CN110054670A

CN110054670A - 一种可减小作物叶夹角的蛋白及其应用

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Publication number: CN110054670A
Application number: CN201910268606.6A
Authority: CN
Inventors: 赵毓; 周超; 刘潜; 周道绣
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2019-07-26

Abstract

本发明公开了一种可减小作物叶夹角的蛋白及其应用，属于植物遗传育种领域。本发明提供的蛋白是水稻中的DRM2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，本发明公开了编码上述蛋白的核酸，以及包含该核酸的表达盒、表达载体、宿主细胞及其在减小作物叶夹角中的应用。

Description

一种可减小作物叶夹角的蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种减小作物叶夹角的蛋白及其应用，属于植物遗传育种技术领域。

背景技术

理想的株型是水稻提高产量的决定因素。在水稻的理想株型中，半矮化和叶片直立是两个对增产非常有利的性状（Wang Y and Li J. Molecular basis of plantarchitecture[J]. Annu Rev Plant Biol, 2008, 59: 253-79.）。绿色革命就是通过改良水稻株型提高水稻产量的成功例证。近年的一些研究表明叶片直立也是成就水稻高产株型的目标之一。叶片直立可提高冠层光合速率，改善群体下部光照，增加物质生产量；同时增加冠层基部光量，增强根系活力，提高抗倒性；且利于密植，提高单位土地面积上的净光合速率。通过密植具有直立叶片的水稻品种可以达到增产的目的（Morinaka Y, Sakamoto T,Inukai Y, et al. Morphological alteration caused by brassinosteroidinsensitivity increases the biomass and grain production of rice[J]. PlantPhysiol, 2006, 141(3): 924-31; Sakamoto T, Morinaka Y, Ohnishi T, et al.Erect leaves caused by brassinosteroid deficiency increase biomass productionand grain yield in rice[J]. Nat Biotechnol, 2006, 24(1): 105-9.）

DNA甲基化是基因表达调控和表观修饰的重要形式。OsDRM2是水稻中的一个主要的CHH类甲基转移酶，能够介导non-CG的DNA甲基化过程。此外，OsDRM2会与组蛋白甲基转移酶SDG711发生互作，并共同参与功能基因表达的抑制（Zhou S, Liu X, Zhou C, et al.Cooperation between the H3K27me3 Chromatin Mark and Non-CG Methylation inEpigenetic Regulation[J]. Plant Physiol, 2016, 172(2): 1131-1141.）。OsDRM2也会与ATP介导的RNA解旋酶OseIF4A发生互作，从而参与RNA指导的DNA甲基化过程（Dangwal M,Malik G, Kapoor S, et al. De novo methyltransferase, OsDRM2, interacts withthe ATP-dependent RNA helicase, OseIF4A, in rice[J]. J Mol Biol, 2013, 425(16): 2853-66.）。

由于OsDRM2的重要作用，其功能的失活能够造成水稻等植物表现出各种不同的异常表型。例如，水稻DRM2基因的突变会导致水稻分蘖数的减少、半矮化、花期延迟、穗发育异常并且纯合突变体不育（Moritoh S, Eun C H, Ono A, et al. Targeted disruption ofan orthologue of DOMAINS REARRANGED METHYLASE 2, OsDRM2, impairs the growthof rice plants by abnormal DNA methylation[J]. Plant J, 2012, 71(1): 85-98.）。DRM2基因的突变也可以导致镉胁迫相关基因OsIRO2、OsPR1b和Os09g02214的转录本的减少（Feng S J, Liu X S, Tao H, et al. Variation of DNA methylation patternsassociated with gene expression in rice (Oryza sativa) exposed to cadmium[J].Plant Cell Environ, 2016, 39(12): 2629-2649.）。

本发明通过鉴定水稻DRM2基因突变体，发现了DRM2基因对水稻叶夹角性状的调控作用。利用DRM2蛋白或其他功能同一性蛋白以及编码该蛋白的核酸序列，可以减小作物的叶夹角，从而培育适合密植的作物品种。

发明内容

本发明提供了一种可以用来减小作物叶夹角的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；或者，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与SEQ ID NO. 1所示的序列相同功能的序列。

