CN102108363A

CN102108363A - 来源于人苍白杆菌的epsp合酶基因及其应用

Info

Publication number: CN102108363A
Application number: CN200910200675XA
Authority: CN
Inventors: 田永生; 姚泉洪; 彭日荷; 熊爱生; 高峰; 付晓燕; 赵伟; 金晓芬; 朱波
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2011-06-29
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: CN102108363B

Abstract

本发明公开了一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用，所述EPSP合酶基因含1353个碱基，编码的氨基酸451个；所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因采用人工方法合成，与已报道的来源于农杆菌CP4的EPSP合酶基因具有很高的同源性，且具有较高的草甘膦耐受性，可用于转基因作物的培育中。

Description

来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用

技术领域

本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用。

背景技术

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种之一。但是该除草剂同样是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。为在农业生产中使用草甘膦，必须培育出具有草甘膦抗性或者降解性的农作物。

草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate)毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(简称EPSP合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成过程中的一个关键酶，该酶由aroA基因编码，目前使用的有潜在的生物安全性问题。

目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断扩大，占全球种植转基因作物的78％以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和南非等七国的主要商品化转基因农作物。耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的62％。然而现在主要研究的抗草甘膦基因主要是I型的，因而发掘新型的II类的EPSP合成酶基因将是必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用，并对该基因进行功能验证，以证明它具有相对较高的草甘膦耐受性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

所述来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因长3100bp，含1353个碱基，编码的氨基酸451个。

所述来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因应用于草甘膦耐受性中。

所述来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因采用人工方法合成，具体包括以下步骤：

1)抗草甘膦菌株的筛选

采集草甘膦频繁使用果园地里土壤中的样品，用0.9％(w/v)氯化钠溶液混合，之后将样品涂布于含有60mM草甘膦的LB固体培养基中培养24h。将长出来的菌株再次涂布于含有200mM草甘膦LB固体培养基中培养24h，最后将仅有的一个生长很好的菌株挑选出来进行进一步研究。

2)菌株总DNA的提取及鉴定

将分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH＝7.5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以6000r重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀在-20℃下冷冻1h。之后使用TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)溶液清洗一次。加入浓度为10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1h。加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和浓度为5M的NaCl轻轻振荡混匀。再加入浓度为20mg/mL蛋白激K(Takara日本)，反应物在37℃下培养1h。用与培养菌液液体体积相当1倍体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取。振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(倍体积的异戊醇。振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA储存于4℃下备用。

以16SR(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和

16SF(5’-ACGGCTACCT TGTTACGACTTC-3’)为扩增引物，以菌株的DNA为模板进行16S rDNA的PCR扩增。随后对PCR产物进行凝胶回收，克隆和测序。

3)基因组文库的构建

菌株DNA用Sau3A I酶切，经琼脂糖凝胶回收2-4kbDNA片断备用。此片断经过末端去磷酸化连接到同样去磷酸化的pACYC184质粒载体。上述连接产物转入E.coli DH5α电击感受态细胞，涂布与LB固体培养基，37℃下培养24h后进行质粒大抽。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

4)筛选草甘膦抗性转化子

将大抽质粒转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)分别涂布与含有50、100、150mM草甘膦的LB固体培养基中培养48h，发现有一个菌落能在含有150mM草甘膦的LB固体培养基上生长，对其进行测序。

5)草甘膦耐受试验及蛋白表达纯化

以P1(5’-gagagaggatccatgtcccattctgcatc-3’)和

P2(5’-gagctctcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3’)为引物，以pAroA-O.anthropi为模板进行EPSP合酶基因AroA-O.anthropi的PCR扩增。PCR产物经BamH I和Sac I酶切后连接如同样经BamH I and Sac I酶切的pYPX251载体。

将大肠杆菌ER2799，ER2799(携带p251-AroA-O.anthropi质粒)及ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)接种到含0-150mM草甘膦的M9液体培养基上进行耐受性试验。

以P5(5’-gagagaccatggatgtcccattctgcatc-3’)和

P6(5’-gtctcgagtcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3’)为引物，以人工合成的EPSP基因的阳性克隆为模板进行EPSP合酶基因的PCR扩增。PCR产物经Nco I和Xho I酶切后连接入同样经Nco I和Xho I酶切的pET-28a载体(Novagen公司)。然后将此质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，转化子用HisTrap HP kit(Amersham Biosciences)试剂盒进行蛋白表达纯化，并进行EPSP酶活测定和动力学参数的测定。

