CN102876690A - 来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的epsp合酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于肺炎克雷伯氏杆菌342（Klebsiella pneumoniae 342）的EPSP合酶基因及其应用。所述的EPSP合酶基因含1284个碱基，编码氨基酸428个；其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因具有较高的草甘膦耐受性，可用于转基因作物的培育。

Description

来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因及其应用

技术领域

本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因及其应用。

背景技术

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种之一。但是该除草剂同样是一种非选择性除草剂，对农作物有着杀死作用。因此，为了在农业生产中使用草甘膦，必须培育出具有草甘膦抗性或者降解性的农作物。

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate）毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（简称EPSP合成酶）的活性。EPSP合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）生物合成过程中的一个关键酶，该酶由aroA基因编码。

目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断扩大，占全球种植转基因作物的78%以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和南非等七国的主要商品化转基因农作物。耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的62%。然而现在应用于生产的抗草甘膦基因仅有两个，且都受到专利的保护，因此发掘新型的EPSP合成酶基因对于培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因作物将是非常有必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因及应用，从而为培养新型的抗草甘膦转基因作物提供必要的理论与实验支持。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

所述的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因，含1284个碱基，编码氨基酸428个。

具体地，所述的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

所述的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因，采用人工方法合成，具体包括以下步骤：

1）抗草甘膦菌株的筛选

采集草甘膦频繁使用果园地里土壤中的样品，用0.9%（w/v）氯化钠溶液混合，之后将样品涂布与含有60mM草甘膦的LB固体培养基中培养24h。将长出来的菌株再次涂布与含有200mM草甘膦LB固体培养基中培养24h，最后将一个生长最好的菌株挑选出来进行进一步研究。

2）菌株总DNA的提取及鉴定

将上述分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基（5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH=7.5）中培养过夜（16小时），菌体培养液以6000r重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀在–20°C下冷冻1h。之后使用TE（10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH=8.0）溶液清洗一次。加入浓度为10mg/mL溶菌酶（Sigma-Aldrich）的无菌水悬浮，在37°C下摇床培养1h。加入0.5M EDTA，10%（w/v）SDS和浓度为5M的NaCl轻轻振荡混匀。再加入浓度为20mg/mL蛋白激K（Takara日本），反应物在37°C下培养1h。用与培养菌液液体体积相当1倍体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1，v/v）提取DNA。水相用与相当水相体积1/2倍体积的氯仿:异戊醇混合液（24:1，v/v）萃取，振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当1倍体积的异戊醇，振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70%（v/v）酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮，所得总DNA储存于4°C下备用。

以16SR (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和

16SF(5’-ACGGCTACCT TGTTACGACTTC-3’)为扩增引物，以菌株的DNA为模板进行16S rDNA的PCR扩增，随后对PCR产物进行凝胶回收，克隆和测序。

3）基因组文库的构建

菌株DNA用Sau3A I酶切，经琼脂糖凝胶回收2-4kbDNA片断备用。此片断经过末端去磷酸化连接到同样去磷酸化的pACYC184质粒载体。上述连接产物转入E.coli DH5α电击感受态细胞，涂布与LB固体培养基，37°C下培养24h后进行质粒大抽。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

4）筛选草甘膦抗性转化子

将上述得到的大抽质粒转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）分别涂布与含有50、100、150mM草甘膦的LB固体培养基中培养48h，发现有一个菌落能在含有150mM草甘膦的LB固体培养基上生长，即筛选得草甘膦抗性转化子。

以基因合成法【Nucleic Acids Research,2004,32,e98】克隆上述获得的转化子，设计26个引物，筛选即获得EPSP合酶基因，进行序列测定，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，全长1284个碱基；编码氨基酸428个，其序列如SEQ ID NO 2所示。

以P1(5’-gagagaccatggaatccctgacg-3’)和P2(5’-gtctcgagttcaggcgagggtact-3’)为引物，以上述获得的EPSP基因为模板进行PCR扩增。PCR产物经Nco I和Xho I酶切后连接入同样经Nco I和Xho I酶切的pET-28a载体（Novagen公司），构建质粒。然后将此质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司）转化，所得转化子用HisTrap HP kit（Amersham Biosciences）试剂盒进行蛋白表达纯化，并进行EPSP酶活测定和动力学参数的测定。

