CN108291236B - 植物epsp合酶和使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了包含多核苷酸和具有EPSP(5‑烯醇丙酮莽草酸‑3‑磷酸)合酶(EPSPS)活性的多肽的组合物和方法。在具体实施例中，序列具有改进的特性，例如但不限于在抑制剂草甘膦的存在下，改进的催化能力。进一步提供了具有EPSPS序列的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和籽粒。提供了采用EPSPS序列的不同方法。此类方法包括用于产生草甘膦耐受性植物、植物细胞、外植体或种子的方法，以及在含有采用本文公开的植物和/或种子的作物的田地中，控制杂草的方法。

Description

植物EPSP合酶和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月30日提交的美国临时申请号62/234,818的权益，将其全部内容通过引用特此结合。
发明领域
本领域涉及分子生物学的领域。更具体地，它涉及赋予对草甘膦的耐受性的序列。
以电子方式提交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“BB2501PCT_SequenceListing_ST25.txt”，创建于2016年9月19日，且具有96千字节大小，并与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
背景技术
EPSP(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸)合酶是催化磷酸烯醇丙酮酸和3-磷酸莽草酸转化为磷酸和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)的酶，并且它参与芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸的生物合成。草甘膦(世界上最畅销的除草剂)起到磷酸烯醇丙酮酸的竞争性抑制剂的作用。
已经通过将草甘膦不敏感的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)酶引入植物，产生了草甘膦耐受性作物。在一个实例中，玉米事件NK603使用来自农杆菌属物种菌株CP4的EPSPS。该酶对于草甘膦的抑制是高度不敏感的，同时它保留了与天然植物酶相似的催化效率(Sikorski和Gruys.1997.Acc.Chem.Res.[化学研究述评]30：2-8)。在另一实例中，玉米事件GA21使用双重突变型玉米EPSPS，其中在位置103的苏氨酸被改变为异亮氨酸，并且在位置107的脯氨酸被改变为丝氨酸。
具有提供对草甘膦的充分耐受性和维持代谢流的正常速率的催化能力的动力学特性的植物EPSP合酶是令人希望的。
发明内容
本文提供了植物EPSP合酶(本文称为EPSPS)和编码其的多核苷酸。还提供了用于产生对植物EPSPS酶耐受的草甘膦耐受性植物的方法。
本文提供了编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，这些EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个或多个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQID NO：2具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，这些多核苷酸编码植物EPSPS多肽，这些植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。
在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的植物EPSPS多肽。
还提供的是包含本文公开的多核苷酸的重组DNA构建体；在其基因组中包含本文公开的多核苷酸或包含此类多核苷酸的重组DNA构建体的植物细胞；以及在其基因组中包含本文公开的多核苷酸或包含此类多核苷酸的重组DNA构建体的植物。在一些实施例中，该植物细胞是玉米细胞。在一些实施例中，该植物是玉米。
本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。这些方法包括在可再生植物细胞中表达包含可操作地连接到至少一种调节序列的多核苷酸的重组DNA构建体，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列；并且产生草甘膦耐受性植物，该草甘膦耐受性植物在其基因组中包含该重组DNA构建体。在一些实施例中，这些方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQ IDNO：2具有至少90％同一性的序列。
在其他实施例中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA，该重组DNA包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA，该重组DNA包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。仍在其他实施例中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA，该重组DNA包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，该方法包括在植物细胞中表达包含编码SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的植物EPSPS多肽的多核苷酸的重组DNA。
本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中修饰内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列；并且从该植物细胞生长草甘膦耐受性植物。在一些实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ IDNO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ IDNO：2具有至少90％同一性的序列。
在其他实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。仍在其他实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的植物EPSPS多肽。
可以通过CRISPR/Cas指导RNA介导的系统、锌指核酸酶介导的系统、大范围核酸酶介导的系统、或寡核碱基介导的系统修饰内源植物EPSPS基因。
本文提供了在植物细胞中提供指导RNA的多核苷酸构建体，其中该指导RNA靶向植物细胞的内源EPSPS基因，并且该多核苷酸构建体进一步包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ IDNO：1中列出的氨基酸突变位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQID NO：2具有至少90％同一性的序列。
在其他实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。仍在其他实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，该多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列。
本文提供了用于产生草甘膦耐受性植物的方法，其中将指导RNA、一种或多种多核苷酸修饰模板、和一种或多种Cas内切核酸酶提供至植物细胞。这一种或多种内切核酸酶在植物细胞中的内源EPSPS基因处引入双链断裂，并且这一种或多种多核苷酸修饰模板被用于产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的EPSPS基因，该EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。从植物细胞获得植物，并且产生了没有指导RNA和Cas内切核酸酶的草甘膦耐受性子代植物。在一些实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模板被用来产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸突变位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。
在其他实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模板被用来产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。仍在其他实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模板被用来产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。仍在其他实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模板被用来产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。仍在其他实施例中，该一种或多种多核苷酸修饰模被用于产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列。
本文还提供了表达内源EPSPS多肽的草甘膦耐受性玉米植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性玉米植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的序列。
本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性向日葵植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性向日葵植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：10中列出的序列。
本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性稻植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性稻植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：11中列出的序列。
本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性高粱植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性高粱植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：12中列出的序列。
本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性大豆植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性大豆植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：18中列出的序列。
本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性小麦植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：14具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性小麦植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：19中列出的序列。
本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性芜菁植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：15具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性芜菁植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：20中列出的序列。
本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性番茄植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：17具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性番茄植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：21中列出的序列。
本文还提供了表达EPSPS多肽的草甘膦耐受性马铃薯植物，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：18具有至少90％同一性的序列。草甘膦耐受性马铃薯植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：22中列出的序列。
还提供了杂草控制的方法，其中将有效量的草甘膦施用在本文提供的草甘膦耐受性植物群体上。这些植物可以是玉米、向日葵、稻、小麦、番茄、马铃薯、油菜、高粱、或大豆。施用的有效量的草甘膦可以是约50克酸当量/英亩至约2000克酸当量/英亩。
还提供了包含部分EPSP合酶(EPSPS)序列的多核苷酸修饰模板，其中多核苷酸修饰模板包含对应于G102A的和对应于选自下组的至少一个或多个氨基酸突变的一个或多个核苷酸突变，该组由以下组成：a)A2R、b)A4W、c)H54M、d)A72Q、e)K84R、f)L98C、g)K173R、h)I208L、i)K243E、j)T279A、k)E302S、1)T361S、m)E391P、n)E391G、o)D402G、p)A416G、q)V438R、r)S440R、s)T441Q、和t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置。还提供了包含本文呈现的多核苷酸修饰模板、指导RNA、和CRISPR/Cas9内切核酸酶的植物细胞，其中所述组合靶向编码EPSPS多肽的内源玉米EPSPS序列，该EPSPS多肽与SEQ ID NO：2具有至少90％的同一性。
还提供的是在抑制剂存在下，快速测定多种酶变体的催化效率的方法。该方法包括：(a)提供多种酶变体；(b)提供抑制剂；(c)提供底物；(d)在不多于两个不同抑制剂浓度下，进行反应，该反应涉及多种酶变体和底物；(e)在不多于两个不同抑制剂浓度下，测量反应速率；以及(f)计算多种酶变体的(kcat/KM)*KI。在一些实施例中，抑制剂浓度之一是零。在其他实施例中，底物是处于与酶变体的亲本酶的米氏常数(KM)基本上相似的浓度。仍在其他实施例中，酶是处于在该两种不同抑制剂浓度下，足以导致基本上线性反应速率的浓度。仍在其他实施例中，抑制剂浓度之一足以导致至少约50％抑制。仍在其他实施例中，在高通量系统中进行测定。仍在其他实施例中，通过获得(kcat/KM)*KI的数值估算在抑制剂存在下的催化能力，其中kcat是最大酶转换率，KM是米氏常数，并且KI是抑制剂解离常数。在一些实施例中，底物是PEP；抑制剂是草甘膦；并且多种酶变体是EPSPS酶变体。在一些实施例中，在两个抑制剂浓度下，酶浓度和底物浓度是相同的。
附图说明
图1显示玉米野生型EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和EPSPS序列的突变的H6版本(SEQ ID NO：5)的比对。
图2显示大豆野生型EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：13)和EPSPS序列的突变的H6版本(SEQ ID NO：18)的比对。
图3显示向日葵野生型EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：9)和EPSPS序列的突变的H6版本(SEQ ID NO：10)的比对。
图4显示稻野生型EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：7)和EPSPS序列的突变的H6版本(SEQ ID NO：11)的比对。
图5显示高粱野生型EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：8)和EPSPS序列的突变的H6版本(SEQ ID NO：12)的比对。
图6示小麦野生型EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：14)和EPSPS序列的突变的H6版本(SEQ ID NO：19)的比对。
图7显示芜菁野生型EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：15)和EPSPS序列的突变的H6版本(SEQ ID NO：20)的比对。
图8显示高粱野生型EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：8)和EPSPS序列的突变的C1版本(SEQ ID NO：23)的比对。
图9显示毛状根从用天然玉米EPSPS或改组的变体之一转化的大豆子叶的生长。
图10显示与底物饱和分析相比，通过快速方法确定的(kcat/KM)*KI的值。将来自表15的数据绘制为线性回归。用于快速方法的值是在调节的条件下获得的那些。
序列表简述
这些序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.8211.825所列出的管理专利申请中核苷酸和氨基酸序列公开内容的规定。如遵循描述于以下文献中的IUPAC IUBMB标准所定义的，序列表包含核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的三字母代码：NucleicAcids Res.[核酸研究]13：3021 3030(1985)和Biochemical J.[生物化学杂志]219(2)：345373(1984)，以上文献通过引用并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中列出的规定。
SEQ ID NO：1是通过将合成EPSP合酶(其中修饰编码SEQ ID NO：2的基因的核苷酸序列，用来添加N末端蛋氨酸至SEQ ID NO：2，并且用来优化密码子使用，以便其在大肠杆菌中表达)克隆进表达载体获得的表达的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：1在本文中要被用作参照EPSPS序列。
SEQ ID NO：2是呈现为GenBank条目CAA44974.1(NCBI GI编号1524383)的玉米EPSPS的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是N末端延伸的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是由克隆771-C2中存在的核苷酸序列编码的玉米EPSPS的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是由克隆868-H6中存在的核苷酸序列编码的玉米EPSPS的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是由克隆123-C1中存在的核苷酸序列编码的玉米EPSPS的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是来自稻(Oryza sativa)的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。
SEQ ID NO：8是来自高粱(石茅(Sorghum halepense))的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。
SEQ ID NO：9是来自向日葵(Helianthus annus)的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。