本发明的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特征将为用于转基因作物的培育提供可能。

附图说明

图1为本发明的EPSP合酶的草甘膦耐受性实验结果，其中：

A代表在草甘膦浓度为0mM时大肠杆菌(Escherichia coli)ER2799(携带p251-AroA-O.anthropi质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；

B代表在草甘膦浓度为50mM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-O.anthropi质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；

C代表在草甘膦浓度为100mM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-O.anthropi质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；

D代表在草甘膦浓度为150mM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-O.anthropi质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况。

图2为本发明的EPSP合酶与I型的来自于大肠杆菌的EPSP合酶和II型的来自于农杆菌CP4的EPSP合酶的氨基酸序列的比较。

图3为本发明的EPSP合酶与典型的I型和II型EPSP合酶的系统发育比较结果。

图4为本发明的EPSP合酶3D结构及其与来自于农杆菌CP4的EPSP合成酶的3D结构的比较。

图5为本发明的EPSP合酶的SDS-PAGE电泳图，其中的1代表用HisTrapHP试剂盒纯化的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶蛋白；2代表在大肠杆菌BL21(DE3)过量表达的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶蛋白、3代表蛋白分子量MARKER。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)

实施例1

高耐受草甘膦的DNA片断克隆

1、草甘膦频繁使用水稻地里土壤样品的采集

从一年至少使用四次并且连续使用十年以上的果园的土壤中采集土壤样品。

2、抗草甘膦菌株的筛选

称取草甘膦频繁使用果园土壤样品1g，加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布与含有60mM草甘膦的LB固体培养基中培养24h。将长出来的单菌落接种与加入1.6mlLB液体培养基的试管中，28℃培养48h，然后吸取150μl的培养液再次涂布与含有200mM草甘膦的LB固体培养基中培养24h，最后将仅有的一个生长良好的菌落人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)选出来进行进一步研究。

3、菌株总DNA的提取及鉴定

将实施例2中分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH＝7.5)中培养16h，菌体培养液以6000转/分速度离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀在-20℃下冷冻1h。之后使用TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.0)溶液清洗一次。加入含有20μl浓度为10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1h。加入50μL 0.5M EDTA，50μl 10％(w/v)SDS和50μl浓度为5M的NaCl轻轻振荡混匀。再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激K(Takara日本)，反应物在37℃下培养1h。用与培养菌液液体体积相当1倍体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取。振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当1倍体积的异戊醇。振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA储存于4℃下备用。

以抽提的总DNA为模板，利用人苍白杆菌的16sRNA特异性引物进行扩增。扩增的引物为16SR(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和16SF(5’-ACGGCTACCT TGTTACGACTTC-3’)。以KOD Plus(Toyobo日本)为TaqDNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃120s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶(大连宝生物工程公司)，72℃延伸90s，扩增片段长1500bp。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物工程公司)，4℃连接过夜。再将该载体转化入DH5α感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与人苍白杆菌中的16s rRNA有99％的同源性，从而证实分离菌株为人苍白杆菌。

4、人苍白杆菌基因组文库的构建

人苍白杆菌DNA用Sau3A I酶切在10μl反应体系进行部分酶切试验，Sau3A I酶按1∶100稀释，37℃分别酶切10min，20min，30min，40min，50min，60min后加入10×loading buffer 1μl终止反应，电泳检测最适酶切反应时间。而后选择相同的体系酶切30min进行大量酶切。经0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳后，切下长度为2-4kb的DNA片段，用凝胶试剂盒(上海生物工程公司)回收。质粒载体pACYC184(NEB公司)用BamHI完全酶切后SAP碱性磷酸酯酶进行末端去磷酸化，以减少载体自连。上述回收后的菌株DNA(200ng)和末端去磷酸化的质粒载体pACYC184(150ng)用2U的T4ligase在4℃下连接16h。

连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲为2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5.S。复苏后，将菌液涂布于LB(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h。而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒提取。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

5、筛选草甘膦抗性转化子

将大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)涂布与含有50mM草甘膦的M9平板上培养48h，发现有三个菌落生长良好。将这三个菌落分别接种到含有100mM、150mM草甘膦的M9平板上培养，发现只有1个克隆能在含150mM草甘膦的M9平板上生长，其所含的质粒命名为pAroA-O.anthropi，即本发明的EPSP合酶。从该克隆抽提的质粒pAroA-O.anthropi再次转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)中，将转化子用无菌牙签点与含150mM草甘膦的M9固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性确实是由于转入本发明的pAroA-O.anthropi EPSP合酶引起的。

