CN103205404A

CN103205404A - 来源于苹果的epsp合酶多位点突变体及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103205404A
Application number: CN2013100984792A
Authority: CN
Inventors: 田永生; 许晶; 姚泉洪; 彭日荷; 赵伟; 付晓燕; 韩红娟; 高建杰; 韩静; 王波; 王丽娟
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2033-03-26
Also published as: CN103205404B

Abstract

本发明公开了一种来源于苹果的EPSP合酶多位点突变体及其编码基因与应用。所述突变体含有8个突变位点，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的碱基序列如SEQ ID No.2所示。试验表明，本发明的来源于苹果的EPSP合酶多位点突变体及其编码的基因，不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性将为该基因用于转基因作物的培育提供了可能。

Description

来源于苹果的EPSP合酶多位点突变体及其编码基因与应用

技术领域

本发明属微生物领域，涉及一种来源于苹果（Malus domestica）的EPSP合酶多位点突变体及其编码基因与应用，具体涉及一种利用DNA分子重排（DNA Shuffling）和功能互补法对来源于苹果的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSP合酶）基因进行改造获得多位点突变体，然后将其编码的基因应用于草甘膦的抗性研究以及水稻转化、转基因作物培育中。

背景技术

莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。EPSP合酶是莽草酸途径的关键酶，催化3-磷酸莽草酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）。除草剂草甘膦是PEP的结构类似物，能与PEP竞争性抑制EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。迄今为止，成功用于商业化的抗草甘膦转基因作物的基因只有II型的CP4-EPSPS基因。

草甘膦的广泛使用及其非选择性的特点，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦转基因作物成为研究热点。我国作为草甘膦生产和出口的大国，目前我国还尚没有拥有自主知识产权的、适用于转基因抗草甘膦作物的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因，因而在国际竞争中处于不利地位。因此，寻找拥有自主知识产权的高抗草甘膦EPSPS新基因、开展对EPSPS活性位点的研究，寻找抗草甘膦新基因中的突变位点以及改造、利用该新基因培育新型抗草甘膦转基因作物均具有积极意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于苹果的EPSP合酶多位点突变体及其编码基因与应用。通过采用DNA分子重排（DNA Shuffling）获得该EPSP合酶多位点突变体，然后利用大肠杆菌aroA突变株（ER2799）的功能互补对来源于苹果的EPSP合酶突变体文库进行筛选，获得了一个含有8个氨基酸突变的多位点突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。经试验验证，该突变体不但在大肠杆菌中表现出显著地高草甘膦抗性，而且在转基因植物中也表现出了稳定的草甘膦抗性。

为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案来实现。

首先，本发明通过基因合成方法（Nucleic Acids Research，2004，32，e98），设计22对引物（MdEPSPS-1～MdEPSPS-44）合成苹果EPSP合酶基因MdEPSP。

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收MdEPSP基因片段，以DNase I缓冲液（50mmol/L Tris-ClpH7.4+1mmol/L MgCl₂）100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10%丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10～50bp的DNA小片段。进行Primerless PCR扩增，反应体系：5μl小片段DNA+4μl2.5mmol/L dNTPs+4.5μl25mmol/L MgCl₂+Taq2U+ddH₂O至50μl；反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环。

以无引物PCR扩增产物为模板，以MdEPSPS-1，MdEPSPS-44为引物进行PCR扩增。反应体系：5μl Primerless PCR产物+MdEPSPS-10.2ng+MdEPSPS-440.2ng+10×PCR Buffer5μl+2.5mmol/L dNTPs4μl+Taq2U+ddH₂O至50μl。反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35个循环，回收1332bp重排EPSP合酶基因片段。

将上述回收的重排EPSP合酶基因片段，经BamH I和Sac I双酶切后，构建入原核表达载体pG251（CN1338515）启动子和t1t2终止子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，库容达到10⁸，而后用质粒大量提取试剂盒（美国Omega公司）进行质粒提取。取1μl大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）涂布与含有50mM草甘瞵的M9平板上培养48h，将生长良好菌落接种到含有80mM草甘瞵的M9平板上培养，发现只有1个克隆能在含80mM草甘瞵的M9平板上生长，其所含的质粒命名为pMdEPSPS_mutant。

