CN110592134B - 一种sdg40基因或其编码蛋白的应用 - Google Patents

一种sdg40基因或其编码蛋白的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种SDG40基因或其编码蛋白的应用，具体地，当抑制SDG40基因或其编码蛋白的表达时，可显著改善农作物的农艺性状，包括：(i)提高低光利用效率(Alow)；(ii)增加生物量；(iii)增加分蘖数；(iv)提高单株产量；和/或(v)增加株高。此外，本发明还发现，将SDG基因启动子区域的C突变为T和/或A突变为C，还可显著提高农作物的低光利用效率(Alow)。

Description

一种SDG40基因或其编码蛋白的应用
技术领域
本发明涉及农学领域，具体地，涉及一种SDG40基因或其编码蛋白的应用。
背景技术
光合作用是地球上最重要的生物反应，调节全球二氧化碳和氧气的平衡。作物的经济产量主要是由光合效率决定。水稻是我国第一大的粮食作物，大部分位于水稻冠层下部叶片处于低光环境中，尤其在区域化大气可见度降低(如雾霾等天气)，可严重影响水稻的经济产量(新华网)。因此，提高水稻低光下光能利用效率关系对于提高我国粮食产量和粮食安全战略保障具有重要意义。
RUBISCO(ribulose-1,5 bisphosphate carboxylase/oxgenase)是植物光合碳代谢中重要的调节酶，可占叶片总蛋白含量的50％。然而，RUBISCO的催化效率较低，同时，RUBISCO具有加氧活性，消耗氧气，降低光合效率。通过一系列遗传学和分子生物学方法，来调节RUBISCO活性和提高光合效率已被广泛报道，但进展缓慢。
近年来，影响蛋白质翻译后修饰(PTMs)的非组蛋白甲基化转移酶(如p53)在动物癌变细胞的作用已被报道。其中SETDOMAIN基因家族中，有一类(CLASS IIB)可编码非组蛋白(主要是叶绿体蛋白)甲基化转移酶。在水稻中，共有5个成员。其中，大亚基甲基化转移酶(LSMT1)可催化S-甲硫蛋氨酸(SAM)的甲基转移至Rubisco赖氨酸14残基和果糖1，6二磷酸(FBA)的赖氨酸395残基上，然而并无相关明显生物学功能。
因此鉴别新型的叶绿体蛋白甲基化转移酶及其生物学功能对于提高光合碳代谢效率和经济产量至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的叶绿体蛋白甲基化转移酶，其生物学功能对于提高光合碳代谢效率和经济产量至关重要。
本发明第一方面提供了一种SDG40基因或其编码蛋白的抑制剂的用途，用于调控植物的农艺性状或制备调控植物农艺性状的制剂或组合物，其中，所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：
(i)低光利用效率(Alow)；
(ii)生物量；
(iii)分蘖数；
(iv)单株产量；
(v)株高。
在另一优选例中，所述“调控植物的农艺性状”包括：
(i)提高低光利用效率(Alow)；和/或
(ii)增加生物量；和/或
(iii)增加分蘖数；和/或
(iv)提高单株产量；和/或
(v)增加株高。
在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、Crispr试剂、siRNA、shRNA、miRNA、小分子配体、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物选自：杨柳科(Salicaceae)、桑科(Moraceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、(Selaginellaceae)、银杏科(Ginkgoaceae)、松科(Pinaceae)、苏铁科(Cycadaceae)、天南星科(Araceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、悬铃木科(Platanaceae)、榆科(Ulmaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、桦科(Betulaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、椴树科(Tiliaceae)、柽柳科(Tamaricaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、景天科(Crassulaceae)、苏木科(Caesalpinaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、石榴科(Punicaceae)、珙桐科(Nyssaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、八角枫科(Alangiaceae)、卫矛科(Celastraceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、黄杨科(Buxaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、小盘木科(Pandaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、漆树