SEQ ID NO：10是来自向日葵的EPSPS序列(SEQ ID NO：9)的突变版本，其包含868-H6突变。
SEQ ID NO：11是来自稻的EPSPS序列(SEQ ID NO：7)的突变版本，其包含868-H6突变。
SEQ ID NO：12是来自高粱的EPSPS序列(SEQ ID NO：8)的突变版本，其包含868-H6突变。
SEQ ID NO：13是来自大豆(Glycine max)的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。
SEQ ID NO：14是来自小麦(Triticum aestivum)的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。
SEQ ID NO：15是来自芜菁的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。
SEQ ID NO：16是来自番茄(Solanum lycopersicum)的天然EPSPS的氨基酸序列，其包含叶绿体转运肽序列。
SEQ ID NO：17是来自马铃薯Solanum tuberosum)的天然EPSPS的氨基酸序列其包含叶绿体转运肽序列。
SEQ ID NO：18是来自大豆的EPSPS序列(SEQ ID NO：13)的突变版本，其包含868-H6突变。
SEQ ID NO：19是来自小麦的EPSPS序列(SEQ ID NO：14)的突变版本，其包含868-H6突变。
SEQ ID NO：20是来自芜菁的EPSPS序列(SEQ ID NO：15)的突变版本，其包含868-H6突变。
SEQ ID NO：21是来自番茄的EPSPS序列(SEQ ID NO：16)的突变版本，其包含868-H6突变。
SEQ ID NO：22是来自马铃薯的EPSPS序列(SEQ ID NO：17)的突变版本，其包含868-H6突变。
SEQ ID NO：23是来自高粱的EPSPS序列(SEQ ID NO：8)的突变版本，其包含123-C1突变。
SEQ ID NO：24是编码天然玉米EPSPS和C末端血球凝集素亲和标签(但不是叶绿体转运肽)的DNA序列。
SEQ ID NO：25是编码玉米EPSPS变体868-H6和C末端血球凝集素亲和标签(但不是叶绿体转运肽)的DNA序列。
SEQ ID NO：26是编码来自拟南芥EPSPS的叶绿体靶向肽的DNA序列。
SEQ ID NO：27是编码称作6H1的人工CTP的核苷酸序列(美国专利号7,345,143)。
SEQ ID NO：28是天然拟南芥EPSPS启动子的核苷酸序列(AT1G48860；NCBI GI编号CP002684.1，拟南芥染色体1，碱基对18071332至18072324)。
SEQ ID NO：29是拟南芥泛素-3启动子的核苷酸序列(NCBI GI编号GenBankL05363.1)。
SEQ ID NO：30是拟南芥泛素-10(UBQ10)启动子的启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是编码血球凝集素亲和标签的多核苷酸的序列。
SEQ ID NO：32是菜豆球蛋白终止子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：33是编码玉米EPSPS变体C1和C末端血球凝集素亲和标签(但不是叶绿体转运肽)的DNA序列。
SEQ ID NO：34是编码玉米EPSPS变体C2和C末端血球凝集素亲和标签(但不是叶绿体转运肽)的DNA序列。
发明详述
I.组合物
A.EPSP合酶多核苷酸和多肽
提供了采用具有EPSP合酶(EPSPS)活性的多核苷酸和多肽的不同方法和组合物。此类EPSPS多肽包括编码植物EPSPS多肽的那些，这些植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个或多个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQ IDNO：2具有至少90％同一性的序列。
在一些实施例中，这些多核苷酸编码植物EPSPS多肽，这些植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。
在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V(这些突变存在于克隆771-C2中)。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q(这些突变存在于克隆868-H6中)。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G(这些突变存在于克隆123-C1中)。仍在其他实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的植物EPSPS多肽，SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6代表由分别存在于771-C2、868-H6、和123-C1中的核苷酸序列编码的玉米EPSPS多肽的氨基酸序列。
当与先前鉴定的EPSPS多肽比较时，在草甘膦存在下，本文公开的EPSPS多肽及其活性变体和片段会具有改进的催化能力。最好地表明体内此性状的适应度的参数是kcat/KM*KI。当与先前已知的EPSPS酶比较时，本文公开的EPSPS多肽会具有增加的kcat/KM*KI。“增加”意在是当与适当的对照比较时，任何统计显著的增加。在一些实施例中，适当的对照是先前已知的EPSPS序列，例如SEQ ID NO：2(玉米)、SEQ ID NO：7(稻)、SEQ ID NO：8(高粱)、SEQ ID NO：9(向日葵)、SEQ ID NO：13(大豆)、SEQ ID NO：14(小麦)、SEQ ID NO：15(芜菁)、SEQ ID NO：16(番茄)、或SEQ ID NO：17(马铃薯)中列出的那些。在一些实施例中，当与SEQID NO：2、7、89、13、14、15、16、或17比较时，kcat/KM*KI的增加可以包括约150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800倍或更大倍数的增加。仍在另外的实施例中，kcat/KM*KI可以包括例如大于约2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、或更大的kcat/KM*KI。野生型玉米EPSPS的kcat/KM*KI是11.8，而包含103I、107S、和445G的EPSPS酶的kcat/KM*KI是2254。
如本文所使用的，“分离的”或“纯化的”多核苷酸或多肽或其生物活性部分是基本上或本质上不含与如在其天然存在的环境中发现的多核苷酸或多肽正常相伴或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或多肽当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在从其衍生出该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然地在该多核苷酸侧翼的序列(即，位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳地是蛋白质编码序列)。出于本公开的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时不包括分离的未改性的染色体。例如，在不同实施例中，该分离的多核苷酸可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列在从其衍生出该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然地在该多核苷酸的侧翼。基本上不含细胞物质的多肽包括具有小于约30％、20％、10％、5％、或1％(以干重计)的污染蛋白质的多肽的制剂。当重组产生本公开的多肽或其生物活性部分时，最佳地，培养基表示少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白质化学品。
如本文所用，“重组”多核苷酸包含两种或更多种化学连接的核酸区段(其在自然界中未发现直接连接)的组合。“直接连接的”意在两个核酸区段紧密相邻并通过化学键彼此连接。在具体实施例中，该重组多核苷酸包含目的多核苷酸或其活性变体或片段，这样使得另外的化学连接的核酸区段位于该目的多核苷酸的5′、3′或内部。可替代地，该重组多核苷酸的化学连接的核酸区段可以通过缺失序列来形成。另外的化学连接的核酸区段或被缺失以连接所述连接的核酸区段的序列可以具有任何长度，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个核苷酸。本文公开了用于制造此类重组多核苷酸的各种方法，包括例如通过化学合成或通过基因工程技术操作分离的多核苷酸区段。在具体实施例中，该重组多核苷酸可以包含重组DNA序列或重组RNA序列。
“重组多肽”包含两种或更多种化学连接的氨基酸区段(其在自然界中未发现直接连接)的组合。在具体实施例中，该重组多肽包含位于该重组多肽的N-末端、C-末端或内部的另外的化学连接的氨基酸区段。可替代地，该重组多肽的化学连接的氨基酸区段可以通过缺失至少一个氨基酸来形成。另外的化学连接的氨基酸区段或缺失的化学连接的氨基酸区段可以具有任何长度，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸。
B.EPSPS序列的活性片段和变体
提供了采用具有EPSPS活性的多核苷酸和多肽的方法和组合物。此外，当与适当的对照比较时，在抑制剂草甘膦存在下，EPSPS序列的任何给定变体或片段可以进一步包含改进的催化能力。
i.多核苷酸和多肽片段
本公开还涵盖本文提供的EPSPS多核苷酸和多肽的片段和变体。“片段”意在是多核苷酸的一部分或者氨基酸序列和因此由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可以编码保留EPSPS活性的蛋白片段，并且在具体实施例中，可以进一步包含改进的特性，例如在草甘膦存在下的改进的催化能力。可替代地，作为杂交探针或PCR引物有用的多核苷酸的片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白质。在具体实施例中，重组多核苷酸的片段或重组多核苷酸构建体包含在自然界并未发现直接连接的两个或更多个化学连接的或可操作地连接的核酸区段中的至少一个连接。因此，核苷酸序列的片段的范围可以为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸、约900个核苷酸、约1000个核苷酸、约1100个核苷酸、约1200个核苷酸、约1300个核苷酸，并且上至编码EPSPS多肽的全长多核苷酸。编码本公开的EPSPS蛋白的生物活性部分的EPSPS多核苷酸的片段将编码至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、或425个氨基酸，或上至存在于全长EPSPS多肽中的氨基酸的总数。
因此，EPSPS核酸序列的片段可以编码EPSPS多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。EPSPS多肽的生物活性部分可以如下制备：分离EPSPS多核苷酸之一的一部分，表达EPSPS多肽的编码部分(例如通过体外重组表达)，并且评价EPSPS蛋白的EPSPS部分的活性。作为EPSPS核苷酸序列的片段的多核苷酸，包含至少20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、或1300个连续核苷酸，或者上至本文公开的全长EPSPS多核苷酸中存在的核苷酸数。
多肽的片段可以编码保留EPSPS活性的蛋白片段，并且在具体实施例中，当与适当的对照比较时，在草甘膦存在下，可以进一步包含改进的催化能力。本文公开的EPSPS多肽的片段将编码至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、或425个连续氨基酸，或上至存在于全长EPSPS多肽中的氨基酸的总数。在具体实施例中，此类多肽片段是活性片段，并且仍在其他实施例中，该多肽片段包含重组多肽片段。如本文所用，重组多肽的片段包含在自然界并未发现直接连接的两个或更多个化学连接的氨基酸区段区段的组合。
ii.多核苷酸和多肽变体
“变体”蛋白质意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失(即在5′和/或3′末端处的截短)和/或缺失或添加，和/或在天然蛋白质中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代衍生自蛋白质的蛋白质。所涵盖的变体蛋白质具有生物学活性，即它们仍然拥有所需的生物学活性，即具有EPSPS活性。此外，当与导致例如氨基酸(例如天冬氨酸)的减少的非特异性乙酰化的适当的对照比较时，任何给定变体或片段可以进一步包含针对草甘膦的改进的特异性。此类变体可以由例如遗传多态性或人为操作产生。
“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在5′和/或3′末端具有缺失(即截短)的多核苷酸，和/或在天然多核苷酸内的一个或多个内部位点的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守的变体包括如下那些序列，由于遗传密码的简并性，该序列编码本文提供的EPSPS多肽之一的氨基酸序列。可以使用熟知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体如，例如使用下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术鉴定。变体多核苷酸还包括通过合成衍生的多核苷酸，诸如例如通过使用定点诱变或基因合成产生但其仍编码EPSPS多肽的那些。
如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，本文公开的EPSPS多肽的生物活性变体(和编码其的多核苷酸)将与SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7、8、9、和10中任一项的多肽具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或更多的序列同一性。
可以以各种方式改变EPSPS多肽及其活性变体和片段，这些方式包括氨基酸取代、缺失、截短、和插入。这种操作的方法在本领域中是普遍已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备EPSPS蛋白质的氨基酸序列变体和片段。用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.[酶学方法]154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in Molecular Biology[分子生物学技术](麦克米兰出版有限公司(MacMillan Publishing Company)，纽约)和在其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以发现于Dayhoff等人，(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白质序列和结构图谱](国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.)，华盛顿)的模型中，其通过引用结合在此。保守取代，例如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，会是最佳的。
将在编码变体的DNA中进行的突变不能将序列置于阅读框之外，并且最优选不会产生可能产生次级mRNA结构的互补区域。参见，欧洲专利申请公开号75,444。
C.序列比较
使用以下术语来描述在两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系。
如本文所用，“参照序列”是用作序列比较的基础的预定的序列。参照序列可以是指定序列的子集或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段、或完整的cDNA或基因序列或蛋白序列。
如本文所用，“比较窗口”参照了多肽序列的连续并指定的区段，其中与用于两种多肽的最佳比对的参照序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多肽序列可能包括添加或缺失(即空位)。通常，比较窗口的长度为至少5、10、15、或20个连续核苷酸，或其可以是30、40、50、100个或更长。本领域技术人员应当理解，由于多肽序列中含有缺口，为了避免与参照序列的高相似性，典型地引入缺口罚分，并且将其从匹配数中减去。
为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25：3389中所述的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。可替代地，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用于进行检测分子之间远缘关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)，同上。当使用BLAST、缺口BLAST、或PSI-BLAST时，可以使用各自程序的默认参数(例如，用于核苷酸序列的BLASTN、用于蛋白质的BLASTP)。比对也可以通过检查手动进行。
GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443-453的算法，以找到使匹配数量最大化并使空位数量最小化的两个完整序列的比对。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并且产生具有最大匹配碱基数量和最少空位的比对。它允许以匹配碱基单位提供空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP必须为它插入的每个空位获取空位产生罚分匹配数目的收益。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP必须另外地为每个所插入空位获取空位长度乘以空位延伸罚分的收益。在GCG威斯康辛遗传软件包的版本10中，蛋白质序列默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生和空位延伸罚分可以表示为选自下组的整数，该组由0至200组成。因此，例如，空位产生和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP代表最佳比对家族的一个成员。可以存在这个家族的许多成员，但是其他成员没有更好的品质。GAP展现出四个比对优值：质量、比率、同一性、和相似性。为了比对序列，质量是最大化的度量。比率是质量除以更短区段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。空位对面的符号被忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，相似性得分。GCG Wisconsin GeneticsSoftware Package[GCG威斯康辛州遗传学软件包]的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：10915)。
D.目的植物和其他目的宿主细胞
另外提供的是用一个或多个EPSPS序列或其活性变体或片段转导(转化或转染)的工程化的宿主细胞。这些EPSPS多肽或其变体和片段可以在任何生物体中表达，包括在非动物细胞中，例如植物、酵母、真菌、细菌等。关于非动物细胞培养的细节可以发现于以下文献中：Payne等人(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems[液体系统中的植物细胞和组织培养]，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)纽约，纽约州；Gamborg和Phillips(编辑)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture[植物细胞、组织和器官培养]；Fundamental Methods[基本方法]Springer Lab Manual[施普林格实验室手册]，施普林格出版社(Springer-Verlag)(柏林，海德堡，纽约)；以及Atlas和Parks(编辑)The Handbook of Microbiological Media[微生物培养基手册](1993)CRC出版社(CRCPress)，波卡拉顿，佛罗里达州。