利用逐步序列测定法对上述筛选获得的高耐受草甘膦质粒pMdEPSPS_mutant全序列进行DNA测序。测序结果显示该突变体在同一分子上含有1至8个突变位点，分别如下：突变位点1（N63D），即EPSP合酶氨基酸序列中第63位上的天冬酰胺被替换为天冬氨酸；突变位点2（N86S），即第86位上的天冬酰胺被替换为丝氨酸；突变位点3（T101A），即第101位的苏氨酸替换为丙氨酸；突变位点4（A187T），即第187位上的丙氨酸被替换为苏氨酸；突变位点5（D230G），即第230位上的天冬氨酸被替换为甘氨酸；突变位点6（H317R），即第317位上的谷氨酰胺被替换为精氨酸；突变位点7（Y399R），即第399位上的酪氨酸被替换为精氨酸；突变位点8（C413A），即第413位上的半胱氨酸被替换为丙氨酸。上述所获得的突变位点均为关键位点，其序列全长如SEQ ID No.1所示，编码的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

试验证明，本发明的来源于苹果的EPSP合酶多位点突变体及其编码的基因（MdEPSPS_mutant），不仅具有较高的草甘膦抗性，使草甘膦的抗性能力大幅度提高，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性将为该基因用于转基因作物的培育提供了可能。

本发明所述的术语与其一般概念相同。

所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。

所述的“生物细胞”指微生物、植物细胞或组织。

所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要为细菌。

附图说明

图1为转本发明的编码EPSP合酶多位点突变体（MdEPSPS_mutant）基因的水稻在含有不同浓度草甘膦平板上的萌发实验图，其中Mu2和Mu5分别为转本发明的编码EPSP合酶多位点突变体基因的不同的水稻株系，MdEPSPS_wt为转野生型来源于苹果的EPSP合酶基因的水稻，CK为对照。

图2为转本发明的编码EPSP合酶突变体（MdEPSPS_mutant）基因的水稻用2.5%（v/v）Roundup喷洒处理表型图，其中Mu2和Mu5分别为转本发明的EPSP合酶突变体基因的不同的水稻株系，MdEPSPS_wt为转野生型来源于苹果的EPSP合酶基因的水稻，CK为对照。

具体实施方式

实施例1EPSP合酶基因的DNA分子重排（DNA Shuffling）

1.1来源于苹果的抗草甘磷除草剂基因MDEPSPS的合成

通过基因合成方法（Nucleic Acids Research，2004，32，e98）合成来源于苹果的EPSP合酶基因MdEPSPS，所设计的22对引物序列如下：