科(Anacardiaceae)，橄榄科(Burseraceae)、桔梗科(Campanulaceae)、红树科(Rhizophoraceae)、檀香科(Santalaceae)、木犀科(Oleaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、禾本科(Gramineae)、露兜树科(Pandanaceae)、黑三棱科(Sparganiaceae)、水蕹科(Aponogetonaceae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、茨藻科(Najadaceae、冰沼草科(Scheuchzeriaceae)、泽泻科(Alismataceae)、花蔺科(Butomaceae)、水鳖科(Hydrocharitaceae)、霉草科(Triuridaceae)、莎草科(Cyperaceae)、棕榈科(槟榔科)(Palmae(Arecaceae))、天南星科(Araceae)、浮萍科(Lemnaceae)、须叶藤科(Flagellariaceae)、帚灯草科(Restionaceae)、刺鳞草科(Centrolepidaceae)、黄眼草科(Xyridaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、田葱科(Philydraceae)、灯心草科(Juncaceae)、百部科(Stemonaceae)、百合科(Liliaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、蒟蒻薯科(箭根薯科)(Taccaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、芭蕉科(Musaceae)、姜科(Zingiberaceae)、美人蕉科(annaceae)、竹芋科(Marantaceae)、水玉簪科(Burmanniaceae)、藜科(Chenopodiaceae)或兰科(Orchidaceae)。
在另一优选例中，所述的禾本科植物选自(但不限于)：小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦；
所述的十字花科植物选自(但不限于)：油菜、白菜等蔬菜；
所述的锦葵科植物选自(但不限于)：棉花、扶桑、木槿；
所述的豆科植物选自(但不限于)：大豆，苜蓿等；
所述的茄科植物包括但不限于：烟草，番茄，辣椒等；
所述的葫芦科植物包括但不限于：南瓜，西瓜，黄瓜等；
所述的蔷薇科植物包括但不限于：苹果，桃、李、海棠等；
所述的藜科植物选自(但不限于)：甜菜；
所述的菊科植物包括但不限于：向日葵，莴苣、莴笋、青蒿、菊芋、甜叶菊等；
所述的杨柳科植物包括但不限于：杨树、柳树等；
所述的桃金娘科植物包括但不限于：桉树、丁子香、桃金娘等；
所述的大戟科植物包括但不限于：橡胶树、木薯、蓖麻等；
所述的蝶形花科植物包括但不限于：花生，豌豆，黄芪等。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：水稻、小麦、高粱、玉米、狗尾草、烟草、拟南芥、或其组合。
在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻、或其组合。
在另一优选例中，所述的SDG40基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。
在另一优选例中，所述SDG40基因来自来自下组的一种或多种农作物：禾本科、茄科、十字花科。
在另一优选例中，所述的SDG40基因来自选自下组的一种或多种农作物：水稻、小麦、烟草、拟南芥、玉米、或其组合。
在另一优选例中，所述SDG40基因选自下组：水稻的SDG40基因(XP_015644803.1)、小麦的SDG40基因(EMS51054.1)、拟南芥(AT5G17240)、烟草(XM_016608916.1)、玉米的SDG40基因(LOC100279317)或其组合。
在另一优选例中，所述SDG40蛋白的氨基酸序列选自下组：
(i)具有SEQ ID NO.:1、31-33任一所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如SEQ ID NO.:1、31-33任一所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控农艺性状功能的、由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1、31-33任一所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，具有所述调控农艺性状功能的多肽。
在另一优选例中，所述SDG40基因的核苷酸序列选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:1、31-33任一所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:2、34-36任一所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:2、34-36任一所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；