6、草甘膦耐受实验

以P1(5’-gagagaggatccatgtcccattctgcatc-3’)和

P2(5’-gagctctcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3’)为引物，以pAroA-O.anthropi为模板进行EPSP合酶基因AroA-O.anthropi的PCR扩增。以KOD Plus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶(大连宝生物工程公司)，72℃延伸90s，扩增片段长1353bp(如下)。选择pG251(CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamH I(大连宝生物工程公司)酶切并进行胶回收。对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后【Sambrook分子克隆手册1989】，再与外源的DNA片段(即长度为1353bp的EPSP合酶基因AroA-O.anthropi)连接。连接前，将回收的部分酶解的细菌基因组DNA片段与pG251载体DNA，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h。再将该载体转化入DH5α感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，确定重组质粒即(p251-AroA-O.anthropi)的正确性。

采用同样的方法用以下引物：

P3：(5’-CGGGATCCGTTAATGCCGAAATTTTGCTTAATC-3’)和

P4：(5’-CGGAGCTCAGGTCC GAAAAAAAACGCCGAC-3’)

扩增大肠杆菌的EPSP合酶基因AroA-E.coli，同样连接到pG251得到p251-AroA-E.coli重组质粒。

将大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-O.anthropi质粒)和ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)接种到含0-150mM草甘膦的M9液体培养基中，经过37℃、36h的摇床培养后，测定培养物的OD660进行耐受性试验，同时以无插入片断的质粒的大肠杆菌ER2799为阴性对照。

结果：将大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-O.anthropi质粒)和ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)接种到含0-150mM草甘膦的M9液体培养基中，经过37℃、36h的摇床培养后，发现阴性对照在M9中几乎不能生长；而ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)在50mM草甘膦的M9液体培养基中严重受到抑制；而ER2799(携带p251-AroA-O.anthropi质粒)在含有150mM草甘膦的M9液体培养基中还能生长(参见图1)。

实施例2

高耐受草甘膦的DNA片断的序列分析及EPSP合酶功能验证

1、高耐受草甘膦的DNA片断的序列分析

利用逐步序列测定方法对实施例1中所筛选获得的高耐受草甘膦质粒pAroA-O.anthropi，即本发明的EPSP合酶基因全序列进行DNA测序。分析结果表明：插入的片断大小为3100bp，其中包含了一个1353的阅读框，其序列如SEQID NO 1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1353个碱基，编码的氨基酸451个，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

氨基酸序列同源性分析结果表明：AroA-O.anthropi氨基酸序列与II型的来自于农杆菌CP4的EPSP合酶有82.89％的同源性(参见图2)，而与I型的来自于大肠杆菌的EPSP合酶的同源性不足30％，说明AroA-O.anthropi EPSP合酶属于II的EPSP合酶。AroA-O.anthropi EPSP合酶与典型的I型和II型EPSP合酶的系统发育比较结果参见图3。

用在线软件Swiss-model对AroA-O.anthropi EPSP合酶进行3D结构预测(参见图4)，结果表明其3D结构与来自于农杆菌CP4的EPSP合酶的3D结构非常相似。但是它们之间有一个区域存在着非常明显的氨基酸差异，这个区域位于高度保守的Glu-354和Arg-357附近。Glu-354和Arg-357是一个由12个氨基酸(347-358)组成的一个环的一部分，这个环不但影响着PEP或者glyphosate结合，而且影响着这个球状结构从“开放”到“关闭”状态。