还提供了具有本文公开的EPSPS序列的植物、植物细胞、植物部分和种子、以及籽粒。在具体实施例中，植物和/或植物部分已经稳定并入本文公开的至少一种异源EPSPS多肽或其活性变体或片段。此外，目的植物或生物体可以包含多个EPSPS多核苷酸(即，至少1、2、3、4、5、6或更多个)。
在具体实施例中，植物或植物部分中的异源植物EPSPS多核苷酸可操作地连接至异源调节元件，例如但不限于组成型启动子、组织偏好型启动子、或用于在植物中表达的其他启动子或组成型增强子。
如本文所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中完好的植物细胞。籽粒意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本公开的范围内，前提条件是这些部分包含引入的多核苷酸。
本文公开的EPSPS序列及其活性变体和片段可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)，芸苔属(例如，甘蓝型油菜、芜菁、芥菜)(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(甜高粱(Sorghum bicolor)，高粱(Sorghum vulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetumglaucum))，黍(粟米(Panicum miliaceum))，粟(谷子(Setaria italica))，穇子(龙爪稷(Eleusine coracana)))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycinemax)，烟草(tobacco，Nicotiana tabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoea batatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属物种(Coffea spp.))，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananascomosus)，柑橘树(柑橘属物种(Citrus spp.))，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))，鳄梨(avocado，Perseaamericana)，无花果(fig，Ficus casica)，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Olea europaea)，木瓜(番木瓜(Caricapapaya)))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物、针叶树、草坪草(包括冷季草和暖季草)。
蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactucasativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属物种(Lathyrus spp.))和黄瓜属(Cucumis)的成员诸如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属物种(Rhododendron spp.))、绣球花(hydrangea，Macrophyllahydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属物种(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属物种(Tulipa spp.))、水仙(水仙属物种(Narcissus spp.))、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可以用于实践公开内容的针叶树包括(例如)松树诸如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、西黄松(ponderosa pine，Pinusponderosa)、黑松(lodgepole pine，Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine，Pinusradiata)；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；西方铁杉(Western hemlock，Tsuga canadensis)；北美云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoiasempervirens))；枞树(true firs)诸如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abies balsamea))；以及雪松，诸如西方红雪松(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄-雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))，以及白杨和桉树。在具体实施例中，本公开的植物是作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，并且在仍然其他的实施例中，玉米植物是最佳的。
其他目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
“主题植物或植物细胞”是其中遗传改变(例如转化)关于目的基因已经受到影响的植物或植物细胞，或是从因此改变的植物或细胞遗传而来并且包含该改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测量主题植物或植物细胞的表型的变化的一个参考点。
对照植物或植物细胞可以包含例如：(a)野生型植物或细胞，即与用于引起主题植物或细胞的遗传学变化的起始材料相同的基因型；(b)与起始材料相同的基因型，但已经用无效构建体(即用对目的性状没有已知的影响的构建体，例如包含标记物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)在主题植物或植物细胞的子代中作为未转化的分离体的植物或植物细胞；(d)与主题植物或植物细胞在遗传上一致，但不暴露于将诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)在不表达目的基因的条件下的主题植物或植物细胞自身。
另外的目的宿主细胞可以是真核细胞、动物细胞、原生质体、组织培养细胞、原核细胞、细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门菌、革兰氏阳性细菌、紫色细菌、绿硫菌、绿色非硫细菌、蓝藻细菌、螺旋体、栖热袍菌、细菌黄杆菌、拟杆菌属；真菌细胞，例如酿酒酵母、毕赤酵母、和粗糙脉孢菌；昆虫细胞，例如果蝇属和草地贪夜蛾；哺乳动物细胞，例如CHO、COS、BHK、HEK 293或人黑色素瘤，古细菌(即初古菌门、热变形菌属、热网菌属、热球菌目、产甲烷菌、古生球菌属、和极端嗜盐菌)等。
例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性玉米植物，其中草甘膦耐受性玉米植物表达内源EPSPS多肽，该内源EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性玉米植物可以表达内源EPSPS多肽，该内源EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性玉米植物可以表达内源EPSPS多肽，该内源EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G；或具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ IDNO：6中列出的序列。
例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性向日葵植物，其中草甘膦耐受性向日葵植物表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性向日葵植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性向日葵植物可以表达内源EPSPS多肽，该内源EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。草甘膦耐受性向日葵植物可以表达EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：10中列出的序列。
例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性稻植物，其中草甘膦耐受性稻植物表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性稻植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性稻植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。草甘膦耐受性稻植物可以表达SEQ ID NO：11中列出的EPSPS多肽。
例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性高粱植物，其中草甘膦耐受性高粱植物表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性高粱植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)1208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性高粱植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。草甘膦耐受性高粱植物可以表达EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：12中列出的序列。
例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性大豆植物，其中草甘膦耐受性大豆植物表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性大豆植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。草甘膦耐受性大豆植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：18中列出的序列。例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性小麦植物，其中草甘膦耐受性小麦植物表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：14具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：14具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性小麦植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。草甘膦耐受性小麦植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：19中列出的序列。
例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性芜菁植物，其中草甘膦耐受性芜菁植物表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：15具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性芜菁植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：15具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性芜菁植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。草甘膦耐受性芜菁植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：20中列出的序列。
例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性番茄植物，其中草甘膦耐受性番茄植物表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：17具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性番茄植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：17具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性番茄植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。草甘膦耐受性番茄植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：21中列出的序列。
例如，在一些实施例中，提供了草甘膦耐受性马铃薯植物，其中草甘膦耐受性马铃薯植物表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的类似氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：18具有至少90％同一性的序列。此外，草甘膦耐受性马铃薯植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：18具有至少90％同一性的序列。仍另外地，草甘膦耐受性马铃薯植物可以表达EPSPS多肽，该EPSPS多肽具有：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。草甘膦耐受性马铃薯植物可以表达植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：22中列出的序列。
E.多核苷酸构建体
术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本公开的多核苷酸限制为包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。
例如，多核苷酸构建体可以是重组DNA构建体。“重组DNA构建体”包含两个或更多个可操作地连接的DNA区段，这些DNA区段在自然界中未发现可操作地连接。重组DNA构建体的非限制性实例包括与异源序列可操作地连接的目的多核苷酸或其活性变体或片段，这些异源序列有助于目的序列的表达、自主复制和/或基因组插入。这样的异源且可操作地连接的序列包括例如启动子、终止序列、增强子等、或表达盒的任何组分；质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体、或线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列；和/或编码异源多肽的序列。
本文公开的EPSPS多核苷酸能以用于在目的植物或任何目的生物体中表达的表达盒提供。该盒可以包括可操作地连接至EPSPS多核苷酸或其活性变体或片段的5’和3′调节序列。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作的连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用于指两个蛋白质编码区域的连接时，可操作地连接意在是这些编码区域处于相同的阅读框中。该盒可以另外包含至少一个待共转化到生物体中的另外的基因。可替代地，所述一个或多个另外的基因可以在多个表达盒上提供。这样的表达盒装备有多个限制性位点和/或重组位点，用于将该EPSPS多核苷酸或其活性变体或片段插入以便处于调节区域的转录调节之下。该表达盒可另外包含选择性标记基因。
该表达盒以5’-3’转录的方向包含转录和翻译起始区域(即启动子)、EPSPS多核苷酸或其活性变体或片段、和在植物中起作用的转录和翻译终止区域(即终止区域)。调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或EPSPS多核苷酸或其活性变体或片段对于宿主细胞或彼此之间可以是天然的/类似的。可替代地，调节区和/或EPSPS多核苷酸或其活性变体或片段对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。
如本文所用，关于序列的“异源性”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。
终止区域对于转录起始区域或其活性变体或片段而言可以是天然的，对于植物宿主而言可以是天然的，或者可以衍生自对于该启动子、EPSPS多核苷酸或其活性片段或变体、该植物宿主、或其任何组合而言的另一种来源(即，外源的或异源的)。
该表达盒可以另外包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导子在本领域是已知的并且包括病毒翻译前导序列。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、移除多余的DNA、移除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。
许多启动子可以用于表达本文公开的各种EPSPS序列，包括目的多核苷酸序列的天然启动子。可以基于期望的结果来选择启动子。此类启动子包括例如组成型启动子、诱导型启动子、组织偏好型启动子或用于在植物或任何目的生物体中表达的其他启动子。组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子和其他在WO 99/43838和美国专利号6,072,050中公开的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature[自然]313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12：619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142：和6,177,611。
合成启动子可以用于表达EPSPS序列或其生物活性变体和片段。合成启动子包括例如一种或多种异源调节元件的组合。
在另一方面，本文公开的EPSPS序列或其活性变体或片段还可以被用作选择性标记基因。在此实施例中，细胞或生物体中EPSPS多核苷酸的存在赋予了该细胞或生物体草甘膦抗性的可检测的表型性状，由此使技术人员可选择己受到与EPSPS多核背酸连接的目的基因转化的细胞或生物体。因此，例如，可以将EPSPS多核苷酸引入核酸构建体(如载体)中，由此可通过在草甘膦存在时使该宿主生长，并且选择成活和/或生长能力明显高于缺乏此核酸构建体的宿主存活或生长速度的宿主，以鉴定含有此核酸构建体的宿主(如细胞或转基因植物)。EPSPS多核苷酸在多种对草甘膦敏感的多种宿主(包括植物、大多数细菌(包括大肠杆菌)、放线菌、酵母、藻类和真菌)中都可用作选择性标记。
在具体实施例中，EPSPS多肽及其活性变体和片段、和编码其的多核苷酸进一步包含叶绿体转运肽。如本文所用，术语“叶绿体转运肽”将被缩写为“CTP”并且是指叶绿体前体蛋白的N末端部分，该N末端部分将叶绿体前体蛋白导入叶绿体并且随后被叶绿体加工蛋白酶切除。当CTP可操作地连接至多肽的N末端时，该多肽被转运至叶绿体中。从天然蛋白去除CTP减小或消除了天然蛋白被运输至叶绿体中的能力。可操作地连接的叶绿体转运肽被发现处于要被靶向至叶绿体的蛋白的N末端处，并且位于转运肽切割位点的上游并且紧邻转运肽切割位点，该转运肽切割位点使转运肽与要被靶向至叶绿体的成熟蛋白分开。
