CN104726475A - 脱氮副球菌epsp合酶基因的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）的EPSP合酶基因及其应用。所述的EPSP合酶基因含1332个碱基，编码氨基酸443个；其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明的来源于脱氮副球菌的EPSP合酶基因具有较高的草甘膦耐受性，可用于转基因作物的培育。

Description

脱氮副球菌EPSP合酶基因的制备及其应用

技术领域

本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种来源于脱氮副球菌的EPSP合酶基因及其应用。

背景技术

莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。EPSP合酶是莽草酸途径的关键酶，催化3-磷酸莽草酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）。除草剂草甘膦是PEP的结构类似物，能与PEP竞争性抑制EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。迄今为止，成功用于商业化的抗草甘膦转基因作物的基因只有II型的农杆菌 CP4的EPSPS基因。由于仅有这个单一的基因被广泛商业化，因而就有可能引起转基因作物的草甘膦抗性降低。所以为了提高转基因作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此基因为基础的抗草甘膦转基因作物。

草甘膦的广泛使用及其非选择性的特点，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦转基因作物成为研究热点。我国作为草甘膦生产和出口的大国，目前缺少拥有自主知识产权的、适用于抗草甘膦转基因作物培育的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因，因而在国际竞争中处于不利地位。因此，寻找拥有自主知识产权的高抗草甘膦EPSPS新基因并利用该基因培育抗草甘膦转基因作物，这对于提升我国基因工程的研究水平具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的技术问题在于提供一种新型的来源于脱氮副球菌的EPSP合酶基因及应用，从而为培育新型的抗草甘膦转基因作物提供必要的理论与实验支持。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

1）抗草甘膦菌株的筛选

收集频繁使用草甘膦的果园地里土壤的样品，用0.9%(w/v) 氯化钠溶液混合之后涂布于含有不同浓度草甘膦的LB固体培养基中培养，筛选出高抗草甘膦菌株。

2）菌株基因组DNA的提取及鉴定

抽提上述筛选出的细菌基因组DNA，储存于4°C下备用。然后以菌株的DNA为模板进行16S rRNA的PCR扩增，以鉴定菌株的菌属。

3）基因组文库的构建

将上述抽提的细菌基因组DNA用Sau3A I酶切，连接到同样去磷酸化的pACYC184质粒载体。连接产物电击转入大肠杆菌DH5α，涂布于LB固体培养基，37°C下培养24h后进行质粒大量提取。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

4）新型草甘膦抗性基因的获得

将上述大量提取的质粒转入大肠杆菌 ER2799（NEB公司），分别涂布于含有不同浓度草甘膦的LB固体培养基中培养，确定能够抵抗草甘膦的阳性菌落，对其进行质粒提取并测序。根据测序结果合成引物，以测序的质粒为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物即为本发明的新型草甘膦抗性基因。

4）新型草甘膦抗性基因的人工合成

以基因合成法【Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98】，设计23对引物，人工合成本发明的新型基因。经序列测定其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

5）新型基因的蛋白表达纯化及酶学特性测定

将上述所获得的新型草甘膦抗性基因连接到pET-28a 载体。然后将此质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3) (Novagen公司)，转化子用HisTrap HP kit (Amersham Biosciences)试剂盒进行蛋白表达纯化，并进行EPSP合酶动力学参数的测定。测定结果说明本发明的新型EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特征将为该基因用于抗草甘膦转基因作物的培育提供可能。

5）转新型基因拟南芥的功能验证

采用蘸花法【Nature Protocol, 2006, (2):641-646】将上述获得的EPSP合酶基因转入拟南芥，进行草甘膦抗性试验，结果表明：本发明的来源于脱氮副球菌的EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性。因此进一步说明本发明的来源于脱氮副球菌的EPSP合酶基因有可能应用于抗草甘膦转基因作物的培育。

附图说明

图1为转本发明的脱氮副球菌的EPSP合酶基因的拟南芥在含有不同浓度草甘膦平板上的抗性实验，其中，Pd1, Pd2和Pd3分别代表转本发明的EPSP合酶基因拟南芥的不同株系；CK代表对照。

图2为转本发明的脱氮副球菌的EPSP合酶基因的拟南芥在含有1000uM草甘膦的MS0液体培养基中的生长实验，其中，Pd1, Pd2和Pd3分别代表转本发明的EPSP合酶基因的拟南芥的不同株系；CK代表对照。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛－奥德里奇（Sigma－Aldrich）公司。