在又一方面，本发明还提供了一种核酸，其特征在于，上述核酸编码上述的蛋白；在一些实施方案中，所述核酸的序列如SEQ ID NO. 2所示。

在又一方面，本发明还提供了基因表达盒，其特征在于，含上述的核酸序列；在一些实施方案中，所述核酸与ubi启动子和nos终止子可操作地连接。

在又一方面，本发明还提供了表达载体，其特征在于，所述载体含有上述表达盒；在一些实施方案中，所述载体还包含CaMV35S:hygromycin:CaMV35S polyA表达盒

在又一方面，本发明还提供了宿主细胞，其特征在于，包含上述表达载体；在一些实施方案中，所述宿主细胞为植物细胞或原核生物细胞；在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞。

在又一方面，本发明还提供了产生转基因作物的方法，其特征在于，用上述表达载体或上述宿主细胞转化作物，得到转基因作物。

在又一方面，本发明还提供了产生转基因种子的方法，其特征在于，从上述方法产生的转基因作物产生转基因种子。

在又一方面，本发明还提供了上述蛋白、核酸、基因表达盒、表达载体、宿主细胞、方法在减小作物叶夹角中的应用。在一些实施方案中，所述作物为水稻。

附图说明

图1 OsDRM2基因结构和突变体T-DNA插入位置示意图。方框表示外显子，线段表示内含子，ATG标识起始密码子，TAG标识终止密码子，LB和RB代表T-DNA区的左右边界，P1、P2、P3、RT标识突变体分子检测的引物位置。

图2 突变体分子检测结果。（A）突变体的基因型检测；（B）OsDRM2基因转录水平表达分析；（C）OsDRM2蛋白表达检测。WT：野生型水稻；osdrm2：OsDRM2基因突变体。

图3 突变体叶夹角性状展示。（A）野生型和突变体水稻株型差异；（B）野生型和突变体水稻叶夹角性状局部图。WT：野生型水稻；osdrm2：OsDRM2基因突变体。

图4 pUDRM21301载体图。各元件英文及各缩写含义列举如下：

CaMV35S ployA	花椰菜花叶病毒<i>35S polyA</i>终止子
		GUS	β-葡萄糖苷酸酶基因
CaMV35S promoter	花椰菜花叶病毒<i>35S</i>启动子
		Terminator	胭脂碱合成酶终止子
DRM2	<i>DRM2</i>基因
		Ubiquitin promoter	玉米泛素启动子
CaMV35S promoter	花椰菜花叶病毒<i>35S</i>启动子
		Hygromycin	潮霉素抗性基因
CaMV35S ployA	花椰菜花叶病毒<i>35S polyA</i>终止子
		T-border(right)	T-DNA区右边界序列
kanamycin(R)	卡那霉素抗性序列
		pBR322 ori	pBR322起始区
pBR322 bom	pBR322骨架区
		pVS1 rep	pVS1复制子
pVS1 sta	pVS1转录起始区
		T-Border(left)	T-DNA区左边界序列

图5 超表达材料OsDRM2基因表达检测。WT：野生型水稻；OX-1、OX-2：不同的OsDRM2基因超表达植株。

图6 超表达材料叶夹角性状展示。WT：野生型水稻；OXDRM2：OsDRM2基因超表达植株。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，所述“水稻”是指水稻（Oryza sativa），包括所有可与水稻繁殖的植物品种，包括野生稻种以及那些属于稻属的允许物种间繁殖的植物。

除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB 生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物（例如，肽核酸），所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然（非合成）内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽（统称“蛋白”）的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。

“转基因”是指其基因组因异源核酸（诸如重组DNA构建体）的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件（诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变）进行的基因组（染色体或染色体外）改变。

“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。

阴性或对照植物可以包括，例如：（a）野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；（b）与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体（即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体）转化的植物或植物细胞；（c）是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；（d）与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或（e）受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff 等人（1978）Atlas of Protein Sequence andStructure（蛋白序列和结构图集）（Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C）（通过引用并入本文）的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群（即基因组文库或cDNA 文库）。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA 片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度（例如，背景的至少2倍、5倍或10倍）与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列（同源探针法）。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度（异源探针法）。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5 M Na离子，通常约0.01 M至1.0 M Na离子浓度（或其它盐），并且温度条件为：当用于短探针时（例如10到50个核苷酸），至少约30℃；当用于长探针时（例如大于50个核苷酸），至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1 M NaCl、1％SDS（十二烷基硫酸钠）杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC（20×SSC=3.0 M NaCl/0.3 M柠檬酸三钠）中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0 M NaCl、1％ SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1 M NaCl、1％ SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm（热力学熔点）可以近似自Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284的公式：Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M 是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L 是杂合体的碱基对长度。Tm是（确定的离子强度和pH 下）50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥ 90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(Sambrook J& Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 水稻OsDRM2基因突变体的分子和表型鉴定