(d)在SEQ ID NO.:2、34-36任一所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于降低Rubsico的甲基化水平。
在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于提高Rubsico的羧化效率。
在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于提高生长速度、和/或提高叶面积指数。
本发明第二方面提供了一种改良植物农艺性状的方法，包括步骤：
降低所述植物中SDG40基因或其编码蛋白的表达量或活性，从而改良植物的农艺性状。
在另一优选例中，所述“改良植物的农艺性状”包括：
(i)提高低光利用效率(Alow)；和/或
(ii)增加生物量；和/或
(iii)增加分蘖数；和/或
(iv)提高单株产量；和/或
(v)增加株高。
在另一优选例中，所述的“提高低光利用效率(Alow)”包括步骤：将所述植物中SDG40基因的启动子区域中的C突变为T和/或A突变为C，从而提高植物低光利用效率(Alow)。
在另一优选例中，所述启动子区域为Chr7:16884900－16886900。
在另一优选例中，所述启动子区域的序列如SEQ ID NO.:37所示。
在另一优选例中，将所述植物中SDG40基因的启动子区域中的第523－1751位(优选1723位)的C突变为T和/或第1803－1914位(优选1845位)的A突变为C，从而提高植物低光利用效率(Alow)。
在另一优选例中，所述方法在低光下进行。
在另一优选例中，所述低光指光照强度＜500μmolm-2s-1，较佳地，为50-500μmolm- 2s-1，更佳地，为50-100μmolm-2s-1。
在另一优选例中，所述方法包括给予植物SDG40基因或其编码的多肽的抑制剂。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(i)提供一植物或植物细胞；和
(ii)将SDG40基因或其编码的多肽的抑制剂导入所述植物或植物细胞，从而获得转基因的植物或植物细胞。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、Crispr试剂、siRNA、shRNA、miRNA、小分子配体、或其组合。
本发明第三方面提供了一种提高植物的低光利用效率(Alow)的方法，包括步骤：在所述细胞或植物中降低SDG40基因或其编码蛋白的表达，或将所述植物中SDG40基因的启动子区域中的C突变为T和/或A突变为C，从而提高植物低光利用效率(Alow)。
在另一优选例中，所述启动子区域的序列如SEQ ID NO.:37所示。
在另一优选例中，将所述植物中SDG40基因的启动子区域中的第523－1751位(优选1723位)的C突变为T和/或第1803－1914位(优选1845位)的A突变为C，从而提高植物低光利用效率(Alow)。
本发明第四方面提供了一种转基因植株，所述转基因植株中导入SDG40基因或其编码的多肽的抑制剂。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、Crispr试剂、siRNA、shRNA、miRNA、小分子配体、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了低光光合效率表型(Alow)的全基因组关联分析结果，以及Alow的自然变异(A)和群体分布(B)，Alow的曼哈顿图(C)和QQ图(D)，在最高SNP峰值(7m16911835)上下游50KB内的候选基因列表(E)。
图2显示了SDG40的基因结构和单倍型分析结果。其中，在SDG40的基因启动子区共有2个显著的SNP被鉴别(A)；单倍型共分2种，TC的单倍型共有104个个体，其Alow要显著高于CA的102个个体。
图3显示了SDG40基因下调与Alow和其他形态学性状的关系，以及amiRNA-sdg转基因T1代的Alow表型分布(A)及sdg基因的表达水平与不同转基因品系间的相关性(B)；amiRNA-sdg的T3代纯合品系amiRNA2-1-3与野生型的Alow、生物量、分蘖数和单株产量的差异分析(C)及图像差异(D)。其中，1-3,1-5,2-1为潮霉素鉴定转基因阳性三个品系，mock为阴性品系，WT为野生型。
图4显示了SDG的CRISPR纯合突变体基本信息。突变位置和测序信息(A)以及SDG基因长度和guide RNA识别位置(B)。
图5显示了基因下调和敲除的转基因品系的甲基化和Rubisco最大羧化效率的关系，以及不同转基因品系中，SDG40基因的表达水平差异(A)、Rubisco的甲基化水平差异(C)、光合-胞间CO2响应曲线变化(B)和理论的Rubisco最大羧化效率的差异(D)。
图6显示了Crispr-sdg生长在低光下的表型差异，以及生长在低光下的灌浆期水稻野生型和基因敲除品系间的图片(A)及具体光合和形态学参数的差异(B)。
