CN103421825B - 组蛋白甲基转移酶基因在调控水稻开花期和穗型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物转基因工程技术领域，具体涉及一种组蛋白甲基转移酶基因在调控水稻开花期及穗型中的应用。克隆得到一种组蛋白甲基转移酶基因SDG711，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过双链抑制RNA的方法，得到该基因相应的转化水稻，发现抑制该基因后植株的开花时间在长日照条件下要提前2个星期左右，植株的穗型较野生型小很多。检测转基因的组蛋白修饰情况发现，转基因植株的组蛋白H3K27的二甲基化和三甲基化水平发生明显变化。表明本发明的组蛋白甲基转移酶基因SDG711可以通过调控水稻组蛋白甲基化修饰并且影响了水稻的开花时间及穗子的大小从而影响了水稻的产量。

Description

组蛋白甲基转移酶基因在调控水稻开花期和穗型中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个影响水稻开花期和穗型的组蛋白甲基转移酶基因SDG711的分离克隆、功能验证和应用。

背景技术

组蛋白修饰是表观遗传调控的重要机制之一，H3K27me3是发生在组蛋白H3的第27位赖氨酸上的三甲基化修饰。在基因表达调控水平上，H3K27me3常常与转录抑制相关。拟南芥中H3K27me3转移酶基因CLF参与PcG复合物介导的花器官同源异型基因PI、AP3的沉默，控制营养生长向生殖生长的转变。它不仅影响着拟南芥花的形态发生，而且在开花时间的调控途径中起着非常重要的作用。研究表明，拟南芥开花时间的调控途径主要包括4种：光周期途径，春化途径，自主开花途径和赤霉素途径。CLF参与不同的PRC2复合物从而产生不同的作用，例如CLF参与EMF复合物时，可以通过对AGL19的H3K27me3修饰来调控拟南芥不依赖FLC的春化途径以及对FT的H3K27me3修饰来调控拟南芥的光周期途径(Chanvivattana et al.，Interaction of Polycomb-group proteins controlling flowering in Arabidopsis.Development，2004)；当CLF参与VRN复合物时，直接对FLC进行H3K27me3修饰抑制FLC的表达来调控拟南芥的春化途径(Greb et al.，The PHD finger protein VRN5 functions in the epigenetic silencing ofArabidopsis FLC.Curr Biol，2007)。

近年来CLF的越来越多的功能被揭示，CLF与FIE、EMF2形成的PRC2复合体将KNOX基因的组蛋白H3K27me3，随后PRC1复合体通过LHP1识别H3K27me3，进而使得染色质压缩，抑制KNOX基因的转录，保证干细胞的适度分化(Jiang et al.，Repression of FLOWERING LOCUS C and FLOWERING LOCUST by the Arabidopsis Polycomb repressive complex 2 components.PLoS One，2008)；同时还发现CLF还可以与BLISTER互作参与了细胞周期的调控(Schatlowski et al.，The CURLY LEAF interacting protein BLISTERcontrols expression of polycomb-group target genes and cellular differentiation of Arabidopsis thaliana，Plant Cell，2010)。有趣的是，CLF中富含半胱氨酸结构域中的一个脯氨酸突变成一个丝氨酸后，它的H3K27me3功能增强，而且对FLC的抑制作用可以不依赖于与春化相关的其他PcG成员的帮助(Doyle et al.，A singleamino acid change in the enhancer of zeste ortholog CURLY LEAF results in vernalization-independent，rapidflowering in Arabidopsis.Plant Physiol，2009)。这表明CLF自身的结构特征对它的生物学功能有着一定的影响，但是这方面的报道并不多见。另外，UCL1通过E3泛素连接酶复合体对CLF的表达进行调节(Jeonget al.，An E3 ligase complex regulates SET-domain polycomb group protein activity in Arabidopsis thaliana.ProcNatl Acad Sci USA，2011)。由此可见，CLF在拟南芥中的作用不可小觑。随着生物技术的不断改进，它的越来越多的未知功能也可能被发现。