本发明对来自于Postech 水稻突变体库的OsDRM2基因插入突变体PFG_3A-04110进行了分子和表型鉴定。

首先在插入位点两侧基因组和T-DNA载体上设计3条引物，分别为P1（SEQ ID NO.3）、P2（SEQ ID NO. 4）、P3（SEQ ID NO. 5），引物位置见图1。利用P1+P2和P2+P3的引物对组合鉴定T-DNA载体是否插入在OsDRM2基因中以及插入基因型。操作过程为：取水稻突变体PFG_3A-04110和野生型水稻品种Dongjing的叶片，抽提基因组DNA，分别利用P1+P2和P2+P3引物对进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。其中，扩增体系为：基因组DNA：3 μL，双向引物各1 μL，2×TaqMix：7.5 μL，ddH₂O：2.5 μL，总体积10 μL。PCR反应条件如下：95℃，5min；（94℃，30 sec；58℃，30 sec；72℃，30 sec）×35循环；72℃，10 min；4℃保存。检测结果见图2A。P1+P2扩增出的条带为没有T-DNA插入的野生型基因型，P2+P3扩增出的条带为有T-DNA插入的突变体基因型，因此，P1+P2扩增出条带而P2+P3未扩增出条带的样品来自于野生型水稻Dongjing（WT），P2+P3扩增出条带而P1+P2未扩增出条带的样品来自于纯合突变体水稻（osdrm2），P1+P2和P2+P3均扩增出条带的样品来自于杂合突变体水稻（+/-）。

进一步对突变体中OsDRM2基因的表达进行分析，其中转录水平表达分析采用RT-PCR方法进行鉴定。步骤包括：

1、RNA提取。1）将25-50 mg左右组织放入匀浆器内，加1 mL Trizol试剂匀浆，转入1.5mL的离心管中。2）2~8℃、12000g离心15 min后，将上清液转入新的离心管中。3）上清液在室温温育5 min后，然后以每1 mL Trizol试剂加入0.2 mL比例加入氯仿，盖紧离心管，涡旋仪剧烈摇荡离心管15sec，室温下温育2~3 min。3）2~8℃、12000 g离心15 min，混合物分层，下层为红色的酚-氯仿层，上层为无色的水相（RNA在水相中）。4）用枪头将水相转移到新的离心管中，按1 mL Trizol液加0.5 mL异丙醇的比例加入异丙醇沉淀RNA室温温育10 min。5）2~8℃、12000 g离心10 min。6）去除上清，按1 mL Trizol液加入至少1 mL的比例加入75%乙醇洗涤，涡旋振荡样品，2~8℃、7500 g 离心5 min。7）小心弃去上清液，然后空气或真空干燥5~10 min，加30-40 μL无RNA酶的（RNase-free）水，用枪头吸几次后于55~60℃下温育10min，溶解RNA。8）电泳检测：从提取的总RNA中取2 -5 μL进行电泳检测。

2、反转录PCR。1）DNA酶处理，按照Invitrogen公司DNase1 Amplification GradeKit说明书操作。2）cDNA第一条链的合成，按照罗氏Transcriptor First Strand cDNASynthesis试剂盒说明书操作。3）PCR。使用水稻内参基因Actin1作为内参，设计引物SEQ IDNO. 6和SEQ ID NO. 7，并设计OsDRM2基因的表达检测引物SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9，分别进行PCR扩增。PCR程序为：95℃，5 min；（94℃，30 sec；58℃，30 sec；72℃，30 sec）×35循环；72℃，10 min；4℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

鉴定结果见图2B。内参基因Actin1在野生型WT和突变体Osdrm2样品中均能够扩增出条带，但是OsDRM2基因仅能在野生型WT样品中扩增出条带，在Osdrm2样品中不能够扩增出条带，表明Osdrm2突变体中OsDRM2基因不能正常转录。