术语“叶绿体转运肽切割位点”是指在叶绿体加工蛋白酶发挥作用的叶绿体靶向序列中的两个氨基酸之间的位点。叶绿体转运肽将所需蛋白靶向至叶绿体，并且可以利于进入细胞器的蛋白质转运。这伴随由原产于叶绿体的叶绿体加工蛋白酶，在适当的转运肽切割位点，从成熟多肽或蛋白切割转运肽。因此，叶绿体转运肽进一步包含适合的切割位点，以便将前体蛋白正确加工成包含在叶绿体内的成熟多肽。
如本文所用，“异源”CTP包含对于其可操作地连接的多肽而言是外源的转运肽序列。此类异源叶绿体转运肽是已知的，包括但不限于衍生自以下的那些：豌豆属(JP1986224990；E00977)，胡萝卜(Luo等人(1997)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]33(4)，709-722(Z33383)，烟草属(Bowler等人，EP 0359617；A09029)，稻属(de Pater等人(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，15(3)，399-406(X51911)，以及合成序列，例如EP0189707；美国专利号5,728,925；美国专利号5,717,084(A10396和A10398)中提供的那些。在一个实施例中，异源叶绿体转运肽是来自：分离自任何植物的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基前体蛋白。从多种植物很好地表征了Rubisco小亚基，并且来自其中任一个的转运肽将适合本文公开的用途。参见例如藓属(Quatrano等人，AW599738)；百脉根属(Poulsen等人，AW428760)；西瓜属(J.S.Shin，AI563240)；烟草属(Appleby等人(1997)Heredity[遗传性]79(6)，557-563)；苜蓿(Khoudi等人(1997)Gene[基因]197(1/2)，343-351)；马铃薯和番茄(Fritz等人(1993)Gene[基因]137(2)，271-4)；小麦(Galili等人(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81(1)，98-104)；以及稻(Xie等人(1987)Sci.Sin.[新加坡科学]，Ser.B[系列B](Engl.编辑)，30(7)，706-19)。例如，转运肽可以衍生自分离自植物的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基，这些植物包括但不限于大豆、油菜籽、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高粱、稻、拟南芥、甜菜、甘蔗、低芥酸菜籽、粟、豆类、豌豆、黑麦、亚麻、和饲草。对于在本公开中使用，优选的是来自例如拟南芥或烟草的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基前体蛋白。
F.堆叠其他目的性状
在一些实施例中，将本文公开的EPSPS多核苷酸或其活性变体和片段工程化进分子堆叠物中。因此，本文公开的各种宿主细胞、植物细胞和种子可以进一步包含一种或多种目的性状，并且在更具体的实施例中，该宿主细胞、植物、植物部分或植物细胞与目的多核苷酸序列的任何组合进行堆叠以便产生具有所希望性状组合的植物。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一个目的植物或生物体中的多种性状。在一个非限制性实例中，“堆叠的性状”包括其中序列在物理上彼此相邻的分子堆叠物。如本文所用的性状是指源自具体序列或序列组群的表型。在一个实施例中，分子堆叠物包含也赋予对至少一个序列(该序列通过相同和/或不同的机制，赋予对草甘膦的耐受性)的耐受性的至少一个另外的多核苷酸和/或赋予对第二种除草剂的耐受性的至少一个另外的多核苷酸。
因此，在一个实施例中，将具有本文公开的EPSPS多核苷酸或其活性变体或片段的宿主细胞、植物、植物细胞或植物部分与至少一种其他EPSPS序列堆叠。此类EPSPS序列包括本文公开的EPSPS序列及其变体和片段，连同其他EPSPS序列，这些其他EPSPS序列包括但不限于以下文献中列出的EPSPS序列：WO 02/36782、美国公开2004/0082770和WO 2005/012515、美国专利号7,462,481、美国专利号7,405,074，其各自通过引用结合在此。
由本文公开的EPSPS序列产生的草甘膦耐受性的机制可以与其他模式的除草剂抗性结合以提供对草甘膦和一种或多种其他除草剂耐受的宿主细胞、植物、植物外植体。例如，由EPSPS赋予的草甘膦耐受性的机制可以与其他模式的本领域已知的草甘膦耐受性结合。在其他实施例中，具有EPSPS序列的或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分可以与例如赋予对以下的耐受性的一个或多个序列堆叠：ALS抑制剂；HPPD抑制剂；2，4-D；其他苯氧基生长素除草剂；芳氧基苯氧基丙酸除草剂；麦草畏；谷氨酰胺合成酶(GS)；草铵膦除草剂；靶向原卟啉原氧化酶(也称为“原卟啉原氧化酶抑制剂”)的除草剂。
具有EPSPS序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分还可以与至少一个其他性状结合，以产生进一步包含多种所希望性状组合的植物。例如，具有EPSPS序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分可以与编码具有杀有害生物的和/或杀昆虫的活性的多肽的多核苷酸堆叠，或具有EPSPS序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分可以与植物疾病抗性基因结合。
这些堆叠的组合可以通过如下任何方法产生，该方法包括但不限于，通过任何常规的方法学进行植物育种、或遗传转化。如果通过对该植物进行基因转化来堆叠这些序列，则可以在任何时间和以任何顺序组合目的这些多核苷酸序列。可以用共转化方案将这些性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能所希望的是引入一种将抑制所关注的聚核苷酸的表达的转化盒。此可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在该植物中产生所需性状组合。进一步应当认识到，可以使用位点特异重组系统，来在希望的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855、以及WO 99/25853，将其全部通过引用并入本文。
具有本文公开的EPSPS序列或其活性变体或片段的任何植物可以用于制造食品或饲料产品。此类方法包括获得包含EPSPS序列或其活性变体或片段的植物、外植体、种子、植物细胞、或细胞，并且加工这些植物、外植体、种子、植物细胞、或细胞以生产食品或饲料产品。
II.使用方法
A.产生草甘膦耐受性植物的方法
术语“草甘膦耐受性”和“草甘膦抗性”在本文中可互换使用。
i.引入
可以使用各种方法来将目的序列引入宿主细胞、植物或植物部分中。“引入”旨在意指以这样一种方式将多核苷酸或多肽提供于宿主细胞、植物、植物细胞或植物部分中以致于该序列得以进入该植物或生物体的细胞的内部。本公开的方法不依赖于用于将序列引入生物体或植物或植物部分中的具体方法，只要该多核苷酸或多肽得以进入该生物体或植物的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸或多肽引入各种生物体(包括植物)的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
“稳定转化”旨在表示经引入植物中的核苷酸构建体合并到目的植物或生物体的基因组中，并且能够被其子代遗传。“瞬时转化”旨在表示将多核苷酸引入目的植物或生物体中并且不合并到该植物或生物体的基因组中，或者将多肽引入植物或生物体中。
转化方案连同用于将多肽或多核苷酸序列引入植物中的方案可以取决于被靶向转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而变化。用于将多肽和多核苷酸引入植物细胞的适合的方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)、和弹道粒子加速法(参见例如美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；和5,932,782；Tomes等人(1995)在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，Gamborg和Phillips编辑(施普林格出版公司(Springer-Verlag)，柏林)；McCabe等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)；和Lec1转化法(WO 00/28058)。也参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science andTechnology[微粒科学与技术]5∶27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87∶671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology[生物学/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞与发育生物学]27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855、5,322,783、和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[卵巢组织的实验操作]中Chapman等人编辑(纽约朗文出版社(Longman，New York))第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany[植物学年鉴]75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(maize via Agrobacterium tumefaciens[经由根癌农杆菌的玉米])；所有这些文献通过引用结合在此。
在具体实施例中，可以使用多种瞬时转化法向植物提供EPSPS序列或其活性变体或片段。这种瞬时转化法包括但不限于将EPSPS蛋白或其活性变体和片段直接引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway等人，(1986)MolGen.Genet.[分子和普通遗传学]202：179-185；Nomura等人，(1986)Plant Sci.[植物科学]44：53-58；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]91：2176-2180和Hush等人，(1994)The Journal of Cell Science[细胞科学杂志]107：775-784，以上所有文献都通过引用并入本文。
在其他实施例中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本文公开的EPSPS多核苷酸或其活性变体和片段引入植物中。通常，这类方法涉及将本公开的核苷酸构建体并入DNA或RNA分子内。应当认识到，EPSPS序列最初可以被合成为病毒多蛋白的一部分，然后可以通过体内或体外蛋白水解而被加工，以产生所希望的重组蛋白。此外，应当认识到，本文公开的启动子也涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子、用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等人(1996)Molecular Biotechnology[分子生物技术]5：209-221；通过引用并入本文。
用于在植物基因组中的具体位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所希望的基因组位置处的插入。参见例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855、以及WO 99/25853，将其全部通过引用并入本文。简言之，本文公开的多核苷酸可以包含在两侧为两个非引起重组的重组位点的转移盒中。将转移盒引入使如下靶位点稳定地并入其基因组中的植物中，该靶位点的侧翼为两个与该转移盒的这些位点相对应的非引起重组的重组位点。提供适当的重组酶，并将该转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体位置处。靶向多核苷酸的其他方法在WO 2009/114321(通过引用并入本文)中阐述，其描述了产生以修饰植物基因组(特别是玉米基因组)的“定制”大范围核酸酶。还参见Gao等人(2010)Plant Journal[植物杂志]1：176-187。
可以根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5：81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化的株系或者不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所希望的表型特征的组成型表达的所得后代。可以培育两代或更多代植株，确保所希望的表型特征的表达得到稳定保持和遗传，并且然后收获种子以确保已实现所希望的表型特征的表达。以这种方式，本公开提供了具有本文公开的多核苷酸的转化种子(也称为“转基因种子”)，该多核苷酸例如作为表达盒的一部分稳定地并入其基因组中。
可以培养通过植物转化技术衍生的转化的植物细胞(包括以上讨论的那些)以再生拥有该转化的基因型(即EPSPS多核苷酸)并且从而拥有所希望的表型(例如对草甘膦或草甘膦类似物的获得性抗性(即耐受性))的完整植物。对于玉米的转化和再生，参见，Gordon-Kamm等人，The Plant Cell[植物细胞]，2：603-618(1990)。从培养的原生质体再生植物描述于Evans等人(1983)Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of PlantCell Culture[原生质体分离和培养-植物细胞培养手册]，第124-176页，MacmillanPublishing Company，New York[麦克米兰出版公司，纽约]；和Binding(1985)Regeneration of Plants，Plant Protoplasts[植物再生-植物原生质体]第21-73页，CRC出版社，波卡拉顿。还可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分中获得再生。此类再生技术通常描述于Klee等人(1987)Ann Rev of Plant Phys[植物生理学年鉴]38：467中。还参见例如Payne和Gamborg。
技术人员将认识到，在将含有EPSPS基因的表达盒稳定地并入转基因植物中并且确认是有效的之后，其可以通过有性杂交被引入其他植物中。可以使用许多标准育种技术中的任何一种，这取决于要杂交的物种。
在无性繁殖的作物中，成熟的转基因植物可以通过取出插条或通过组织培养技术进行繁殖，以产生多个相同的植物。进行所希望的转基因学的选择，并且获得并且无性繁殖新品种用于商业用途。在种子繁殖的作物中，成熟的转基因植物可以自交以产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新引入的异源核酸的种子。这些种子可以生长，以产生植物，这些植物僵产生选择的表型。
包括从再生植物获得的部分，例如花、种子、叶、枝、果实、等，条件是这些部分包含细胞，这些细胞包含EPSPS核酸。还包括再生植物的后代和变体、以及突变体，条件是这些部分包含引入的核酸序列。
在一个实施例中，可通过将含有单个添加的异源核酸的杂合转基因植物有性交配(自交)，使产生的种子中的一些发芽，并且针对相对于对照植物(即天然的、非转基因的)，改变的细胞分裂，分析产生的所得植物。还考虑了与亲本植物回交和与非转基因植物外交。
动物的和低等真核生物的(例如酵母)宿主细胞是感受态的或成为感受态的，用于通过各种手段的转基因。存在将DNA引入动物细胞的若干熟知方法。这些方法包括：磷酸钙沉淀；受体细胞与含有DNA的细菌原生质体的融合；用含有DNA的脂质体处理受体细胞；二乙氨乙基葡聚糖；电穿孔；基因枪法；以及将DNA直接微注射到细胞中。通过本领域熟知的手段培养转染细胞。参见Kuchler，R.J.，Biochemical Methods in Cell Culture andVirology[细胞培养和病毒学中的生物化学方法]，道登、哈金森和罗斯有限公司(Dowden，Hutchinson and Ross，Inc.)(1977)。
在一些实施例中，这些方法包括通过以下方式进行引入：在可再生植物细胞中表达包含可操作地连接到至少一种调节序列的多核苷酸的重组DNA构建体，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列；并且产生草甘膦耐受性植物，该草甘膦耐受性植物在其基因组中包含该重组DNA构建体。在一些实施例中，这些方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中植物EPSPS多肽包含与SEQ IDNO：2具有至少90％同一性的序列。
重组DNA可以包含：(a)编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、和F442V；(b)编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、和T441Q；或(c)编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、和D402G。该重组DNA还可以包含多核苷酸，该多核苷酸编码SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的植物EPSPS多肽。
ii.修饰
通常，用来修饰或改变宿主基因组DNA的方法是可获得的。例如，可以使用一种或多种位点特异性工程系统，以位点特异性方式，修饰或改变宿主植物中的预先存在的或内源的EPSPS序列。这包括改变包括调节元件、编码序列和非编码序列的宿主DNA序列或预先存在的转基因序列。这些方法在将核酸靶向至基因组中的预先工程化的靶识别序列中是有用的。作为实例，使用“定制”或工程化的内切核酸酶，例如生产的大范围核酸酶来修饰植物基因组，产生本文所述的基因修饰的细胞或植物(参见例如WO 2009/114321；Ga0等人(2010)Plant Journal[植物杂志]1：176-187)。另一种定点工程化是通过使用与限制性内切酶的限制特性偶联的锌指结构域识别。参见例如Urnov等人，(2010)Nat Rev Genet.[自然遗传学综述]11(9)：636-46；Shukla等人，(2009)Nature[自然]459(7245)：437-41。转录激活子样(TAL)效应子DNA修饰酶(TALE或TALEN)也被用于植物基因组中的工程改变。参见例如US 20110145940，Cermak等人，(2011)Nucleic Acids Res.[核酸研究]39(12)和Boch等人，(2009)，Science[科学]326(5959)：1509-12。还可以使用细菌型II CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关的)系统来进行植物基因组的位点特异性修饰。参见例如Belhaj等人，(2013)，Plant Methods[植物方法]9：39；CRISPR/Cas系统允许由可定制的小非编码RNA指导的基因组DNA的靶向切割。
例如，可以修饰植物细胞中的内源植物EPSPS基因以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。可以从该植物细胞生长草甘膦耐受性植物。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含G102A和选自下组的氨基酸突变中的至少两个、至少三个、或至少四个，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的植物EPSPS多肽。
可以通过CRISPR/Cas指导RNA介导的系统、锌指核酸酶介导的系统、大范围核酸酶介导的系统、寡核碱基介导的系统、或本领域的普通技术人员已知的任何基因修饰系统修饰内源植物EPSPS基因。
此外，出于本文的目的，内源植物EPSPS基因包括编码DNA和编码DNA内部和周围的基因组DNA，例如像启动子、内含子、和终止子序列。