实施例3

高耐受草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成

以基因合成方法【Nucleic Acids Research，2004，32，e98】将上述高耐受草甘膦的EPSP合酶基因克隆。设计的引物如下：

1.AroA-1：Tm＝54，60mer

ATG，TCC，CAT，TCT，GCA，TCC，CCG，AAA，CCA，GCA，ACC，GCC，CGC，CGG，TCG，GAG，GCA，CTT，ACG，GGC

2.AroA-2：Tm＝54，60mer

ACG，ATG，CGA，GAT，GGA，TTT，GTC，ACC，CGG，AAT，GCG，AAT，TTC，GCC，CGT，AAG，TGC，CTC，CGA，GCG

3.AroA-3：Tm＝54，60mer

GAC，AAA，TCC，ATC，TCG，CAT，CGT，TCC，TTC，ATG，TTC，GGC，GGC，CTT，GCA，TCG，GGT，GAA，ACC，CGC

4.AroA-4：Tm＝54，60mer

GGT，ATT，GAT，GAC，GTC，TTC，GCC，TTC，CAG，AAG，GCC，GGT，GAT，GCG，GGT，TTC，ACC，CGA，TGC，AAG

5.AroA-5：Tm＝54，60mer

GGC，GAA，GAC，GTC，ATC，AAT，ACC，GGT，CGC，GCC，ATG，CAG，GCC，ATG，GGC，GCG，AAA，ATC，CGC，AAG

6.AroA-6：Tm＝54，60mer

GCC，GTT，GCC，GAC，GCC，ATT，GAT，GAT，CCA，GGC，ATC，GCC，ATC，CTT，GCG，GAT，TTT，CGC，GCC，CAT

7.AroA-7：Tm＝54，60mer

ATC，AAT，GGC，GTC，GGC，AAC，GGC，TGC，CTG，TTG，CAG，CCC，GAA，GCA，GCG，CTC，GAC，TTC，GGC，AAT

8.AroA-8：Tm＝54，60mer

GCC，GAC，AAG，GCC，CAT，GGT，GAG，GCG，CGC，ACC，GGT，TCC，GGC，ATT，GCC，GAA，GTC，GAG，CGC，TGC

9.AroA-9：Tm＝54，60mer

CTC，ACC，ATG，GGC，CTT，GTC，GGC，ACC，TAT，GAC，ATG，AGA，ACC，TCC，TTT，ATC，GGC，GAT，GCC，TCG

10.AroA-10：Tm＝54，60mer

CAA，CGG，GTT，CAG，CAC，GCG，ACC，CAT，CGG，GCG，CTT，GGA，AAG，CGA，GGC，ATC，GCC，GAT，AAA，GGA

11.AroA-11：Tm＝54，60mer

GGT，CGC，GTG，CTG，AAC，CCG，TTG，CGT，GAA，ATG，GGC，GTT，CAG，GTG，GAA，GCA，GCC，GAA，GGC，GAC

12.AroA-12：Tm＝54，60mer

ATT，GGC，CGT，CTT，GGG，GCC，GAT，CAG，CGT，CAG，CGG，CAT，GCG，GTC，GCC，TTC，GGC，TGC，TTC，CAC

13.AroA-13：Tm＝54，60mer

ATC，GGC，CCC，AAG，ACG，GCC，AAT，CCG，ATC，ACC，TAT，CGC，GTG，CCG，ATG，GCA，TCC，GCA，CAG，GTC

14.AroA-14：Tm＝54，60mer

GCC，CGG，CGT，GTT，GAG，ACC，GGC，GAG，CAG，CAC，GGC，GGA，TTT，GAC，CTG，TG C，GGA，TGC，CAT，CGG

15.AroA-15：Tm＝54，60mer

GCC，GGT，CTC，AAC，ACG，CCG，GGC，GTT，ACC，ACC，GTC，ATC，GAG，CCG，GTC，ATG，ACC，CGC，GAC，CAC

16.AroA-16：Tm＝54，60mer

CGA，AAG，ATC，GGC，GCC，AAA，GCC，CTG，CAG，CAT，CTT，TTC，GGT，GTG，GTC，GCG，GGT，CAT，GAC，CGG

17.AroA-17：Tm＝54，60mer

GGC，TTT，GGC，GCC，GAT，CTT，TCG，GTT，GAA，ACC，GAC，AAG，GAC，GGC，GTG，CGC，CAT，ATC，CGC，ATC

18.AroA-18：Tm＝54，60mer

TAC，GTC，GAT，GGT，CTG，GCC，GAT，AAG，CTT，GCC，CTG，TCC，GGT，GAT，GCG，GAT，ATG，GCG，CAC，GCC

19.AroA-19：Tm＝54，60mer

ATC，GGC，CAG，ACC，ATC，GAC，GTA，CCG，GGT，GAT，CCA，TCG，TCA，ACG，GCT，TTC，CCG，CTC，GTT，GCC

20.AroA-20：Tm＝54，60mer

GTT，GCG，GAT，GGT，AAC，ATC，CGA，ACC，TTC，GAC，CAG，AAG，GGC，GGC，AAC，GAG，CGG，GAA，AGC，CGT