再利用OsDRM2蛋白抗体Anti-OsDRM2结合Western blot实验检测突变体中的蛋白表达情况。操作步骤为：

1、蛋白提取。1）待测样品在田间收集后用冰袋保存带回实验室，按不同组织称重混合好后放入2mL离心管中，每个离心管放入两颗钢珠，按比例加入提取液。2）打样机打样，每次1000-1500 rpm，1.5 min，至匀浆状态。3）4℃ 10000 rpm离心5 min，取上清，再4℃ 10000rpm离心5 min。4）取上清分装后冻存于-80℃冰箱，备用。

2、蛋白电泳。取蛋白提取液经80V/100VSDS-PAGE凝胶电泳分离。每个泳道上样的总蛋白量相同。3、转膜。1）裁剪与凝胶表面积等同大小的硝酸纤维尼龙膜，在转膜液中浸泡5 min；准备与凝胶表面积等同大小的10层过滤纸，在转膜液中浸泡5 min。3）将Bio-rad杂交装置置入转膜液中，在石墨层上覆盖5层过滤纸，再依次放置胶和膜，上面再覆盖5层过滤纸，夹好石墨层。注意每层之间都无气泡存在，确保胶和膜的位置相互覆盖并无移位。将装置放入电泳槽，在电泳槽中添加冰袋，电泳槽外覆盖冰水混合物以降温。380 mA恒流转膜1h。

4、封闭。1）使用1×TBS-Tween缓冲液快速冲洗膜一遍，5%（w/v）封闭液在室温摇床上孵育膜1 h。2）1×TBS-Tween缓冲液快速冲洗膜一遍。加入按比例稀释好的一抗，室温下杂交1.5 h。使用1×TBS-Tween缓冲液清洗膜4次。3）加入按比例稀释好的二抗，室温下杂交1.5 h，使用1×TBS-Tween缓冲液清洗膜4次。

5、显色。1）吸取2 mL NBT/BCIP显色液，温和添加至膜上，在塑料盒中孵育1min。确保膜与塑料盒间无气泡。2）倒掉多余显色液，用双蒸水冲洗已经显色完毕的膜。

鉴定结果见图2C。野生型WT和突变体Osdrm2样品中均能够看到考马斯亮蓝染色的Rubisco条带，但是Anti-OsDRM2抗体仅能在野生型WT样品中标记出条带，在Osdrm2样品中不能够标记出条带，表明Osdrm2突变体中OsDRM2蛋白也是不表达的。

以上结果表明，Osdrm2突变体中的OsDRM2基因因T-DNA载体的插入而无法正常表达。

通过对Osdrm2突变体的表型鉴定，发现Osdrm2突变体水稻的叶夹角相对于野生型（WT）水稻的叶夹角更大。叶夹角性状的照片见图3。对突变体和野生型材料的叶夹角性状进行测量，结果表明，野生型材料的叶夹角为24.72±3.31°，而Osdrm2突变体中的叶夹角会增加到86.12±2.45°。结果见表1。这表明OsDRM2基因的失活能够造成水稻叶夹角增大的结果。

表 1： Osdrm2突变体的叶夹角性状表现

材料	调查单株	叶夹角（°）
			WT野生型	10	24.72±3.31 b
<i>Osdrm2</i>突变体	10	86.12±2.45 a

采用LSD法检测叶夹角数据的差异显著性（α=0.05）。

实施例2 利用OsDRM2蛋白减小水稻叶夹角

叶夹角是影响水稻株型的重要性状，而理想的株型是水稻提高产量的决定因素。在水稻的理想株型中，叶片直立是对增产非常有利的性状。叶片直立可提高冠层光合速率，改善群体下部光照，增加物质生产量；同时增加冠层基部光量，增强根系活力，提高抗倒性；且利于密植，提高单位土地面积上的净光合速率。通过密植具有直立叶片的水稻品种可以达到增产的目的。实施例1的结果显示，OsDRM2基因的失活以及OsDRM2蛋白含量的降低能够造成水稻叶夹角增大的结果，因此提高水稻中OsDRM2基因的表达以及增加OsDRM2蛋白含量则可以起到相反的作用（减小水稻叶夹角）。

本发明为了增加水稻中OsDRM2蛋白的含量，构建了OsDRM2基因超表达载体，并将该载体通过农杆菌介导法转入野生型水稻品种Dongjing中。

1、超表达载体的构建。

根据OsDRM2的全长cDNA序列设计引物（SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11）PCR扩增得到OsDRM2核苷酸序列（如SEQ ID NO. 2所示），然后用一步法构建到超表达pU1301-3×FLAG骨架载体上得到pUDRM2载体。载体图谱见图4。

