. euramericana, P. kitakamiensis, P. lasiocarpa, P. laurifolia, P. maximowiczii, P. maximowiczii×P. balsamfera subsp. trichocarpa, P. nigra, P. sieboldii×P. grandideiztata, P. suaveolens, P. szechuanica, P. tomentosa, P. tremula, P. tremula×P. tremuloides, P. tremuloides, P. wilsonii, P. canadensis, P. yunnanensis), 침엽수(예를 들면, loblolly pine(Pinus taeda), slash pine(Pinus elliotii), ponderosa pine(Pinus ponderosa), lodgepole pine(Pinus contorta), Monterey pine(Pinus radiata); Douglas-fir(Pseudotsuga menziesii); Western hemlock(Tsuga canadensis); Sitka spruce(Picea glauca); redwood(Sequoia sempervirens); silver fir(Abies amabilis); balsam fir(Abies balsamea)) 및 삼나무(예를 들면 Western red cedar(Thuja plicata), Alaska yellow-cedar(Chamecyparis nootkatensis)) 등을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

다른 예로서, 상기 상기 형질전환 식물은 목본 식물의 일종인 포플러가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "포플러(poplar)"란, 쌍떡잎식물 버드나무목 버드나무과 사시나무속에 속하는 식물의 총칭이다. 본 발명에서 상기 포플러는 목본 식물의 대표 식물로서 사용될 수 있으며, Populus alba × P. glandulosa 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 포플러 나무에서 유래된 MYC2 유전자를 포플러에 도입한 결과, MYC2 유전자의 발현수준이 상이한 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러를 제작할 수 있었다.

또한, 상기 형질전환 포플러의 노화수준을 비교한 결과, 잎에 포함된 엽록소의 수준(도 3a 및 3b) 및 광합성 효율(도 3c 및 3d)의 특성 모두 야생형 포플러 보다 형질전환 포플러가 우수하였고, 형질전환 포플러 중에서도 MYC2의 발현수준이 낮은 형질전환 포플러(35S::PagMYC2 #2) 보다는 MYC2의 발현수준이 높은 형질전환 포플러(35S::PagMYC2 #7)가 우수함을 확인하여, 상기 MYC2 유전자가 식물체의 노화를 억제할 수 있음을 확인하였다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 노화가 억제된 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법에 사용되는 프로모터, MYC2 유전자, 식물체 등은 상술한 바와 동일하고, 상기 방법에 의해 본 발명의 형질전환 식물을 제조할 수 있다.

또한, 상기 제조방법에 의하여 제조된 형질전환 식물을 토양 또는 배지에서 재배하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 형질전환식물의 재배는 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 재배 온도, 재배 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.

사용되는 배지는 특정한 형질전환식물의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 배지의 형태로는 고체배지(solid medium), 액체배지(liquid medium), 이중배지(double layer medium)가 있으며, 이에 대한 성분으로는 물, 교질재료로서, 한천, 아가로스(agarose), 겔라이트(gelite) 등이 사용될 수 있다.

무기 영양소로는 15개의 원소, 즉 C, H, O, N, P, K, S, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, B, 및 Mo 등이 형태에 구애받지 않고 첨가되며, 유기 영양소로는 탄수화물, 식물생장 조절물질, 비타민 등이 첨가되고, 아미노산류로는 미오-이노시톨, 글라이신, L-글루타민 등이 첨가될 수 있다.

탄소원으로는 글루코스, 프럭토스, 만노스, 리보오스, 자일로스, 수크로스, 멜리비오스, 셀로비오스, 락토오스, 아밀로스, 탄수화물, 라피노스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤 등이 첨가될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자를 포함하는 식물체의 노화 억제용 조성물을 제공한다.

상기 조성물에 사용되는 프로모터, MYC2 유전자 등은 상술한 바와 동일하고, 상기 조성물을 이용하여, 식물체의 노화를 억제할 수 있다.

