CN105543188B

CN105543188B - 一种高耐受草甘膦的epsp合酶及其应用

Info

Publication number: CN105543188B
Application number: CN201610090318.2A
Authority: CN
Inventors: 陆伟; 燕永亮; 战嵛华; 周正富; 柯秀彬; 张维; 陈明; 林敏�
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Longping Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd.
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2016-02-18
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2036-02-18
Also published as: CN105543188A

Abstract

本发明从细菌中克隆到一种高耐受草甘膦的EPSP合酶，为具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。通过实验证实了它具有高草甘膦耐受性；并且转入植物后，可导致植物对草甘膦耐受能力。

Description

一种高耐受草甘膦的EPSP合酶及其应用

技术领域：

本发明涉及一种5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶及其高耐受草甘膦除草剂的用途。

背景技术：

草甘膦是世界上使用最广泛的除草剂品种之一。研究发现，草甘膦通过竞争性结合EPSPS(5’-烯醇式丙酮芒草酰-3-磷酸合酶)从而阻断莽草酸代谢途径，造成植物无法合成芳香族氨基酸及其衍生物，以及莽草酸积累，导致植物死亡。由于自然界中绝大部分植物体内EPSP合酶均属于草甘膦敏感型，因此草甘膦除草剂具有十分优秀的广谱性。但是自然界微生物群体的多样性造就微生物中EPSP合酶的多样性，部分微生物体内EPSP合酶对草甘膦不敏感，利用基因工程技术将草甘膦不敏感EPSP合酶转入目标植物中以替代内源敏感型EPSP合酶，将使该植物获得草甘膦除草剂抗性。

抗草甘膦转基因植物的研究开发对农业发展可起到巨大推进作用，而不同作物对导入的EPSP合酶编码基因可能会产生不同的EPSP合酶表达能力，因此，为选育新的高抗草甘膦的转基因作物，本领域迫切需要开发新的抗草甘膦的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(以下亦简称为“EPSP合酶”或“EPSPS”)及获得该合酶的方法。

本发明的另一目的是提供编码该合酶的多核苷酸序列；

本发明的又一目的是提供所述合酶及其编码序列在提高植物对草甘膦耐受性方面的用途。

本发明的第一方面，发明人从草甘膦污染土壤中分离一株高耐受草甘膦的细菌并从该菌中克隆到高耐受草甘膦的EPSP合酶，为具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

本发明人经过广泛而深入的研究，从细菌中分离获得了一种新的EPSP合酶，通过实验证实了它具有高草甘膦耐受性，并且转入植物后，可导致植物对草甘膦耐受能力。

本发明的第二方面，提供了编码上述具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的所述EPSP合酶的多核苷酸，所述多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO:1中1-1281位的序列；

(b)具有SEQ ID NO:1中1-1284位的序列。

本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备所述EPSP合酶的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。

在本发明的第六方面，提供了一种改变植物抗草甘膦耐受性的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合酶DNA编码序列，所述的EPSP合酶具有SEQ ID NO:2氨基酸序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使EPSP合酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入EPSP合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

在本发明中，术语“EPSPS”、“EPSP合酶”、“EPSP合成酶”、“EPSP多肽”或“5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶”可互换使用，都指具有5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括EPSP合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然EPSP合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“EPSP多肽”指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括但并不限于：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EPSPS DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EPSP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有EPSP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供EPSP合酶或多肽的类似物。这些类似物与天然EPSP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。

在本发明中，“EPSP合酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EPSP合成酶的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的EPSPS核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组法的方法获得。例如首先根据SEQ ID NO:1的序列进行全序列合成。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用人工合成的EPSPS核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EPSP合酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，如采用Science，1984；224：1431公开的方法，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的EPSP多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码EPSP多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，EPSP合酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EPSP合酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染方法、磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得草甘膦抗性提高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

另一方面，本发明还包括对本发明的EPSP合酶DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与EPSP合酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制EPSP合酶的分子，也包括那些并不影响EPSP合酶功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的EPSP合酶基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的EPSP合酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达EPSP合酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用EPSP合酶基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与EPSP合酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗EPSP合酶的抗体可用于检测样品中的EPSP合酶。