图7显示了SDG40拟南芥突变体在低光下的生长表现。A:拟南芥野生型(col)和突变体(Atsdg40)生长在低光(LL，100μmol m-2s-1)和高光(HL，500μmol m-2s-1)下的表现。B:野生型与SDG同源基因AT5G17240拟南芥突变体(stock#:SALK_097673.56.00.X)的光合速率和生物量比较；C：利用免疫印迹对野生型和突变体的Rubisco甲基化水平的比较。利用泛甲基化抗体(PTM-602,PTM-Biolab,Hangzhou Jingjie Corp.)进行试验(稀释倍数1：10000)。CBB：考马斯亮蓝染色。
图8显示了SDG基因功能缺失增加玉米低光光合效率。A：利用CRISPR-CAS9技术，编辑SDG在玉米的同源基因(LOC100279317)的引物序列；B：B73和2个CRISPR敲除品系的序列比较分析；C：水稻ChSDG蛋白与玉米ZmSDG的蛋白序列比对。CRISPR-CAS9编辑位置用方框标出；D：B73与SDG玉米突变体的光合参数与形态学特征比较。Asat(饱和光1800PPFD下的光合效率)，Alow(低光100PPFD下的光合效率)，株高(60天的株高)；E：B73与SDG玉米突变体的田间表现。照片拍摄于海南陵水基地，播种后60天。
图9显示了SDG基因功能缺失增加烟草低光光合效率。A：不同时期下本氏烟和NtSDG基因LOC107787360的CRISPR敲除品系(ntsdg)的表型比较；B：ntsdg突变体与本氏烟的序列比对信息；C：CRISPR敲除品系鉴定的引物序列；D-E：水稻ChSDG蛋白与NtSDG蛋白的序列相似度得分与序列分析，CRISPR-CAS9编辑位置用方框标出；F：本氏烟(WT)和ntsdg在1000PPFD饱和光下(Asat)和100PPFD低光下光合效率(Alow)的比较。不同字母表示t-test显著性差异(p<0.05)。
图10显示了SETdomain和rubisco binding domain在不同物种中的序列比对分析。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的植物农艺性状位点的研究和筛选，首次意外地发现了一种SDG40基因或其编码蛋白，其所编码的蛋白为甲基化转移酶，当抑制SDG40基因或其编码蛋白的表达时，可显著改善植物的农艺性状，包括：(i)提高低光利用效率(Alow)；(ii)增加生物量；(iii)增加分蘖数；(iv)提高单株产量；(v)增加株高。此外，进一步实验还发现，将SDG40基因的启动子区域的第523－1751位(优选第1723位)的C突变为T和/或第1803－1914位(优选第1845位)的A突变为C，还可显著提高植物的低光利用效率(Alow)。在此基础上完成了本发明。
SDG40基因
如本文所用，术语“本发明的SDG40基因”、“SDG40基因”可互换使用，均指来源于农作物(如水稻、小麦)的SDG40基因或其变体。在一优选实施方式中，本发明的SDG40基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2、34-36任一所示。在本发明中，SEQ ID NO.:37为SDG40基因的启动子区域的序列。
本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO.:2、34-36)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也能有效地调控农作物(如水稻)的农艺性状。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
在本发明中，SEQ ID NO.:2、34-36中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.:2、34-36的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ IDNO.:2、34-36的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:1、31-33任一所示的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO.:2、34-36中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:2、34-36所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ IDNO.:2、34-36所示)具有一定同源性(保守性)的SDG40的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:2、34-36所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
应理解，虽然本发明的SDG40基因优选来自水稻，但是来自其它植物的与水稻SDG40基因高度同源(如具有80％以上，如85％,90％,95％甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的SDG40核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
SDG40基因编码的多肽
如本文所用，术语“本发明多肽”、“SDG40基因的编码蛋白”、可以互换使用，都是指来源于水稻的SDG40的多肽及其变体。在一优选实施方式中，本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、31-33任一所示。