水稻中关于H3K27me3的报道并不多见，而具有这类修饰的转移酶基因在水稻的生长发育过程起着怎样的作用也未见有报道，本发明通过对SDG711的研究揭示了其在调控水稻开花时间以及幼穗发育中有着重要的作用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种组蛋白甲基转移酶基因SDG711在调控水稻开花时间上的应用，抑制该基因表达后，长日照条件下植株开花时间较野生型明显提前。

本发明的另一个目的是提供了一种组蛋白甲基转移酶基因SDG711在调控水稻穗型上的应用，抑制该基因表达后，植株的穗型较野生型明显缩小。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：

申请人克隆得到水稻组蛋白甲基转移酶基因SDG711，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，由2823个碱基组成，推测其蛋白质编码序列有2691个碱基，是序列表SFQ ID NO：1自5’端第4位碱基到2694位碱基组成，其共编码896个氨基酸。在此基因的翻译区内设计一段该基因特异的片段，构建到用于一种抑制表达载体pDS1301(见图1)，然后转化粳稻品种中花11(或称ZH11)，得到转基因水稻植株。转基因阳性植株表现为开花推迟，穗型变小等多种表型。检测转基因植株的组蛋白修饰情况发现，抑制植株的组蛋白H3K27三甲基化和H3K27二甲基化水平要明显低于野生型；阴性植株在开花时间和穗形上与野生型相比没有什么变化，其组蛋白H3K27修饰也没发生变化(图6)。这说明本发明的所克隆到的组蛋白甲基化酶基因SDG711是通过调控水稻组蛋白H3K27甲基化修饰来调控水稻开花时间以及穗型的发育。

本发明的具体技术方案如下：

(1)从ChromDB数据库(http://www.chromdb.org/index.html)得到SDG711基因(基因登录号LOC_Os06g16390)的DNA序列，根据该序列设计引物对，以水稻cDNA为模板，分别用三对引物扩增了SDG711的全长的三段(翻译起始位点上游3个碱基至下游129个碱基)，然后连接起来，得到全长，其序列为SEQ ID NO：1所示(其中4-2694是编码区)的核苷酸序列，扩增该片段的引物对的DNA序列如下所示：

SDG711-F1(正向引物)5’-CTGATGGCTGGCGATTCC-3’，

SDG711-R1(反向引物)5’-GTTTCTCCCCTTGTAGGATCTCAT3’；

SDG711-F2(正向引物)5’-GGCATGTCTGATGCTGTGCTT-3’，

SDG711-R2(反向引物)5’-CGATTCTTGCACATTTTCGG-3’；

SDG711-F3(正向引物)5’-CAGGTCCTGGAAAGTGATTGAG-3’，

SDG711-R3(反向引物)5’-CATATGCGAATGGCAGGAAAGTTTTCC-3’。

(2)从ChromDB数据库(http://www.chromdb.org/index.html)得到SDG711基因(LOC_Os06g16390)的DNA序列，根据该序列设计引物对，以水稻cDNA为模板，扩增了SDG711的特异的片段区域，其序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列(序列全长为505bp)，扩增该片段的引物对的DNA序列如下所示：

dsSDG711-F 5’-AGAACTAGTGGTACCACAGATTTAGTCTCGAATTTGCTCA-3’，

dsSDG711-R 5’-AGAGAGCTCGGATCCGTTTCTCCCCGTAGGATCTCAT-3’。

(3)构建抑制表达载体pDS1301-SDG711(图1)，获得转化载体pDS1301-SDG711；

(4)利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei Y等，Efficient tra-nsformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.1994，6：271-282.)将所述的载体导入水稻受体中花11(ZH11)，获得转化植株；