本发明涉及的分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书（J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社）

实施例1 新型草甘膦抗性基因EPSP合酶基因的获得

1、土壤样品的采集

从一年至少使用四次并且连续使用十年以上的果园的土壤中采集土壤样品。

2、抗草甘膦菌株的筛选

称取草甘膦频繁使用果园土壤样品1g，加入0.9%（w/v）氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9%（w/v）氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布与含有60mM草甘膦的LB固体培养基中培养24h。将长出来的单菌落接种与加入1.6ml LB液体培养基的试管中，28°C培养48h，然后吸取150μl的培养液再次涂布与含有200mM草甘膦的LB固体培养基中培养24h，最后将一个生长最好的菌落选出来进行进一步研究。

3、菌株总DNA的提取及鉴定

将上述分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基（5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH=7.5）中培养16h，菌体培养液以6000转/分速度离心5min，得到菌体沉淀，这些沉淀在–20°C下冷冻1h。之后使用TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0）溶液清洗一次。加入含有20μl浓度为10mg/mL溶菌酶（Sigma-Aldrich）的无菌水悬浮，在37°C下摇床培养1h。加入50μL 0.5M EDTA，50μl 10%（w/v）SDS和50μl浓度为5M的NaCl轻轻振荡混匀。再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激K（Takara日本），反应物在37°C下培养1h。用与培养菌液液体体积相当1倍体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1）提取DNA。水相用与相当水相体积1/2倍体积的氯仿:异戊醇混合液（24:1）萃取，振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当1倍体积的异戊醇，振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70%（v/v）酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮，所得总DNA储存于4°C下备用。

以抽提的总DNA为模板，利用16s r RNA特异性引物进行扩增。扩增的引物为16SR (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 和16SF (5’-ACGGCTACCTTGTTACGA CTTC-3’)。以KOD Plus（Toyobo日本）为DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30 s，55℃30 s，72℃120 s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶（大连宝生物工程公司），72℃延伸90s，扩增片段长1500bp。PCR结束后，1%（w/v）琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物工程公司），4℃连接过夜。再将该载体转化入DH5α感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到的菌株与脱氮副球菌中的16s rRNA有99%的同源性，从而证实上述所挑选的菌株为脱氮副球菌。

4、脱氮副球菌基因组文库的构建

将上述获得的脱氮副球菌的DNA用Sau3AI酶切在10μl反应体系进行部分酶切试验，Sau3A I酶按1:100稀释，37℃分别酶切10min，20min，30min，40min，50min，60min后加入10×loading buffer 1μl终止反应，电泳检测最适酶切反应时间。而后选择相同的体系酶切30min进行大量酶切。经0.7%（w/v）琼脂糖凝胶电泳后，切下长度为2-4kb的DNA片段，用凝胶试剂盒（上海生物工程公司）回收。质粒载体pACYC184（NEB公司）用BamH I完全酶切后SAP碱性磷酸酯酶进行末端去磷酸化，以减少载体自连。上述回收后的菌株DNA（200ng）和末端去磷酸化的质粒载体pACYC184（150ng）用2U的T4 ligase在4℃下连接16h。

连接产物用正丁醇沉淀后，用70%（v/v）的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲为2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5.S。复苏后，将菌液涂布于LB（含有50μg/mL氨苄青霉素）平板上，37℃培养l2-16h。而后用质粒大量提取试剂盒（美国Omega公司）进行质粒提取，这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

5、筛选草甘膦抗性转化子

将上述大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）涂布与含有80mM草甘膦的M9平板上培养48h，发现有三个菌落生长良好。将这三个菌落分别接种到含有150mM和200mM草甘膦的M9平板上培养，发现只有1个能在含200mM草甘膦的M9平板上生长，再次将该菌落用无菌牙签点于含200mM草甘膦的M9固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆确实具有抗草甘膦特性。然后对这个克隆进行质粒提取并利用逐步序列测定方法对该质粒进行DNA测序。测序结果表明：该片断大小为2100bp，其中包含了一个1332的阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

根据测序结果合成引物PZ (5’-gagagaccatgtctcattctgct-3’)和PF (5’- gtctcgagttaatcgatctgggca -3’)，以该质粒为模板进行PCR扩增，扩增条件依次为：94℃30 s，55℃30 s，72℃120 s，扩增30个循环。所得PCR产物即为本发明的新型EPSP合酶基因。