在一些实施例中，CRISPR/Cas指导RNA介导的系统被用于修饰内源植物EPSPS基因。CRISPR是细菌基因组内的大量成簇的规律间隔的短回文重复序列。最近从酿脓链球菌发现CRISPR相关蛋白9核酸酶(Cas9)提供了将突变引入天然基因的可能性(Sander和Joung，2014)。为了将双链断裂引入靶基因，通过与工程化的RNA的正常碱基配对，将Cas9指导至靶基因DNA。在双链断裂后，可以通过同源-定向修复过程，从工程化的模板引入EPSPS中的一个或多个所希望的突变。由修饰基因编码的EPSPS将在天然启动子的控制下。因此，所有组织将根据它们天然的空间的和时间的程序，可以在提供适当的催化能力中，赋予超过转基因表达的优点的条件，表达酶。
如本文所用，术语“指导多核苷酸”是指可以与Cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得Cas内切核酸酶能够识别并任选地切割DNA靶位点。指导多核苷酸可以包括单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，引导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代A、2’-氟代U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。在本公开的一些实施例中，指导多核苷酸并不仅仅包含核糖核酸(RNA)。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导RNA”。
指导多核苷酸可以是双分子(也称为双链体指导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子指导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。两个单独的分子可以是RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一些实施例中，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链体指导多核苷酸的第一个分子被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。cr核苷酸可以包含在细菌和古细菌中天然存在的crRNA的片段。在一个实施例中，存在于本文公开的cr核苷酸中的细菌和古细菌中天然存在的crRNA的片段的大小范围可以是，但并不限于2、3、4、5、6、7、8、9，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施例中，包含CER结构域的双链体指导多核苷酸的第二个分子被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。在一个实施例中，指导RNA/Cas9核酸内切酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体化的RNA。
指导多核苷酸还可以是单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。“结构域”意指可以为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列的核苷酸的连续延伸。单指导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一些实施例中，单指导多核苷酸包含连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含与CER结构域连接的VT结构域)，其中该连接是包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单指导多核苷酸可以被称为“单指导RNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导DNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导RNA-DNA”(当由RNA和DNA核苷酸的组合构成时)。在本公开的一个实施例中，单指导RNA包含可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的crRNA或crRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述指导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。
使用单指导多核苷酸对比双链体指导多核苷酸的一个方面是，为了表达单指导多核苷酸，仅需要制造一个表达盒。
术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中可互换使用，并且是指与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一核苷酸序列结构域(VT结构域)与靶序列之间的互补％可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变目标结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在一些实施例中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)或其任何组合构成。
术语引导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在本文中可互换使用，并且是指与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如引导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)或其任何组合构成。
连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施例中，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸的长度。在一个实施例中，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含四核苷酸环序列，例如但不限于GAAA四核苷酸环序列。
指导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可以选自但不限于下组，该组由以下组成：5′帽、3’聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔物18分子的连接、5′至3′共价连接、或其任何组合。这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自由以下组成的组：修改的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修改的结合亲和力、修改的细胞降解抗性和增加的细胞通透性。
在本公开的一个实施例中，组合物包含指导多核苷酸，该指导多核苷酸包括：(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列区域(VT结构域)；和(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列区域(CER结构域)，其中该第一核苷酸序列区域和该第二核苷酸序列区域由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其组合构成。第一核苷酸序列结构域(可变靶向结构域)与靶序列之间的互补％可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在本公开的一个实施例中，指导多核苷酸的第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和第二核苷酸序列结构域(CER结构域)位于单分子上。在另一实施例中，第二核苷酸序列结构域(Cas内切核酸酶识别结构域)包含能够沿着互补区域杂交的两个分开的分子。
在一个实施例中，组合物包含指导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域(VT结构域)是DNA序列，并且第二核苷酸序列结构域(CER结构域)选自下组，该组由以下组成：DNA序列、RNA序列、及其组合。
在一个实施例中，可以使用本领域技术人员已知的任何方法(例如但不限于粒子轰击或局部应用)将指导多核苷酸直接引入植物细胞。
当指导多核苷酸仅包含RNA序列(也称为“指导RNA”)时，可以通过引入包含可操作地连接至能够在所述植物细胞中转录指导多核苷酸的植物特异性启动子的相应指导DNA序列的重组DNA分子，将其间接引入。术语“相应的指导DNA”是指与RNA分子相同的，但具有“T”取代RNA分子的每个“U”的DNA分子。
在一些实施例中，经由包含可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子的相应指导DNA的重组DNA构建体的粒子轰击或农杆菌转化，引入指导多核苷酸。
术语“靶位点”、“靶序列”、”靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指细胞的基因组(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在该多核苷酸序列处通过Cas内切核酸酶在细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是细胞或生物体的基因组中的内源性位点，或者可替代地，靶位点可以与细胞或生物体异源并且从而不是天然存在于基因组中，或者与在自然界发生的位置相比，可以在异质基因组位置中找到靶位点。如本文所用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换使用，指的是对细胞或生物体的基因组来说是内源的或天然的、并且位于细胞或生物体的基因组中该靶序列的内源或天然位置处的靶序列。细胞包括但不限于动物、细菌、真菌、昆虫、酵母和植物细胞，连同通过本文所述的方法产生的植物和种子。
在一个实施例中，与正使用的具体基因编辑系统关联的靶位点，可以相似于通过双链断裂诱导剂(例如但不限于锌指内切核酸酶、大范围核酸酶、或TALEN内切核酸酶)，特异性识别和/或结合的DNA识别位点或靶位点。
“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入细胞或生物体(例如但不限于植物或酵母)的基因组中的靶序列。这样的人工靶序列可以在序列上与细胞的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于细胞或生物体的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”、“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指如本文公开的靶序列，当与非改变的靶序列相比时，该靶序列包括至少一个改变。例如，此类“改变”包括：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
本文提供了多核苷酸构建体，这些多核苷酸构建体提供了靶向植物细胞的内源EPSPS基因的指导RNA。多核苷酸构建体可以进一步包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(1)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸突变位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列。
本文提供了用于产生草甘膦耐受性植物的方法，其中将指导RNA、一种或多种多核苷酸修饰模板、和一种或多种Cas内切核酸酶提供至植物细胞。这一种或多种内切核酸酶在植物细胞中的内源EPSPS基因处引入双链断裂，并且这一种或多种多核苷酸修饰模板被用于产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的EPSPS基因，该EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。从植物细胞获得植物，并且产生了没有指导RNA和Cas内切核酸酶的草甘膦耐受性子代植物。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个、至少三个、或至少四个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)A2R、(b)A4W、(c)H54M、(d)A72Q、(e)K84R、(f)L98C、(g)K173R、(h)I208L、(i)K243E、(j)T279A、(k)E302S、(l)T361S、(m)E391P、(n)E391G、(o)D402G、(p)A416G、(q)V438R、(r)S440R、(s)T441Q、和(t)F442V，其中每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸突变位置，并且其中内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：(a)A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V；(b)A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q；或(c)A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。修饰的内源植物EPSPS基因可以编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列。
本文提供了多核苷酸修饰模板，这些多核苷酸修饰模板用于通过CRISPR/Cas9基因编辑进行基因的内源修饰。多核苷酸修饰模板可以包含部分EPSP合酶(EPSPS)序列并且可以进一步包含对应于G102A的和对应于选自下组的至少一个或多个氨基酸突变的一个或多个核苷酸突变，该组由以下组成：a)A2R、b)A4W、c)H54M、d)A72Q、e)K84R、f)L98C、g)K173R、h)I208L、i)K243E、j)T279A、k)E302S、l)T361S、m)E391P、n)E391G、o)D402G、p)A416G、q)V438R、r)S 440R、s)T441Q、和t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO：1中列出的氨基酸位置。
B.用于在目的宿主细胞、植物或植物部分中，增加至少一个EPSPS序列或其活性变体或片段的表达和或活性水平的方法
提供了各种方法用于在目的宿主细胞中表达EPSPS序列或其活性变体或片段。例如，用EPSPS序列转化目的宿主细胞，并且在允许表达EPSPS序列的条件下，培养这些细胞。在一些实施例中，将细胞通过离心收获，用物理或化学手段破裂，并且将保留所得粗制提取物用于进一步纯化。可以用任何常规的方法破裂用于表达蛋白质的微生物细胞，这些方法包括冷冻-解冻循环、超声、机械破碎或使用细胞溶解剂或其他方法，这些都是本领域技术人员熟知的。
值得一提的是，有很多关于培养和产生多种细胞(包括细菌、植物、动物(尤其是哺乳动物)和古细菌来源的细胞)的参考资料。参见例如Sambrook，Ausubel，和Berger(都同上)，连同Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique[动物细胞的培养，基本技术的手册]，第3版，Wiley-Liss公司，纽约以及其中引用的参考文献；Doyle和Griffiths(1997)Mammalian Cell Culture：Essential Techniques[哺乳动物细胞培养：基本技术]约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)，纽约州；Humason(1979)Animal Tissue Techniques[动物组织技术]，第4版，弗里曼和公司(W.H.Freeman andCompany)；以及Ricciardelli等人，(1989)In vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞和发育生物学]25：1016-1024。对于植物细胞培养和再生，参见Payne等人(1992)Plant Cell andTissue Culture in Liquid Systems[液体系统中的植物细胞和组织培养]约翰威利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)纽约，纽约州；Gamborg和Phillips(编辑)(1995)PlantCell，Tissue and Organ Culture[植物细胞、组织和器官培养]；Fundamental Methods[基本方法]Springer Lab Manual[施普林格实验室手册]，施普林格出版社(Springer-Verlag)(柏林，海德堡，纽约)；Jones编辑(1984)Plant Gene Transfer and ExpressionProtocols[植物基因转移和表达方案]，胡马纳出版社(Humana Press)，托托华，新泽西州；以及Plant Molecular Biology[植物分子生物学](1993)R.R.D.Croy编辑，BiosScientific Publishers出版社，牛津，英国ISBN 0121983706。通常，细胞培养基列出于Atlas和Park(编辑)The Hahdbook of Microbiologlcal Media[微生物培养基手册](1993)CRC出版社(CRC Press)，波卡拉顿，佛罗里达州。在可获得的商业文献中发现了用于细胞培养的另外的信息，例如Life Science Research Cell Culture Catalogue[生命科学研究细胞培养目录](1998)，来自的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，Inc.)(圣路易斯，密苏里州)(“Sigma-LSRCCC”)以及例如The Plant Culture Catalogue andsupplement[植物培养目录和补充](1997)，也来自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，Inc.)圣路易斯，密苏里州)(“Sigma-PCCS”)。
提供了用于增加植物、植物细胞、植物部分、外植体、和/或种子中的本文公开的EPSPS序列或其活性变体或片段的活性的方法。在另外的实施例中，相对于适当的对照植物、植物部分、或细胞，在植物或植物部分中，EPSPS多肽的活性增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％、5000％、或10,000％。仍在其他实施例中，相对于适当的对照植物、植物部分、或细胞，在植物或植物部分中的EPSPS多肽的活性水平增加了10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍。可以按多种方式，包括例如通过表达多个拷贝的一种或多种EPSPS多肽，通过采用启动子来驱动更高水平的序列的表达，或通过采用具有增加的活性水平的EPSPS序列，实现细胞中EPSPS多肽的活性方面的这样一种增加。
在具体实施例中，将多肽或EPSPS多核苷酸或其活性变体或片段引入植物、植物细胞、外植体或植物部分中。随后，使用本领域技术人员已知的方法，例如但不限于Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析、或表型分析，选择具有本文公开的引入的序列的植物细胞。在植物形成条件下，使通过上述实施例改变或修饰的植物或植物部分生长一段时间，该段时间足以调节在本文公开的多肽在植物中的时间的或空间的表达。植物形成条件是本领域熟知的，并且在本文别处进行了简要讨论。
在一个实施例中，提供了产生草甘膦耐受性植物细胞的方法，并且该方法包括用编码EPSPS多肽或其活性变体或片段的多核苷酸转化植物细胞。在具体实施例中，该方法进一步包括通过在足够的浓度的草甘膦中生长植物细胞，这样使得除草剂杀死不包含目的EPSPS多肽的植物细胞，选择对草甘膦有抗性或耐受的植物细胞。
C.产生作物和控制杂草的方法
提供了用于在耕作区中控制杂草，防止耕作区中发展或出现除草剂抗性杂草，产生作物，并且增加作物安全性的方法。术语“控制”及其衍生物，例如，如在“控制杂草”中，是指抑制杂草的生长、发芽、复制、和/或增殖；和/或杀死、去除、破坏、或以其他方式减少杂草的出现和/或活性。