(5)借助PCR及Realtime-PCR方法分析鉴定阳性转基因植株，并观察统计转基因植株表型；

(6)利用Realtime-PCR分析转基因植株中相关基因的表达；

(7)借助Western Blot分析转基因植株组蛋白修饰情况。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

水稻是全世界最重要的粮食作物之一，对缓解粮食短缺，尤其是保障我国的粮食安全有着重要的意义，如何提高水稻产量已经成为一项具有重要意义的科学问题。多疏蛋白类基因是植物和动物在进化过程中形成的一类保守的转录抑制因子，拟南芥的几个PcG蛋白复合物在控制开花时间和种子发育中具有重要功能。然而有关PcG类基因在水稻中的功能报道尚不多见。本发明的组蛋白H3K27me3和H3K27me2修饰酶基因SDG711在水稻开花时间以及穗型中的作用尚未有报道，申请人通过构建该基因的双链抑制载体，并转化水稻粳稻品种中花11(ZH11)，得到相应的转基因植株，其开花时间较野生型(非转基因)提早约13天左右，穗型变小。表明该基因通过调控水稻开花及穗型发育来控制水稻的产量，这对水稻产量的研究有着重要的指导意义，可为水稻品质改良和新品种的选育提供理论基础。

附图说明

序列表SEQ ID NO1：是本发明克隆的水稻组蛋白甲基转移酶基因SDG711的核苷酸序列，序列全长为2823bp，其第4-2694位为编码区(CDS)。

序列表SEQ ID NO2：是本发明克隆的水稻组蛋白甲基转移酶基因SDG711的蛋白质的氨基酸序列，其编码896个氨基酸。

序列表SEQ ID NO3：是本发明克隆的水稻组蛋白甲基转移酶基因SDG711的构建双链抑制载体的特异核苷酸序列。

图1：抑制表达载体pDS1301及pDS1301-SDG711示意图，该图的上半部分为表达载体质粒pDS1301pDS1301图，下半部分为本发明构建的pDS1301-SDG711抑制表达载体图。

图2：SDG711基因在转基因植株中的表达量示意图。图中：dj代表阴性对照(水稻品种中花11)；r-6代表转基因阴性植株；其余从r-1到r-12代表抑制转基因阳性植株T0代。

图3：在SDG711的RNAi转基因植株与野生型植株的形态表型及统计学分析示意图。图中：WT代表阴性对照；ds代表抑制转基因阳性植株。

图4：转基因植株与野生型植株及获得性突变体在持续光照14小时的条件下生长35天后检测开花相关基因的表达。图中：WT代表阴性对照；RNAi代表抑制转基因阳性植株。

在上述图4中：图4A表示RFT1在两种材料中的表达量；图4B表示RID1在两种材料中的表达量；图4C表示Hd3a在两种材料中的表达量；图4D表示Hd1在两种材料中的表达量；图4E表示Ehd1在两种材料中的表达量；图4F表示OsGI在两种材料中的表达量；图4G表示Ghd7在两种材料中的表达量。

图5：抑制转基因植株与野生型植株幼穗中细胞分裂素氧化酶基因的检测。图中：WT代表阴性对照；R-3、R-4、R-7分别代表抑制转基因植株的不同家系的T1代植株。

图6：SDG711基因抑制转基因植株的组蛋白修饰。图中显示的试验结果是由Western Blot方法获得的，实验用的一抗分别为H3，H3K4me3，H3K4me2，H3K9me3，H3K9me2，H3K27me3，H3K27me2，H3K27mel，H3K36me3和H3K36me2(组蛋白对应的数字是相应的一抗编号)；所检测的蛋白分别为野生型和SDG711基因双链抑制转基因T1代材料的组蛋白。

具体实施方式

实施例1：SDG711基因全长cDNA的扩增

对本发明所需要的基因SDG711(基因登录号LOC_Os06g16390)，主要通过RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)进行扩增得到SDG711基因的三段序列，然后通过酶切连接得到该基因的全长。具体操作如下：