21.AroA-21：Tm＝54，60mer

TCG，GAT，GTT，ACC，ATC，CGC，AAC，GTG，CTG，ATG，AAC，CCG，ACC，CGT，ACC，GGC，CTG，ATC，CTG，ACG

22.AroA-22：Tm＝54，60mer

GGC，ATT，GAG，CAC，TTC，GAT，ATC，GGC，GCC，CAT，TTC，CTG，CAA，CGT，CAG，GAT，CAG，GCC，GGT，ACG

23.AroA-23：Tm＝54，60mer

GAT，ATC，GAA，GTG，CTC，AAT，GCC，CGT，CTT，GCC，GGC，GGC，GAG，GAT，GTC，GCC，GAT，CTG，CGC，GTG

24.AroA-24：Tm＝54，60mer

TTC，CGG，CGG，AAC，GAC，AAC，GCC，CTT，CAG，CTT，CGA，GGC，CTT，CAC，GCG，CAG，ATC，GGC，GAC，ATC

25.AroA-25：Tm＝54，60mer

GGC，GTT，GTC，GTT，CCG，CCG，GAA，CGC，GCT，CCG，TCG，ATG，ATC，GAT，GAA，TAT，CCG，GTT，CTG，GCC

26.AroA-26：Tm＝54，60mer

GTC，CAT，CAC，GGT，TTC，GCC，TTC，CGC，GAA，GGA，CGC，GGC，GAT，GGC，CAG，AAC，CGG，ATA，TTC，ATC

27.AroA-27：Tm＝54，60mer

GAA，GGC，GAA，ACC，GTG，ATG，GAC，GGT，CTC，GAC，GAA，CTG，CGC，GTC，AAG，GAA，TCG，GAT，CGT，CTG

28.AroA-28：Tm＝54，60mer

ATC，GAC，GCC，ATT，GGC，TTC，AAG，GCC，GCG，TGC，AAC，CGC，TGC，CAG，ACG，ATC，CGA，TTC，CTT，GAC

29.AroA-29：Tm＝54，60mer

CTT，GAA，GCC，AAT，GGC，GTC，GAT，TGC，ACC，GAA，GGC，GAG，ATG，TCG，CTG，ACG，GTC，CGT，GGT，CGC

30.AroA-30：Tm＝54，60mer

GGT，TGC，GAC，TGT，GCC，ACC，GCC，CAG，TCC，CTT，GCC，GTC，GGG，GCG，ACC，ACG，GAC，CGT，CAG，CGA

31.AroA-31：Tm＝54，60mer

GGC，GGT，GGC，ACA，GTC，GCA，ACC，CAT，CTC，GAT，CAC，CGC，ATC，GCG，ATG，AGC，TTC，CTC，GTC，ATG

32.AroA-32：Tm＝54，60mer

GCT，GTC，GTC，AAC，CGT，CAC，CGG，CTT，TTC，CGA，TGC，AAG，GCC，CAT，GAC，GAG，GAA，GCT，CAT，CGC

33.AroA-33：Tm＝54，60mer

CCG，GTG，ACG，GTT，GAC，GAC，AGC，ACC，ATG，ATC，GCC，ACG，TCC，TTC，CCC，GAA，TTC，ATG，GAC，ATG

34.AroA-34：Tm＝54，34mer

TCA，GTC，CCG，GCA，TCA，TGT，CCA，TGA，ATT，CGG，GGA，A

利用PCR进行EPSP合酶基因扩增，在100μl反应体系中，AroA-2-AroA-33共32个引物的添加量为2ng，外侧引物AroA-1和AroA-34添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，2min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆。

实施例4

高耐受草甘膦的EPSP表达

上述人工合成的EPSP基因的阳性克隆用引物P5(5’-gagagaccatggatgtcccattctgcatc-3’)和P6(5’-gtctcgagtcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3’)进行PCR扩增，以KOD Plus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶(大连宝生物工程公司)，72℃延伸90s，扩增片段长1353bp。PCR产物用Nco I and Xho I酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a(NEB公司)得到重组质粒pET-AroA-O.anthropi并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，将转化子涂布在LB固体培养基中培养24h。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP(Amersham Biosciences公司)对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测，蛋白大小约48kDa，与预测值相符(参见图5)。