实施例2  新型草甘膦抗性基因EPSP合酶基因的人工合成

以基因合成方法【Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98】人工合成实施例1所获得的

本发明的新型EPSP合酶基因。共设计23对引物，所设计的引物如下：

1. P1: Tm=54, 60mer

GGA,TCC,ATG,TCT,CAT,TCT,GCT,GAA,CCA,CTG,CCA,ATG,ACT,GCC,AGA,AGA,AGT,GGT,CCA,CTG

2. P2: Tm=54, 60mer

CTT,GTC,ACC,TGG,AAC,CTG,AGC,TTC,ACC,AGT,CAG,TGG,ACC,ACT,TCT,TCT,GGC,AGT,CAT,TGG

3. P3: Tm=54, 60mer

ACT,GGT,GAA,GCT,CAG,GTT,CCA,GGT,GAC,AAG,TCC,ATC,TCT,CAC,AGA,GCA,CTG,ATT,CTT,GGT

4. P4: Tm=54, 60mer

AGT,GAT,GTG,AGT,TTC,ACC,AAC,AGA,CAG,AGC,ACC,AAG,AAT,CAG,TGC,TCT,GTG,AGA,GAT,GGA

5. P5: Tm=54, 60mer

GCT,CTG,TCT,GTT,GGT,GAA,ACT,CAC,ATC,ACT,GGT,CTT,CTT,GAA,GGT,CAA,GAT,GTT,CTT,GAC

6. P6: Tm=54, 60mer

AGC,ACC,GAA,GGC,TCT,CAT,TGC,AGC,AGC,AGT,GTC,AAG,AAC,ATC,TTG,ACC,TTC,AAG,AAG,ACC

7. P7: Tm=54, 60mer

ACT,GCT,GCT,GCA,ATG,AGA,GCC,TTC,GGT,GCT,CAA,GTC,GAG,AGA,CTG,GGT,GAA,GGT,GAA,TGG

8. P8: Tm=54, 60mer

AAA,GCC,ACC,AAC,ACC,AAC,GCC,ATT,GAC,TCT,CCA,TTC,ACC,TTC,ACC,CAG,TCT,CTC,GAC,TTG

9. P9: Tm=54, 60mer

AGA,GTC,AAT,GGC,GTT,GGT,GTT,GGT,GGC,TTT,GCT,GAA,CCA,GAA,GGT,GTC,ATC,GAC,TGT,GGC

10. P10: Tm=54, 60mer

CAT,GAT,CAG,TCT,ACA,ACC,AGT,ACC,AGA,GTT,GCC,ACA,GTC,GAT,GAC,ACC,TTC,TGG,TTC,AGC

11. P11: Tm=54, 60mer

AAC,TCT,GGT,ACT,GGT,TGT,AGA,CTG,ATC,ATG,GGT,GCT,ATG,GCT,ACT,ACT,CCA,ATC,ACT,GCT

12. P12: Tm=54, 60mer

TCT,GGA,CAG,AGA,AGC,ATC,ACC,AGT,GAA,GGT,AGC,AGT,GAT,TGG,AGT,AGT,AGC,CAT,AGC,ACC

13. P13: Tm=54, 60mer

ACC,TTC,ACT,GGT,GAT,GCT,TCT,CTG,TCC,AGA,AGA,CCA,ATG,GGC,AGA,GTC,ACT,GAT,CCA,CTG

14. P14: Tm=54, 60mer

TCT,AGC,AGT,GAC,CTC,ACA,GCC,AAA,CAG,TTC,CAG,TGG,ATC,AGT,GAC,TCT,GCC,CAT,TGG,TCT

15. P15: Tm=54, 60mer

GAA,CTG,TTT,GGC,TGT,GAG,GTC,ACT,GCT,AGA,GAA,GGA,AAG,CGA,CTG,CCA,CTG,ACC,ATC,AAA

16. P16: Tm=54, 60mer

GTA,TCT,GAC,TGG,AAC,TGG,TTC,AGA,GGC,ACC,TTT,GAT,GGT,CAG,TGG,CAG,TCG,CTT,TCC,TTC

17. P17: Tm=54, 60mer

GGT,GCC,TCT,GAA,CCA,GTT,CCA,GTC,AGA,TAC,AAG,ACT,CCA,GTT,GCC,TCT,GCT,CAG,ATC,AAG

18. P18: Tm=54, 60mer

AGC,ATT,CAG,ACC,AGC,AAG,CAG,GAC,AGC,AGA,CTT,GAT,CTG,AGC,AGA,GGC,AAC,TGG,AGT,CTT

19. P19: Tm=54, 60mer