즉, 상기 조성물에 포함된 MYC2 유전자가 식물체에 도입되면, 엽록소의 수준을 향상시키고, 광합성 효율을 향상시켜서 식물체의 노화를 억제시킬 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 식물체의 노화 억제용 조성물을 포함하는 식물체의 노화 억제용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 식물체의 노화를 억제시킬 수 있다. 본 발명의 식물체의 노화 억제용 키트에는 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYC2 유전자 뿐만 아니라 상기 MYC2 유전자의 도입 또는 발현에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일 예로서, 본 발명의 키트는 MYC2 유전자의 형질도입을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 완충액 농도는 다양), 식물체 배양용기, 식물배양용 배지, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 내부대조군로 사용될 수 있는 MYC2 유전자가 아닌 다른 유전자를 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 식물체에서 노화를 억제시키는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 식물체에서 노화를 억제시키는 방법은 상기 조성물을 식물체에 도입하여 발현시키는 단계를 포함한다. 이때. 상기 방법에 사용되는 프로모터, MYC2 유전자, 식물체 등은 상술한 바와 동일하고, 상기 방법에 의해 임의의 식물체의 노화를 억제시킬 수 있다.

본 발명에서 제공하는 식물체의 노화를 억제시키는 방법을 이용하면, 식물체의 잎에 포함된 엽록소의 수준이 증가되고, 이로 인하여 광합성 효율이 향상될 수 있으므로, 식물의 노화연구에 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 MYC2 유전자(PagMYC2)를 포플러에 도입하여 과발현시키기 위한 MYC2 유전자 도입용 35S::PagMYC2 벡터의 구조를 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 제작된 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러에서 발현되는 MYC2 유전자(PagMYC2)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 4개월간 재배된 정상 포플러 및 형질전환 포플러의 식물 전체 및 잎의 노화 수준을 나타내는 사진이다.
도 3b는 4개월간 재배된 정상 포플러 및 형질전환 포플러의 잎에 포함된 엽록소의 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 3c는 6주간 재배된 정상 포플러 및 형질전환 포플러 잎을 암조건에서 처리한 후, 이의 광합성 효율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3d는 6주간 재배된 정상 포플러 및 형질전환 포플러 잎을 겨울철의 광조건으로 설정한 6시간의 명조건과 18시간의 암조건으로 처리한 후, 이의 광합성 효율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: MYC2 유전자 도입용 플라스미드 제작

포플러 나무로부터 MYC2 유전자(PagMYC2)를 분리하고, 이의 염기서열과 상기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하였다. 그 결과, 상기 MYC2 유전자의 염기서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 확인되었고, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 확인되었다.

상기 분리된 MYC2 유전자(PagMYC2)를 포플러에 과발현시키기 위해 cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S promoter가 삽입되어 있는 pH2GW7 벡터를 이용하였다. 35S promoter에 의해 PagMYC2가 식물체 전신에 발현되도록 클로닝 하였다. Colony PCR과 제한효소 처리에 의해 삽입을 확인하여 MYC2 유전자 도입용 35S::PagMYC2 벡터를 제작하였다(도 1).

도 1은 MYC2 유전자(PagMYC2)를 포플러에 도입하여 과발현시키기 위한 MYC2 유전자 도입용 35S::PagMYC2 벡터의 구조를 나타내는 개략도이다.