1.MdEPSPS-1:Tm=54,60mer

ATGCCGGAGATTGTGCTGCAACCCATCCAAGAAATCTCGGGCACCATAAAGTTGCCGGGT

2.MdEPSPS-2:Tm=54,60mer

CAGCAGAATTCGATTCGACAACGACTTGGAACCCGGCAACTTTATGGTGCCCGAGATTTC

3.MdEPSPS-3:Tm=54,60mer

TCCAAGTCGTTGTCGAATCGAATTCTGCTGATTGCTGCTCTCTCTGAGGGAACAACTGTT

4.MdEPSPS-4:Tm=54,60mer

AATATCTTCACTATCTAACAAGTTGTCAACAACAGTTGTTCCCTCAGAGAGAGCAGCAAT

5.MdEPSPS-5:Tm=54,60mer

GTTGACAACTTGTTAGATAGTGAAGATATTCATTATATGCTTGGTGCATTGAAAACCCTT

6.MdEPSPS-6:Tm=54,60mer

GTTTTCCTTGTCCTCTTCAACATCCAGCCCAAGGGTTTTCAATGCACCAAGCATATAATG

7.MdEPSPS-7:Tm=54,60mer

GGGCTGGATGTTGAAGAGGACAAGGAAAACAGGCGAGCGGTCGTGGAGGGTTGTGGTGGT

8.MdEPSPS-8:Tm=54,60mer

ATCTACTGATTCACTACTCAAAGGAAACCGACCACCACAACCCTCCACGACCGCTCGCCT

9.MdEPSPS-9:Tm=54,60mer

CGGTTTCCTTTGAGTAGTGAATCAGTAGATGAAGTGCAACTATTCCTTGGAAATGCTGGA

10.MdEPSPS-10:Tm=54,60mer

AACTGCAGCAGTCAATGGCCGCATTGCTGCTCCAGCATTTCCAAGGAATAGTTGCACTTC

11.MdEPSPS-11:Tm=54,60mer

GCAGCAATGCGGCCATTGACTGCTGCAGTTGTTGCTGCTGGTGGACATGCTAGGTATGTA

12.MdEPSPS-12:Tm=54,60mer

TCTCTCCCTCATTCGGGGCACCCCATCAAGTACATACCTAGCATGTCCACCAGCAGCAAC

13.MdEPSPS-13:Tm=54,60mer

CTTGATGGGGTGCCCCGAATGAGGGAGAGACCAATCGGAGACTTAGTTGATGGTCTTAAG

14.MdEPSPS-14:Tm=54,60mer

AAGAAAACAATCAGCATCCGCACCAAGCTGCTTAAGACCATCAACTAAGTCTCCGATTGG

15.MdEPSPS-15:Tm=54,60mer

CAGCTTGGTGCGGATGCTGATTGTTTTCTTGGAACAAACTGCCCTCCTGTCCGTGTGATT

16.MdEPSPS-16:Tm=54,60mer

CACCTTCCCTCCTGGAAGGCCTCCCTTTCCAATCACACGGACAGGAGGGCAGTTTGTTCC

17.MdEPSPS-17:Tm=54,60mer

GGAAAGGGAGGCCTTCCAGGAGGGAAGGTGAAGCTCTCTGGATCAATTAGTAGTCAGTAC

18.MdEPSPS-18:Tm=54,60mer

CAAAGGAGCTGTCATAAGCAAAGCAGTCAAGTACTGACTACTAATTGATCCAGAGAGCTT

19.MdEPSPS-19:Tm=54,60mer

TTGACTGCTTTGCTTATGACAGCTCCTTTGGCCCTTGGAGATGTTGAAATAGAGATTATT

20.MdEPSPS-20:Tm=54,60mer

TTCCACATACGGAATGGAAATTAGTTTATCAATAATCTCTATTTCAACATCTCCAAGGGC

21.MdEPSPS-21:Tm=54,60mer

GATAAACTAATTTCCATTCCGTATGTGGAAATGACTTTGAAGTTGATGGAACGCTTTGGG

22.MdEPSPS-22:Tm=54,60mer

ACCCCAACTACCACTGTGTTCCACTGAGACCCCAAAGCGTTCCATCAACTTCAAAGTCAT

23.MdEPSPS-23:Tm=54,60mer

GTCTCAGTGGAACACAGTGGTAGTTGGGGTCGGTTTTTGATCCAAGGAGGTCAAAAGTAC

24.MdEPSPS-24:Tm=54,60mer

GCCTTCGACAAAAGCATTTCCAGGAGACTTGTACTTTTGACCTCCTTGGATCAAAAACCG

25.MdEPSPS-25:Tm=54,60mer

AAGTCTCCTGGAAATGCTTTTGTCGAAGGCGATGCTTCAAGTGCTAGTTACTTTCTAGCT

26.MdEPSPS-26:Tm=54,60mer

AGTGACAGTCCCACCAGTGACAGCAGCACCAGCTAGAAAGTAACTAGCACTTGAAGCATC

27.MdEPSPS-27:Tm=54,60mer

GGTGCTGCTGTCACTGGTGGGACTGTCACTGTTGAAGGCTGTGGGACAAGCAGTTTACAG

28.MdEPSPS-28:Tm=54,60mer

TTCAAGAACTTCAGCGAACTTTACATCTCCCTGTAAACTGCTTGTCCCACAGCCTTCAAC

29.MdEPSPS-29:Tm=54,60mer

GGAGATGTAAAGTTCGCTGAAGTTCTTGAAAAGATGGGTGCTAAAGTTACATGGACAGAG

30.MdEPSPS-30:Tm=54,60mer

TCGTTGAGGTCCTGTAACTGTGACAGAATTCTCTGTCCATGTAACTTTAGCACCCATCTT

31.MdEPSPS-31:Tm=54,60mer

AATTCTGTCACAGTTACAGGACCTCAACGACTTTCTTCTGGAGGAAAACGCTTGAAAGCT