1)抽提来自水稻粳稻品种中花11(ZH11)(中国农业科学院作物科学研究所李梅芳研究员赠送，为中国公开应用的水稻品种)幼苗叶片的RNA，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)；

2)RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配制混合液1：总RNA4μg，DNaseI2U，10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl500μg/ml的oligo(dT)，④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配制混合液2：混合液1 10μl，5x first strand buffer4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

3)然后根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的SDG711基因的全长cDNA序列，设计引物PCR扩增片段。PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mM Mg2+1.5μl，正向引物和反向引物各0.4μl，LATaq酶0.2μl，加水至20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③58℃30秒，④72℃60秒，⑤从②-④循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。分别扩增出三段序列：即用SDG711-F1和SDG711-R1扩增出第一段，用SDG711-F2和SDG711-R2扩增出第二段，用SDG711-F3和SDG711-R3扩增出第三段。

用来克隆SDG711全长的引物如下所示：

SDG711-F1(正向引物)：5’-CTGATGGCTGGCGATTCC-3’，

SDG711-R1(反向引物)：5’-GTTTCTCCCCTTGTAGGATCTCAT3’；

SDG711-F2(正向引物)：5’-GGCATGTCTGATGCTGTGCTT-3’，

SDG711-R2(反向引物)：5’-CGATTCTTGCACATTTTCGG-3’；

SDG711-F3(正向引物)：5’-CAGGTCCTGGAAAGTGATTGAG-3’，

SDG711-R3(反向引物)：5’-CATATGCGAATGGCAGGAAAGTTTTCC-3’。

4)将扩增出的第一段连接到T/A克隆载体pGEMT-vector(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)上用T7和SP6引物测序验证。

5)将带有第一段的T/A克隆载体用EcoRV和PstI酶切，回收载体片段，与EcoRV和pstI酶切后的第二段连接(所使用的内切酶均购自宝生物工程大连有限公司，使用方法及用量按照该公司提供的产品说明书；连接酶为上海英俊生物技术公司产品，用法及用量按照该公司产品说明书)；连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，在含有250ppm氨苄青霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm氨苄青霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002版报道的方法抽提质粒，用EcoRV和PstI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的载体(带有第一段和第二段的T/A克隆载体)，并用T7和SP6引物测序验证。

6)将带有第一段和第二段的T/A克隆用PstI和NdeI酶切，回收载体片段，与PstI和NdeI酶切后的第二段连接(所使用的内切酶均购自宝生物工程大连有限公司，使用方法及用量按照该公司提供的产品说明书；连接酶为上海英俊生物技术公司产品，用法及用量按照该公司产品说明书)；连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，在含有250ppm氨苄青霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm氨苄青霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002版报道的方法抽提质粒，用PstI和NdeI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的载体(带有三段的T/A克隆载体)，并用T7和SP6引物测序验证。

最终得到的SDG711基因的cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2：SDG711双链抑制载体的构建

对本发明所需要的基因，通过RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)进行扩增得到SDG711特异的一段序列，具体步骤是：根据公共数据库(http://rice.plantbiologymsu.edu/)公布的SDG711基因的全长cDNA序列，通过在ChromDB数据库(http://www.chromdb.org/index.html)中比对寻找SDG711特异的序列设计引物，PCR扩增RNAi抑制片段。扩增产物通过T/A克隆连接到pGEMT-vector(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)进行测序验证。