실시예 2: 아그로박테리움을 이용한 포플러 형질전환

상기 실시예 1에서 제작된 형질전환용 벡터를 포플러에 도입하기 위하여 Populus alba × Populus grandulosa를 이용하여 아그로박테리움 균주(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)에 도입하여 형질전환 균주를 수득하였다. 그런 다음, 시험관에서 6주간 무균배양한 포플러 나무의 줄기를 약 5~7mm의 길이로 잘라 상기 수득한 형질전환 균주와 15분간 공조 배양하여 배양물을 수득하고, 이를 캘러스유도배지(MS, 2,4-D 1.0 mg/L, BAP 0.1 mg/L, NAA 0.01 mg/L)에서 2일간 암배양 한 후, 하이그로마이신(hygromycin 0.2mg/L)이 첨가된 캘러스 유도배지에서 4~5주간 배양하였다. 이후, 캘러스로부터 신초를 유도하기 위해 줄기유도배지(WPM, Zeatin 1.0mg/L, BAP 0.1mg/L, NAA 0.01mg/L, hygromycin 0.2mg/L)로 옮겨 4~6주간 배양하였다. 유도된 신초는 뿌리유도배지(½ MS, IBA 0.2 mg/L)로 옮겼다. 식물체는 25℃, 30μmole m^-2S^-1, 16시간 광조건에서 배양하여 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러를 제작하였다.

실시예 3: 형질전환 포플러에서 발현되는 MYC2 유전자의 발현수준 비교

quantitative RT-PCR을 이용하여 상기 실시예 2에서 제작된 2종류 형질전환체 포플러에서 발현되는 MYC2 유전자(PagMYC2)의 발현수준을 야생형 포플러에서 발현되는 MYC2 유전자(PagMYC2)의 발현수준과 비교하였다(도 2).

도 2는 본 발명에서 제작된 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러에서 발현되는 MYC2 유전자(PagMYC2)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 형질전환 포플러에서는 야생형 포플러에 비하여 MYC2 유전자(PagMYC2)가 상대적으로 높은 수준(약 4배~50배)으로 발현되었고, 2종류의 형질전환 포플러를 비교하면, 35S::PagMYC2 #2 보다는 35S::PagMYC2 #7에서 상대적으로 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

실시예 4: 형질전환 포플러의 노화 특성비교

상기 실시예 2에서 제작된 형질전환 포플러의 노화에 MYC2 유전자(PagMYC2)가 영향을 미칠 수 있는지 확인하고자 하였다.

실시예 4-1: 잎의 표현형 비교

본 발명에서 제작된 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러를 4개월 동안 재배한 후, 재배된 형질전환 포플러의 노화상태 및 잎의 색을 비교하였다(도 3a). 이때, 대조군으로는 형질전환되지 않은 포플러 나무를 사용하였다.

도 3a는 4개월간 재배된 정상 포플러 및 형질전환 포플러의 식물 전체 및 잎의 노화 수준을 나타내는 사진이다.

도 3a에서 보듯이, 4개월간 재배된 정상 포플러는 그의 잎이 노화되어 잎의 색이 전체적으로 황색을 나타내었으나, 동일 기간동안 재배된 형질전환 포플러는 정상 포플러에 비하여 노화가 더디게 진행되었으며, 그 결과로서 형질전환 포플러의 잎은 정상 포플러의 잎에 비하여 더 진한 빛의 초록색을 나타냄을 확인하였다.

또한, 2종류의 형질전환 포플러를 비교하면, PagMYC2 #7이 PagMYC2 #2에 비하여 더욱 노화가 더디게 진행됨을 확인하였다.

실시예 4-2: 잎의 엽록소 수준 비교

상기 실시예 4-1에서 보듯이, 형질전환 포플러의 잎은 정상 포플러의 잎에 비하여 더 진한 빛의 초록색을 나타냄을 확인하였는 바, 이러한 잎의 색이 엽록소의 수준을 반영한 것인지를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명에서 제작된 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러를 4개월 동안 재배한 후, 아래에서 7번째 잎을 채취하고, 상기 채취된 잎에서 나타나는 엽록소의 수준을 비교하였다(도 3b). 이때, 대조군으로는 형질전환되지 않은 포플러의 잎을 사용하였다.

도 3b는 본 발명에서 제작된 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러를 4개월간 재배한 후, 잎에 포함된 엽록소의 수준을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.

도 3b에서 보듯이, 야생형 포플러에 비하여 형질전환 포플러는 잎에 포함된 엽록소의 수준이 상대적으로 높은 수준을 나타내었다.