2、水稻遗传转化。

本发明采用农杆菌介导法将OsDRM2基因表达载体转入水稻，所用农杆菌菌株为EHA105。水稻种子消毒后诱导愈伤，然后与农杆菌共培养以感染愈伤，通过选择培养筛选被转化的愈伤，之后在选择培养基上进行植株再生。具体过程如下：

1）诱导水稻愈伤组织：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，放入100 ml无菌烧杯中，倒入70%酒精（15 ml）消毒2 min；倒去酒精，加入100 ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30 min；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30 min。将种子放在无菌滤纸上吸干，置入成熟胚诱导培养基中，每皿20-30颗；操作完毕用封口膜（MicroporeTM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱培养。在暗培养条件下诱导愈伤组织，需要7～10天；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃暗培养1周继代。

2）农杆菌培养：挑取转化有目的表达载体的农杆菌单克隆于15 ml YEP培养液中（含相应的抗生素），28℃，250 rpm振荡培养12～16 h至菌液OD600为0.8-1.0。

3）共培养和抗性愈伤组织的选择：将培养好的菌液于室温下，4000 rpm离心10min，去上清。将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液，水平摇床上80 rpm共培养30 min；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40 min；将愈伤组织置于有一张无菌滤纸的共培养基上，25℃暗培养3天。

4）选择培养：愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停振荡。再用含300mg/L羧苄青霉素钠（Carb）的无菌水清洗2遍，每次在水平摇床上摇晃30 min，最后置于无菌滤纸上沥干2小时。将晾干的愈伤转入含300 mg/L羧苄青霉素钠（Carb）和相应筛选压力的选择培养基上，28℃暗培养14天，共进行两轮选择，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。

5）抗性愈伤组织的诱导分化和生根：挑取从不同愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-5颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中，用封口膜封好，放入恒温（25℃）培养室中（16h/8 h），等待分化成苗（约40天）。待苗长至3 cm左右，用剪刀从苗基部剪去老根和愈伤组织，放入生根培养基中壮苗（约1周）。

6）炼苗移栽：将苗根部和茎叶分化完好的试管挑出，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水（防止培养基长菌），炼苗2～3天，然后洗去琼脂，移栽苗到温室土钵中，检测转基因植株阳性。并检测转基因植株中OsDRM2基因的表达量，检测方法参照实施例1。结果见图5。OsDRM2基因在超表达材料（OX-1和OX-2）中的表达量相对于野生型有显著的升高。

3、超表达水稻材料的叶夹角性状表现。

通过对OsDRM2基因超表达材料（OXDRM2）的叶夹角性状进行鉴定，发现OXDRM2水稻的叶夹角相对于野生型（WT）水稻的叶夹角更小，株型更加紧凑，更加适合密植。叶夹角性状的照片见图6。对超表达和野生型材料的叶夹角性状进行测量，结果表明，野生型材料的叶夹角为24.72±3.31°，而OXDRM2超表达水稻中的叶夹角会减小到19.94±1.43°，结果见表2。这表明OsDRM2基因超表达确实能够减少水稻叶夹角。

表2： OsDRM2超表达材料的叶夹角性状表现

材料	调查单株	叶夹角（°）
			WT野生型	10	24.72±3.31 a
OXDRM2超表达	10	19.94±1.43 b

采用LSD法检测叶夹角数据的差异显著性（α=0.05）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种可减小作物叶夹角的蛋白及其应用

<130> 11

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 507

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Gln Ala Ile Gly Gly Asp Ala Ser Val Gly Asn Cys Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ala Cys Ala Pro Gln Thr Leu Glu Val Asp Glu Glu Glu Asp Asp Thr

20 25 30

Asn Trp Asp Glu Tyr Asp Thr Ala Gly Asn Cys Asp Arg Thr Pro His

35 40 45

Ser Asp Gly Ser Gly Asp Glu Asp Phe Phe Gln Glu Met Ser Glu Lys

50 55 60

Asp Glu Lys Met Lys Ser Leu Val Asn Met Gly Phe Pro Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Lys Met Ala Ile Asp Arg Cys Leu Asp Ala Pro Val Ala Val Leu