采用蘸花法【Nature Protocol,2006,(2):641-646】将上述获得的EPSP合酶基因转入拟南芥，进行草甘膦萌发试验，结果表明：所述的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，因而说明本发明的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因可应用于转化拟南芥中，这些特征为用于转基因作物的培育提供可能。

附图说明

图1为本发明的EPSP合酶的SDS-PAGE电泳图，其中1代表用HisTrap HP试剂盒纯化的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶蛋白，2代表在大肠杆菌BL21（DE3）过量表达的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶蛋白，3代表蛋白分子量MARKER。

图2为转本发明的肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因的拟南芥在含有不同浓度草甘膦平板上的萌发实验，其中，Kp2，Kp4，Kp5分别代表转本发明的EPSP合酶基因的不同的拟南芥株系；CK代表对照。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛－奥德里奇（Sigma－Aldrich）公司。

本发明涉及的分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书（J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社）

实施例1高耐受草甘膦的DNA片断克隆

1、草甘膦频繁使用水稻地里土壤样品的采集

从一年至少使用四次并且连续使用十年以上的果园的土壤中采集土壤样品。

2、抗草甘膦菌株的筛选

称取草甘膦频繁使用果园土壤样品1g，加入0.9%（w/v）氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9%（w/v）氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布与含有60mM草甘膦的LB固体培养基中培养24h。将长出来的单菌落接种与加入1.6ml LB液体培养基的试管中，28°C培养48h，然后吸取150μl的培养液再次涂布与含有200mM草甘膦的LB固体培养基中培养24h，最后将一个生长最好的菌落选出来进行进一步研究。

3、菌株总DNA的提取及鉴定

将上述分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基（5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH=7.5）中培养16h，菌体培养液以6000转/分速度离心5min，得到菌体沉淀，这些沉淀在–20°C下冷冻1h。之后使用TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0）溶液清洗一次。加入含有20μl浓度为10mg/mL溶菌酶（Sigma-Aldrich）的无菌水悬浮，在37°C下摇床培养1h。加入50μL 0.5M EDTA，50μl 10%（w/v）SDS和50μl浓度为5M的NaCl轻轻振荡混匀。再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激K（Takara日本），反应物在37°C下培养1h。用与培养菌液液体体积相当1倍体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1）提取DNA。水相用与相当水相体积1/2倍体积的氯仿:异戊醇混合液（24:1）萃取，振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当1倍体积的异戊醇，振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70%（v/v）酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮，所得总DNA储存于4°C下备用。

以抽提的总DNA为模板，利用肺炎克雷伯氏杆菌342的16sRNA特异性引物进行扩增。扩增的引物为16SR(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和16SF(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTTC-3’)。以KOD Plus（Toyobo日本）为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃120s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶（大连宝生物工程公司），72℃延伸90s，扩增片段长1500bp。PCR结束后，1%（w/v）琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物工程公司），4℃连接过夜。再将该载体转化入DH5α感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到的菌株与肺炎克雷伯氏杆菌342中的16s rRNA有99%的同源性，从而证实上述所挑选的菌株为肺炎克雷伯氏杆菌342。

4、肺炎克雷伯氏杆菌342基因组文库的构建

将上述获得的肺炎克雷伯氏杆菌342的DNA用Sau3AI酶切在10μl反应体系进行部分酶切试验，Sau3A I酶按1:100稀释，37℃分别酶切10min，20min，30min，40min，50min，60min后加入10×loading buffer 1μl终止反应，电泳检测最适酶切反应时间。而后选择相同的体系酶切30min进行大量酶切。经0.7%（w/v）琼脂糖凝胶电泳后，切下长度为2-4kb的DNA片段，用凝胶试剂盒（上海生物工程公司）回收。质粒载体pACYC184（NEB公司）用BamH I完全酶切后SAP碱性磷酸酯酶进行末端去磷酸化，以减少载体自连。上述回收后的菌株DNA（200ng）和末端去磷酸化的质粒载体pACYC184（150ng）用2U的T4ligase在4℃下连接16h。