用来克隆SDG711的RNAi抑制片段的引物如下所示：

dsSDG711-F 5’-AGAACTAGTGGTACCACAGATTTAGTCTCGAATTTGCTCA-3’；

dsSDG711-R 5’-AGAGAGCTCGGATCCGTTTCTCCCCGTAGGATCTCAT-3’。

其扩增的DNA片段如序列表SEQ ID NO：3所示，序列全长为505bp。。

具体步骤如下：

1)将带有SDG711的RNAi片段的T/A克隆用KpnI和BamHI酶切，回收目标条带，与KpnI和BamHI酶切的表达载体质粒pDS1301(见图1的上图，山东农业大学山东省农业微生物重点实验室，储昭辉教授赠送)；构建方法参见文献：Chu等，Promoter mutations of an essential gene for pollen development result indisease resistance in rice.Genes Dev，2006，20：1250-1255.)连接(所使用的内切酶均购自宝生物工程大连有限公司，使用方法及用量按照该公司提供的产品说明书；连接酶为上海英俊生物技术公司产品，用法及用量按照该公司产品说明书)；

2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司代理)，在含有250ppm卡那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；

3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002版报道的方法抽提质粒，用KpnI和BamHI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的抑制表达载体：pDS1301-SDG711-1(该质粒的图谱见图1)；

4)将带SDG711干涉片段的TA克隆用SpeI和SacI酶切，回收目标条带，与SpeI和SacI酶切的质粒pDS1301-SDG711-1连接，依据2)、3)步得到抑制表达载体：pDS1301-SDG711-2(该质粒的图谱见图1)

实施例3：双元Ti质粒载体的转化及转基因植株阳性和表达量检测

1)把新构建的抑制表达载体pDS1301-SDG711-2(来自实施例2)通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数如实施例2的步骤2)所述)导入农杆菌EHA105(购自澳大利亚CAMBIA实验室，为常规商业菌株)菌株中。将转化后的菌株命名为TR-SDG711。

2)将上步得到的TR-SDG711转化水稻粳稻品种中花11(ZH11)，转化方法参照Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis ofthe boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282.)以及华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的标准方法(例如：专利号ZL200710053552.9，发明的名称：水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用；专利公开号：CN101200725A；专利授权日：2010年04月21日的专利文献)进行。将所获得的T0代转基因植株命名为R-SDG711-n，其中n＝1，2，3...代表转基因的不同家系。

3)取T0代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)。以叶片总DNA为模板，用PCR方法对双联抑制T0代转化植株用载体第一链引物(pMCG1F和pMCG1R)和第二链引物(pMCG2F和pMCG2R)进行阳性检测。

引物的序列如下：

pMCG1F：5′-CTGCTCCACACATGTCCATT-3’，

pMCG1R：5′-CCCACCATCTTGTGGAGCTA-3’；

pMCG2F：5’-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3’，

pMCG2R：5’-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3’。

以上引物均由生工生物工程(上海)有限公司(或称上海生工生物工程有限公司)合成。

PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mMMg2+1.5μl，正向引物、反向引物(pMCG1F和pMCG1R，pMCG2F和pMCG2R)各0.4μl，r-Taq酶0.2μl，加去离子水至20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、r-Taq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③57℃30秒，④72℃1分钟，⑤从②-④循环32次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。因为载体第一链引物(pMCG1F和pMCG1R)和第二链引物(pMCG2F和pMCG2R)片段为转化载体所特有，这样能扩增出′特异条带的转基因植株即为阳性植株。对T0代阳性植株收种子(称为T1代)，为T1代的大田种植和性状调查做准备。

3)为了检测双链抑制植株中的目标基因的表达量，申请人采用Real-time PCR的方法对转基因T0代植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自分蘖期的水稻叶片，RNA抽提用的试剂是采用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；按照实施例1的方法进行反转录，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测SDG711的表达量。试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。Real-time PCR所用引物序列为：

SDG711RT-F：5’-TGAGGAAACCCTTGCAGTTGA-3’

SDG711RT-R：5’-TATCCCTAGGCCAATGGCATC-3’

最终得到的T0代转基因植株中SDG711表达结果见图4。R-1到R-12为最终得到的12个转基因家系，其中R-6为转基因阴性，Real-time PCR结果显示在转基因材料中，SDG711的表达与野生型中花11(ZH11)相比，下降了约85％，说明抑制效果很好。