32.MdEPSPS-32:Tm=54,60mer

ATCTGGCATTTTGTTCATGTTGACGTCAACAGCTTTCAAGCGTTTTCCTCCAGAAGAAAG

33.MdEPSPS-33:Tm=54,60mer

GTTGACGTCAACATGAACAAAATGCCAGATGTTGCCATGACTCTTGCTGTAGTTGCTCTT

34.MdEPSPS-34:Tm=54,60mer

ATCTCTTATGGCAGTTTGTCCATCGGCAAAAAGAGCAACTACAGCAAGAGTCATGGCAAC

35.MdEPSPS-35:Tm=54,60mer

TTTGCCGATGGACAAACTGCCATAAGAGATGTGGCAAGTTGGAGAGTGAAGGAGACAGAA

36.MdEPSPS-36:Tm=54,60mer

TCTTAGTTCAGTGCATATGGCGATCATCCTTTCTGTCTCCTTCACTCTCCAACTTGCCAC

37.MdEPSPS-37:Tm=54,60mer

AGGATGATCGCCATATGCACTGAACTAAGAAAGCTGGGAGCAACCGTTGAAGAGGGACCA

38.MdEPSPS-38:Tm=54,60mer

TTTTTCTGGCGGTGTGATTATGCAGTAATCTGGTCCCTCTTCAACGGTTGCTCCCAGCTT

39.MdEPSPS-39:Tm=54,60mer

GATTACTGCATAATCACACCGCCAGAAAAATTAAACTTGACTGCAATAGACACGCGTGAT

40.MdEPSPS-40:Tm=54,60mer

AAGAGAGAAAGCCATGGCCATTCGGCGGTCATCACGCGTGTCTATTGCAGTCAAGTTTAA

41.MdEPSPS-41:Tm=54,60mer

GACCGCCGAATGGCCATGGCTTTCTCTCTTGCTGCCGCTGGAGACGCTCCAGTTACTATC

42.MdEPSPS-42:Tm=54,60mer

GAATGTTTTTCTGGTACAACCGGGATCCTTGATAGTAACTGGAGCGTCTCCAGCGGCAGC

43.MdEPSPS-43:Tm=54,60mer

AAGGATCCCGGTTGTACCAGAAAAACATTCCCCGATTACTTTGAAGTCCTCAGGAAGTTT

44.MdEPSPS-44:Tm=54,60mer

TCAATGCTTGGTAAACTTCCTGAGGACTTCAAAGTAATCGGGGAATGTTTTTCTGGTACA

利用PCR进行EPSP合酶基因扩增，在100μl反应体系中，MdEPSPS-2～MdEPSPS-43共42个引物的添加量为2ng，外侧引物MdEPSPS-1和MdEPSPS-44的添加量为30ng。以KODFX taq酶（Toyobo公司，日本）为Taq DNA聚合酶。扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃1.5min，共25个循环。

PCR结束后，1%（w/v）琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连（宝生物工程（大连）有限公司），4℃连接过夜。高效转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得含有MdEPSPS基因的阳性克隆，抽提质粒，测序。

1.2PCR扩增EPSP合酶基因及回收

以上述所获得的含有MdEPSPS基因的阳性质粒为模板，MdEPSPS-1，MdEPSPS-44为引物扩增EPSP合酶基因，反应条件为：94℃10min预变性，94℃变性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30个循环，1%Agrose电泳，透吸袋法回收得1332bp的EPSP合酶基因片段。

1）DNase I降解DNA及回收小片段

上述回收的EPSP合酶基因片段以DNase I缓冲液（50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/LMgCl₂）100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10%丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10～50bp的小片段。用10μl10×无引物PCR缓冲液（Primerless PCRBuffer）（50mmol/L KCl+10mmol/L Tris-Cl pH9.0+1%Triton）溶解沉淀。

2）无引物PCR（Primerless PCR）

进行Primerless PCR扩增。反应体系：5μl小片段DNA+4μl2.5mmol/L dNTPs+4.5μl25mmol/L MgCl₂+Taq2U+ddH₂O至50μl；反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环），2%Agrose电泳检测PCR扩增结果。

3）有引物PCR（Primer PCR）

以上述无引物PCR扩增产物为模板，以MdEPSPS-1，MdEPSPS-44为引物进行PrimerPCR扩增反应。反应体系：5μl Primerless PCR产物+MdEPSPS-10.2ng+MdEPSPS-440.2ng+10×PCR Buffer5μl+2.5mmol/L dNTPs4μl+Taq2U+ddH₂O至50μl。反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35个循环，1%Agrose电泳检测，回收得1332bp重排的EPSP合酶基因片段。

实施例2高草甘膦抗性EPSP合酶筛选

将上述回收重排的EPSP合酶基因片段经BamH I和Sac I双酶切后，构建入原核表达载体pG251（CN1338515）启动子和t1t2终止子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，库容达到10⁸，而后用质粒大量提取试剂盒（美国Omega公司）进行质粒提取。