本发明涉及一种调控农艺性状的SDG40多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、31-33任一所示。本发明的多肽能够有效调控农作物(如水稻)的农艺性状。
本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:1、31-33任一所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。
所述“相同或相似功能”主要是指：“调控农作物(如水稻)的农艺性状”。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有SDG40蛋白活性的SDG40蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然SDG40蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:1、31-33任一所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。
表1
本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.:1、31-33任一所示的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
此外，在本发明中，从图10中可以看出，SET domain与rubisco binding domain在本发明的物种(比如禾本科植物、十字花科植物、锦葵科植物、豆科植物、茄科植物、葫芦科植物、蔷薇科植物、藜科植物、菊科植物、杨柳科植物、桃金娘科植物、蝶形花科植物等)中具有保守的功能区。可推测，这些物种的SDG蛋白对rubisco甲基化的修饰功能与水稻相似。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
在本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。
包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如水稻细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次筛选到一种SETDOMAIN40(SDG40)基因，该基因编码一个叶绿体蛋白甲基化转移酶(OsCPMT1)，可调节RUBISCO及其他光合碳代谢酶活性。
(2)本发明首次发现，降低SDG40基因或其编码蛋白的表达(尤其是在低光下)，可显著改善植物的农艺性状，比如，提高低光利用效率(Alow)、增加生物量、增加分蘖数、提高单株产量、增加株高等。
(3)本发明首次发现，将SDG40基因启动子区域的第523－1751位(优选第1723位)的C突变为T和/或第1803－1914位(优选第1845位)的A突变为C，可显著提高植物的低光利用效率(Alow)。
(4)本发明首次发现，降低SDG40基因或其编码蛋白的表达，可显著降低Rubsico的甲基化水平，提高Rubisco的羧化效率。
(5)本发明首次发现，降低SDG40基因或其编码蛋白的表达，还可提高生长速度、和/或提高叶面积指数。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
1.低光利用效率Alow的测定
全基因组关联分析中，以minicore水稻小核心自然群体为材料，该群体包含205个水稻品系或品种(购自美国农业部种质资源库,USDA-Genetic Stocks Oryza)，来源于全球97个国家。试验在中国科学院遗传发育研究所水稻培育展开，2013年5月中旬播种，该群体生长在自然光照的盆栽条件下，每周浇水2次。播种后60天开始进行光合测定。为消除日间气温对光合测定的影响，测定前，将材料提前移入人工气候室，室温控制在27℃，光照强度维持在600PPFD左右。测定时，采用4台便携式光合仪(LICOR-6400XT)同时进行。叶室温度为25℃，光照强度为100PPFD，CO2为400ppm。每个品系为4次生物学重复。光合速率-胞间CO2反应曲线测定由自动程序完成。每个曲线由14个CO2浓度梯度数据点组成，首先依次为425，350，250，150，100，40，425，500，600，700，900，1100，1400和1800ppm。每个数据点时间间隔为5分钟。Rubisco最大羧化效率(Vcmax)的估计是依据Farquhar光合生化模型计算得出(Farquhar et al.1980)。
2.全基因组关联分析和候选基因筛选
经过质量控制和SNP过滤，共获得2.3M SNPs来用于全基因组关联分析(GWAS)。GWAS是由常规的GEMAA软件来实现，采用混合线性模型算法进行相关性分析。经200次随机抽样，然后界定关联分析的显著性阈值(P值＝6)，随后采用GCTA开源软件(Jian Yang昆士兰大学，http://cnsgenomics.com/software/gcta/index.html)，计算最高SNP峰值(7m16911835)的连锁不平衡距离。曼哈顿和QQ图均由开源软件R(R 3.2.1GUI1.66Mavericks build)完成。