85 90 95

Val Asp Ser Ile Tyr Ala Ser Gln Glu Ala Gly Asn Gly Tyr Ser Ala

100 105 110

Asn Leu Ser Asp Tyr Glu Asp Thr Glu Phe Ser Ser Phe Gly Gly Arg

115 120 125

Lys Lys Thr Arg Phe Val Asp Gly Ser Lys Lys Arg Lys Arg Tyr Gly

130 135 140

Ser Gly Pro Ser Gly Asn Gln Val Pro Phe Asp Gly Ser His Glu Glu

145 150 155 160

Pro Met Pro Leu Pro Asn Pro Met Val Gly Phe Ser Leu Pro Asn Glu

165 170 175

Arg Leu Arg Ser Val His Arg Asn Leu Pro Asp Gln Ala Leu Gly Pro

180 185 190

Pro Phe Phe Tyr Tyr Glu Asn Val Ala Leu Ala Pro Lys Gly Val Trp

195 200 205

Thr Thr Ile Ser Arg Phe Leu Tyr Asp Ile Gln Pro Glu Phe Val Asp

210 215 220

Ser Lys Tyr Phe Cys Ala Ala Ala Arg Lys Arg Gly Tyr Ile His Asn

225 230 235 240

Leu Pro Ile Glu Asn Arg Ser Pro Val Leu Pro Met Pro Pro Lys Thr

245 250 255

Ile Ser Glu Ala Phe Pro Asn Thr Lys Arg Trp Trp Pro Ser Trp Asp

260 265 270

Pro Arg Arg Gln Phe Asn Cys Leu Gln Thr Cys Met Ala Ser Ala Lys

275 280 285

Leu Thr Glu Arg Ile Arg Cys Ala Leu Gly Arg Phe Ser Asp Val Pro

290 295 300

Thr Pro Gln Val Gln Lys Tyr Val Leu Asp Glu Cys Arg Lys Trp Asn

305 310 315 320

Leu Val Trp Val Gly Lys Asn Lys Val Ala Pro Leu Glu Pro Asp Glu

325 330 335

Met Glu Phe Leu Leu Gly Tyr Pro Arg Asn His Thr Arg Gly Val Ser

340 345 350

Arg Thr Glu Arg Tyr Arg Ala Leu Gly Asn Ser Phe Gln Val Asp Thr

355 360 365

Val Ala Tyr His Leu Ser Val Leu Arg Asp Leu Phe Pro Asn Gly Met

370 375 380

Asn Val Leu Ser Leu Phe Ser Gly Ile Gly Gly Ala Glu Val Ala Leu

385 390 395 400

His Arg Leu Gly Ile His Met Lys Thr Val Ile Ser Val Glu Lys Ser

405 410 415

Glu Val Asn Arg Thr Ile Leu Lys Ser Trp Trp Asp Gln Thr Gln Thr

420 425 430

Gly Thr Leu Ile Glu Ile Ala Asp Val Arg His Leu Thr Thr Glu Arg

435 440 445

Ile Glu Thr Phe Ile Arg Arg Phe Gly Gly Phe Asp Leu Val Ile Gly

450 455 460

Gly Ser Pro Cys Asn Asn Leu Ala Gly Ser Asn Arg His His Arg Asp

465 470 475 480

Gly Leu Glu Gly Glu His Ser Ala Leu Phe Tyr Asp Tyr Ile Arg Ile

485 490 495

Leu Glu His Val Lys Ala Thr Met Ser Ala Val

500 505

<210> 2

<211> 2066

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

ggactgggct tcagatagcg acaatgataa gttcgagtgg gacacagacg gtgaggctga 60

gacctcatct gccccggccc taaggaacat agatgctcct ggtccgtcca cgaggctgcc 120

gcaggtagga gatagaggtc tatctttgaa cacacgtgct agtcatttgt tcaaaccatg 180

ttgttacttt actgtaatta taatcaaaat gtggtgtttg tttgtggaac tgtctgaagg 240

atgcaaatgg gaaggccaac gggtcaggtg ctttggttgc tgaatttatg ggaatgggat 300

tcccaaaaga aatgatcttg aaagcgatta aggagattgg taacgataac aataatctag 360

ttctcttatt tgcttctggt tgcattttga atcttctgtt tcaactgctg tcttttcttt 420

caggggatac agatacagag caattgcttg agttacttct gacttatcag gtatttgccc 480

acatggttgc atcactctgt ttattattat ctaatgctct actgtacaag tgatgccgtg 540

taatgcaggc aataggcggt gacgcttcag tgggtaactg ctctgcttcg gcctgtgccc 600

cccagactct tgaagtcgac gaggaggagg atgatactaa ttgggatgaa tatgatactg 660

ctggcaattg tgacaggact cctcactctg atggttctgg tgacgaggat ttctttcaag 720

aaatgtcaga gaaggatgaa aaaatgaagt ccttagtcaa catgggtttt cctgaagatg 780

aagcaaagat ggctatcgat agatgtctcg atgcgcctgt agcagtgttg gttgattcaa 840