实施例4：转基因植株性状调查和SDG711在调控水稻开花时间和穗型发育中基因的表达分析

1)将本发明T0代阳性植株(即SDG711基因表达量下降的植株)收种子(T1代)种入大田进行表型鉴定。结果发现转基因阳性植株均有不同程度的表型，具体表现为开花期推迟，穗型变小等表型(图3)，统计T1代3，4，7，9，13五个家系各20株以及中花11(ZH11)对照20株，五个家系分别与中花11(ZH11)对照进行单因素数据显著性分析，结果如表1，其中NO3，NO4，NO7，NO9，NO13代表转基因不同家系，*代表差异显著，P＜0.05；**代表差极异显著，P＜0.01。具体见表1所述。

表1.表型统计

2)为了验证SDG711长日照条件下调控水稻开花时间，我们将转基因植株和野生型植株在长日照14小时的条件下在光照培养箱中处理35天后，每四小时取一次样，取样部位为植株最顶端3片叶子，抽提叶片RNA，反转录产物检测开花相关基因的表达量。实验所用的总RNA来自所取的叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；按照实施例1的方法进行反转录，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测开花相关基因的表达量。试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。

表达结果见图4所示，图4中WT代表阴性对照；RNAi代表抑制转基因阳性植株。图4A表示RFT1在两种材料中的表达量；图4B表示RID1在两种材料中的表达量；图4C表示Hd3a在两种材料中的表达量；图4D表示Hd1在两种材料中的表达量；图4E表示Ehd1在两种材料中的表达量；图4F表示OsGI在两种材料中的表达量；图4G表示Ghd7在两种材料中的表达量。其中RFT1、RID1，Hd3a、Ehd1在抑制转基因阳性植株中表达量上升，Hd1在抑制转基因阳性植株中表达量下降，OsGI、Ghd7表达量在两种材料中基本没有变化。实验结果表明开花途径上的重要基因大多部受到SDG711的调控，SDG711在调控水稻开花过程中有着重要的作用。

Real-time PCR所用引物序列如下所示：

RFT1QF 5’-TGGTGTTCGTGCTGTTCCA-3’，

RFT1QR 5’-TTGTAGAGCTCGGCGAAGTTC-3’；

RID1QF 5’-CGACGACAATAGCTCGATCGC-3’，

RID1QR 5’-GTGCATGGTCACGGAGCCTT-3’；

Hd3a QF 5’-GCTCACTATCATCATCCAGCATG-3’，

Hd3a QR 5’-CCTTGCTCAGCTATTTAATTGCATAA-3’；

Hd1 QF 5’-TCAGCAACAGCATATCTTTCTCATCA-3’，

Hd1 QR 5’-TCTGGAATTTGGCTATACTATCACC-3’；

Ehd1 QF 5’-GGATGCAAGGAAATCATGGA-3’，

Ehd1 QR 5’-AATCCCATCGGAAATCTTGG-3’；

OsGI QF 5’-TGGAGAAAGGTTGTGGATGC-3’，

OsGI QR 5’-GATAGACGGCACTTCAGCAGAT-3’；

Ghd7 QF 5’-AAATCCGGTACGCGTCCAG-3’，

Ghd7 QR 5’-GACATAGGTGGATGGCGGTG-3’；

ActinQF 5’-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3’，

ActinQR 5’-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3’。

其中RFT1QF、RFT1QR是用于RFT1基因定量PCR检测的引物；RID1QF、RID1QR是用于RID1基因定量PCR检测的引物；Hd3a QF、Hd3a QR是用于Hd3a基因定量PCR检测的引物；Hd1 QF、Hd1 QR是用于Hd1基因定量PCR检测的引物；Fhd1 QF、Fhd1 QR是用于Ehd1基因定量PCR检测的引物；OsGIQF、OsGI QR是用于OsGI基因定量PCR检测的引物；Ghd7 QF、Ghd7 QR是用于Ghd7基因定量PCR检测的引物；Actin QF、Actin QR是用于Actin基因定量PCR检测的引物。