또한, 2종류의 형질전환 포플러를 비교하면, 35S::PagMYC2 #2의 잎 보다는 35S::PagMYC2 #7의 잎에 포함된 엽록소의 수준이 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4-3: 암조건 처리후 잎의 광합성 효율 비교

상기 실시예 4-2에서 보듯이, 야생형 포플러에 비하여 형질전환 포플러는 잎에 포함된 엽록소의 수준이 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인하였으므로, Dark-induced senescence 방법을 이용하여, 잎의 광합성 효율을 비교하였다.

본 발명에서 제작된 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러를 6주 동안 재배한 후, 위에서 3번째와 4번째 잎을 채취하였다. 상기 채취된 잎을 건조되지 않는 조건을 유지하면서 암조건에서 정치한 다음, 18일 동안 광합성 효율을 비교하였다(도 3c). 이때, 대조군으로는 형질전환되지 않은 포플러의 잎을 사용하였다.

도 3c는 본 발명에서 제작된 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러를 6주간 재배한 후, 잎의 광합성 효율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3c에서 보듯이, 정상 포플러의 잎과 2종류의 형질전환 포플러의 잎이 나타내는 광합성 효율을 비교한 결과, 전체적으로 정상 포플러의 잎에 비하여 형질전환 포플러의 잎이 상대적으로 높은 광합성 효율을 나타냄을 확인하였다.

또한, 2종류의 형질전환 포플러를 비교하면, 35S::PagMYC2 #2의 잎 보다는 35S::PagMYC2 #7의 잎이 상대적으로 높은 광합성 효율을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4-4: 단일 조건 처리후 잎의 광합성 효율 비교

상기 실시예 4-3에서 보듯이, 암조건으로 처리된 잎의 경우, 야생형 포플러 잎에 비하여 형질전환 포플러 잎의 광합성 효율이 상대적으로 우수함을 확인하였으므로, 활엽수인 포플러의 잎이 지는 겨울철의 광조건으로 처리한 후에도 동일한 결과를 얻을 수 있는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명에서 제작된 2종류(35S::PagMYC2 #2 및 35S::PagMYC2 #7)의 형질전환 포플러를 6주 동안 재배한 후, 겨울철의 광조건으로 설정한 6시간의 명조건과 18시간의 암조건으로 25일 동안 처리하고(LD 6/18), 광합성 효율을 비교하였다(도 3d). 이때, 대조군으로는 형질전환되지 않은 포플러의 잎을 사용하였다.

도 3d는 겨울철의 광조건으로 설정한 6시간의 명조건과 18시간의 암조건으로 처리한 형질전환 포플러 잎의 광합성 효율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3d에서 보듯이, 2종류의 형질전환 포플러 잎은 전체적으로 볼 때 정상 포플러 잎 보다도, 높은 수준의 광합성 효율을 나타내었으나, 이들 형질전환 포플러 잎을 비교하면 서로 다른 광합성 효율을 나타냄을 확인하였다.

먼저, 35S::PagMYC2 #2의 잎은 약 10일이 경과될 때 까지는 정상 포플러의 잎과 유사한 수준의 광합성 효율을 나타내었으나, 10일이 경과된 후에는 정상 포플러의 잎 보다도 현저히 높은 수준의 광합성 효율을 나타내었다.

반면, 35S::PagMYC2 #7의 잎은 약 15일이 경과될 때 까지는 정상 포플러 및 35S::PagMYC2 #2의 잎 보다도 현저히 높은 수준의 광합성 효율을 나타내었으나, 15일이 경과된 후에는 35S::PagMYC2 #2의 잎과 유사한 수준의 광합성 효율을 나타내었다.

상기 실시예 4-1 내지 4-4의 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 형질전환 포플러는 정상 포플러의 잎이 노화될 때 까지 재배한 후에도, 잎의 노화가 억제되어, 잎에 잔류하는 엽록소를 상대적으로 높은 수준으로 유지하고, 이에 의하여 광합성 효율이 상대적으로 높은 수준으로 유지됨을 확인하였다.