多克隆抗体的生产可用EPSP合酶或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明还涉及定量和定位检测EPSP合酶水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测样品中是否存在EPSP合酶的方法是利用EPSP合酶的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与EPSP合酶特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EPSP合酶。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用EPSP合酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测EPSP合酶的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从一株高耐受草甘膦除草剂菌株中分离并人工全合成的。其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1284个碱基，其开放读框位于1-1281位，编码全长为427个氨基酸的EPSP合酶(SEQ ID NO:2)。本发明的该EPSP合酶被简称为“KO1-EPSPS”。

本发明的EPSP合酶具有如下主要特点：

A)首次明确该EPSP合酶具有草甘膦耐受能力；

B)草甘膦耐受性功能明确，且显示了相对较高的草甘膦耐受能力。

本发明的EPSP合酶为改变植物耐受草甘膦除草剂提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以通过将EPSP合酶的编码基因导入，改变现有优良农作物品种的草甘膦耐受性，可获得耐受草甘膦的大豆、玉米、小麦、水稻或其它农作物品种，解决农业生产中存在的实际问题。

附图说明

图1是KO1-EPSPS蛋白表达及纯化SDS-PAGE电泳图，其中：

M：蛋白标尺；

1：超声波处理后离心上清液；

2：过Ni-NTA纯化柱后溶液；

3：NTA-10洗脱液；

4：NTA-50洗脱液；

5：NTA-200洗脱液)；

图2是高耐受草甘膦的KO1-EPSP合酶植物表达框；

图3是转基因油菜草甘膦耐受实验结果，其中

A：转KO1-EPSPS油菜T1；

B:对照非转基因油菜亲本。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1高耐受草甘膦的EPSP合酶基因克隆

1、草甘膦极端污染环境中土壤样品的采集

自然环境中特别是在长期使用草甘膦等除草剂地区的土壤中，存在种类繁多的能耐受草甘膦或其它除草剂的细菌菌株。因此从被草甘膦污染的土壤中采集样品。取表层下2厘米-10厘米土壤样品用于细菌菌株筛选。

2、高耐受草甘膦细菌菌株的筛选和鉴定

称取草甘膦污染土壤样品5克置于50mL含20mL无菌水三角瓶中室温剧烈震荡15分钟，静止1分钟后取200uL上清液涂布于含100mM、200mM草甘膦的R2A培养基平皿上，28℃培养1-3天，期间观察平皿中菌落生长情况。挑取平皿中生长的菌落以划线形式接入新的含100mM、200mM草甘膦的R2A培养基平皿上，28℃培养1-3天，期间观察平皿中菌落生长情况。挑取单菌落重复上述培养过程。为保证菌种单一应至少重复上述菌株转接、培养过程3次。选取在含200mM草甘膦平皿上生长最好的一株菌暂命名为KO1

3、菌株基因组测序与EPSP合酶基因鉴定

将KO1菌株提供给测序公司利用illumina公司的Solexa进行全基因组测序。利用Glimar3.0软件将该菌基因组序列与美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的NR库进行比较分析并注释。找到一个EPSP合酶编码基因同源的ORF，长度为1284bp，定名为KO1aroA，其编码蛋白定名为KO1-EPSPS。

(1)引物设计与PCR扩增

以KO1aroA序列为模板设计PCR扩增引物。引物设计如下：

KO1-aroA(F):GGCATATG ATGGAATCCCTGACGTTACAAC(SEQ ID NO:X)；

NdeI

KO1-aroA(R):GGCTCGAG TCAGGCCGGCGTACTGATTC(SEQ ID NO:X)；

XhoI

以KO1菌的基因组DNA为模板，以上述引物为引物，进行PCR反应。PCR反应程序如下(30个循环)：94℃预变性DNA 5min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸60S。30个循环后72℃补充延伸10min。

(2)PCR产物片段克隆

用Promega公司pGEM-T Vector Systems对PCR产物进行克隆，连接产物(KO1aroA-T)转化E.coli JM109中，在含Amp^r(50μg/ml)/IPTG/X-gal的LB平板上筛选白斑，碱解法提取质粒，用NdeI和XhoI双酶切分析插入片段的大小。