tctatgcatc acaggaagca ggaaatggtt actctgcaaa cttatctgac tatgaggata 900

cagagttcag ttcctttgga ggaagaaaga aaacaagatt tgtggatgga agcaagaaga 960

gaaagcggta tggaagtggg ccatctggga atcaagtgcc gtttgatggc agccacgaag 1020

agcccatgcc tcttccaaat ccaatggtgg gattcagctt gcccaatgag aggttaaggt 1080

cagtccacag aaatcttcct gaccaagctc ttgggccacc attcttttac tatgaaaacg 1140

tggccctagc tccaaaaggt gtatggacaa ccatctcaag gtttttatat gacattcagc 1200

ctgagtttgt ggactccaag tacttttgtg ctgctgccag gaagaggggt tatattcata 1260

acctgccgat tgagaacagg tcacctgttc tcccaatgcc tcccaaaaca atatctgaag 1320

cctttcctaa taccaagagg tggtggcctt cctgggatcc aaggaggcag ttcaactgct 1380

tgcaaacttg tatggcaagc gcaaagctta cagagcgaat tcgttgtgct ttgggtagat 1440

tcagtgatgt accaactcca caagttcaga agtatgtctt ggacgaatgt aggaaatgga 1500

acctagtttg ggtcggaaag aataaggtcg ctcctctaga gcctgatgag atggagttcc 1560

tgttagggta ccctagaaac cacactaggg gagttagcag gacggagagg tacagggctc 1620

tcgggaattc attccaagtt gatacagtag cataccatct ctctgtgctg agggacctgt 1680

ttcccaatgg aatgaatgtc ttatccctgt tttctggtat tggaggagca gaggtagctc 1740

tccacagact ggggatacat atgaaaacag tgatctctgt tgagaaatca gaagtgaaca 1800

gaacgattct gaagagctgg tgggatcaga cacaaactgg aacgctgatt gaaatcgccg 1860

acgtgcggca tcttactact gaaagaattg aaacattcat cagaaggttt ggcggttttg 1920

acctggtgat tggtggcagc ccgtgcaaca accttgctgg cagcaaccgc catcaccgag 1980

atggtctgga gggcgagcac tccgcgctct tctacgatta cattagaata ttagaacatg 2040

taaaggctac catgtcagca gtctag 2066

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 3

tatgcatcac aggaagcagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 4

gtaatcgtag aagagcgcgg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 5

ctagagtcga gaattcagta ca 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 6

tgaagatcaa ggtggtggca c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 7

tgctggaccc gactcatcat a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 8

agaaggtttg gcggttttga c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 9

aatcgtagaa gagcgcggag t 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 10

ggactgggct tcagatag 18

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(unknown)

<400> 11

ctagactgct gacatggtag cct 23

Claims

1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；或者，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与SEQ ID NO. 1所示的序列相同功能的序列。

2.核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的蛋白；任选地，所述的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.基因表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权利要求2所述的核酸序列；任选地，所述核酸与ubiquitin启动子和nos终止子可操作地连接。

4.表达载体，其特征在于，含有权利要求3所述的表达盒；任选地，所述载体还包含CaMV35S:hygromycin:CaMV35S polyA表达盒。

5.宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的表达载体；任选地，所述宿主细胞为植物细胞或原核生物细胞；任选地，所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞。

6.产生转基因作物的方法，其特征在于，用权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的宿主细胞转化作物，得到转基因作物。

7.产生转基因种子的方法，其特征在于，从权利要求6所述方法产生的转基因作物产生转基因种子。

8.权利要求1、权利要求3至权利要求7所述的蛋白、基因表达盒、表达载体、宿主细胞、方法在减小作物叶夹角中的应用；任选地，所述作物为水稻。

9.权利要求2所述的核酸在减小作物叶夹角中的应用；任选地，所述作物为水稻。