CN104232600A - 草甘膦抗性提高的葡萄epsps突变体的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用DNA分子重排（DNAShuffling）技术获得了草甘膦抗性增强的来源于葡萄的EPSP合酶多位点突变体及其编码基因与应用。所述突变体含有7个突变位点，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码的碱基序列如SEQIDNo.2所示。试验表明，本发明的来源于葡萄的EPSP合酶多位点突变体及其编码的基因，同时具有较高的草甘膦抗性和较强的与PEP亲和性，这些特性将为该基因用于抗草甘膦转基因作物的培育提供了可能。

Description

草甘膦抗性提高的葡萄EPSPS突变体的制备及其应用
技术领域
本发明属微生物领域，涉及一种来源于葡萄（Vitis vinifera）的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSP合酶/EPSPS）多位点突变体制备及其编码基因与应用，具体涉及一种利用DNA分子重排（DNA Shuffling）和功能互补法对来源于葡萄EPSP合酶基因进行改造获得多位点突变体，然后将其编码的基因应用于草甘膦的抗性研究以及水稻转化、转基因作物培育中。
背景技术
莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。EPSP合酶是莽草酸途径的关键酶，催化3-磷酸莽草酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）。除草剂草甘膦是PEP的结构类似物，能与PEP竞争性抑制EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。迄今为止，成功用于商业化的抗草甘膦转基因作物的基因只有II型的农杆菌 CP4的EPSPS基因。然而由于该基因来源于细菌，因而容易引起普通消费者的心理顾忌。最近有学者报道了来源于可食性植物的EPSPS基因在转基因作物中表现出了良好的草甘膦抗性（Plant Physiol 140:184-195），这就为发展抗草甘膦转基因作物提供了一种新的途径即以植物源的EPSPS基因来为基础来发展抗草甘膦转基因作物。但是来源于植物的野生型EPSPS基因往往对草甘膦很敏感，因而不能直接用于转基因作物的培育。这就需要通过基因工程手段对其进行改造，从而获得新型的来源于植物的功能良好的可用于转基因作物培育的新型基因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于葡萄的EPSP合酶多位点突变体及其编码基因与应用。通过采用DNA分子重排（DNA Shuffling）获得该EPSP合酶多位点突变体文库，然后利用大肠杆菌aroA突变株（ER2799）的功能互补对来源于葡萄的EPSP合酶突变体文库进行筛选，获得了一个含有7个氨基酸突变的多位点突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。经试验验证，该突变体不但在大肠杆菌中表现出显著地高草甘膦抗性，而且在转基因植物中也表现出了稳定的草甘膦抗性。
为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案来实现：
首先，申请人在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）输入5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase and Vitis vinifera, 得到序列号为NM_001281247的编码葡萄5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的mRNA序列。根据此序列设计一对PCR引物（VvEPSPSZ和 VvEPSPSF），以本试验保存的巨峰葡萄cDNA文库（西北植物学报, 2009,29:1723-1729）为模板，RT-PCR扩增获得葡萄EPSP合酶基因（VvEPSPS）的全长cDNA 序列。 
利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收VvEPSPS基因片段，以DNase I 缓冲液（50mmol/L Tris-Cl pH7.4 + 1mmol/L MgCl2）100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10%丙烯酰胺凝胶电泳，透吸袋法回收10~50bp的DNA小片段。进行Primerless PCR扩增，反应体系：5μl小片段DNA + 4μl 2.5mmol/L dNTPs + 4.5μl 25mmol/L MgCl2 + Taq2U + ddH2O 至50μl；反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环。
以无引物PCR扩增产物为模板，以VvEPSPSZ和VvEPSPSF为引物进行PCR扩增。反应体系：5μl Primerless PCR产物 + VvEPSPSZ 0.2ng + VvEPSPSF 0.2ng + 10×PCR Buffer 5μl + 2.5mmol/L dNTPs 4μl + Taq2U + ddH2O至50μl。反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃2.0 min，共35个循环，回收重排的VvEPSPS基因片段。