连接反应按以下所示体积进行连接反应：

轻轻混匀，4℃过夜连接。

(3)KO1-EPSPS蛋白表达载体的构建与功能验证

酶切验证正确的重组子进行测序分析，测序结果证明PCR产物具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。用NdeI和XhoI酶切消化KO1aroA-T和蛋白表达载体pET28a(Novagen)，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收相应条带，用凝胶回收试剂盒分别回收KO1aroA和pET28a DNA片段后进行连接反应，获得链接产物pET-KO1-EPSPS。将连接产物转化EPSP合酶缺陷型大肠杆菌ER2799(购自NEB公司)，涂布在含Kan^r(50μg/ml)LB固体平板上，用牙签点取所有的转化子到草甘膦20mmol/L M9固体培养基上，观察生长情况。结果发现，转化pET-KO1-EPSPS后，ER2799(pET-KO1-EPSPS)能够在限制性培养基M9固体平板上生长，表明KO1-EPSPS能够回补ER2799菌株缺失的EPSP合酶功能，说明KO1-EPSPS具有完整的EPSP合酶的功能。

实施例2KO1-EPSPS草甘膦耐受能力检测

将质粒pET-KO1-EPSPS转化大肠杆菌BL21(DE3)获得KO1-EPSPS蛋白表达菌株BL21(KO1-EPSPS)。以大肠杆菌BL21(DE3)为对照，37℃培养48小时。观察其在不同草甘膦浓度(20至250mM)的M9培养基中生长情况。

结果见表1。

表1 在原核生物中KO1-EPSPS草甘膦耐受能力实验

20mM

50mM

100mM

150mM

200mM

250mM

BL21(KO1-EPSPS)

++++

+++

+

BL21(DE3)

+

-

实验结果显示：含KO1-EPSPS大肠杆菌能够在含250mM草甘膦的M9培养基上生长。

实验结论：KO1-EPSPS具有极高的草甘膦耐受能力。

实施例3KO1-EPSPS蛋白表达与纯化

含pET-KO1-EPSPS蛋白表达质粒的大肠杆菌BL21(KO1-EPSPS)接种于10mL含Kan^r100μg/mL LB液体培养基中，于37℃活化过夜后，按2％比例取液加入到20mL含Kan^r 100μg/mL LB液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀值为0.6，加入IPTG至终浓度为0.75mmol/L，继续于37℃，220rpm培养2h。随后将培养液加入到离心管中4℃，6,000xg离心5分钟，收集菌体加入1/20体积的NTA-0Buffer悬浮细胞，加入200μL溶菌酶(0.4mg/mL)，冰浴30min进行低温超声破碎，振幅25％，间隔2sec，超声3sec，10-15个循环，或至溶液变得清亮；加入10μL DNase I，降低细胞DNA引起的粘稠度，冰浴10min；10,000xg，4℃离心30min，分别收集上清和沉淀，存放于-70℃冰箱备用。

Ni-NTA resion纯化程序：

(1)将Ni-NTA树脂装入层析柱，用10倍树脂体积的NTA-0缓冲液平衡Ni-NTA树脂；

(2)将制备好的蛋白样品加入层析柱，控制流速(约15mL/h)，收集流出液(用于鉴定蛋白挂柱效率)，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结合情况；

(3)用5倍树脂体积含不同浓度咪唑的NTA缓冲液(咪唑梯度0,20,40,60,80,100,200mM)梯度洗脱，分别收集洗脱液；

(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳确定融合蛋白最佳洗脱缓冲液的浓度。

结果详见图1，为KO1-EPSPS蛋白表达及纯化SDS-PAGE电泳图。

实施例4KO1-EPSPS的酶动力学参数的测定

本实验方法参照Ming He et al.,Biochimica et Biophysica acta 151568(2001)1-6，具体操作如下：

(a)测定方法

无机磷标准曲线：10mM无机磷标准液按1:10稀释，分别取0、1、2、3…20μl于1.5mlEppendorf离心管中，加入milli-Q纯水至100μl混匀，加入MAT溶液0.8ml混匀，计时三分钟后加入34％SC溶液100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD₆₆₀值。重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD₆₆₀值为纵坐标作图得到无机磷标准曲线。

酶活测定：酶粗提物蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法(Bradford,1976)。在冰上于1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μl，10mM S3P溶液2μl，0.5M HEPES溶液2μl，1mM(NH4)6MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl和milli-Q纯水12μl混匀，于28℃温浴5min后各管样品间隔2s加入1μl粗酶液并计时，2min后再间隔2s依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl 34％SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD₆₆₀值。对照除不加酶液外，其余同样品管。样品管与对照管的OD₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到该酶的酶活力(U/mg)。

Km(PEP)测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度(0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM)下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S](Eadic-Hofstee)法作图。