为深入挖掘候选基因，选取了极端表型Alow的高低各10个品系，测定了最高SNP附近的12个候选基因(表1)。
表1候选基因的表达水平在不同极端材料中的差异分析
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选取出苗后5周的水稻叶片，样品用液氮保存。RNA提取用TRIzol Plus RNA纯化试剂盒(英潍捷基生命技术公司)，根据说明书的标准流程进行操作。反转录cDNA采用SuperScript VILO cDNA反转录试剂盒(英潍捷基生命技术公司)。2ug的总RNA用于反转录cDNA。定量PCR采用SYBR Green PCR反应体系(美国应用生物系统公司)和ABI定量PCR仪器(StepOnePlus)实现。扩增反应程序为：95℃10s，55℃20s，72℃20s。管家基因为actin。三次生物学重复和三次技术重复。新开发的引物序列如下(表2)：
表2定量PCR的引物序列表
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3.CRISPR-CAS9载体系统的构建
经过密码子优化的hSpCas9与玉米的ubiquitin启动子(UBI)共连到pCAMBIA1300双元载体(购自NTCC典型培养物保藏中心-Biovector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心)上。该载体骨架含有潮霉素筛选标记(HPT)。引物筛选序列为：F，AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA(SEQ ID NO.:28)；R，ATCGCCTCGCTCCAGTC AATG(SEQ ID NO.:29)。为构建完整的CRISPR/Cas9双元载体pBGK032，需额外引入OsU6启动子，选择标记基因ccdB，带有BsaI的限制性酶切位点和来源于pX260的sgRNA序列。识别sdg基因CDS区的特异性序列通过人工合成完成。最后，将10ng的消化后的pBGK032载体和0.05mM oligo结合子连接，10μl反应体系。测序确认没有发生碱基突变后，然后进行下一步操作，包括大肠杆菌表达质粒、根癌农杆菌介导的水稻转化和愈伤组织再生系统。
4.amiRNA基因干扰系统的构建
人工的microRNAs(amiRNAs)是21mer的小RNAs，可用来对目标基因进行特异性识别，来降低基因的表达水平。依据WMD3的MicroRNA设计网站(http://wmd3.weigelworld.org/)和TIGR水稻基因组注释网站，我们构建了特异性识别SDG40基因的miR319载体。其由三部分组成(5’arm-centralloop-3’arm)。首先将三部分片段分别扩增。然后通过设计特异性21mer的小RNAs(TCTTTGAGCAAGAATTTGCT SEQ ID NO.:30)来替换miR319的20mer的序列。根据WMD3设计，以pNW55载体(购自NTCC典型培养物保藏中心-Biovector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心)为模板进行PCR扩增，然后切胶纯化，整合到pGEMH-T Easy Vector(Promega)上。限制性酶切位点为BamHI/KpnI。获得的重组片段再与IRS154双元载体(由pCAMBIA衍生而成)连接，测序确认没有发生碱基突变后，然后进行下一步操作，包括大肠杆菌表达质粒、根癌农杆菌介导的水稻转化和愈伤组织再生系统。
5.农杆菌介导的转基因和突变体检测
构建好的CRISPR/Cas9和amiRNA质粒通过热激法，在根癌农杆菌菌株EHA105(购自NTCC典型培养物保藏中心-Biovector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心)中表达。转化受体的选择一般为野生型水稻(中花11)(购自上海光明种业有限公司)种子成熟胚诱导愈伤组织，经过诱导培养基增减2周后将胚芽剪下，继续培养1周，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。采用常规的农杆菌介导的遗传转化方法,将含有上述两种质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有120mg/L G418的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有120mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。
6.甲基化水平检测
选取出苗后5周的水稻叶片，样品用液氮保存。SDS蛋白提取液包括：25mM Tris-HCl,pH 7.8,1mM EDTA,5mM MgCl2,1％(w/v)SDS,2mMβ-巯基乙醇)。约50mg鲜重叶片用液氮磨碎，并与1ml的SDS蛋白提取液混合。100℃加热3-5分钟。随后用12,000g离心10分钟，提取上清液。12％的SDS-PAGE胶用于约5μg蛋白的分离。考马斯亮蓝染色，观测蛋白含量变化。免疫杂交采用尼龙纤维素膜为介质，用于蛋白转移，用5％脱脂奶粉封闭，然后用1:5000的泛1,2甲基化抗体(ab23367,Abcam)杂交。最后用化学发光的ECL显色，拍胶用GE公司的发光照相系统(LAS-4000mini,GE Healthcare)。