将上述回收的重排VvEPSPS基因片段，经BamH I和Sac I双酶切后，构建入原核表达载体pG251（CN1338515）启动子和t1t2终止子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，库容达到108，而后用质粒大量提取试剂盒（美国Omega公司）进行质粒提取。取1μl大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）涂布与含有200mM草甘瞵的M9平板上培养48h，将生长良好菌落接种到含有200mM草甘瞵的M9平板上培养，发现只有1个克隆能在含200mM草甘瞵的M9平板上生长，其所含的质粒命名为pVvEPSPSmutant。
利用逐步序列测定法对上述筛选获得的高耐受草甘膦质粒pVvEPSPSmutant全序列进行DNA测序。测序结果显示该突变体在同一分子上含有下述7个突变位点，分别是：突变位点1（Q93R），即EPSP合酶氨基酸序列中第93位上的谷氨酰胺被替换为精氨酸；突变位点2（T113A），即第113位上的苏氨酸被替换为丙氨酸；突变位点3（P117L），即第117位的脯氨酸替换为亮氨酸；突变位点4（G126A），即第126位上的甘氨酸被替换为丙氨酸；突变位点5（C160Y），即第160位上的半胱氨酸被替换为酪氨酸；突变位点6（N239H），即第239位上的天冬酰胺被替换为组氨酸；突变位点7（V343A），即第343位上的缬氨酸被替换为丙氨酸。上述所获得的突变体其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
将上述得到的高耐受草甘膦质粒pVvEPSPSmutant转入水稻，通过水稻种子萌发试验以及草甘膦喷洒试验说明本发明的来源于葡萄的EPSP合酶多位点突变体及其编码的基因（VvEPSPS mutant ），不仅具有较高的草甘膦抗性而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性将为该基因用于转基因作物的培育提供了可能。
本发明所述的术语与其一般概念相同。
所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。
所述的“生物细胞”指微生物、植物细胞或组织。
所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要为细菌。
 
附图说明
图1 为高草甘膦抗性EPSP合酶突变体的体外草甘膦抗性试验。VvEPSPS matant 为本发明所获得的高草甘膦抗性EPSP合酶突变体，VvEPSPS为葡萄野生型EPSP合酶。
图2为转本发明的编码EPSP合酶多位点突变体（VvEPSPSmutant）基因的水稻在含有不同浓度草甘膦平板上的萌发实验图，其中Mur为转本发明的编码EPSP合酶多位点突变体基因的不同水稻株系，WTr为转野生型来源于葡萄的EPSP合酶基因的水稻，CK为对照。
图3为转本发明的编码EPSP合酶突变体（VvEPSPSmutant）基因的水稻用1.0 %（v/v）Roundup喷洒处理表型图，其中Mur1为转本发明的编码EPSP合酶多位点突变体基因的水稻株系，WTr1为转野生型来源于葡萄的EPSP合酶基因的水稻，CK为对照。
具体实施方式
实施例1  EPSP合酶基因的DNA分子重排（DNA Shuffling）
1.1  来源于葡萄的抗草甘膦除草剂基因VvEPSPS的合成
申请人在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）输入5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase and Vitis vinifera,得到序列号为NM_001281247的编码葡萄5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的mRNA序列。根据此序列设计一对PCR引物（VvEPSPSZ：5'-AAGGATCCATGGCCTCTGTCGCCACTAAG
-3' 和 VvEPSPSF： 5'-AAGAGCTCTCAATGTTTGGTAAAACGCTGG-3'），以本试验保存的巨峰葡萄cDNA文库（西北植物学报, 2009,29:1723-1729）为模板，RT-PCR扩增获得葡萄EPSP合酶基因（VvEPSPS）的全长cDNA 序列。反应体系：1μlcDNA + 4μl 2.5mmol/L dNTPs + 25μl Buffer + KOD Plus（Toyobo日本）聚合酶1U + 1μl VvEPSPSZ + 1μl VvEPSPSF +ddH2O至50μl；反应程序为：94℃30s，54℃30s，72℃120s，共45个循环），2% Agrose电泳检测PCR扩增结果。
PCR结束后，1%（w/v）琼脂糖胶回收，采用TArget Clone -Plus-试剂盒（Toyobo日本）连接。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得含有VvEPSPS基因的阳性克隆，抽提质粒，测序。即得到野生型葡萄EPSP合酶基因（VvEPSPS）。
1.2  PCR扩增EPSP合酶基因及回收
以上述所获得的含有VvEPSPS基因的阳性质粒为模板，VvEPSPSZ和VvEPSPSF为引物扩增EPSP合酶基因，反应条件为：94℃10min预变性，94℃变性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30个循环，1% Agrose电泳，透吸袋法回收得1368bp的EPSP合酶基因片段。
1）DNase I降解DNA及回收小片段