또한, 동일한 형질전환 포플러 잎을 비교하면, 상기 MYC2 유전자(PagMYC2)의 발현수준이 증가될 수록 형질전환 포플러의 노화가 억제됨을 알 수 있었다.

<110> KOREA FOREST RESEARCH INSTITUTE <120> Transgenic plants for inhibiting senescence <130> KPA150925-KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYC2 cDNA <400> 1 atggaggaac tcattatttc tccatcttca tcatcttcac cggcctcgtt atcccaagaa 60 accccaccga ctctccaaca aaggcttcaa ttcatagtcc aaaaccaacc agattggtgg 120 tcttatgcca tattttggca aacatcaaac gatgacagcg gcagaatctt cctaggctgg 180 ggtgatggcc attttcaagg ctctaaagac acttctccca aaccaagcac cttcagcaat 240 agccgcatga cgatatcaaa ctccgagagg aaaagggtca tgatgaaggg aatccaatcc 300 ctgatcggtg aatgtcacga tcttgatatg tctctgatgg atggtaacga tgctaccgac 360 tctgagtggt tctatctcat gtcccttact cgatctttct cacctggaga tggcatcctt 420 ggcaaagctt ataccactgg ttctttgatt tggttaactg gtggccatga acttcaattc 480 tacaactgtg aaagagtcaa agaagcacaa atgcatggca ttgagaccct ggtttgcata 540 cctacatcgt gtggggttct tgaattagga tcctcttctg tgatcagaga aaattggggt 600 cttgttcaac aagccaagtc tctttttggg tcagatctta gcgcttattt ggtgcccaag 660 ggccctaata actccagtga agaaccgacc cggtttcttg acaggagcat ttcttttgcg 720 gatatgggca taatagctgg acttcaagaa gattgtgcag ttgatcgtga acagaagaac 780 gctcatgaaa cagatgaagc aaataaacgt aacgctaata aaccaggcct gtcttatttg 840 aactcagagc attcagactc ggactttcct ctacttgcta tgcacatgga gaaaagaatt 900 ccaaagaaaa gagggagaaa gcctggccta ggcagagacg ccccactgaa ccatgtagag 960 gctgagaggc agcggagaga gaagttgaac caccggtttt acgcgctgcg tgcggtggtc 1020 ccaaacgtgt ctagaatgga caaagcatca ctattatctg atgctgtatc ctacatcaat 1080 gagttgaagg cgaaggttga tgaattagag tcacaactag aaagggaatc caagaaagtg 1140 aaattggaag ttgccgataa tttggacaat caaagcacca ccacttccgt ggaccaatca 1200 acctgcaggc cgaatggtgc tggtggcgct ggactggcac ttgaagttga ggtcaagttt 1260 gtgggtaatg atgcaatgat tagagtccaa tcggagaatg tgaactatcc ggcttccagg 1320 ttaatgtgtg cactccgtga actggagttt caggttcacc atgccagtat gtcctgtgtt 1380 aacgagctta tgctccaaga tgtggtagtt agggttcctg atggactgag aacagaagag 1440 gccttgaaat ctgctcttct tggaagacta gaataa 1476 <210> 2 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant MYC2 <400> 2 Met Glu Glu Leu Ile Ile Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Thr Pro Pro Thr Leu Gln Gln Arg Leu Gln Phe Ile 20 25 30 Val Gln Asn Gln Pro Asp Trp Trp Ser Tyr Ala Ile Phe Trp Gln Thr 35 40 45 Ser Asn Asp Asp Ser Gly Arg Ile Phe Leu Gly Trp Gly Asp Gly His 50 55 60 Phe Gln Gly Ser Lys Asp Thr Ser Pro Lys Pro Ser Thr Phe Ser Asn 65 70 75 80 Ser Arg Met Thr Ile Ser Asn Ser Glu Arg Lys Arg Val Met Met Lys 85 90 95 Gly Ile Gln Ser Leu Ile Gly Glu Cys His Asp Leu Asp Met Ser Leu 100 105 110 Met Asp Gly Asn Asp Ala Thr Asp Ser Glu Trp Phe Tyr Leu Met Ser 115 120 125 Leu Thr Arg Ser Phe Ser Pro Gly Asp Gly Ile