TCT,GCT,GTC,CTG,CTT,GCT,GGT,CTG,AAT,GCT,CCA,GGC,GAG,ACT,GTC,GTC,ATT,GAA,GCT,GAA

20. P20: Tm=54, 60mer

AAG,CAT,TCT,CTC,AGT,ATG,GTC,TCT,GGT,TGG,TTC,AGC,TTC,AAT,GAC,GAC,AGT,CTC,GCC,TGG

21. P21: Tm=54, 60mer

CCA,ACC,AGA,GAC,CAT,ACT,GAG,AGA,ATG,CTT,CAA,GGC,TTT,GGT,GCT,GCC,ATC,ACT,ACT,GAG

22. P22: Tm=54, 60mer

CAG,GAT,GAT,TAC,ATG,GCC,TTC,AGC,AGT,AGT,CTC,AGT,AGT,GAT,GGC,AGC,ACC,AAA,GCC,TTG

23. P23: Tm=54, 60mer

ACT,ACT,GCT,GAA,GGC,CAT,GTA,ATC,ATC,CTG,AAA,GGC,AGA,CCA,GAG,CTG,AAA,CCA,CAA,CCA

24. P24: Tm=54, 60mer

AGC,AGA,GGA,TGG,ATC,TCT,TGG,AAC,AGC,AAC,TGG,TTG,TGG,TTT,CAG,CTC,TGG,TCT,GCC,TTT

25. P25: Tm=54, 60mer

GTT,GCT,GTT,CCA,AGA,GAT,CCA,TCC,TCT,GCT,GCC,TTT,CCT,GTT,GCT,GCT,GCT,CTG,ATT,GTT

26. P26: Tm=54, 60mer

GAC,ACC,TGG,AAC,TCT,GAT,CTC,GGA,GCC,TGG,AAC,AAT,CAG,AGC,AGC,AGC,AAC,AGG,AAA,GGC

27. P27: Tm=54, 60mer

CCA,GGC,TCC,GAG,ATC,AGA,GTT,CCA,GGT,GTC,TCC,AGA,AAC,CCG,ACC,AGA,GAT,GGT,CTG,TAT

28. P28: Tm=54, 60mer

GAT,GTC,AGC,ACC,CAT,CTC,CAG,CAG,TGT,GAC,ATA,CAG,ACC,ATC,TCT,GGT,CGG,GTT,TCT,GGA

29. P29: Tm=54, 60mer

GTC,ACA,CTG,CTG,GAG,ATG,GGT,GCT,GAC,ATC,AGA,TTC,GAG,AAC,CAG,AGA,GAA,GAA,GGT,GGT

30. P30: Tm=54, 60mer

ATG,TCT,GAC,AAC,AAG,GTC,AGC,GAC,TGG,TTC,ACC,ACC,TTC,TTC,TCT,CTG,GTT,CTC,GAA,TCT

31. P31: Tm=54, 60mer

GAA,CCA,GTC,GCT,GAC,CTT,GTT,GTC,AGA,CAT,GGT,CCA,CTG,AAA,GGT,GTT,ACG,GTT,CCA,GCT

32. P32: Tm=54, 60mer

GAA,CTC,GTC,GAT,CAT,AGA,GGC,AGC,TCT,CTC,AGC,TGG,AAC,CGT,AAC,ACC,TTT,CAG,TGG,ACC

33. P33: Tm=54, 60mer

GAG,AGA,GCT,GCC,TCT,ATG,ATC,GAC,GAG,TTC,CCA,ATC,CTG,TCT,GTC,ATT,GCC,TGT,TTC,GCT

34. P34: Tm=54, 60mer

GTG,AAC,ACC,TTG,CAT,GAC,CGT,AGT,GCC,TTC,AGC,GAA,ACA,GGC,AAT,GAC,AGA,CAG,GAT,TGG

35. P35: Tm=54, 60mer

GAA,GGC,ACT,ACG,GTC,ATG,CAA,GGT,GTT,CAC,GAG,TTG,AGA,GTC,AAG,GAG,TCT,GAC,AGA,ATA

36. P36: Tm=54, 60mer

ATT,GGC,TCT,CAG,ACC,AAC,AGC,CAT,AGC,ATC,TAT,TCT,GTC,AGA,CTC,CTT,GAC,TCT,CAA,CTC

37. P37: Tm=54, 60mer

GAT,GCT,ATG,GCT,GTT,GGT,CTG,AGA,GCC,AAT,GGT,GCT,GAA,GTT,GTT,GAC,ACT,CAG,GAT,ACT

38. P38: Tm=54, 60mer

ATC,AAG,ACC,TCC,TTT,GCC,ATG,AAC,AGT,CAT,AGT,ATC,CTG,AGT,GTC,AAC,AAC,TTC,AGC,ACC