上述回收的EPSP合酶基因片段以DNase I缓冲液（50mmol/L Tris-Cl pH7.4 + 1mmol/L MgCl2）100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10%丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10~50bp的小片段。用10μl 10×无引物PCR缓冲液（Primerless PCR Buffer）（50mmol/L KCl + 10mmol/L Tris-Cl pH9.0 + 1% Triton）溶解沉淀。
2）无引物PCR（Primerless PCR）
进行Primerless PCR扩增。反应体系：5μl小片段DNA + 4μl 2.5mmol/L dNTPs + 4.5μl 25mmol/L MgCl2 + Taq2U + ddH2O至50μl；反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环），2% Agrose电泳检测PCR扩增结果。
3）有引物PCR（Primer PCR）
以上述无引物PCR扩增产物为模板，以VvEPSPSZ和VvEPSPSF为引物进行PrimerPCR扩增反应。反应体系：5μl Primerless PCR产物 + VvEPSPSZ 0.2ng + VvEPSPSF 0.2ng + 10×PCR Buffer 5μl + 2.5mmol/L dNTPs 4μl + Taq2U + ddH2O至50μl。反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35个循环，1%Agrose电泳检测，回收得1368bp重排的EPSP合酶基因片段。
实施例2  高草甘膦抗性EPSP合酶突变体筛选及序列分析
2.1  高草甘膦抗性EPSP合酶突变体的筛选
将上述回收重排的EPSP合酶基因片段经BamH I和Sac I双酶切后，构建入原核表达载体pG251（CN1338515）启动子和t1t2终止子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，库容达到108，而后用质粒大量提取试剂盒（美国Omega公司）进行质粒提取。
取1μl大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）涂布与含有200mM草甘瞵的M9平板上培养48h，发现有一个菌落生长良好。将该克隆抽提的质粒（pVvEPSPSmutant）再次转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）中，将转化子用无菌牙签点与含200mM草甘瞵的M9固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性确实是由于转入了该pVvEPSPSmutant质粒引起的。
2.2  高耐受草甘膦的EPSP合酶突变体的序列分析
利用逐步序列测定方法对2.1筛选所获得的高耐受草甘膦质粒pVvEPSPSmutant全序列进行DNA测序。分析结果表明，该高抗草甘膦突变体在同一分子上含有下述7个突变位点，具体是：突变位点1（Q93R），即EPSP合酶氨基酸序列中第93位上的谷氨酰胺被替换为精氨酸；突变位点2（T113A），即第113位上的苏氨酸被替换为丙氨酸；突变位点3（P117L），即第117位的脯氨酸替换为亮氨酸；突变位点4（G126A），即第126位上的甘氨酸被替换为丙氨酸；突变位点5（C160Y），即第160位上的半胱氨酸被替换为酪氨酸；突变位点6（N239H），即第239位上的天冬酰胺被替换为组氨酸；突变位点7（V343A），即第343位上的缬氨酸被替换为丙氨酸。上述所获得的突变体其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
实施例3  体外草甘膦抗性试验
将实施例1所获得的野生型VvEPSPS基因用BamH I和Sac I双酶切后，构建入原核表达载体pG251得到质粒pVvEPSPS。用大肠杆菌ER2799菌株分别转化pVvEPSPS质粒和实施例2所获得的pVvEPSPSmutant质粒，涂布于M9平板上培养48h，用牙签挑取各自转化子接种于LB液体培养基中培养，待浓度达到5 × 103 cells/μL时，分别取2μL各自细胞液以及1/5和1/25稀释后的细胞液点样于含有不同浓度草甘膦（0，50mM，200mM）的M9平板上，培养48h后观察到50mM 草甘膦已经基本抑制了野生型VvEPSPS 细胞的生长。然而在草甘膦浓度为200mM时，突变体VvEPSPSmutant细胞则仍然可以增殖。由此可见突变体VvEPSPSmutant相对于野生型VvEPSPS来说具有较高的体外草甘膦耐受性，结果参看图1。
实施例3  高草甘膦抗性的EPSP合酶突变体的原核表达
3.1  EPSP合酶多位点突变体基因在大肠杆菌中的表达
以上述筛选获得的EPSP合酶多位点突变体基因为模版，用引物VvEPSPSZ和VvEPSPSF进行PCR扩增，以KOD Plus（Toyobo日本）为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶（大连宝生物工程公司），72℃延伸90s，扩增片段长1368bp。PCR产物用BamH I和Sac I酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a（NEB公司）得到重组质粒pET-VvEPSPSmutant并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司），将转化子涂布在LB固体培养基中培养24h。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP（Amersham Biosciences公司）对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测，本发明的EPSP合酶多位点突变体基因（VvEPSPS mutant）编码的EPSP合酶突变体（VvEPSPSmutant）蛋白大小约50kDa，与预测值相符。