如本文所用，耕作区包括人们希望生长植物的任何区域。此类耕作区包括但不限于其中培养植物的田地(例如作物田地、草场、树林、经营性林、用于培养水果和蔬菜的田地等)，温室，生长室等。
如本文所用，“选择性控制”意在耕作区中的大多数杂草被显著损害或杀死，而如果作物植物也存在于该田地中，则大多数作物植物未显著损害。因此，当至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的杂草被显著损害或杀死，而如果作物植物也存在于该田地中，小于10％、5％、或1％的作物植物被显著损害或杀死时，一种方法就被认为是选择性控制杂草。
提供的方法包括用具有本文公开的EPSPS序列或其活性变体或片段的植物或从该植物衍生的转基因种子种植耕作区，并且在具体实施例中，向作物、种子、杂草或其耕作区施加有效量的目的除草剂。当认识到，可以在作物被种植在耕作区之前或之后施加除草剂。此类除草剂施加可以包括草甘膦的施加。
因此，术语“草甘磷”应被认为包括N-磷酞基甲基甘氨酸(包括其任何盐)的任何除草有效形式和其他会导致在植物中产生草甘磷阴离子的形式。
在具体方法中，将草甘膦施加具有EPSPS序列或其活性变体或片段的植物或它们的耕作区。在具体实施例中，草甘膦是处于盐的形式，例如铵、异丙基铵、钾、钠(包括倍半钠)或三甲基锍(可替代地称为草硫膦)。仍在另外的实施例中，草甘膦和ALS抑制剂(例如磺酰脲)的协同性有效量的组合的混合物被施加至植物或其耕作区。
通常，施加至田地的有效量的除草剂足以选择性控制杂草而不显著影响作物。在一些实施例中，施加的有效量的草甘膦是约50克酸当量/英亩至约2000克酸当量/英亩。重要的是应注意，不必使作物对除草剂完全不敏感，只要从抑制杂草得到的益处超过草甘膦或草甘膦类似物对作物或作物植物的负面影响即可。
如本文所用的“杂草”是指具体区域中不希望的植物。相反，如本文所用的“作物植物”是指在具体区域中希望的植物，例如像玉米或大豆植物。因此，在一些实施例中，杂草是非作物植物或非作物物种，而在一些实施例中，杂草是试图从具体区域消除的作物物种，例如像种植有具有本文公开的EPSPS序列或其活性变体或片段的植物的田地中的差的和/或非转基因的大豆植物。
因此，本公开提供了在种有作物的田地中选择性控制杂草的方法，涉及在田地上种植由于被编码本文公开的EPSPS或其活性变体或片段的基因转化因而具有草甘磷耐受性的作物种子或植物，并对田地里的作物和杂草施加足量的草甘磷以控制杂草而不显著影响作物。
进一步提供了用于控制田地中的杂草并防止草甘磷抗性杂草出现在种有作物的田地中的方法，涉及在田地上种植由于被编码EPSPS的基因和编码通过另一机制而赋予草甘磷耐受性的多肽(例如草甘磷耐受的草甘膦-N-乙酰转移酶和/或草甘磷耐受的草甘磷氧化还原酶)的基因转化，因而具有草甘磷耐受性的作物种子或植物，并且对田地里的作物和杂草施加足量的草甘磷以控制杂草而不显著影响作物。在本文别处详细讨论了可以在此方法中使用的各种植物。
在另外的实施例中，本公开提供了用于控制田地中的杂草并防止除草剂抗性杂草出现在种有作物的田地中的方法，涉及在田地上种植由于被编码EPSPS的基因、编码通过另一机制而赋予草甘磷耐受性的多肽(例如草甘磷耐受的草甘膦-N-乙酰转移酶和/或草甘磷氧化还原酶)的基因和编码赋予对另外的除草剂的耐受性的多肽(例如突变的羟基苯丙酮酸双氧化酶、磺酰脲耐受的乙酰乳酸合酶、磺酰脲耐受的乙酰羟酸合酶、磺酰胺耐受的乙酰乳酸合酶、磺酰胺耐受的乙酰羟酸合酶、咪唑啉酮耐受的乙酰乳酸合酶、咪唑啉酮耐受的乙酰羟酸合酶、草丁膦乙酰转移酶和突变的原卟啉原氧化酶)的基因转化，因而具有草甘磷耐受性的作物种子或植物，并且对田地里的作物和杂草施加足量的草甘磷和另外的除草剂，例如羟基苯丙酮酸双氧化酶抑制剂、磺酰胺、咪唑啉酮、双丙氨磷、草丁膦、唑啶草酮、氟丙嘧草酯、草硫膦、草铵膦、和原卟啉原氧化酶抑制剂以控制杂草而不显著影响作物。在本文别处详细讨论了可以在此方法中使用的各种植物和种子。
进一步供了用于控制田地中的杂草并防止除草剂抗性杂草出现在种有作物的田地中的方法，涉及在田地上种植由于被编码EPSPS的基因和编码赋予对另外的除草剂的耐受性的多肽(例如突变的羟基苯丙酮酸双氧化酶、磺酰胺耐受的乙酰乳酸合酶、磺酰胺耐受的乙酰羟酸合酶、咪唑啉酮耐受的乙酰乳酸合酶、咪唑啉酮耐受的乙酰羟酸合酶、草丁膦乙酰转移酶和突变的原卟啉原氧化酶)的基因转化，因而具有草甘磷耐受性的作物种子或植物，并且对田地里的作物和杂草施加足量的草甘磷和另外的除草剂，例如羟基苯丙酮酸双氧化酶抑制剂、磺酰胺、咪唑啉酮、双丙氨磷、草丁膦、唑啶草酮、氟丙嘧草酯、草硫膦、草铵膦、和原卟啉原氧化酶抑制剂以控制杂草而不显著影响作物。在本文别处详细讨论了可以在此方法中使用的各种植物和种子。
进一步供了用于产生作物的方法，通过在使得作物植物产生作物，并且收获作物的条件下，生长由于被本文公开的EPSPS多核苷酸或其活性变体或片段转化，或由于内源植物EPSPS基因被修饰，因而具有草甘磷耐受性的作物植物。优选地，在植物上或植物附近施用草甘膦，其浓度可有效控制杂草而不抑制转基因作物植物生长和产生作物。可以在种植之前，或在种植后的任何时间直到并且包括收获时施用草甘膦。草甘膦可以施用一次或多次。草甘膦施用的时间安排、用量、施加模式和其他参数将取决于作物植物和生长环境的具体性质而变化，并且可以由本领域技术人员容易地确定。还提供了通过此方法产生的作物。
进一步提供的是用于繁殖植物的方法，该植物含有EPSPS多肽或其活性变体或片段。这种植物可以是，例如，单子叶植物或双子叶植物。一方面，繁殖必需使含有EPSPS多核苷酸转基因的植物与第二种植物杂交，这样使得至少一些杂交后代显示草甘膦耐受性。
本文的方法进一步允许开发要与具有EPSPS序列或其活性变体或片段的植物一起使用的除草剂应用。在此类方法中，评估了耕作区中的环境条件。可以被评估的环境条件包括但不限于涉及的地下水和地表水污染、作物的预期用途、作物耐受、土壤残留、耕作区中存在的杂草、土壤质地、土壤的pH、土壤中的有机物质的量、应用设备、和耕作实践。在评估环境条件时，有效量的除草剂的组合可以被施加至作物、作物部分、和作物的种子或耕作区。
任何除草剂或除草剂的组合可以被施加至具有本文公开的EPSPS序列或其活性变体或片段的植物或从该植物衍生的转基因种子、作物部分、或种有作物植物的耕作区。“用除草剂的组合处理”或“施加除草剂的组合”至作物、耕作区或“田地”，意在用指明是该组合的一部分的除草剂和/或化学品中的每一个处理具体的田地、作物、或杂草，这样使得实现希望的效果，即这样使得选择性控制杂草而不显著损害作物。每一种除草剂和/或化学品的施加可以是同时的，或者该施加可以处于不同时间(顺序的)，只要能实现希望的效果。此外，施加可以发生在种植作物之前。
除草剂的分类(即将除草剂分组为多个类别和亚类)是本领域熟知的，并且包括HRAC(除草剂抗性行动委员会(Herbicide Resistance Action Committee))和WSSA(美国杂草科学学会(the Weed Science Society of America))的分类，(还参见Retzinger和Mallory-Smith(1997)Weed Technology[杂草技术]11：384-393)。
可以通过其作用模式和/或作用位点，将除草剂分类，并且还可以通过它们被施加的时间(例如发芽前或发芽后)，通过施加的方法(例如叶面施加或土壤施加)，或通过它们如何被植物吸收或它们如何影响植物或通过它们的结构，将除草剂分类。“作用模式”通常是指在除草剂抑制或以其他方式损害的植物内的代谢过程或生理过程，而“作用位点”通常是指在除草剂起作用或直接相互作用的植物内的物理位置或生物化学位点。可以按各种方式，包括作用模式和/或作用位点，将除草剂分类。
通常，对表达除草剂耐受性基因的植物赋予对具体除草剂或其他化学品的耐受性的除草剂耐受性基因还将赋予对相同类别和或亚类中的其他除草剂或化学品的耐受性。因此，在一些实施例中，转基因植物耐受相同类别或亚类中的多于一种除草剂或化学品，例如HPPD抑制剂、草甘膦、ALS化学品、PPO的抑制剂、磺酰脲、和/或合成生长素。
典型地，本公开的植物可以耐受用不同类型的除草剂(即具有不同作用模式和/或不同作用位点的除草剂)处理，由此允许推荐的改进的杂草管理策略，以减小除草剂耐受性杂草的发生率和流行率。
在一些实施例中，通过用按等价于至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、150、170、200、300、400、500、600、700、800、800、1000、2000、3000、4000、5000、5400或更多克或盎司(1盎司＝29.57ml)的活性成分或商品或除草剂制剂每英亩或每公顷的比率的剂量，施加至植物的草甘膦除草剂进行处理，本公开的植物未显著损害，而适当的对照植物被相同草甘膦处理显著损害。
可以例如在来自大学推广服务的各种出版物中发现除草剂的有效量的另外的范围。参见例如Bernards等人，(2006)Guide for Weed Management in Nebraska[内布拉斯加州的杂草管理的指导](www.ianrpubs.url.edu/sendlt/ec130)；Regher等人，(2005)Chemical Weed Control for Fields Crops，Pastures，Rangeland，and Noncropland[田地、作物牧场、草原、和非耕地的化学品杂草控制]，堪萨斯州立大学农业推广站和企业推广服务(Kansas State University Agricultural Extension Station and CorporateExtension Service)；Zollinger等人，(2006)North Dakota Weed Control Guide[北达科他州杂草控制指导]，北达科他州推广服务(North Dakota Extension Service)和爱荷华州立大学推广(the Iowa State University Extension)，在www.weeds.iastate.edu，其各自通过引用结合在此。
在本公开的一些实施例中，按8盎司和32盎司的酸当量每英亩之间的比率，或按10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30盎司的酸当量每英亩之间的比率，按应用范围的下端并且在12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32盎司的酸当量每英亩之间，按应用范围的高端，将草甘膦施加至耕作区和/或施加至耕作区中的至少一株植物(1盎司＝29.57ml)。在其他实施例中，至少按1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或更大盎司的活性成分每公顷，施加草甘膦(1盎司＝29.57ml)。在本公开的一些实施例中，按0.04盎司和1.0盎司的活性成分每英亩之间的比率，或按0.1、0.2、0.4、0.6和0.8盎司的活性成分每英亩之间的比率，按应用范围的下端并且在0.2、0.4、0.6、0.8和1.0盎司的活性成分每英亩之间，按应用范围的高端，将磺酰脲除草剂施加至田地和/或施加至田地中的至少一株植物。(1盎司＝29.57ml)。在一些实施例中，如本文所述，对于杂草控制，可以在从作物植物的发芽前开始的阶段至作物植物的早期繁殖阶段，进行草甘膦处理。
III.针对多种酶变体的催化效率的快速测定
定向进化的商业应用之一是使酶脱敏，以便例如被除草剂抑制。Kcat、1/KM、和KI是三个维度，当相乘时是针对在抑制剂存在时的催化，酶的内在能力的量度。单个维度的理想值取决于在应用条件下，底物浓度和抑制剂浓度。当尝试通过定向进化优化那些值时，(kcat/KM)*KI可以是用于评估变体文库的信息性参数。然而，通过底物饱和分析评估数百个变体的(kcat/KM)*KI，可以不提供足够的通量。本文呈现了使得能够分离在等式的一侧的(kcat/KM)*KI的米氏方程的操作。如果底物浓度和酶浓度是相同的，但是在两个不同抑制剂浓度(其中一个可以是0)测量速度，则数据足以仅用两次速率测量，计算(kcat/KM)*KI。已经通过关联用快速方法获得的值与通过底物饱和动力学获得的那些值，验证该程序。
该方法包括：(a)提供多种酶变体；(b)提供抑制剂；(c)提供底物；(d)在不多于两个不同抑制剂浓度下，进行反应，该反应涉及多种酶变体和底物；(e)在不多于两个不同抑制剂浓度下，测量反应速率；以及(f)计算多种酶变体的(kcat/KM)*KI。在一些实施例中，抑制剂浓度之一是零。在其他实施例中，底物是处于与酶变体的亲本酶的米氏常数(KM)基本上相似的浓度。仍在其他实施例中，酶是处于在该两种不同抑制剂浓度下，足以导致基本上线性反应速率的浓度。仍在其他实施例中，抑制剂浓度之一足以导致至少约50％抑制。仍在其他实施例中，在高通量系统中进行测定。仍在其他实施例中，通过获得(kcat/KM)*KI的数值估算在抑制剂存在下的催化能力，其中kcat是最大酶转换率，KM是米氏常数，并且KI是抑制剂解离常数。在一些实施例中，底物是PEP；抑制剂是草甘膦；并且多种酶变体是EPSPS酶变体。仍在其他实施例中，在两个抑制剂浓度下，酶浓度和底物浓度是相同的。
实例
在以下实例中，除非另有说明，其中份数和百分比以重量计，并且度数为摄氏度。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上述讨论和这些实例，本领域技术人员可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。此类修改也旨在落入所附实施例的范围内。
实例1
植物EPSP合酶的表达、纯化、和评价
从GenBank条目CAA44974.1(NCBI GI号1524383：本文呈现为SEQ ID NO：2)获得成熟玉蜀黍EPSP合酶(EPSPS)的氨基酸序列。产生核苷酸序列以便添加N末端蛋氨酸并且用来优化密码子使用，用于在大肠杆菌中表达。由商业供应商供应合成基因。将该基因克隆进表达载体，该表达载体提供驱动蛋白表达的T7启动子。修饰该载体，以便将6x N末端组氨酸标签改变为10x标签。所得载体的编码区域产生具有表1中所示的氨基酸序列的表达蛋白(用SEQ ID NO：1表示)。编码区域前面是用SEQ ID NO：3表示的N末端延伸。
表1.称作“天然玉米EPSPS”的变体的氨基酸序列。当涉及本文公开的玉米EPSPS突变时，此序列是针对本文提供的所有位置编号的参考。
Figure BDA0001676909970000701
Figure BDA0001676909970000711
Figure BDA0001676909970000721
AroA敲除菌株
用P1噬菌体病毒转导，使编码EPSPS的大肠杆菌基因(AroA)功能上缺失。供体菌株是JW0891(CGSC)，其中用卡那霉素抗性基因破坏AroA基因。受体菌株是B121DE3-Tuner(Novagen公司)。在未转化的Top10细胞中繁殖病毒颗粒。1∶10和1∶100稀释109个噬斑形成单位的储备液。从每个稀释，按0.4OD的密度，将10μL的噬菌体添加至0.3ml的JW0891供体细胞。在37℃持续30min后，将噬菌体和细胞的混合物在顶层琼脂(0.6％)上铺板，并且使其在37℃生长过夜。将5ml的含有10mM CaCl2的液体LB培养基添加至顶层琼脂，以便收获噬斑。收集的液体与1ml的氯仿结合，并且充分混合。然后将混合物旋转，并且将上清液在4℃储存。转导混合物含有处于0.5OD的密度的0.3ml的LB中的BL21(DE3)Tuner细胞、10mM CaCl2和10ul的收获字供体细胞的病毒颗粒，按10倍、100倍和1000倍稀释。允许在37℃转导1小时。将120ul的含有100mM柠檬酸钠的LB添加至每个细胞和噬菌体的混合物，并且在37℃将混合物摇动1小时。将细胞在含有40mg/L卡那霉素和柠檬酸钠的选择培养基上铺板。通过将AroA基因的区域测序，确认将破坏的AroA基因转导进Tuner。通过洗涤和在10％甘油中再悬浮，将Tuner敲除菌株制成电感受态的。
EPSPS产生和纯化
无论是在BL21(DE3)中或用Tuner AroA敲除完成蛋白产生，将载体电穿孔进入细胞，并且选择转化体，用于在含有100ug羧苄青霉素/ml的LB琼脂上生长。在Magic培养基中生长细胞，其中当培养基变得耗尽葡萄糖时，发生诱导。在37℃生长4小时后，将细胞转移至30℃并且再生长16hr。用含有0.2mg/ml溶菌酶、1mM二硫苏糖醇、蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司(Sigma)，细菌混合物)和内切核酸酶的BPER(皮尔斯公司(Pierce))蛋白提取试剂裂解沉淀的细胞。通过离心去除不溶性细胞碎片。通过在镍形式的次氮基三乙酸(Ni-NTA)树脂(凯杰公司(Qiagen))上的亲和色谱法，从可溶性蛋白溶液纯化EPSPS蛋白。使用由VectorNTI提供的0.676OD/mg/ml的消光系数，用在280nm的吸光度，测量蛋白浓度。
EPSPS测定
从克雷白氏肺炎杆菌aroA-(ATCC 25597)的培养物制备莽草酸-3-磷酸(S3P)。将来自在2xYT中生长的500ml培养物的细胞用于接种增加有55uM酪氨酸、60uM苯丙氨酸、25uM色氨酸、0.1uM 4-氨基苯甲酸盐和0.1uM 4-羟基苯甲酸盐的6L的基本培养基(Weiss等人，1953.JAmer Chem Soc[美国化学学会学报]75：5572-5576)。挺阴离子交换HPLC监测S3P的累积。在37℃摇动4天后，浓度达到约1mM。用高达0.7M的梯度洗脱，在pH 7.3下，用碳酸氢铵中的阴离子交换色谱法从培养上清液纯化S3P。S3P干净地与被洗脱更早的磷酸盐分开。
通过将产生自EPSPS反应的磷酸盐量化，确定EPSPS活性。无机磷酸盐的释放与由嘌呤-核苷磷酸化酶催化的与2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷的反应偶联(MR Webb，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]89：4884-4887，1992)。使用Spectramax酶标仪(分子仪器公司(Molecular Devices))，在360nm处监测到发生的吸光度改变，其中消光度是11，200M-1cm-1。为了确定动力学参数，按七个浓度(第八个是空白，不含底物)(范围从4至400uM)存在变化底物，并且按饱和存在不变的底物。六微升的变化底物的50倍浓储备溶液置于96孔测定板的孔中，并且通过添加含有25mM Hepes，pH 7，100mM KCl，0.3mM 2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷，1uM(1单位/ml)嘌呤-核苷磷酸化酶(西格玛公司(Sigma)N8264)和200uM的非变化底物的混合物开始反应。用Spectramax酶标仪监测反应。针对使用的底物浓度，定制Spectramax软件的米氏动力学方案。使用米氏方程的Lineweaver-Burke转化，软件返回KM和Vmax的值。为了确定kcat，将Vmax(uM/min)除以酶浓度(uM)。为了确定KI，在针对PEP的明显KM中产生大约2倍提高的草甘膦的浓度存在下，以更高范围的PEP浓度重复底物饱和。然后从以下形式的针对竞争性抑制的米氏方程计算KI：
KI＝KM[I]/(KM app-KM)
KM近似酶-底物复合物的解离常数，而kcat是当底物浓度饱和时，底物至产物的转化速率。kcat/KM是当底物浓度低(约KM)时，针对催化效率的广泛接受的参数。KI是酶抑制剂复合物的解离常数，其中更高的值指明平衡位于更朝向游离酶和更高的不敏感性。参数kcat/KMx KI被用于量化催化效率和不敏感性，以及因此而来的酶的总体适合性。
实例2
玉米EPSPS的定向进化
饱和诱变
使天然玉米EPSPS的成熟形式经受饱和诱变，以发现减小对草甘膦的敏感性的新颖突变。使用NNK(其中N表示腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、和胞嘧啶核苷酸各自25％的混合物；并且K表示胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷酸各自50％的混合物)作为待诱变的位置的简并密码子，产生EPSPS多肽链中每个位置的取代文库。PCR反应混合物含有诱变的正向引物(NNK密码子侧翼是在NNK的每一例与模板匹配的28个核苷酸)和反向引物(它是正向引物之前的序列的互补体，长度28个核苷酸)。为了从平端PCR产物制造环状双链DNA质粒，用T4多核苷酸激酶、T4DNA连接酶、和DpnI(用来破坏亲代DNA模板)消化产物。在通过超滤脱盐后，准备好连接产物用于转化和下游应用。
筛选有益突变
流过用于在基本培养基上生长的EPSPS反应的要求是从质粒表达的功能EPSPS的有力选择，条件是天然AroA基因被敲除。因此，Tuner敲除菌株被用于优化的早期，其中对草甘膦的不敏感性将处在与内源EPSPS的范围相似的范围内。预期天然EPSPS中的单突变并不赋予对草甘膦的显著不敏感性，所以在选择培养基中的草甘膦浓度是10mM的较低浓度。分离克隆并且产生异源表达EPSPS，并且如上所述进行纯化。然后通过在具有或不具有10uM草甘膦的情况下，在50uM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和莽草酸-3-磷酸(S3P)存在下，测量反应速率，测定纯化的变体。有益于活性或对草甘膦的不敏感性的突变显示在表2中。