实施例5

EPSP酶活测定和动力学参数的测定

1.测定方法

无机磷标准曲线：10mM无机磷按1∶10稀释，分别取0、1、2、3……20μl与1.5ml Eppendorf离心管中，加入纯水至100μl混匀，加入MAT溶液0.8ml混匀，计时三分钟后加入SC溶液100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD660值。重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD660值为总纵坐标作图得到无机磷标准曲线。

1)酶活测定：蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法(Bradford，1976)。在冰上与1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μl，10mMS3P溶液2μl，0.5M HEPES溶液2μl，1mM(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl和双蒸水12μl混匀，与28℃温浴5min后各管样品间隔2s加入5μl纯化蛋白并计时，2min后再间隔2s依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl 34％SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD660值。对照除不加纯化蛋白外，其余同样品管。样品管与对照管的OD660值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到酶的酶活力(nkat/mg)。

2)半抑制量(IC₅₀)测定：上述反应液中添加0、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度(nkat/mg)为Y轴作图。

3)K_m(PEP)测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度(0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM)下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S](Eadic-Hofstee)法作图。

4)K_i(glyphosate)测定：在不同草甘膦浓度(0、10、50、100μM)下测定PEP浓度为0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM时EPSP的酶反应速度。采取双倒数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦的浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为K_i(glyphosate)值。

2.测定结果

本发明的EPSP合酶活性为84.52±0.12nkat/mg，其动力学参数如下表1所示。

表1本发明的EPSP合酶的动力学参数

根据该动力学参数可知：本发明的EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性为将本发明的EPSP合酶用于转基因作物的培育提供了可能。

附：本申请中所涉及到的核苷酸/氨基酸序列表：

<110>上海市农业科学院

<120>来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No 1

<211>1353

<212>DNA

<213>人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)