实施例4  VvEPSPS mutant的酶活测定和动力学参数测定
4.1  测定方法
无机磷标准曲线：10 mM无机磷按1 : 10稀释，分别取0、1、2、3…20μl与1.5ml Eppendorf离心管中，加入纯水至100μl混匀，加入MAT溶液（0.045%孔雀石绿:4.2%钼酸铵=3:1,V/V）0.8ml混匀，计时三分钟后加入SC溶液（34%柠檬酸三钠）100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD660值。重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD660值为纵坐标作图得到无机磷标准曲线。
1、酶活测定：蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford，1976）。在冰上与1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μl、10 mM S3P溶液2μl、0.5M HEPES溶液2μl、1mM (NH4)6MO7O24·4H2O溶液2μl和双蒸水12μl混匀，与28℃温浴5min后各管样品间隔2s加入5μl纯化蛋白并计时，2min后再间隔2s依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl 34% SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD660值。对照除不加纯化蛋白外，其余同样品管。样品管与对照管的OD660值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到酶的酶活力。
2、半抑制量（IC50）测定：上述反应液中添加0、10-3、10-2、10-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度（nkat/mg）为Y轴作图。
3、Km（PEP）测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度（0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM）下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S]（Eadic-Hofstee）法作图。
4、Ki（glyphosate）测定：在不同草甘膦浓度（0、10、50、100μM）下测定PEP浓度为0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM时EPSP的酶反应速度。采取双倒数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦的浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为Ki（glyphosate）值。
4.2  测定结果
本发明的VvEPSPS mutant的酶动力学参数如下表1所示。
表1  EPSP合酶多位点突变体的动力学参数
根据VvEPSPSmutant的酶动力学参数可知，本发明的VvEPSPSmutant不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性将为该VvEPSPSmutant合酶多位点突变体基因用于转基因作物的培育提供可能。
实施例5  水稻的转化及其草甘膦抗性的试验
5.1  转基因水稻的获得
1、农杆菌的准备
1）挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养20h。
2）取1mL菌液转接入20~30mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD600 ≈ 1.5。
3）8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5wt%蔗糖，0.05wt% Silwet L-77）并稀释至OD600 ≈ 0.8。
2、农杆菌侵染及与水稻愈伤组织的共培养将预培养4天的成熟胚来源的胚性愈伤组织或培养4~5d的未成熟胚来源的初生愈伤组织立即浸入准备好的农杆菌悬浮液中，侵染30min后，然后将愈伤组织在无菌滤纸上吸除多余的菌液，直接转入共培养培养基于23℃黑暗条件下培养3~4d。
3、抗性愈伤组织的筛选
将共培养的愈伤组织转出，无菌水漂洗3~4次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，将愈伤组织转入选择培养基上，28℃暗培养，两周继代一次。
4、植株再生
经2~3代筛选后，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上进行预分化处理；暗培养5~7天后再将抗性愈伤组织转移到分化培养基（每天16h光照、8h黑暗、28℃条件下进行分化，再生的小苗剪去原有的根，在生根培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆栽，即获得转基因水稻，最初几天保持湿度，后续栽培管理按照常规方法进行。