实施例1大规模的低光利用效率表型调查和全基因组关联分析(GWAS)
利用217份来自全球97个国家的水稻自然小核心群体(minicore)，通过多年多点试验，来调查低光利用效率(Alow)的自然变异和亚群体分布(图1A和图1B)。并利用2.3M过滤后的全基因组覆盖的SNPs进行关联分析，获得Alow的Manhattan和QQ图(图1C&D)。最高SNP峰值(7m16911835)位于第七号染色体上P值为2.3E-09。利用GCTA软件计算最高SNP峰值的连锁不平衡距离(LD＝50KB)。在该峰值上下游50KB附近，共发现有12个候选基因(图1E)。
实施例2候选基因的初步筛选
选取极端Alow表型的高低各10份材料，通过qPCR分析12个候选基因在极端表型个体材料中的表达差异(表1)，结果表明，SDG40基因呈现最显著差异(pair-wise t-test P值＝0.02)。其中，在低Alow表型的个体材料中，SDG40基因的平均表达水平要高于高Alow表型个体材料64％，说明该基因对于低光利用效率可能具有负调节作用。
本发明还发现，SDG40基因的启动子区的活性差异,可导致表型差异。GWAS结果表明(图2，A-B)，在SDG40基因的启动子区，有两个显著的SNP，分别为7m16886623(T/C)和7m16886745(C/A)，分别对应于SDG40基因的启动子区(SEQ ID NO.:3和37)中的第523－1751位(优选第1723位)、第1803－1914位(优选第1845位)。单倍型结构分析表明，含有TC变异的104个亚群体和含有CA的102个亚群体的Alow都有显著变化，其中，含有TC变异的104个亚群体的Alow要显著高于含有CA的102个亚群体，说明启动子区的单倍型变异所引起的表达活性变化可引起光合表型的变化。
实施例3 SDG40基因下调、敲除与光合效率和经济产量的关系
为了证明SDG40基因与水稻叶片光合效率的负调节关系，利用CRISPR-CAS9载体系统和amiRNA基因干扰载体系统，结合农杆菌转化系统获得转基因纯系后代材料。首先测定了T1代三个不同amiRNA株系间与野生型的Alow表型的比较(图3，A-D)。
结果表明，三种amiRNA株系的低光光合效率均显著高于阴性对照(mock)和野生型材料。随着SDG40基因表达水平增加，Alow的值呈显著的线性降低趋势(R2＝0.42)。也考察了T3代纯合株系amiRNA2-1-3的表型，发现低光光合效率Alow、生物量、分蘖数和单株产量均显著高于对照(图3C-D)。
由于SDG40编码的蛋白是一种甲基化转移酶，因此，本发明利用CRISPR基因编辑技术，敲除了SDG40基因第221位的核苷酸序列，获得了SDG40的纯合突变体材料(Crispr-1-3)，并分析了不同基因表达水平的转基因品系间甲基化水平的变化(图4，A-B)。
结果表明，随着SDG40基因表达降低，Rubisco的甲基化水平也随之同步性降低(图5A,C)。
为分析Rubisco甲基化水平变化与羧化活力的关系，分析了不同转基因品系间光合-胞间CO2响应曲线，结果表明，Rubisco的最大羧化效率(Vcmax)随着SDG40基因表达和Rubisco甲基化水平的降低，而表现规律性的增加趋势，说明SDG40基因的表达水平可以影响Rubisco的甲基化水平，进而影响Rubisco的羧化效率(图5，A-D)。
为进一步证明SDG40基因敲除转基因品系中的低光优势，Crispr材料分别生长在不同的光照条件处理下(高光1500PPFD和低光100PPFD)(图6,A-B)。结果表明，低光下Crispr材料表现出更好的生长状态，包括Alow，株高、分蘖数、生物量和单株产量均显著高于对照。而在高光下，差异不明显(图6)。
实施例4拟南芥中的SDG40基因下调、敲除与光合效率和经济产量的关系
通过T-DNA插入突变技术，导致AtSDG40基因第32位氨基酸突变。
结果如图7所示，结果显示，与野生型Col相比，AtSDG40基因的突变体Atsdg40在低光下表现出更好的弱光优势，表现为更高的光合效率，而在高光下雨野生型无异(图7，A-B)。低光处理可降低33％野生型的生物量，而对于突变体仅降低12％的生物量(图7，B)。低光下拟南芥野生型的Rubisco甲基化程度要显著高于高光下的Rubisco甲基化程度。而突变体的Rubisco甲基化水平在高光和低光下差异不明显(图7，C)。
实施例5玉米中的SDG40基因下调、敲除与光合效率和经济产量的关系
利用CRISPR-CAS9技术，对B73玉米的ZmSDG40基因进行定点突变，导致该基因功能丧失。gRNA序列为：GCAAGTCACGCGCCGCCGCG。结果如图8所示，结果表明，通过特异性PCR扩增及测序，证明了利用CRISPR-CAS9成功获得了玉米ZmSDG的349个氨基酸的插入突变(图8，A-C)，扩繁获得T1代敲除品系。单链敲除后仍然在一定程度上增加12％的低光下的光合效率(Alow)，降低了玉米的开花期，而并不提高高光下的光合效率和株高(图8，D-E)。
实施例6烟草中的SDG40基因下调、敲除与光合效率和经济产量的关系
利用CRISPR-CAS9技术，将烟草中SDG40同源基因敲除，进而基因功能缺失。