39. P39: Tm=54, 60mer

ATG,ACT,GTT,CAT,GGC,AAA,GGA,GGT,CTT,GAT,GGT,GGT,GCC,ACT,TGT,GCT,ACT,CAT,CTG,GAC

40. P40: Tm=54, 60mer

AGC,AAC,AAG,GAA,GGA,CAT,GGC,AAT,TCT,GTG,GTC,CAG,ATG,AGT,AGC,ACA,AGT,GGC,ACC,ACC

41. P41: Tm=54, 60mer

CAC,AGA,ATT,GCC,ATG,TCC,TTC,CTT,GTT,GCT,GGT,CTT,GCT,TCT,CAT,CAA,CCA,ATC,TCT,GTT

42. P42: Tm=54, 60mer

AAA,GGA,GGT,GGC,AAT,TGG,ACC,ACC,ATC,GTC,AAC,AGA,GAT,TGG,TTG,ATG,AGA,AGC,AAG,ACC

43. P43: Tm=54, 60mer

GAC,GAT,GGT,GGT,CCA,ATT,GCC,ACC,TCC,TTT,CCA,GAC,TTC,CTG,CCA,CTG,ATG,AGA,GGT,CTT

44. P44: Tm=54, 60mer

GTG,ATG,GTG,ATG,GTG,ATC,GAT,CTG,GGC,ACC,AAG,ACC,TCT,CAT,CAG,TGG,CAG,GAA,GTC,TGG

45. P45: Tm=54, 60mer

CCA,CTG,ATG,AGA,GGT,CTT,GGT,GCC,CAG,ATC,GAT,CAC,CAT,CAC,CAT,CAC,CAT,TAA,GAG,CTC

46. P46: Tm=54, 60mer

GAG,CTC,TTA,ATG,GTG,ATG,GTG,ATG,GTG,ATC,GAT,CTG,GGC,ACC,AAG,ACC,TCT,CAT,CAG,TGG

利用PCR进行扩增，在100μl反应体系中， P2至P45共44个内侧引物的添加量为2ng，外侧引物P1和P46添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，50℃30s，72℃2min，使用的DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。

PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化DH5 α感受态中。获得阳性克隆，提取质粒并经序列测定，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，说明该阳性克隆即为本发明的EPSP合酶基因。

实施例3  新型草甘膦抗性基因EPSP合酶基因的原核表达

将实施例2人工合成的本发明的EPSP合酶基因用引物PZ (5’-gagagaccatgtctcattctgct-3’)和PF (5’- gtctcgag ttaatcgatctgggca -3’)进行PCR扩增，以KOD Plus（Toyobo 日本）为DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶（大连宝生物工程公司），72℃延伸90s，扩增片段长1353bp。PCR产物用Nco I and Xho I酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a（NEB公司）得到重组质粒并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司），将转化子涂布在LB固体培养基中培养24h。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP（Amersham Biosciences公司）对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测，蛋白大小约45kDa，与预测值相符。

实施例4  新型草甘膦抗性基因EPSP合酶的酶学特性测定

1. 测定方法

无机磷标准曲线：10mM无机磷按1:10稀释，分别取0、1、2、3……20μl与1.5ml Eppendorf离心管中，加入纯水至100μl混匀，加入MAT溶液0.8ml混匀，计时三分钟后加入SC溶液（？）100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD₆₆₀值，重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD₆₆₀值为纵坐标作图，得到无机磷标准曲线。