5.2  转基因水稻的种子萌发试验
将T1代转突变体VvEPSPSmutant基因的5个株系（Mur1- Mur5），野生型VvEPSPS的2个株系（WTr1和 WTr2）和CK种子首先用75%的酒精浸泡1min进行表面消毒，然后用2%活性氯含量的NaClO溶液（加1~3滴Tween 20）浸泡60min以上（最长可至2h），并不时摇动，然后用无菌水冲洗4~5次。接下来将种子均匀的分布在含有不同浓度草甘膦（0，500uM，1000uM）的1/2MS平板上，Parafilm膜封口，放置在恒温室里25°C，16小时光照培养6天观察种子的萌发情况，结果参看图2。
试验发现：CK对照和转野生型VvEPSPS基因的种子在草甘膦浓度为500μM时生长受到严重抑制，而转本发明的VvEPSPSmutant突变体基因的种子（Mur1, Mur3和Mur5）生长良好，且在草甘膦浓度为1000μM转突变体VvEPSPSmutant基因的株系Mur1和Mur5仍然生长良好，而且形态正常。
（三）转基因水稻的草甘膦喷洒试验
将T3代转突变体VvEPSPSmutant基因的株系1（Mur1）和野生型VvEPSPS的一个株系（WTr1）和CK对照种子首先用75%的酒精浸泡1min进行表面消毒，然后用2%活性氯含量的NaClO溶液（加1~3滴Tween 20）浸泡60min以上（最长可至2h），并不时摇动，然后用无菌水冲洗4~5次。接下来将种子包在纱布里浸泡在含有水分的平皿上，37℃，培养4天，待种子露白后移栽到营养铂里，放置在恒温室里25°C，16小时光照培养。待小苗子长到12~15厘米高时用1.0%（v/v）Roundup喷洒，观察苗子的生长情况，结果参看图3。
试验发现：用Roundup处理10天后，对照和野生型WTr1苗子已经开始枯萎，而转本发明的VvEPSPSmutant的EPSP合酶突变体基因的苗子则生长良好，而且形态正常。
 
附母液及各培养基配方：
一、母液（stock solution）配方
1、MSmax母液（stock solution） (10X)
NH4NO3        16.5g
KNO3          19.0g
MgSO4·7H2O    3.7g
CaCl2·2H2O       4.4g
加水定容至1000ml。
2、MSmin母液（stock solution） (100X)
KI              0.083g
H3BO4          0.62g
MnSO4·2H2O    2.23g
ZnSO4·7H2O     0.86g
Na2MoO4·2H2O   0.025g
CuSO4·5H2O     0.0025g
CoCl2·2H2O       0.0025g
加水定容至1000ml。
3、N6max 母液（stock solution） (10X)
KNO3            28.3g
KH2PO4          4.0g
(NH4)2·SO4        4.63g
MgSO4·7H2O     1.85g
CaCl2·2H2O     1.66g
加水定容至1000ml。
4、N6min 母液（stock solution） (100X)
KI             0.08g
H3BO4             0.16g
MnSO4·2H2O      0.44g
ZnSO4·7H2O      0.15g
加水定容到1000ml
5、Fe2+-EDTA 母液(100X)
FeSO4·7H2O      2.78g
Na2EDTA·2H2O   3.73g
单独溶解，然后混合，加水定容至1000ml。
6、维生素母液（Vitamin stock solution） (100X)
烟酸（Nicotinic acid）         0.1g
维生素B6（Pyridoxine HCl，VB6）  0.1g
维生素B1（Thiaminc HCl，vb1）    0.1g
甘氨酸（Glycine）            0.2g
肌糖（Inositol）              10g
加水定容至1000ml。
二、培养基配方
1、共培养培养基
N6max 母液（N6max stock solution） (10X)             12.5ml
N6min 母液（N6min stock solution ）(100X)                1.25ml
Fe2+-EDTA 母液（Fe2+-EDTA stock solution） (100X)   2.5ml
维生素母液（Vitamin stock solution）(100X)              2.5ml
二氯苯氧乙酸2g/L（2,4-D）                       0.75ml
酶水解酪素（Casein Enzymatic Hydrolysate）           0.2g
蔗糖（Sucrose）                                   5g
琼脂粉（Agarose）                                      1.75g
加水至250ml调pH＝5.6用前微波炉融化加5ml 50%葡萄糖和250μl 20g/L乙酰丁香酮。
2、选择培养基
N6max 母液（N6max stock solution） (10X)             25ml
N6min 母液（N6min stock solution） (100X)               2.5ml