3)为了验证SDG711调控水稻穗型的发育，我们分别取转基因植株和野生型(非转基因)的3期幼穗(幼穗长约1-2mm)抽提RNA(抽提RNA的方法参见实施例1)，反转录(具体方法参见实施例1)产物用Real-time PCR(具体方法详见实施例4)方法检测直接影响水稻穗型发育的重要基因细胞分裂数氧化酶基因GN1a(基因登录号LOC_Os01g10110)的表达量，检测结果见图5，实验结果表明GN1a受到SDG711的负调控，说明SDG711在调控水稻穗型方面也有着重要的作用。

Real-time PCR所用引物序列如下所示：

GN1aQF 5’-GTCCACGACGGCGAGCTCAA-3’，

GNlaQR 5’-TCATGCGAGTGGTGACGTGA-3’；

ActinQF 5’-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3’，

ActinQR 5’-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3’。

实施例5SDG711基因的蛋白功能检测

为了确定SDG711蛋白在组蛋白修饰上的作用，我们通过提取SDG711转基因和野生型的组蛋白，利用组蛋白修饰类的商业化抗体(见后所述)做Western Blot实验(方法参照Huang et al.，Down-regulation ofa Silent Information Regulator2-related gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation and cell death in rice.PlantPhysiol，2007，144：1508-1519.)。具体操作方法为：分别取播种后40天左右的野生型植株(非转基因)和转基因植株的叶片4-5片，液氮研磨后放入3倍体积的组蛋白抽提缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5；2mMEDTA；0.25M HCl；5mM2-mercaptoethanol；0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF))中充分混匀，经12000g，4℃离心10分钟后，吸取上清于另一新离心管，按体积加入三氯乙酸至终浓度为25％，17000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀用丙酮洗涤三次，晾干后溶解于上样缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH6.8；2％SDS；25％甘油(glycerol)；0.01％溴酚蓝(Bromophenol Blue)；10％β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)中，经浓度为15％的SDS-PAGE电泳可检测抽提效果，电泳采用Bio-Rad公司的Mini-PROTEAN3电泳槽系统，按照其说明书进行操作。

将提取好的组蛋白进行western检测，western blot转膜使用Bio-Rad公司的Mini Trans-Blot Cell转印槽系统，按照其说明书，将组蛋白转至Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用配好的含2％(质量体积比)小牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L，pH7.5)对膜封闭两小时以上，然后以体积比1∶10000加入不同的抗体(如后所示)室温孵育两小时左右。所用抗体为：H3，H3K4me3，H3K4me2，H3K9me3，H3K9me2，H3K27me3，H3K27me2，H3K27me1和H3K36me3，H3K36me2，其中H3K4me2(货号：07-430)，H3K9me2(货号：07-441)，H3K27me3(货号：07-449)，H3K36me2(货号：07-274)购自Millipore公司；H3(货号：ab1791)，H3K4me3(货号：ab8580)，H3K9me3(货号：ab8898)，H3K27me2(货号：ab24684)，H3K27me1(货号：ab113671)，H3K36me3(货号：ab9050)购自Abcam公司。倒掉一抗后，用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，再加入按体积比为1∶10000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(购自SouthernBiotech公司，德博生物科技有限公司(北京)代理)，室温孵育1-2小时，然后用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，使用SuperSingnal Pico(购自Pierce公司)试剂盒按说明书操作方法进行X光片显影，经扫描仪扫描X光片后分析结果。

实验结果显示SDG711具有组蛋白甲基化功能，是一个组蛋白甲基化酶，主要作用于H3K27me3，H3K27me2位点(图6)。

Claims (2)

1.组蛋白甲基转移酶基因SDG711在调控水稻开花期中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID：1所述。

2.组蛋白甲基转移酶基因SDG711在调控水稻穗型中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID：1所述。