连接产物用正丁醇沉淀后，用70%（v/v）的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲为2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5.S。复苏后，将菌液涂布于LB（含有50μg/mL氨苄青霉素）平板上，37℃培养l2-16h。而后用质粒大量提取试剂盒（美国Omega公司）进行质粒提取，这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

5、筛选草甘膦抗性转化子

将上述大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）涂布与含有50mM草甘膦的M9平板上培养48h，发现有三个菌落生长良好。将这三个菌落分别接种到含有100mM、150mM草甘膦的M9平板上培养，发现只有1个能在含150mM草甘膦的M9平板上生长，将其所含的质粒命名为pAroA_k.pneumoniae。将该质粒pAroA_k.pneumoniae再次转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）中转化，将转化获得的转化子用无菌牙签点与含150mM草甘膦的M9固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性确实是由于转入质粒引起的。

实施例2高耐受草甘膦的DNA片断的序列分析

利用逐步序列测定方法对实施例1筛选获得的高耐受草甘膦质粒pAroA_k.pneumonia全序列进行DNA测序。分析结果表明：该片断大小为2100bp，其中包含了一个1284的阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，编码氨基酸428个，其序列如SEQ ID NO 2所示。。

实施例3高耐受草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成与筛选

以基因合成方法【Nucleic Acids Research,2004,32,e98】克隆上述含有质粒pAroA_k.pneumonia的转化子，设计26个引物，合成并筛选本发明的EPSP合酶基因。所设计的引物如下：