表2.在添加或不添加10uM草甘膦的情况下，在50uM PEP和莽草酸-3-磷酸存在下，玉米EPSPS变体的活性。值表示每uM EPSPS，磷酸盐形成的速率(uM每min)。在第二栏中的速率是在10μM草甘膦存在下的速率，表示为无草甘膦时的速率的％。
Figure BDA0001676909970000761
Figure BDA0001676909970000771
在位置103和107处的饱和诱变
在玉米EPSPS序列中的位置103和107进行NNK激活的饱和诱变，并且如上所述筛选转化的BL21DE3细胞。代表性结果呈现在表3中。
表3.在位置103和107处的同时饱和诱变后选择的变体的动力学参数
Figure BDA0001676909970000772
EPSPS-TGPW蛋白版本对草甘膦是约3,000倍更不敏感。然而，催化效率(kcat/KM)仅是天然玉米EPSPS的催化效率的5％，这是由于其针对PEP的4倍更低的kcat和5倍更高的KM。
天然玉米EPSPS的组合改组
之前的调查揭示，不存在赋予对草甘膦的显著不敏感性的新颖单突变，也不存在赋予不敏感性同时保留催化效率的在位置103和107处的氨基酸的任何新颖组合。然而，鉴定的取代的一些组合可以产生具有希望的特性的变体。因此，设计并且合成组合文库。在文库中随机组合的可变氨基酸位置的完整清单显示在表4中。
表4.用于构建组合文库WT-FS的多样性。显示的是天然玉米EPSPS(SEQ ID NO：1)中的位置编号和取代。
2P
4LNR
6S
76T
78L
101S
102A
103IALGV
107GLQSWA
156GY
194M
202R
208V
224R
241A
246G
249V
278VG
302S
310V
311S
313G
328C
338S
391G
402G
437R
438R
445G
用于组合文库WT-FS的多样性是表2和3中所示的相同多样性，其中添加了G102A、103A和103I。添加102A，因为其在使EPSPS对草甘膦脱敏中的已知作用(Sost和Amrhein.1990.Arch Biochem Biophy[生物化学与生物理学集刊]282：433-436；Eschenburg等人2002.Planta[植物]216：129-35)。通过全合成改组，合成该文库(Ness，J.E.等人2002.Nature Biotechnology[自然生物技术]20：1251-1255)。假定每个基因1至10个突变，该文库可以包含的独特成员的理论数目是5.6x 108。
将文库的载体DNA转化进BL21(DE3)Tuner AroA敲除菌株，并且将细胞在含有50mM草甘膦的M9培养基上铺板。将转化细胞的小的等分试样在LB上铺板，由此确定，铺板并且筛选了1.1x 108个菌落形成单位，或20％的理论文库大小。挑取115个菌落并且经受第二层级的筛选，其中如实例1中所述纯化EPSPS蛋白，并且在以下三个条件下测量活性：0.2mM PEP和S3P、0.05mM PEP和S3P、以及0.05mM PEP和S3P加上10uM草甘膦。通过考虑以下选择命中：在高底物浓度下的反应速率(反映kcat)，在低至高底物浓度下的活性的比率(反映KM)，以及具有至不具有草甘膦时的活性的比率(反映KI)。选择的变体经受如实例1中所述的底物饱和动力学分析。用于选择的变体的动力学参数显示在表5中。
表5.从WT-FS组合文库选择的变体的动力学参数(参见说明书文本)
Figure BDA0001676909970000791
Figure BDA0001676909970000801
变体B含有存在于GA21玉米转化事件中的T103I和P107S突变(例如美国专利6,566,587和美国专利6,040,497)。动力学分析指明，TIPS突变赋予高水平的对草甘膦的不敏感性，同时保留了对PEP的接近天然的亲和力，但是仅具有约5％的天然kcat(Funke等人2009.J Biological Chemistry[生物化学杂志]284：9854-9860；Yu等人2015.PlantPhysiology.[植物生理学]2015年2月第00146页.2015)。在牛筋草的种群中记载了T103I和P107S突变的分步获取(Yu等人，2015同上)。然而，在193个个体植物的种群中，仅1.6％是对于TIPS纯合的，指明与具有造成高度不敏感的、但是催化缺陷的酶的第二等位基因相比，由P107S等位基因造成的正常催化能力对于适合性而言更重要。
变体E具有在位置102取代甘氨酸的丙氨酸。在来自农杆菌属物种菌株CP4的II型EPSPS(具有与12uM的针对PEP的低KM结合的高度的对草甘膦的不敏感性的酶)中的同源位置处存在丙氨酸(美国专利5,633,435)。因为PEP比草甘膦更短，假设CP4EPSPS中的丙氨酸甲基基团被适合地定位，从而干扰草甘膦而不是PEP的结合。在CP4酶和大肠杆菌或玉米EPSPS之间，仅存在24％至26％同源性(美国专利5,633,435)。
与单独的G102A(表5)相比，变体WT-FS-E中的三个另外的突变赋予针对PEP的KM中的2倍改进。从那些观察结果，推断变体FS-WT-E的进一步诱变会生成A102甲基基团的背景，这样使得其位置可以提供有利的动力学参数。
同样，存在于变体WT-FS-D中的另外的突变对比单独的P107L，提供了改进的动力学参数(表5)。尝试表示先前已知机制中的每一者的变体WT-FS-B、-D和-E的进一步优化，用于使EPSPS对用草甘膦抑制更不敏感。目标是增加B的kcat，增加D的KI，并且改进针对E的PEP的kcat/KM。各自经受如实例1中所述的饱和诱变。针对每一者鉴定的中性的或有益的单取代显示在表6中。(该表包括来自以下讨论的变体868-H6的饱和诱变的结果。)
表6.得自天然玉米EPSPS和变体WT-FS-B、WT-FS-D、WT-FS-E和868-H6的饱和诱变的氨基酸序列多样性。仅包括从天然玉米EPSPS变化的位置。粗体指明在饱和诱变之前主链序列中存在的氨基酸。
Figure BDA0001676909970000811
Figure BDA0001676909970000821
Figure BDA0001676909970000831
存在若干位置(54、72、173、和224)，在这些位置饱和诱变在多个主链中产生中性的或有益的突变。然而，在多数情况下，具体的氨基酸取代特异性针对具体的主链。仅在六个位置(173、190、224、241、246、和278)是发现于五个主链中的多于两个中的相同取代，并且在任何情况下也不是发现于四个主链中的相同取代。通常情况是，在其中产生多样性的主链中，在中性的或有益的单取代中，存在少量重叠，指明对产生自突变的酶的适合性的影响取决于其中发生突变的序列上下文。给出在各种植物EPSP合酶中的序列同源性，基于本公开的指导，针对玉米EPSPS序列的本文提供的具体突变的相应序列上下文是在另一物种(例如稻、高粱、和向日葵)中容易地可确定的。重要的是注意到，用变体WT-FS-E中的I208L突变发现，在表6中所示的改变中没有一个赋予了kcat/KMx KI中大于2倍的改进(表5)。
从针对每一者鉴定的功能多样性，构建并且筛选组合文库。在WT-FS-E的情况下，将I208L突变固定进组合文库的主链。来自这三个组合文库的选择的命中的动力学参数显示在表7中。
表7.在EPSPS变体FS-WT-B、-D和-E的饱和诱变和组合改组后，选择的变体的动力学参数。
Figure BDA0001676909970000832
Figure BDA0001676909970000841
旨在针对FS-WT-B和-D的改进，即分别是改进的kcat和KI，并不确保来自一轮的多样性产生和组合改组，并且未尝试进一步改进它们(数据未显示)。然而，相对于FS-WT-E-I208L，显著改进了两个变体771-C2和868-H6(本文也分别称为“C2”和“H6”)。为了充分开发存在于771-C2和868-H6中的多样性，构建文库，其中用天然氨基酸切换两个酶的可变位置。这将允许所有位置获取取代或恢复至天然氨基酸，由此产生存在于两个变体中的突变的所有可能的组合，并且消除非必需的或有害的突变。在表8中可见文库的设计。将半合成改组用于在天然玉米EPSPS、771-C2和868-H6中存在的氨基酸中显示的每个位置处切换多样性。该程序并未导致显著的改进。然而，变体123-C1(本文也称为“C1”)具有相对于868-H6适度改进的动力学参数，同时具有与针对868-H6的15个突变相比，仅9个突变。123-C1序列显示在表8中，并且动力学数据在表7中。
表8.与变体WT-FS-E的后代相关的多样性
Figure BDA0001676909970000842
无填充：天然的
灰色填充，对于该变体是独特的
具有白色字体的深色填充：多于一个变体是共享的
实例3
868-H6和123-C1的突变可转移至来自其他植物物种的EPSPS
来自各种植物物种的EPSPS的氨基酸序列的比对显示范围从80％至99％的同源性水平，表明在玉米背景下定义的突变将在来自其他物种的EPSPS中具有相似效果。将表9中的比对用于将868-H6和123-C1突变映射到显示的序列上。
组装并且分析包括叶绿体转运肽序列的稻(Oryza sativa)(SEQ ID NO：7)、高粱(石茅(Sorghumhalepense))(SEQ ID NO：8)、和向日葵(Helianthus annus)(SEQ ID NO：9)的天然EPSPS氨基酸序列，用于映射来自玉米868-H6的相应氨基酸突变。如果完整EPSPS序列不是可获得的，则基于序列比对和保守残基映射进行适当调整。
对于向日葵(Helianthus annuus)，不存在可获得的完整序列。以下显示的序列是编码表9中的氨基酸61-323的部分向日葵序列(GE499295)的复合物，以及针对柳叶向日葵(AY545662.1)、H.ciliaris(EL428089)和TC22032(未鉴定的物种)的cDNA数据。
Figure BDA0001676909970000861
Figure BDA0001676909970000871
Figure BDA0001676909970000881
Figure BDA0001676909970000891
Figure BDA0001676909970000901
Figure BDA0001676909970000911
Figure BDA0001676909970000921
Figure BDA0001676909970000931
对于玉米克隆868-H6中的15个突变中的10个(98、102、208、279、302、361、391、402、416和438)，氨基酸位置的背景连同天然氨基酸的化学特征是高度同源的。对于剩余氨基酸位置(2、4、72、84和441)，在向日葵序列中的天然氨基酸显著不同于单子叶植物玉米序列。然而，如表9中指明，不论哪些考虑，将H6改变并入突变的向日葵序列(SEQ ID NO：10)中。
将ChloroP预测服务器(Emanuelsson，O.等人1999.Protein Sci.[蛋白质科学]8(5)：978-84)用于近似成熟EPSPS蛋白的氨基末端。优化天然的和诱变的基因二者的核苷酸序列用于在大肠杆菌中表达，并且合成这二者的核苷酸序列。将合成基因克隆进质粒载体，并且如实例1中所述进行表达、纯化和分析。纯化的EPSPS蛋白的动力学参数显示在表10中。
表10.来自各种物种的天然EPSPS和携带868-H6突变的相同酶的动力学参数。KM值是针对PEP的。
Figure BDA0001676909970000941
Figure BDA0001676909970000951
当映射到来自其他物种的EPSPS上时，在868-H6玉米EPSPS中发现的突变的组合清楚地具有对适合性(kcat/KM*KI)的非常相似的影响。不出人意料地，与单子叶植物物种相比，在单个参数中的最大偏差是用向日葵。向日葵具有更高的针对PEP的KM，和更低的kcat，导致为玉米H6的值的38％的kcat/KM。然而，与突变体单子叶植物EPSPS酶相比，突变体向日葵酶具有74％至150％更高的针对草甘膦的KI。
同样，将存在于玉米EPSPS 123-C1中的突变(参见表8)映射到高粱的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)上并且如上产生并且纯化蛋白。当PEP和S3P二者都以200uM存在时，并且当底物以30uM存在并且草甘膦以1mM存在时，通过测量反应速率来分析酶活性(表11)。
表11.只具有在G102A的突变或具有针对玉米变体123-C1定义的突变的EPSPS酶的反应速率。
Figure BDA0001676909970000952
对于高粱和玉米EPSPS，与单独的G102A相比，在草甘膦存在和不存在的两种情况下，都可见C1突变的益处，这是由于由8个其他突变赋予的远远更低的针对PEP的KM。
还可以将突变映射至来自各种作物的其他已知EPSPS序列(参见，例如对应于含有H6突变的突变版本(参见例如SEQ ID NO：18-22)的SEQ ID NO：13-17)。具有其对应的突变版本的天然EPSPS序列的比对显示在图1-8中。
实例4
表达草甘膦耐受性植物EPSPS的草甘膦抗性玉米的产生
使用至少两种方法产生表达EPSPS变体的玉米植物-(i)在内源基因组座位处的基于重组DNA的转化或定点改变。基于重组DNA的转化方法是本领域熟知的，例如，根癌农杆菌介导的转化和基于粒子轰击的转化。
(i)重组玉米EPSPS变体转化
基于根癌农杆菌的植物转化，根据本领域已知的方法构建载体。EPSPS载体含有具有组成型植物启动子(例如泛素启动子)、内含子、任选的增强子(例如35S增强子元件)、编码草甘膦耐受性EPSPS的EPSPS变体DNA(例如868-H6)、以及植物终止子(例如PinII终止子)的T-DNA插入物。切下玉米未成熟胚并用含有目的EPSPS变体的根癌农杆菌载体进行感染。感染后，将胚转移并在共培养的培养基中培养。共培养后，将感染的未成熟胚转移到含有1.0mM草甘膦的培养基上。选择通常持续，直至鉴定到主动生长的推定的转基因愈伤组织。使用PCR和任选的蛋白印迹法(Western assay)来取样推定的转基因愈伤组织以确认EPSPS变体基因的存在。将推定的转基因愈伤组织保持在1.0mM草甘膦选择培养基上用于进一步生长并在植物再生之前进行选择。在再生时，将确认为转基因的愈伤组织转移到含有0.1mM草甘膦的成熟培养基上并且培养用于进行体细胞胚成熟。然后将成熟胚转移到含有0.1mM草甘膦再生培养基上用于进行芽和根形成。在芽和根出现后，将单个小植物转移到具有生根培养基(含有0.1mM草甘膦)的管中。将具有建立的芽和根的小植物移植到温室中的盆中用于进一步生长，从而获得T0喷雾数据并且产生T1种子。
为了评估表达EPSPS变体转基因的转基因玉米植物的草甘膦抗性的水平，在温室中用草甘膦喷雾T0植物。草甘膦浓度包括例如1X比率的可商购的草甘膦制剂的剂量。用植物变色评分和植物高度量度评估植物抗性水平。根据以下标度评估植物变色：
在用草甘膦喷雾后1、2、3和4周时的变色评分
9＝无叶/茎变色
7＝小的叶/茎变色
5＝更坏的叶/茎变色
3＝严重变色的植物或枯萎的植物
1＝死亡的植物
在用草甘膦喷雾喷雾之前和用草甘膦喷雾后，在应用后1、2、3和4周时，记录植物高度量度。将来自每一转殖项(独立的转基因愈伤组织)的两个植物送至温室。保持植物1用于种子生产并且不用草甘膦喷雾。在移植后14天时，按2X-4X草甘膦(1X草甘膦＝26盎司/英亩)喷雾植物2。也观察到在喷雾后7天和14天时的T0植物变色评分。也测量了在抽雄期时的高度数据。
(ii)基于指导的Cas9的EPSPS修饰
至少在2015年7月1日提交的国际申请号PCT/US2015/38767的实例1-15中公开了玉米植物中基于基因组修饰的指导RNA/Cas内切核酸酶的表达盒。
本文所述的是基于II型CRISPR/Cas系统并且包括Cas内切核酸酶和指导RNA(或双链体化的crRNA和tracrRNA)的指导RNA/Cas内切核酸酶系统，Cas内切核酸酶和指导RNA一起可以形成复合物，该复合物识别植物中的基因组靶位点并且将双链断裂引入所述靶位点(2013年8月22日提交的美国专利申请61/868706)，通过引用结合在此。在此实例中，希望的靶位点是玉米内源天然EPSPS序列。
使用本领域熟知的技术，并且任选地，在BBM和WUS2基因存在下，通过粒子介导的递送，将玉米优化Cas9内切核酸酶和含有特异性可变靶向结构域的玉米单指导RNA表达盒共递送至例如60-90Hi-II不成熟玉米胚(2013年3月13日提交的美国专利申请13/800447中)。
在7天后，合并20-30个最一致转化的胚并且提取总基因组DNA。用
Figure BDA0001676909970000981
高保真PCR预混合物(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，M0531L)，添加对于扩增子-特异性条形码必要的序列，对预期靶位点周围的区域进行PCR扩增，并且使用“加尾的”引物通过两轮PCR进行Illumnia测序。
用凯杰公司(Qiagen)PCR纯化旋转柱对所得PCR扩增物进行纯化；用基于Hoechst染料的荧光测定测量浓度；按等摩尔比率组合PCR扩增；并且使用Illumina的MiSeq个人测序仪用PhiX对照v3(Illumina，FC-110-3001)的30％-40％(v/v)加标以抵消序列偏差来进行单读数100个核苷酸长度的深度测序。将只在集中在预期切割位点上的10个核苷酸窗口内产生的具有≥1个核苷酸插入缺失并且未在阴性对照中以相似的水平发现的那些读数分类为非同源末端连接突变。对具有相同突变的NHEJ突变体读数进行计数并使其压缩成单个读数，并且目视确认在预期切割位点内产生的前10个最常见的突变。然后基于含有与条形码和正向引物完全匹配的合适长度的读数的总数，使用目视确认的NHEJ突变的总数来计算％突变体读数。
通过用于靶向一个或多个希望的EPSPS靶(例如868-H6变体的一个或多个突变)的指导RNA/Cas内切核酸酶系统的深度测序回收的NHEJ突变的频率，与cas9相比，仅分析了对照。此实例描述了本文所述的指导RNA/Cas9内切核酸酶系统可以用于在玉米内源EPSPS基因组区域内的目的基因组位点处引入双链断裂。编辑EPSPS靶导致针对基于草甘膦的除草剂耐受性和/或抗性的植物的产生。
实例5
用于在转化的植物中，赋予草甘膦耐受性的改组的植物EPSPS的功效
构建转化载体，由编码天然玉米EPSPS抑或玉米EPSPS变体H6的核苷酸序列组成(核苷酸序列分别是SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25)。各自前面是编码拟南芥叶绿体靶向肽(SEQ ID NO：26)抑或称作6H1的人工CTP的核苷酸序列(美国专利号7,345，143；SEQ ID NO：27)。对于启动子、CTP和酶的总计12种组合而言，所得四种CTP酶组合前面是天然拟南芥EPSPS启动子(AT1G48860；SEQ ID NO：28)、泛素-3启动子(SEQ ID NO：29)、抑或泛素-10启动子(Norris等人1993.Plant Mol Biol[植物分子生物学]21：895-906；SEQ ID NO：30)。将编码血球凝集素亲和标签的多核苷酸(核苷酸序列是SEQ ID NO：31)融合至每个EPSPS编码区的C-末端，随后是菜豆球蛋白终止子(SEQ ID NO：32)。
使用标准分子生物学技术构建用于农杆菌介导的转化的二元载体。拟南芥Col-0转化使用修饰的花浸法(Clough和Bent(1998)Plant J[植物学]16：735-743)进行，其中将植物的开花部分浸入用12种不同二元载体(指定为PHD6020-PHD6031，如表12中所述)转化的根癌农杆菌菌株GV3101的悬浮液中。
表12.用于拟南芥转化的二元载体的描述
Figure BDA0001676909970000991
Figure BDA0001676909970001001
在接种后，将植物置于植物生长室中，设置为持续16hr光周期。白天条件为21℃，具有280uM/m2/s的光强度，并且夜间条件为18℃。在荚果变成褐色后收集种子。种子用95％乙醇表面杀菌1分钟，然后在20％漂白剂加一滴Tween-20表面中杀菌15分钟，并用无菌水洗涤3次。将30mg灭菌的种子铺在pH 5.7，在150x 25mm培养皿(例如福尔肯大型培养皿(Falcon Large Petri Dishes)，VWR目录号351013)中的琼脂选择培养基上，所述培养基由具有维生素的MS盐(例如西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)，M0404)、1％蔗糖、8％TC琼脂、100mg/L特美汀和50mg/L卡那霉素组成。将板用石蜡膜密封，并且在21℃以60-100μE/m2/s的光周期孵育16小时以发芽和生长。将经选择存活的转殖项移植至RediEarth制陶土(SunGro公司)并且在生长室中生长(16hr光周期，其中白天条件在21℃，具有280uM/m2/s的光强度，并且夜间为18℃)。在移植后二十二天，将植物按0.42、0.84或1.26kg ai/ha的比率(分别是0.5、1.0和1.5倍的标准田地应用比率)，用Touchdown喷雾植物。在处理后6和10天，评估植物的损伤和表型。