Leu Gly Lys Ala Tyr 130 135 140 Thr Thr Gly Ser Leu Ile Trp Leu Thr Gly Gly His Glu Leu Gln Phe 145 150 155 160 Tyr Asn Cys Glu Arg Val Lys Glu Ala Gln Met His Gly Ile Glu Thr 165 170 175 Leu Val Cys Ile Pro Thr Ser Cys Gly Val Leu Glu Leu Gly Ser Ser 180 185 190 Ser Val Ile Arg Glu Asn Trp Gly Leu Val Gln Gln Ala Lys Ser Leu 195 200 205 Phe Gly Ser Asp Leu Ser Ala Tyr Leu Val Pro Lys Gly Pro Asn Asn 210 215 220 Ser Ser Glu Glu Pro Thr Arg Phe Leu Asp Arg Ser Ile Ser Phe Ala 225 230 235 240 Asp Met Gly Ile Ile Ala Gly Leu Gln Glu Asp Cys Ala Val Asp Arg 245 250 255 Glu Gln Lys Asn Ala His Glu Thr Asp Glu Ala Asn Lys Arg Asn Ala 260 265 270 Asn Lys Pro Gly Leu Ser Tyr Leu Asn Ser Glu His Ser Asp Ser Asp 275 280 285 Phe Pro Leu Leu Ala Met His Met Glu Lys Arg Ile Pro Lys Lys Arg 290 295 300 Gly Arg Lys Pro Gly Leu Gly Arg Asp Ala Pro Leu Asn His Val Glu 305 310 315 320 Ala Glu Arg Gln Arg Arg Glu Lys Leu Asn His Arg Phe Tyr Ala Leu 325 330 335 Arg Ala Val Val Pro Asn Val Ser Arg Met Asp Lys Ala Ser Leu Leu 340 345 350 Ser Asp Ala Val Ser Tyr Ile Asn Glu Leu Lys Ala Lys Val Asp Glu 355 360 365 Leu Glu Ser Gln Leu Glu Arg Glu Ser Lys Lys Val Lys Leu Glu Val 370 375 380 Ala Asp Asn Leu Asp Asn Gln Ser Thr Thr Thr Ser Val Asp Gln Ser 385 390 395 400 Thr Cys Arg Pro Asn Gly Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Leu Glu Val 405 410 415 Glu Val Lys Phe Val Gly Asn Asp Ala Met Ile Arg Val Gln Ser Glu 420 425 430 Asn Val Asn Tyr Pro Ala Ser Arg Leu Met Cys Ala Leu Arg Glu Leu 435 440 445 Glu Phe Gln Val His His Ala Ser Met Ser Cys Val Asn Glu Leu Met 450 455 460 Leu Gln Asp Val Val Val Arg Val Pro Asp Gly Leu Arg Thr Glu Glu 465 470 475 480 Ala Leu Lys Ser Ala Leu Leu Gly Arg Leu Glu 485 490

Claims (10)

1. 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 MYC2 유전자가 도입되어 노화가 억제된 형질전환 식물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 프로모터는 35S 프로모터인 것인 형질전환 식물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 형질전환 식물은 형질전환 포플러인 것인 형질전환 식물.
   
5. 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 MYC2 유전자를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 노화가 억제된 형질전환 식물의 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 형질전환 식물을 토양 또는 배지에서 재배하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
   
7. 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 MYC2 유전자를 포함하는 식물체의 노화 억제용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 조성물은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 MYC2 유전자를 포함하는 발현벡터인 것인 조성물.
   
9. 제7항 또는 제8항의 조성물을 포함하는 식물체의 노화 억제용 키트.
   
10. 제7항 또는 제8항의 조성물을 식물체에 도입하여 발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 노화를 억제시키는 방법.
    

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