Fe2+-EDTA母液（Fe2+-EDTA stock solution） (100X)    2.5ml
维生素母液（Vitamin stock solution） (100X)            2.5ml
二氯苯氧乙酸2g/L（2,4-D）                             0.625ml
酶水解酪素（Casein Enzymatic Hydrolysate）          0.15g
蔗糖（Sucrose）                                        7.5g
琼脂粉（Agarose）                                1.75g
加水至250ml调pH＝6.0，用前融化加潮霉素和羧苄。
3、预分化培养基
MSmax母液(MSmax stock solution) (10X)            25ml
MSmin母液（MSminstock solution ) (100X)           2.5ml
Fe2+-EDTA母液（Fe2+-EDTA stock solution) (100X)    2.5ml
维生素母液（Vitamin stock solution) (100X)            2.5ml
6-苄胺基嘌呤2g/L （6-BA）                     0.5ml
激动素2g/L（KT）                                    0.5ml
吲哚乙酸1mg/ml（IAA）                             50μl
酶水解酪素（Casein Enzymatic Hydrolysate)         0.15g
蔗糖（Sucrose)                                       7.5g
琼脂粉（Agarose)                               1.75g
加水至250m调pH＝5.9，用前融化加潮霉素和羧苄。
4、分化培养基
MSmax母液（MSmaxstock solution) (10X)              100ml
MSmin母液（MSminstock solution ) (100X)           10ml
Fe2+-EDTA母液（Fe2+-EDTA stock solution) (100X)   10ml
维生素母液（Vitamin stock solution) (100X)            10ml
6-苄胺基嘌呤2g/L (6-BA)                              2.0ml
激动素2g/L（KT ）                                    2.0ml
吲哚乙酸1mg/ml（IAA）                         0.2ml
萘乙酸1g/L （NAA）                            0.2ml
酶水解酪素（Casein Enzymatic Hydrolysate )          1g
蔗糖（Sucrose)                                         30g
植物凝胶（Phytagel)                                  3g
加水至1000ml调pH＝6.0，分装小瓶。
5、生根培养基
MSmax母液（MSmaxstock solution) (10X)        50ml
MSmin母液 （MSminstock solution) (100X)       5ml
Fe2+-EDTA （Fe2+-EDTA stock solution) (100X)  10ml
维生素母液（Vitamin stock solution ) (100X)     10ml
琼脂粉（Sucrose)                           20g
植物凝胶（Phytagel )                        3g
加水至1000ml调pH＝5.8，分装小瓶。
<110> 上海市农业科学院
<120> 来源于葡萄的EPSP合酶多位点突变体及其编码的基因和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> SEQ ID No 1
<211> 455
<212> PRT
<213> Vitis vinifera
MASVATKEKP STAPEIVLQP IKEISGTITL PGSKSLSNRI LLLAALSEGT TVVDNLLNSE  60
DVHYMLGALR TLGLHVEEQS ENKRVIVQGC GGRFPAGNGS VGEVQLFLGN AGAAMRLLTA  120
AVTAAAGNAS YVLDGVPRMR ERPIGDLVTG LKQLGADVNY FLGTNCPPVR VNGNGGLPGG  180
KVKLSGSISS QYLTALLMAA PLALGDVEIE IIDKLISIPY VEMTLKLMER FGVSVEHSHT  240
WDRFLIRGGQ KYKSPGNAFV EGDASSASYF LAGAAVTGGT VTVEGCGTSS LQGDVKFAEV  300
LEQMGAKVSW MENSVTVTGP PRDSSGRKHL RAIDVNMNKM PDAAMTLAVV ALYADGPTAI  360
RDVASWRVKE TERMIAICTE LRKLGATVEE GPDYCVITPP EKLNVTSIDT YDDHRMAMAF  420