取1μl大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）涂布与含有50mM草甘瞵的M9平板上培养48h，发现有三个菌落生长良好。将这三个菌落分别接种到含有50mM、80mM草甘瞵的M9平板上培养，发现只有1个克隆能在含80mM草甘瞵的M9平板上生长。将该克隆抽提的质粒（pMdEPSPS_mutant）再次转入大肠杆菌ER2799（NEB公司）中，将转化子用无菌牙签点与含80mM草甘瞵的M9固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性确实是由于转入了该pMdEPSPS_mutant质粒引起的。

实施例3高草甘膦抗性的EPSP表达

3.1高耐受草甘膦的DNA片断的序列分析

利用逐步序列测定方法对实施例2所筛选获得的高耐受草甘膦质粒pMdEPSPS_mutant全序列进行DNA测序。分析结果表明，该高抗抗草甘膦突变体在同一分子上含有下述1至8个突变位点，具体是：突变位点1（N63D），即EPSP合酶氨基酸序列中第63位上的天冬酰胺被替换为天冬氨酸；突变位点2（N86S），即第86位上的天冬酰胺被替换为丝氨酸；突变位点3（T101A），即第101位的苏氨酸替换为丙氨酸；突变位点4（A187T），即第187位上的丙氨酸被替换为苏氨酸；突变位点5（D230G），即第230位上的天冬氨酸被替换为甘氨酸；突变点6（H317R），即第317位上的谷氨酰胺被替换为精氨酸；突变位点7（Y399R），即第399位上的酪氨酸被替换为精氨酸；突变位点8（C413A），即第413位上的半胱氨酸被替换为丙氨酸。上述所获得的突变位点均为关键位点，其氨基酸序列全长如SEQ ID No.1所示，编码的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

3.2EPSP合酶多位点突变体基因在大肠杆菌中的表达

以上述筛选获得的EPSP合酶多位点突变体基因为模版，用引物MdEPSPS-1，MdEPSPS-44进行PCR扩增，以KOD Plus（Toyobo日本）为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶（大连宝生物工程公司），72℃延伸90s，扩增片段长1332bp。PCR产物用BamH I和Sac I酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a（NEB公司）得到重组质粒pET-MdEPSPS_mutant并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司），将转化子涂布在LB固体培养基中培养24h。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP（Amersham Biosciences公司）对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测，本发明的EPSP合酶多位点突变体基因（MdEPSPS_mutant）编码的EPSP合酶突变体（MdEPSPS_mutant）蛋白大小约50kDa，与预测值相符。

实施例4MdEPSPS_mutant的酶活测定和动力学参数测定

4.1测定方法

无机磷标准曲线：10mM无机磷按1:10稀释，分别取0、1、2、3…20μl与1.5ml Eppendorf离心管中，加入纯水至100μl混匀，加入MAT溶液（0.045%孔雀石绿:4.2%钼酸铵=3:1,V/V）0.8ml混匀，计时三分钟后加入SC溶液（34%柠檬酸三钠）100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD₆₆₀值。重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD₆₆₀值为纵坐标作图得到无机磷标准曲线。

1、酶活测定：蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford，1976）。在冰上与1.5mlEppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μl、10mM S3P溶液2μl、0.5M HEPES溶液2μl、1mM(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl和双蒸水12μl混匀，与28℃温浴5min后各管样品间隔2s加入5μl纯化蛋白并计时，2min后再间隔2s依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl34%SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD₆₆₀值。对照除不加纯化蛋白外，其余同样品管。样品管与对照管的OD₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到酶的酶活力。

2、半抑制量（IC₅₀）测定：上述反应液中添加0、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度（nkat/mg）为Y轴作图。

3、Km（PEP）测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度（0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM）下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S]（Eadic-Hofstee）法作图。

4、Ki（glyphosate）测定：在不同草甘膦浓度（0、10、50、100μM）下测定PEP浓度为0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM时EPSP的酶反应速度。采取双倒数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦的浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为Ki（glyphosate）值。

4.2测定结果

本发明的MdEPSPS_mutant的酶动力学参数如下表1所示。

表1EPSP合酶多位点突变体的动力学参数

根据MdEPSPS_mutant的酶动力学参数可知，本发明的MdEPSPS_mutant不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性将为该MdEPSPS_mutant合酶多位点突变体基因用于转基因作物的培育提供可能。