<400>

ATGTC CCATT CTGCA TCCCC GAAAC CAGCA ACCGC CCGCC GCTCG GAGGC ACTTA CGGGC 60

GAAAT TCGCA TTCCG GGTGA CAAAT CCATC TCGCA TCGTT CCTTC ATGTT CGGCG GCCTT 120

GCATC GGGTG AAACC CGCAT CACCG GCCTT CTGGA AGGCG AAGAC GTCAT CAATA CCGGT 180

CGCGC CATGC AGGCC ATGGG CGCGA AAATC CGCAA GGATG GCGAT GCCTG GATCA TCAAT 240

GGCGT CGGCA ACGGC TGCCT GTTGC AGCCC GAAGC AGCGC TCGAC TTCGG CAATG CCGGA 300

ACCGG TGCGC GCCTC ACCAT GGGCC TTGTC GGCAC CTATG ACATG AGAAC CTCCT TTATC 360

GGCGA TGCCT CGCTT TCCAA GCGCC CGATG GGTCG CGTGC TGAAC CCGTT GCGTG AAATG 420

GGCGT TCAGG TGGAA GCAGC CGAAG GCGAC CGCAT GCCGC TGACG CTGAT CGGCC CCAAG 480

ACGGC CAATC CGATC ACCTA TCGCG TGCCG ATGGC ATCCG CACAG GTCAA ATCCG CCGTG 540

CTGCT CGCCG GTCTC AACAC GCCGG GCGTT ACCAC CGTCA TCGAG CCGGT CATGA CCCGC 600

GACCA CACCG AAAAG ATGCT GCAGG GCTTT GGCGC CGATC TTTCG GTTGA AACCG ACAAG 660

GACGG CGTGC GCCAT ATCCG CATCA CCGGA CAGGG CAAGC TTATC GGCCA GACCA TCGAC 720

GTACC GGGTG ATCCA TCGTC AACGG CTTTC CCGCT CGTTG CCGCC CTTCT GGTCG AAGGT 780

TCGGA TGTTA CCATC CGCAA CGTGC TGATG AACCC GACCC GTACC GGCCT GATCC TGACG 840

TTGCA GGAAA TGGGC GCCGA TATCG AAGTG CTCAA TGCCC GTCTT GCCGG CGGCG AGGAT 900

GTCGC CGATC TGCGC GTGAA GGCCT CGAAG CTGAA GGGCG TTGTC GTTCC GCCGG AACGC 960

GCTCC GTCGA TGATC GATGA ATATC CGGTT CTGGC CATCG CCGCG TCCTT CGCGG AAGGC 1020

GAAAC CGTGA TGGAC GGTCT CGACG AACTG CGCGT CAAGG AATCG GATCG TCTGG CAGCG 1080

GTTGC ACGCG GCCTT GAAGC CAATG GCGTC GATTG CACCG AAGGC GAGAT GTCGC TGACG 1140

GTCCG TGGTC GCCCC GACGG CAAGG GACTG GGCGG TGGCA CAGTC GCAAC CCATC TCGAT 1200

CACCG CATCG CGATG AGCTT CCTCG TCATG GGCCT TGCAT CGGAA AAGCC GGTGA CGGTT 1260

GACGA CAGCA CCATG ATCGC CACGT CCTTC CCCGA ATTCA TGGAC ATGAT GCCGG GACTG 1320

GGCGC CAAGA TCGAA CTGAG CGACG CGCGA TGA 1353

<210>SEQ ID No 2

<211>451

<212>PRT

<213>人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)

<400>

1 MET Ser His Ser Ala Ser Pro Lys Pro Ala Thr Ala Arg Arg Ser Glu Ala Leu Thr Gly

21 Glu Ile Arg Ile Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His Arg Ser Phe MET Phe Gly Gly Leu

41 Ala Ser Gly Glu Thr Arg Ile Thr Gly Leu Leu Glu Gly Glu Asp Val Ile Asn Thr Gly

61 Arg Ala MET Gln Ala MET Gly Ala Lys Ile Arg Lys Asp Gly Asp Ala Trp Ile Ile Asn

81 Gly Val Gly Asn Gly Cys Leu Leu Gln Pro Glu Ala Ala Leu Asp Phe Gly Asn Ala Gly

101 Thr Gly Ala Arg Leu Thr MET Gly Leu Val Gly Thr Tyr Asp MET Arg Thr Ser Phe Ile

121 Gly Asp Ala Ser Leu Ser Lys Arg Pro MET Gly Arg Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu MET

141 Gly Val Gln Val Glu Ala Ala Glu Gly Asp Arg MET Pro Leu Thr Leu Ile Gly Pro Lys

161 Thr Ala Asn Pro Ile Thr Tyr Arg Val Pro MET Ala Ser Ala Gln Val Lys Ser Ala Val

181 Leu Leu Ala Gly Leu Asn Thr Pro Gly Val Thr Thr Val Ile Glu Pro Val MET Thr Arg

201 Asp His Thr Glu Lys MET Leu Gln Gly Phe Gly Ala Asp Leu Ser Val Glu Thr Asp Lys

221 Asp Gly Val Arg His Ile Arg Ile Thr Gly Gln Gly Lys Leu Ile Gly Gln Thr Ile Asp

241 Val Pro Gly Asp Pro Ser Ser Thr Ala Phe Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Val Glu Gly

261 Ser Asp Val Thr Ile Arg Asn Val Leu MET Asn Pro Thr Arg Thr Gly Leu Ile Leu Thr

281 Leu Gln Glu MET Gly Ala Asp Ile Glu Val Leu Asn Ala Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asp

301 Val Ala Asp Leu Arg Val Lys Ala Ser Lys Leu Lys Gly Val Val Val Pro Pro Glu Arg

321 Ala Pro Ser MET Ile Asp Glu Tyr Pro Val Leu Ala Ile Ala Ala Ser Phe Ala Glu Gly

341 Glu Thr Val MET Asp Gly Leu Asp Glu Leu Arg Val Lys Glu Ser Asp Arg Leu Ala Ala

361 Val Ala Arg Gly Leu Glu Ala Asn Gly Val Asp Cys Thr Glu Gly Glu MET Ser Leu Thr

381 Val Arg Gly Arg Pro Asp Gly Lys Gly Leu Gly Gly Gly Thr Val Ala Thr His Leu Asp

401 His Arg Ile Ala MET Ser Phe Leu Val MET Gly Leu Ala Ser Glu Lys Pro Val Thr Val

421 Asp Asp Ser Thr MET Ile Ala Thr Ser Phe Pro Glu Phe MET Asp MET MET Pro Gly Leu

441 Gly Ala Lys Ile Glu Leu Ser Asp Ala Arg -

Claims

1.一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.根据权利要求1所述的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

3.

权利要求1或2所述的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因采用人工方法制备而成。

4.

利要求1或2所述的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因在草甘膦耐受性中的应用。