Ki(glyphosate)测定：在不同草甘膦浓度(0、10、50、100μM)下测定PEP浓度为66.7、100、200、500μM时EPSPS的酶反应速度。采用双对数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为Ki(glyphosate)值。

(b)结果

KO1-EPSPS的酶活性为8.11±0.15U/mg。

表2 KO1-EPSPS的酶动力学参数

根据上表中KO1-EPSPS的动力学参数可知，KO1-EPSPS不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性。

实验结论：

KO1-EPSPS可用于培育转基因抗草甘膦除草剂作物。

实施例5高耐受草甘膦的KO1-EPSP合酶基因植物表达载体的构建

高耐受草甘膦的EPSP合酶基因植物表达载体构建的具体方法如下：

A.植物表达框设计：

见图2高耐受草甘膦的KO1-EPSP合酶植物表达框。

植物表达框按图2设计，CaMV35S启动子接拟南芥EPSP合酶叶绿体转运肽(CTP)接KO1-EPSP合酶接NOS终止子，前后添加内切酶EcoRI和SalI。

B.人工合成上述表达框基因序列，该序列连接在T-vector上获得质粒pT-KO1EPSPS。

C.EcoRI和SalI双酶切pT‐KO1EPSPS质粒和植物表达载体pCAMBIA2300，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收相应大小DNA片段，将上述两个DNA片段进行连接反应，将KO1‐EPSPS表达框连入pCAMBIA2300，获得pCAMBIA2300‐35S‐KO1EPSPS植物表达载体，将其转化LBA4404农杆菌中，获得重组菌LBA4404(pCAMBIA2300‐35S‐KO1EPSPS)。

实施例6高耐受草甘膦转基因油菜的构建及草甘膦耐受实验

1)无菌苗的获得：油菜种子先用无菌水浸泡10min，然后用75％酒精消毒1min，随后用无菌水冲洗2～3次。再用10％NaClO消毒12min，用无菌水冲洗2～3次，接种于无激素的MS培养基上。在光照培养4～5天后，无菌的油菜幼苗用于转化。

2)预培养：剪下子叶和生长点，取紧接生长点的约0.5cm长的下胚轴，置于预培养基上培养2天。

3)含有本发明的EPSP合酶基因表达载体的农杆菌的培养：在50ml农杆菌摇菌培养基(含卡那霉素、利福平、链霉素各50mg/L)中加入LBA4404(pCAMBIA2300-35S-KO1EPSPS)菌液，220rpm，28℃振荡培养16hrs左右；室温下4000rpm，10min离心，弃上清液，菌体用MS液体培养基(含AS100uM)悬浮，稀释到原体积的5～20倍，在与上述相同的条件下培养1hr，使菌液的OD₆₀₀＝0.5左右。

4)共培养：把预培养2天的下胚轴放入LBA4404(pCAMBIA2300-35S-KO1EPSPS)菌液中轻轻震荡1min，取出放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上共培养2天(暗培养)。

5)选择培养：把共培养2天后的下胚轴放到筛选培养基上，每两周继代一次，直至长出苗。

6)生根培养：把再生苗剪下，放到生根培养基上生根。

7)将具有较好根系的转基因植株直接转到含有湿土的小盆中，并在培养室中28℃～30℃(16hrs光/8hrs暗，循环光照培养)培养2周，然后，转移这些小盆到温室中继续培养。

8)对长势良好的植株进行喷施草甘膦检测，观察植株受损情况。

9)抗性植株进一步经Southern、Northern杂交以及Westhern blot验证为转基因的抗性植株。

10)在温室中经草甘膦抗性梯度实验证明，转基因油菜能耐受0.3％草甘膦异丙胺盐水溶液处理而生长正常(结果见图3)。

Claims

1.一种高耐受草甘膦的EPSP合酶，为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。

2.权利要求1所述EPSP合酶在抗草甘膦耐受性方面的应用。

3.一种具有高耐受草甘膦功能的基因，其多核苷酸的序列选自以下：

(1)SEQ ID NO:1中1-1281位的序列；

(2)SEQ ID NO:1中1-1284位的序列。

4.权利要求3所述基因在抗草甘膦耐受性方面的应用。

5.含权利要求3所述基因的载体。

6.一种改变植物抗草甘膦耐受性的方法，包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合酶DNA编码序列，所述的EPSP合酶氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(3)选择出转入EPSP合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。