1）酶活测定：蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法。在冰上与1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μl，10mM S3P溶液2μl，0.5M HEPES溶液2μl，1mM (NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl和双蒸水12μl混匀， 28℃温浴5min后各管样品间隔2s加入5μl纯化蛋白并计时，2min后再间隔2s依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl 34% SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD₆₆₀值。对照除不加纯化蛋白外，其余同样品管。样品管与对照管的OD₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到酶的酶活力（nkat/mg）。

2）半抑制量（IC₅₀）测定：上述反应液中添加0、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度（nkat/mg）为Y轴作图。

3）K _m （PEP）测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度（0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM）下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S]（Eadic-Hofstee）法作图。

4）K _i （glyphosate）测定：在不同草甘膦浓度（0、10、50、100μM）下测定PEP浓度为0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM时EPSP的酶反应速度。采取双倒数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦的浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为K_i (glyphosate)值。

2. 测定结果

本发明的EPSP合酶活性为980.15 nkat/mg，其动力学参数如表1所示。

表1 本发明的EPSP合酶的动力学参数

动力学参数	测定值
		IC50 (glyphosate；mM)	0.38250.004
K m (PEP；mM)	0.280.11
		K i (glyphosate；μM)	112.233.6
K i / K m	0.4010.033

根据表1的动力学参数可知：本发明的EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性为将本发明的EPSP合酶用于转基因作物的培育提供了可能。

实施例5  拟南芥的转化及其草甘膦抗性的试验

（一）转基因拟南芥的获得

1. 农杆菌的准备：

1）挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养20h。

2）取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD₆₀₀≈1.5。

3）8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5wt%蔗糖，0.05wt% Silwet L-77）并稀释至OD₆₀₀≈0.8。

2. 拟南芥蘸花法转化

1）将拟南芥的花薹浸入渗透液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，托盘中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22℃避光培养，24h后去掉保鲜膜直立培养。

2）初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。

3）生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。

（二）转基因拟南芥的草甘膦抗性试验  

1. 将T3代转本发明的EPSP合酶基因的3个阳性株系（Pd1, Pd2, Pd3）和CK种子首先用1ml 75%乙醇消毒1min（不停摇晃振荡），8000rpm离心5秒，去上清。然后加入1ml过滤后的漂白粉消毒15min（不停摇晃振荡，充分消毒），8000rpm离心5秒，去上清，再用无菌水洗涤3-4次。接下来将种子均匀的防止到含有不同浓度草甘膦的1/2MS平板上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天后，22℃，16小时光照垂直培养10天后观察生长情况。结果发现：对照种子在草甘膦浓度为200μM时生长已经受到严重抑制，而转本发明的脱氮副球菌的EPSP合酶基因的种子在草甘膦浓度为1000μM则仍然生长良好，而且形态正常（参看图1）。

2. 将T3代转本发明的EPSP合酶基因的3个阳性株系（Pd1, Pd2, Pd3）和CK种子首先用1ml 75%乙醇消毒1min（不停摇晃振荡），8000rpm离心5秒，去上清。然后加入1ml过滤后的漂白粉消毒15min（不停摇晃振荡，充分消毒），8000rpm离心5秒，去上清，再用无菌水洗涤3-4次。接下来将种子均匀的放置到MS0平板上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天后，22℃，16小时光照培养6天后，用镊子分别将4个株系（Pd1, Pd2, Pd3和CK）各20株植株放置在含有1000uM草甘膦的液体MS0培养基中观察生长情况。10天后发现：CK株系植株受到严重胁迫，叶子已经开始枯萎发黄；而转本发明的脱氮副球菌的EPSP合酶基因的株系植株则依然生长良好，而且形态正常（参看图2）。

转基因拟南芥的草甘膦抗性试验进一步说明了本发明的EPSP合酶基因有可能用于抗草甘膦转基因作物的培育。

<110> 上海市农业科学院

<120>脱氮副球菌EPSP合酶基因的制备及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> SEQ ID No 1