结果如图9所示，结果表明，利用CRISPR-CAS9对烟草SDG同源基因LOC107787360的第9个氨基酸进行敲除，命名为ntsdg(图9，B-E)该材料具有更快的生长速度和叶面积指数(图9，A)，更高的低光光合效率，而ntsdg的饱和光下的光合效率并无明显增加(图9，F)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种抑制SDG40基因或其编码蛋白表达或活性在用于调控植物的农艺性状中的应用，其特征在于，用抑制剂抑制SDG40基因或其编码蛋白的表达或活性，其中，所述植物的农艺性状选自下组的一种或多种：
(i) 低光利用效率（Alow）；
(ii) 生物量；
(iii) 分蘖数；
(iv) 单株产量；
(v) 株高；
（vi）生长速度；
（vii）叶面积指数；
所述SDG40基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、34-36任一所示，所述“调控植物的农艺性状”包括：
(i) 提高低光利用效率（Alow）；和/或
(ii) 增加生物量；和/或
(iii) 增加分蘖数；和/或
(iv) 提高单株产量；和/或
(v) 增加株高；和/或
（vi）提高生长速度；和/或
（vii）提高叶面积指数，所述的植物选自下组：水稻、玉米、烟草、拟南芥、或其组合。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、Crispr试剂、siRNA、shRNA、miRNA、小分子配体、或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻、或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述SDG40蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、31-33任一所示。
5.一种改良植物农艺性状的方法，其特征在于，包括步骤：
降低所述植物中SDG40基因或其编码蛋白的表达量或活性，从而改良植物的农艺性状，所述SDG40基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、34-36任一所示，所述“改良植物的农艺性状”包括：
(i) 提高低光利用效率（Alow）；和/或
(ii) 增加生物量；和/或
(iii) 增加分蘖数；和/或
(iv) 提高单株产量；和/或
(v) 增加株高；和/或
（vi）提高生长速度；和/或
（vii）提高叶面积指数，所述的植物选自下组：水稻、玉米、烟草、拟南芥、或其组合。
6.一种提高植物的低光利用效率（Alow）的方法，其特征在于，包括步骤：将所述植物中SDG40基因的启动子区域中的第1723位的 C突变为T或第1845位的 A突变为C，从而提高植物低光利用效率（Alow），所述的植物为水稻，所述启动子区域的序列如SEQ ID NO.:37所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113004382B (zh) * 2019-12-20 2022-09-30 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种EmBP1基因或其蛋白的应用
CN111424050B (zh) * 2020-03-04 2022-02-22 深圳大学 悬铃木突变体、获取悬铃木突变体的方法和应用
CN114600765B (zh) * 2022-03-21 2022-11-25 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 一种弱感光粳稻种质的创制方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103194453A (zh) * 2012-01-05 2013-07-10 中国科学院上海生命科学研究院 一种改良植物性状的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103421825B (zh) * 2013-03-13 2015-04-22 华中农业大学 组蛋白甲基转移酶基因在调控水稻开花期和穗型中的应用
CN103740750B (zh) * 2014-01-13 2016-01-13 华南农业大学 一种培育矮化、增加分蘖、提高抗旱性的转基因植物的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103194453A (zh) * 2012-01-05 2013-07-10 中国科学院上海生命科学研究院 一种改良植物性状的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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NCBI Reference Sequence: NM_121730.4;Tabata,S等;《NCBI》;20160912;第1-2页 *
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