实施例5水稻的转化及其草甘膦抗性的试验

5.1转基因水稻的获得

1、农杆菌的准备

1）挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养20h。

2）取1mL菌液转接入20～30mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD₆₀₀≈1.5。

3）8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5wt%蔗糖，0.05wt%Silwet L-77）并稀释至OD₆₀₀≈0.8。

2、农杆菌侵染及与水稻愈伤组织的共培养将预培养4天的成熟胚来源的胚性愈伤组织或培养4～5d的未成熟胚来源的初生愈伤组织立即浸入准备好的农杆菌悬浮液中，侵染30min后，然后将愈伤组织在无菌滤纸上吸除多余的菌液，直接转入共培养培养基于23℃黑暗条件下培养3～4d。

3、抗性愈伤组织的筛选

将共培养的愈伤组织转出，无菌水漂洗3～4次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，将愈伤组织转入选择培养基上，28℃暗培养，两周继代一次。

4、植株再生

经2～3代筛选后，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上进行预分化处理；暗培养5～7天后再将抗性愈伤组织转移到分化培养基（每天16h光照、8h黑暗、28℃条件下进行分化，再生的小苗剪去原有的根，在生根培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆栽，即获得转基因水稻，最初几天保持湿度，后续栽培管理按照常规方法进行。

5.2转基因水稻的种子萌发试验

将T3代转突变体MdEPSPS_mutant基因的株系2（Mu2）和株系5（Mu5），野生型MdEPSPS_wt的一个株系和CK种子首先用75%的酒精浸泡1min进行表面消毒，然后用2%活性氯含量的NaClO溶液（加1～3滴Tween20）浸泡60min以上（最长可至2h），并不时摇动，然后用无菌水冲洗4～5次。接下来将种子均匀的分布在含有不同浓度草甘膦（0，500uM，1000uM，2000uM）的1/2MS平板上，Parafilm膜封口，放置在恒温室里25°C，16小时光照培养6天观察种子的萌发情况，结果参看图1。

试验发现：CK对照和野生型MdEPSPS_wt种子在草甘膦浓度为500μM时根生长受到严重抑制，而转本发明的MdEPSPS_mutant的EPSP合酶突变体基因生长良好，且在草甘膦浓度为1000μM仍然生长良好，而且形态正常。

（三）转基因水稻的草甘膦喷洒试验

将T3代转突变体MdEPSPS_mutant基因的株系2（Mu2）和株系5（Mu5），野生型MdEPSPS_wt的一个株系和CK对照种子首先用75%的酒精浸泡1min进行表面消毒，然后用2%活性氯含量的NaClO溶液（加1～3滴Tween20）浸泡60min以上（最长可至2h），并不时摇动，然后用无菌水冲洗4～5次。接下来将种子包在纱布里浸泡在含有水分的平皿上，37℃，培养4天，待种子露白后移栽到营养铂里，放置在恒温室里25°C，16小时光照培养。待小苗子长到12～15厘米高时用2.5%（v/v）Roundup喷洒，观察苗子的生长情况，结果参看图2。

试验发现：用Roundup处理14天后，几乎所有的对照和野生型MdEPSPS_wt苗子都枯萎，严重脱水而死亡，而转本发明的MdEPSPS_mutant的EPSP合酶突变体基因的苗子则生长良好，而且形态正常。

附母液及各培养基配方：

一、母液（stock solution）配方

1、MS_max母液（stock solution）(10X)

加水定容至1000ml。

2、MS_min母液（stock solution）(100X)

加水定容至1000ml。

3、N6_max母液（stock solution）(10X)

加水定容至1000ml。

4、N6_min母液（stock solution）(100X)

加水定容到1000ml

5、Fe²⁺-EDTA母液(100X)

FeSO₄·7H₂O 2.78g

Na₂EDTA·2H₂O 3.73g

单独溶解，然后混合，加水定容至1000ml。

6、维生素母液（Vitamin stock solution）(100X)

加水定容至1000ml。

二、培养基配方

1、共培养培养基

加水至250ml调pH＝5.6用前微波炉融化加5ml50%葡萄糖和250μl20g/L乙酰丁香酮。

2、选择培养基

加水至250ml调pH＝6.0，用前融化加潮霉素和羧苄。

3、预分化培养基

加水至250m调pH＝5.9，用前融化加潮霉素和羧苄。

4、分化培养基

加水至1000ml调pH＝6.0，分装小瓶。

5、生根培养基

加水至1000ml调pH＝5.8，分装小瓶。