<211> 1332

<212> DNA

<213> 脱氮副球菌

<400>

ATGTCTCATTCTGCTGAACCACTGCCAATGACTGCCAGAAGAAGTGGTCCACTGACTGGT  60

GAAGCTCAGGTTCCAGGTGACAAGTCCATCTCTCACAGAGCACTGATTCTTGGTGCTCTG  120

TCTGTTGGTGAAACTCACATCACTGGTCTTCTTGAAGGTCAAGATGTTCTTGACACTGCT  180

GCTGCAATGAGAGCCTTCGGTGCTCAAGTCGAGAGACTGGGTGAAGGTGAATGGAGAGTC  240

AATGGCGTTGGTGTTGGTGGCTTTGCTGAACCAGAAGGTGTCATCGACTGTGGCAACTCT  300

GGTACTGGTTGTAGACTGATCATGGGTGCTATGGCTACTACTCCAATCACTGCTACCTTC  360

ACTGGTGATGCTTCTCTGTCCAGAAGACCAATGGGCAGAGTCACTGATCCACTGGAACTG  420

TTTGGCTGTGAGGTCACTGCTAGAGAAGGAAAGCGACTGCCACTGACCATCAAAGGTGCC  480

TCTGAACCAGTTCCAGTCAGATACAAGACTCCAGTTGCCTCTGCTCAGATCAAGTCTGCT  540

GTCCTGCTTGCTGGTCTGAATGCTCCAGGCGAGACTGTCGTCATTGAAGCTGAACCAACC  600

AGAGACCATACTGAGAGAATGCTTCAAGGCTTTGGTGCTGCCATCACTACTGAGACTACT  660

GCTGAAGGCCATGTAATCATCCTGAAAGGCAGACCAGAGCTGAAACCACAACCAGTTGCT  720

GTTCCAAGAGATCCATCCTCTGCTGCCTTTCCTGTTGCTGCTGCTCTGATTGTTCCAGGC  780

TCCGAGATCAGAGTTCCAGGTGTCTCCAGAAACCCGACCAGAGATGGTCTGTATGTCACA  840

CTGCTGGAGATGGGTGCTGACATCAGATTCGAGAACCAGAGAGAAGAAGGTGGTGAACCA  900

GTCGCTGACCTTGTTGTCAGACATGGTCCACTGAAAGGTGTTACGGTTCCAGCTGAGAGA  960

GCTGCCTCTATGATCGACGAGTTCCCAATCCTGTCTGTCATTGCCTGTTTCGCTGAAGGC  1020

ACTACGGTCATGCAAGGTGTTCACGAGTTGAGAGTCAAGGAGTCTGACAGAATAGATGCT  1080

ATGGCTGTTGGTCTGAGAGCCAATGGTGCTGAAGTTGTTGACACTCAGGATACTATGACT  1140

GTTCATGGCAAAGGAGGTCTTGATGGTGGTGCCACTTGTGCTACTCATCTGGACCACAGA  1200

ATTGCCATGTCCTTCCTTGTTGCTGGTCTTGCTTCTCATCAACCAATCTCTGTTGACGAT  1260

GGTGGTCCAATTGCCACCTCCTTTCCAGACTTCCTGCCACTGATGAGAGGTCTTGGTGCC  1320

CAGATCGATTAA                                                  1332

 

<210> SEQ ID No 2

<211> 443

<212> PRT

<213> 脱氮副球菌

<400>

 

MSHSAEPLPM TARRSGPLTG EAQVPGDKSI SHRALILGAL SVGETHITGL LEGQDVLDTA 60

AAMRAFGAQV ERLGEGEWRV NGVGVGGFAE PEGVIDCGNS GTGCRLIMGA MATTPITATF 120

TGDASLSRRP MGRVTDPLEL FGCEVTAREG KRLPLTIKGA SEPVPVRYKT PVASAQIKSA 180

VLLAGLNAPG ETVVIEAEPT RDHTERMLQG FGAAITTETT AEGHVIILKG RPELKPQPVA 240

VPRDPSSAAF PVAAALIVPG SEIRVPGVSR NPTRDGLYVT LLEMGADIRF ENQREEGGEP 300

VADLVVRHGP LKGVTVPAER AASMIDEFPI LSVIACFAEG TTVMQGVHEL RVKESDRIDA 360

MAVGLRANGA EVVDTQDTMT VHGKGGLDGG ATCATHLDHR IAMSFLVAGL ASHQPISVDD 420

GGPIATSFPD FLPLMRGLGA QID-                                        443

Claims (2)

1.一种来源于脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）的EPSP合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.根据权利要求1所述的来源于脱氮副球菌的EPSP合酶基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。