1.KP-1:Tm=54,60mer

GGA,TCC,ATG,GAA,TCC,CTG,ACG,TTA,CAA,CCC,ATC,GCA,CGC,GTA,GAG,GGC,ACC,GTG,AAC,CTG

2.KP-2:Tm=54,60mer

GAG,CGG,CCA,GCA,GCA,GCG,CGC,GGT,TGG,AGA,CGC,TTT,TCG,AAC,CTG,GCA,GGT,TCA,CGG,TGC

3.KP-3:Tm=54,60mer

TGG,CCC,GCG,GCA,CGA,CGG,TGC,TGA,CCA,ACC,TGC,TGG,ACA,GCG,ACG,ATG,TGC,GCC,ATA,TGC

4.KP-4:Tm=54,60mer

GAT,AGG,GTA,TAT,TGA,ACC,CCC,AGC,GCA,CTC,AGG,GCA,TTC,AGC,ATA,TGG,CGC,ACA,TCG,TCG

5.KP-5:Tm=54,60mer

TGC,CGA,CCG,CAC,CCG,CTG,CGA,AGT,GAC,CGG,CAA,CGG,CGG,CCC,GCT,GCG,CGC,TGC,TGC,GGC

6.KP-6:Tm=54,60mer

CCG,CAT,CGC,GGT,TCC,GGC,GTT,GCC,GAG,GAA,CAG,CTC,CAG,CGC,CGC,AGC,AGC,GCG,CAG,CGG

7.KP-7:Tm=54,60mer

CCG,CTG,GCG,GCG,GCC,CTG,TGC,CTT,GGC,AGC,AAC,GAT,ATT,GTG,CTG,ACC,GGC,GAA,CCG,CGG

8.KP-8:Tm=54,60mer

GCA,GGG,CAT,CCA,CCA,GAT,GGC,CGA,TCG,GGC,GCT,CTT,TCA,TCC,GCG,GTT,CGC,CGG,TCA,GCA

9.KP-9:Tm=54,60mer

GTC,AGG,GCG,GCG,CTC,AGA,TCG,ACT,ATC,TTG,AGC,AGG,AAA,ATT,ATC,CAC,CGC,TGC,GCC,TGC

10.KP-10:Tm=54,60mer

CTG,CCG,TCA,ACC,TCG,ACG,TTC,CCG,CCC,TGA,AAA,CCG,CCG,CGC,AGG,CGC,AGC,GGT,GGA,TAA

11.KP-11:Tm=54,60mer

CGT,CTC,CAG,TCA,GTT,CCT,GAC,CGC,GCT,GCT,GAT,GAC,CGC,GCC,GCT,GGC,GCC,GCA,GGA,TAC

12.KP-12:Tm=54,60mer

ATA,GGG,TTT,CGA,CAC,CAG,ATC,GCC,CTT,AAT,GGC,GAT,CAC,GGT,ATC,CTG,CGG,CGC,CAG,CGG

13.KP-13:Tm=54,60mer

ATC,GAC,ATT,ACG,CTG,CAC,CTG,ATG,AAA,ACC,TTC,GGC,GTT,GAG,GTG,GAC,AAT,CAG,TCT,TAT

14.KP-14:Tm=54,60mer

GCG,ACT,GAT,ACT,GCT,GCT,TGC,CGC,GCA,CCA,CAA,AAC,GCT,GAT,AAG,ACT,GAT,TGT,CCA,CCT

15.KP-15:Tm=54,60mer

CAG,GGG,ATT,ACC,TGG,TGG,AAG,GCG,ATG,CTT,CCT,CGG,CCT,CGT,ATT,TCC,TCG,CCG,CTG,GCG

16.KP-16:Tm=54,60mer

CGG,CCG,ATA,CCG,GTG,ACT,TTT,ACC,GTG,CCG,CCC,TTA,ATG,GCG,CCA,GCG,GCG,AGG,AAA,TAC

17.KP-17:Tm=54,60mer

CGG,CAG,TGT,GCA,GGG,CGA,TAT,CCG,TTT,CGC,CGA,CGT,CCT,GGA,GAA,AAT,GGG,CGC,TAC,CGT

18.KP-18:Tm=54,60mer

CTC,GCC,GCG,GGT,GCA,GGC,GAT,AAA,ATC,GTC,GCC,CCA,GGT,CAC,GGT,AGC,GCC,CAT,TTT,CTC

19.KP-19:Tm=54,60mer

CTC,AAG,GCT,ATC,GAT,ATG,GAT,ATG,AAC,CAT,ATC,CCG,GAC,GCG,GCG,ATG,ACC,ATC,GCC,ACC

20.KP-20:Tm=54,60mer

TAT,TGC,GCA,GCG,TAG,TGG,TCC,CTT,GCG,CGA,ACA,GCG,CGG,CGG,TGG,CGA,TGG,TCA,TCG,CCG

21.KP-21:Tm=54,60mer

TCT,ACA,ACT,GGC,GGG,TCA,AAG,AGA,CGG,ACC,GTC,TGT,TCG,CCA,TGG,CGA,CCG,AGT,TGC,GTA

22.KP-22:Tm=54,60mer

CGA,ATA,TAA,TCT,TCA,CCC,TCT,TCC,ACC,TCG,GCG,CCT,ACT,TTA,CGC,AAC,TCG,GTC,GCC,ATG

23.KP-23:Tm=54,60mer

CAT,CAC,CCC,GCC,GGC,AAA,GTT,GAA,ATA,TGC,TGA,AAT,TGG,CAC,CTA,TAA,CGA,CCA,CCG,GAT

24.KP-24:Tm=54,60mer

CGG,CGT,ATC,AGA,CAG,CGC,CAC,CAG,CGA,GAA,GCA,CAT,CGC,CAT,CCG,GTG,GTC,GTT,ATA,GGT

25.KP-25:Tm=54,60mer

GTG,ACC,ATC,CTT,GAT,CCC,AAA,TGT,ACG,GCC,AAA,ACG,TTC,CCG,GAC,TAT,TTT,GAG,CAA,CTG

26.KP-26:Tm=54,50mer

GAG,CTC,TCA,GGC,GAG,GGT,ACT,GAT,CCG,CGC,CAG,TTG,CTC,AAA,ATA,GTC,CG

利用PCR进行EPSP合酶基因扩增，在100μl反应体系中，KP-2至KP-25共24个内侧引物的添加量为2ng，外侧引物KP-1和KP-26添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，50℃30s，72℃2min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。

PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆，经序列检测，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示，它包含1287个碱基，其编码氨基酸428个，序列如SEQ ID NO 2所示，即该阳性克隆为本发明的EPSP合酶基因。

实施例4  高耐受草甘膦的EPSP表达

将上述合成的EPSP基因用引物P1(5’-gagagaccatggaatccctgacg-3’)和P2(5’-gtctcgagttcaggcgagggtact-3’)进行PCR扩增，以KOD Plus（Toyobo日本）为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶（大连宝生物工程公司），72℃延伸90s，扩增片段长1353bp。PCR产物用Nco I and Xho I酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a（NEB公司）得到重组质粒pET-pAroA_k.pneumonia并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司），将转化子涂布在LB固体培养基中培养24h。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP（Amersham Biosciences公司）对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测，蛋白大小约45kDa，与预测值相符（电泳图参看图1）。

实施例5EPSP合酶基因的酶活测定和动力学参数的测定

1.测定方法

无机磷标准曲线：10mM无机磷按1:10稀释，分别取0、1、2、3……20μl与1.5ml Eppendorf离心管中，加入纯水至100μl混匀，加入MAT溶液0.8ml混匀，计时三分钟后加入SC溶液（？）100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD₆₆₀值，重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD₆₆₀值为纵坐标作图，得到无机磷标准曲线。

1）酶活测定：蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法。在冰上与1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μl，10mM S3P溶液2μl，0.5M HEPES溶液2μl，1mM(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl和双蒸水12μl混匀，与28℃温浴5min后各管样品间隔2s加入5μl纯化蛋白并计时，2min后再间隔2s依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl 34%SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD₆₆₀值。对照除不加纯化蛋白外，其余同样品管。样品管与对照管的OD₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到酶的酶活力（nkat/mg）。

2）半抑制量（IC₅₀）测定：上述反应液中添加0、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度（nkat/mg）为Y轴作图。

3）K_m（PEP）测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度（0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM）下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S]（Eadic-Hofstee）法作图。

4）K_i（glyphosate）测定：在不同草甘膦浓度（0、10、50、100μM）下测定PEP浓度为0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM时EPSP的酶反应速度。采取双倒数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦的浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为K_i(glyphosate)值。

2.测定结果

本发明的EPSP合酶活性为71.53±0.13nkat/mg，其动力学参数如下表1所示。

表1本发明的EPSP合酶的动力学参数

根据表1的动力学参数可知：本发明的EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性为将本发明的EPSP合酶用于转基因作物的培育提供了可能。

实施例6  拟南芥的转化及其草甘膦抗性的试验

（一）转基因拟南芥的获得

1.农杆菌的准备：

1）挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养20h。

2）取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD₆₀₀≈1.5。

3）8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5wt%蔗糖，0.05wt%Silwet L-77）并稀释至OD₆₀₀≈0.8。

2.拟南芥蘸花法转化

1）将拟南芥的花薹浸入渗透液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，托盘中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22℃避光培养，24h后去掉保鲜膜直立培养。

2）初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。

3）生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。

（二）转基因拟南芥的草甘膦耐受性试验

将T2代Kp2，Kp4，Kp5三个株系和CK种子首先用1ml 75%乙醇消毒1min（不停摇晃振荡），8000rpm离心5秒，去上清。然后加入1ml过滤后的漂白粉消毒15min（不停摇晃振荡，充分消毒），8000rpm离心5秒，去上清，再用无菌水洗涤3-4次。

接下来将种子均匀的播撒到含有不同浓度草甘膦的1/2MS平板上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16小时光照培养6天观察种子萌发情况。

结果发现：对照种子在草甘膦浓度为200μM已经不能萌发生长，而转本发明的肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因的种子在草甘膦浓度为1000μM则仍然生长良好，而且形态正常（参看图2）。

Claims (5)

1.一种来源于肺炎克雷伯氏杆菌342（Klebsiella pneumoniae 342）的EPSP合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.根据权利要求1所述的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

3.权利要求1或2所述的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因在拟南芥转化中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用蘸花法将所述的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因转入拟南芥中。

5.权利要求1或2所述的来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的EPSP合酶基因在转基因作物培育中的应用。

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