SLAACADVPV TIKDPGCTRK TFPDYFEVLQ RFTKH*                            455
 
 
<210> SEQ ID No 2
<211> 1368
<212> DNA
<213> Vitis vinifera
atggcctctg tcgccactaa ggagaagccg tcgacggcgc cggagattgt cctgcaaccc  60
attaaagaga tctccggcac catcacgttg ccgggttcca agtccctttc caatcggatc  120
ctgcttctag ctgctctctc tgagggaact actgttgtgg acaatttgtt aaatagtgag  180
gatgtccatt acatgctcgg agcactgagg acccttgggc tacatgtgga agagcaaagt  240
gaaaataaaa gagttattgt gcaaggttgt gggggccgat ttccagcggg aaatggatcg  300
gtaggtgaag tccaactttt cctaggaaat gctggagcag caatgcgtct attgacagcc  360
gcagttacag ctgctgctgg aaatgcaagc tatgtacttg atggggtgcc gcgcatgaga  420
gaaagaccaa ttggggatct agtcacaggt cttaagcagc tcggtgcaga cgttaactac  480
tttctcggaa caaactgccc tcctgttcgt gttaatggga atggaggcct tccaggagga  540
aaggtgaagc tctctggatc aattagtagt caatacttga ctgctttgct tatggcagct  600
cccttggctc taggagatgt ggagattgag attattgata aacttatttc cattccttat  660
gttgaaatga ccttgaaatt gatggaacgt tttggggtta gtgtagagca cagtcataca  720
tgggaccgat tcttgatccg aggaggtcaa aaatacaagt ctcctggaaa tgcttttgtt  780
gagggtgatg cttctagtgc tagttacttc ctagccggtg cagctgtaac tggtgggact  840
gtcacagttg aaggctgtgg gacaagcagc ctacaggggg atgtaaaatt tgctgaggtt  900
cttgagcaaa tgggtgcaaa agtttcctgg atggagaaca gtgtcacagt cacaggccca  960
ccccgagatt cttctggaag gaaacactta cgtgccattg acgtcaacat gaacaagatg  1020
ccagatgctg ccatgactct tgctgtagtt gccctttatg ctgatgggcc gactgccatc  1080
agagatgtgg ctagttggag agtgaaggag accgaaagga tgattgccat ttgcacagaa  1140
ctcaggaagc tgggagcaac agttgaagaa gggcctgatt actgtgtgat cactccaccc  1200
gaaaaactaa acgtgacatc aatagacaca tacgacgatc acaggatggc catggcattt  1260
tctcttgctg cctgtgcaga tgttccagta accatcaagg atcctggttg cacccggaag  1320
accttccctg actacttcga agtcctccag cgttttacca aacattga               1368
 

Claims (4)

1.一种来源于葡萄（Vitis vinifera）的EPSP合酶多位点突变体，其特征在于，所述多位点突变体含有下述7个突变位点：
突变位点1：Q93R，即EPSP合酶氨基酸序列中第93位上的谷氨酰胺被替换为精氨酸；
突变位点2：T113A，即第113位上的苏氨酸被替换为丙氨酸；
突变位点3：P117L，即第117位的脯氨酸替换为亮氨酸；
突变位点4：G126A，即第126位上的甘氨酸被替换为丙氨酸；
突变位点5：C160Y，即第160位上的半胱氨酸被替换为酪氨酸；
突变位点6：N239H，即第239位上的天冬酰胺被替换为组氨酸；
突变位点7：V343A，即第343位上的缬氨酸被替换为丙氨酸。
2. 编码权利要求1所述的来源于葡萄（Vitis vinifera）的EPSP合酶多位点突变体，其特征在于，所述多位点突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.编码权利要求1所述的来源于葡萄（Vitis vinifera）的EPSP合酶多位点突变体，其特征在于，所述多位点突变体的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
4.权利要求2或3所述的编码来源于葡萄（Vitis vinifera）的EPSP合酶多位点突变体的基因在抗草甘膦转基因水稻培育中的应用。
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