按1.26kg/Ha喷雾比率，未转化的植物在处理后完全不生长，并且到第10天，显示萎黄病和濒临坏死。具有拟南芥天然EPSPS抑或合成的6H1CTP，对草甘膦的耐受性关联启动子的强度(UbiQ10＞UbiQ3＞天然的)。与未喷雾的对照相比，用含有UbiQ10启动子和H6变体的构建体转化的植物不具有可见的损伤或生长抑制。尽管天然EPSPS用更强的其松子赋予了一些耐受性，但是在每一条件下，H6变体的改进的适合性([kcat/Km]*Ki)清楚地可见。
实例6
用于在转化的大豆中，赋予草甘膦耐受性的改组的植物EPSPS的功效
构建转化载体，由编码天然玉米EPSPS、玉米EPSPS变体H6、玉米EPSPS变体C1、抑或玉米EPSPS变体C2的核苷酸序列组成(核苷酸序列分别被提供为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、或SEQ ID NO：34)。各自前面是编码称作6H1的人工CTP的核苷酸序列(美国专利号7,345，143；SEQ ID NO：27)。所得CTP酶组合前面是天然拟南芥EPSPS启动子(AT1G48860；SEQ ID NO：28)、泛素-3启动子(SEQ ID NO：29)、抑或泛素-10启动子(Norris等人1993.同上；SEQ ID NO：30)。将编码血球凝集素亲和标签的多核苷酸(核苷酸序列是SEQ ID NO：31)融合至每个EPSPS编码区的C-末端，随后是菜豆球蛋白终止子(SEQ ID NO：32)。
使用标准分子生物学技术构建用于农杆菌介导的转化的二元载体。使用从Cho等人(Cho等人2000.Planta[植物]210：195-204)的方法略微修改的方法，进行大豆(93Y21)毛状根转化，其中用发根土壤杆菌菌株K599(用表13中所述的二元载体转化)的悬浮液感染受伤的子叶外植体。
表13.用于拟南芥转化的二元载体的描述
Figure BDA0001676909970001021
在共培养后，将外植体置于含有卡那霉素的生长培养基上，用于转化转殖项的选择，具有或不具有25uM草甘膦。在缺乏草甘膦的培养基上，未转化的子叶形成根的密集生长，但是在含有25uM草甘膦的相同培养基上没有生长(未显示)。在缺乏草甘膦的培养基上，用所有构建体转化的子叶形成密集的根生长，与用未转化的子叶所见的现象不可区别(图9)。未从用构建体(其中编码EPSPS的基因是由更弱的启动子(UBQ3和天然的)驱动的)转化的子叶形成毛状根。然而，在25uM草甘膦的存在下，用含有UBQ10启动子和H6、C1以及C2变体的构建体转化的子叶产生毛状，而天然EPSPS不支持根生长。
实例7
EPSPS基因座的内源基因组编辑
针对其在EPSPS基因组靶序列处引入一个或多个双链断裂的能力，开发并且评估玉米优化Cas9内切核酸酶。通过将信号添加至moCas9编码序列的5′末端，玉米优化Cas9内切核酸酶(moCas9)通常补充有核定位信号(例如SV40)。随后，通过将内含子插入moCas9编码序列，修饰植物moCas9表达盒，以增强其在玉米细胞中的表达，并且以消除其在大肠杆菌和农杆菌中的表达。玉米泛素启动子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因终止子序列补足了moCas9内切核酸酶基因设计。然而，可以使用任何其他启动子和/或终止子。
单指导RNA(sgRNA)表达盒包括例如U6聚合酶III玉米启动子及其同源U6聚合酶终止序列。指导RNA包括核苷酸可变靶向结构域，随后是能够与双链断裂诱导内切核酸酶相互作用的RNA序列。
在EPSPS密码子序列内的玉米优化Cas9内切核酸酶靶序列(moCas9靶序列)与指导sgRNA的核苷酸可变序列(该序列确定EPSPS编码序列内的Cas9内切核酸酶切割的位点)互补。基于要被靶向至EPSPS基因座内的突变的性质和数目，此靶向区域可以变化。
合成moCAS9靶序列并且将其克隆进设计用于通过农杆菌介导的转化，将指导RNA-Cas9系统的组分递送进玉米细胞的指导RNA-Cas9表达载体。如果需要的话，农杆菌T-DNA还递送酵母FLP位点特异性重组酶和WDV(小麦矮缩病毒)复制相关蛋白(复制酶)。如果moCas9靶序列侧翼是FLP重组靶(FRT)，则可以用形成游离基因的(染色体样结构)的玉米细胞中的FLP将它们切下。通过允许其在大肠杆菌细胞中回收的WDV复制酶复制此类环状DNA片段(将复制起点嵌入到WDV启动子中)。如果玉米优化Cas9内切核酸酶在moCas9靶序列处造成双链断裂，则其修复可能产生突变。在以下文献中详细描述了该程序：Lyznik，L.A.，Djukanovic，V.，Yang，M.和Jones，S.(2012)Double-strand break-induced targetedmutagenesis in plants.[植物中的双链断裂诱导的靶向诱变]在以下中：Transgenicplants：Methods and Protocols[转基因植物：方法和方案](Dunwell，J.M.和Wetten，A.C.编辑).纽约，海德堡，多德雷赫特，伦敦：施普林格出版公司(Springer)，第399-416页。本文所述的玉米优化Cas9内切核酸酶在玉米细胞中是功能的，并且在moCas9靶序列处有效产生双链断裂。
为了实现玉米染色体EPSPS基因的靶向基因组编辑，可以产生用于编辑EPSPS编码序列的多核苷酸修饰模板，并且将其与指导RNA/Cas9系统一起共递送。可以存在同时地或顺序地递送的多于一个的修饰模板。
当与要编辑的天然EPSPS基因组序列相比时，多核苷酸修饰模板包括一个或多个核苷酸修饰(例如，对应于本文公开的一个或多个氨基酸改变的核苷酸改变)。这些核苷酸修饰通常是取代突变。EPSPS模板序列可以编码功能EPSPS蛋白或可以是并不编码全长功能多肽的部分片段。
使用粒子轰击，EPSPS多核苷酸修饰模板可以与指导sgRNA表达盒和玉米优化Cas9内切核酸酶表达载体一起共递送，该玉米优化Cas9内切核酸酶表达载体含有玉米优化Cas9内切核酸酶表达盒和选择性标记基因。在轰击之前，将十至十一天龄的未成熟胚按胚轴向下置于含N6培养基上，并且在28℃孵育4-6小时。在PDS-1000装置中，将这些板置于从底数的第三层搁板上，并且按200psi进行轰击。轰击后，将胚在28℃，在黑暗中孵育过夜，转移至含有N6-2培养基的板上，并且然后在28℃储存6-8天。然后将胚转移至含有N6-3培养基的板上，持续三周。然后将响应的愈伤组织转移至含有N6-4培养基的板上，持续另外三周的选择。在28℃总计六周的选择后，将少量的选择的组织转移至MS再生培养基上，并且在28℃，在黑暗中，孵育三周。
针对靶向点突变的存在，筛选含有针对选择性标记的适当底物(例如针对moPAT选择性标记基因的bialophos)的培养基上的选择的多个愈伤组织事件。进行EPSPS基因座的进一步测序，以确认突变。按照标准程序，从愈伤组织事件产生小植株。
实例8
在抑制剂存在下，针对多种酶变体的快速高通量酶测定
定向进化的商业应用之一是使酶脱敏，以便例如被除草剂抑制。Kcat、1/KM和KI是三个维度，当相乘时是针对在抑制剂存在时的催化，酶的内在能力的量度。当尝试通过定向进化优化那些值时，(kcat/KM)*KI可以是用于评估变体文库的信息性参数。然而，通过底物饱和分析评估数百个变体的(kcat/KM)*KI，可以不提供足够的通量。使得能够分离在等式的一例的(kcat/KM)*KI的米氏方程的操作，是用来加快测定的通量的一种方法。如果底物浓度和酶浓度是相同的，但是在两个不同抑制剂浓度(其中一个可以是0)测量速度，则此实例证明数据足以仅用两次速率测量，计算(kcat/KM)*KI。通过关联用快速方法获得的值与通过底物饱和动力学获得的那些值，验证该程序。
定向进化是在由商业或学术目的定义的特性方面，用于改进酶的适应度的过程，由体外产生的变体的适应度的经验观察所定向。在其中目标是使酶对抑制剂(例如除草剂或反馈抑制代谢物)脱敏的情况下，将通过提高KI(酶抑制剂复合物的解离常数)的值，进行改进，如方案1所示。
Figure BDA0001676909970001061
很少会这样，造成KI的增加而不影响其他参数，所以捕获所有三个参数的一些测量是优选要使用的。参数(kcat/KM)*KI组合了催化效率的表示(kcat/KM)与和底物相比，对抑制剂的亲和力的表示(KI/KM)。用增加的kcat、增加的KM、增加的KI或任何组合获得改进的(kcat/KM)*KI。增加kcat比减小KM更有效：
Figure BDA0001676909970001062
增加KI是有效的，直至其达到大约抑制剂浓度，此后进一步增加将成比例地增加(kcat/KM)*KI，但是仅会导致vi的另外2倍的增加。
如果已知的话，则通过在底物和抑制剂浓度、pH和离子强度的条件下，测量反应速度，进行变体的文库的直接评估。用等式1描述获得的速率。如果在酶改进项目开始时，速度设置在作为改进的唯一标准的应用条件下，则技术人员冒着变得受困于导致与远远更高的潜在最大值分开的峰值的序列上下文的风险。技术人员可以通过具有替代性适应度参数(kcat/KM)*KI(其捕获在单个参数中的一个或两个中改进的变体)，避免一直下降至底部。监测(kcat/KM)*KI具有以下益处：揭示给定单个参数的值的更有利分布，是否可以获得更多优化。例如，在与当前最适变体处于同等水平的应用条件下具有vi的变体可以具有：足够高的KI，这样使得(kcat/KM)*KI两倍或更多倍大于其他候选者。在米氏方程中，可以用一些取样计算见到这样一种变体的值。如果KI是5000uM并且KM 100uM，并且如果I和S的浓度分别是1000uM和20uM，则在速率方程中的分母是140。然而，如果通进一步诱变，KI和KM分别成比例地减小(例如5倍)至1000和20uM，则分母将是60，并且vi将增加2.33倍(140/60)。因此，(kcat/KM)*KI可以是有用的代数余子式，用来在用于指导定向进化的应用条件下，测量vi，该定向进化针对：对抑制剂的不敏感性。
通常，通过在抑制剂不存在和存在下，进行底物饱和分析，获得(kcat/KM)*KI。然而，分析持续更长时间。因此，使得能够仅用两次速率测量准确估算(kcat/KM)*KI的用于竞争性抑制的米氏方程的新颖处理显著增加通量并且加快了用于评估数百和数千个变体的筛选过程。为了验证该方法，针对玉米5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)及其竞争性抑制剂草甘膦，使用两种方法-传统的(饱和)和即刻的方法(快速)，量化(kcat/KM)*KI。
在用于具有竞争性抑制的稳态反应速度的米氏方程中，由于分母中的KM和[S]项，不能分离项(kcat/KM)*KI。然而，如果在不同抑制剂浓度下进行两次速率测量，则可以通过减法和分离的(kcat/KM)*KI，消除那些项，如下：
Figure BDA0001676909970001081
Figure BDA0001676909970001082
Figure BDA0001676909970001083
其中v1和v2是在相同底物([S])和酶([E])浓度下，但是在两个抑制剂浓度[I]1和[I]2下的初速度。此外，当[I]2＝0时，等式2可以被简化为：
Figure BDA0001676909970001084
其中v0和vi是具有和不具有抑制剂的情况下，但是在相同底物和酶浓度下的初速度。尽管等式2和3是同样有效的，但是为了产生表1中的数据，使用等式3，在具有和不具有抑制剂的情况下，进行速率测量。
试剂、酶和变体的来源
从克雷白氏肺炎杆菌aroA-(ATCC 25597)的培养物制备莽草酸-3-磷酸(S3P)。将来自在2xYT中生长的500ml培养物的细胞用于接种增加有55uM酪氨酸、60uM苯丙氨酸、25uM色氨酸、0.1uM 4-氨基苯甲酸盐和0.1uM 4-羟基苯甲酸盐的6L的基本培养基(Weiss等人，1953.JAmer Chem Soc[美国化学学会学报]75：5572-5576)。挺阴离子交换HPLC监测S3P的累积。在37℃摇动4天后，浓度达到约1mM。用高达0.7M的梯度洗脱，在pH 7.3，用碳酸氢铵中的阴离子交换色谱法从培养上清液纯化S3P。S3P干净地与被洗脱更早的磷酸盐分开。2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)来自Setareh Biotech公司，尤金，俄勒冈州。所有其他试剂来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。
从GenBank条目CAA44974.1(SEQ ID NO：2)获得成熟玉蜀黍EPSPS的氨基酸序列。产生核苷酸序列以便添加N末端蛋氨酸并且用来优化密码子使用，用于在大肠杆菌中表达。将合成的基因克隆进表达载体，该表达载体提供驱动蛋白和10x N末端组氨酸标签的表达的T7启动子。选择用于此研究的变体包括天然玉米EPSPS和通过本文所述的基因改组级联产生的变体。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白并且通过Ni-NTA树脂(凯杰公司(Qiagen))进行纯化。使用0.676OD/mg/mL的消光系数，通过在280nm处的吸光度，确定蛋白浓度。将蛋白归一化至0.5mg/mL用于测定。
酶测定程序和数据分析
EPSPS催化以下反应：磷酸烯醇丙酮酸(PEP)+3-磷酸莽草酸(S3P)＝磷酸盐(Pi)+5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)通过将反应产生的磷酸盐量化，确定EPSPS活性。使用标准方法，由嘌呤-核苷磷酸化酶催化，将磷酸盐的释放偶联至与MESG的反应。使用Spectramax酶标仪(分子仪器公司(Molecular Devices))，在360nm处监测到发生的吸光度改变，其中消光度是11，200M-1cm-1。为了以常规方式确定动力学参数，按七个浓度(第八个是空白，不含底物)(范围从15uM至800uM)存在PEP，并且不变的底物S3P按200uM的饱和浓度存在。5微升的PEP的60倍浓储备溶液置于96孔测定板的孔中，并且通过添加含有25mMHepes，pH 7，100mM KCl，5％(v/v)乙二醇，0.2mM MESG，1单位/ml嘌呤-核苷磷酸化酶(西格玛公司(Sigma)N8264)，200uM S3P和EPSPS的混合物开始反应。调节酶浓度，以产生足够的信号，而不超过线性初始反应速率的极限。用草甘膦的两个或三个浓度重复相同程序，并且用具有图板棱柱(GraphPad Prism)(graphpad.com)的非线性回归分析加工数据，并且全局拟合至针对竞争性抑制的米氏方程。
对于该新颖的方法，使用相同的测定条件。PEP浓度设置在30uM，其接近野生型EPSPS的KM，同时S3P按200uM存在。将EPSPS的浓度固定在0.07uM。用或不用1mM草甘膦作为抑制剂，一式三份进行反应。将v0和vi的值代入等式3，产生(kcat/KM)*KI。
为了验证快速方法产生(kcat/KM)*KI的准确估算，将结果与通过全底物饱和分析获得的那些进行比较。针对玉米5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶的天然的和该组的变体，获得数据。为了建立实际的和替代的(kcat/KM)*KI之间的关联，选择显示大范围的已知单个参数的一组变体，用于通过快速方法的分析。天然玉米EPSPS和另一EPSPS形成该范围的下端和高端。由Zm-H6EPSPS及其单突变供应在中间的值。通过天然玉米EPSPS的基因该组产生Zm-H6EPSPS，并且相对于天然酶，具有16个突变，如本文所述。变体的动力学参数跨越以下范围：对于kcat，39倍，对于KM，37倍，对于KI，10000倍，并且对于(kcat/KM)*KI，9000倍。通过全部两种方法获得的所有参数显示在表15中。通过底物饱和分析和快速方法确定的(kcat/KM)*KI的值的线性回归，显示贯穿值的范围的优异关联(图10)。
用两个简单反应，产生集总参数(kcat/KM)*KI，捕获了在抑制剂存在下，催化必需的动力学特性。给定适当的测定，可以用自动液体处理进行这两个反应，使得能够评估数百个变体。这些测量将伴随在使用相同自动测定的应用的条件下的速率测量。
当涉及抑制时，(kcat/KM)乘以KI另外捕获抑制剂解离常数的幅度。第一步将是在应用条件下的速率测量，和用于通过快速方法确定(kcat/KM)*KI的两个测量。接下来，将完整批次的(kcat/KM)*KI的值与如通过在应用条件下的速率标准确定的最佳变体的那些值进行比较。如果(kcat/KM)*KI的值明显超过了在应用条件下的最佳变体所拥有的那些值，则指明例外的单个参数存在于群体内并且进一步优化是可能的。在突出的单个参数和特异性突变之间的任何关联可以表明多个策略，通过这些策略，可以在一种酶中捕获最佳单个参数。因此，当依赖于作为唯一筛选标准的应用条件下的速率时，会有助于在稍后轮的改组中的改进的性能的有益突变会丢失。通过表14中提供的假设数据说明了这一点。
表14：针对酶变体的假设动力学数据
变体 kcat KM kcat/KM KI (k<sub>cat</sub>/K<sub>M</sub>)*K<sub>I</sub> v<sub>i</sub>
A 500 25 20.0 400 8000 93
B 300 75 4.0 7000 28000 57
C 300 15 20.0 1000 20000 120
D 1500 75 20.0 1000 20000 177
应用条件：[S]，20uM；[I]，1000uM；[E]，1uM
在应用条件下的催化性能(vi)方面，相比变体B，变体A是更好的变体，即使变体B具有远远更大的(kcat/KM)*KI，仅仅由于其17.5倍更高的KI。如以上解释的，高于[I]的KI的值具有对vi的减少的影响，最高达到2倍。然而，在稍后轮的该组中，这一特性可以潜在交换为更低的KM(变体C)或更高的kcat(变体D)，以便最后获得具有与其亲本中的任一者相比，在应用条件下的更佳性能的变体。
存在若干实际考虑，用于使用快速方法准确估算(kcat/KM)*KI。1)必须发现在具有和不具有抑制剂的两种情况下，产生线性初始反应速率的酶浓度。2)必须调节抑制剂浓度，以获得在等式3的项v0-vi中，最小地放大误差的抑制程度。如果抑制太小，则v0-vi将很小，并且乘数vi x v0/(v0-vi)中的误差将很大。将50％抑制设置为目标。3)底物浓度应设置在一个或多个亲本变体的大约KM，符合测定的敏感性。高底物浓度掩盖了对抑制剂的敏感性，并且减小了严格性，用于捕获KM中的改进。取决于速度的必要性，存在定制酶的和抑制剂的浓度的机会。表15显示选择的条件，对于准确分析变体中的一些，0.07uM酶和1mM草甘膦是不适当的。重复快速方法用于那些数据和获得的数据，这些数据更好地符合用底物饱和分析获得的数据。然而，出于筛选目的，相关步骤不是必需的。可以设置条件，这样使得准确量化具有预定最小适应度水平的变体。
在表15中，在标准条件下，获得高于快速方法的粗线的参数。对于显示低于粗线的变体，用根据需要调节的酶浓度或草甘膦浓度，重复快速分析，以产生线性初始速率的极限内的足够的信号。
因此，总之，此实例证明，可以仅用两次速率测量确定(kcat/KM)*KI，以便评估多种酶变体。因为它量化了在抑制剂存在下，催化的内在能力，(kcat/KM)*KI捕获了具有突变的多个变体，这些变体特性可以并入随后轮的优化中。由于其含有作为经历改进的参数的KM，该方法还适合体内应用，其中不存在对底物浓度的控制。
Figure BDA0001676909970001131
Figure IDA0001676911040000011
Figure IDA0001676911040000021
Figure IDA0001676911040000031
Figure IDA0001676911040000041
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Figure IDA0001676911040000291
Figure IDA0001676911040000301

Claims (18)

1.一种多核苷酸，其编码植物EPSP合酶（EPSPS）多肽，其中该植物EPSPS多肽选自SEQID NOs:5、10、11、12、18、19和20。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码SEQ ID NO: 5中列出的植物EPSPS多肽。
3.一种重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含如权利要求1或2所述的多核苷酸。
4.一种产生草甘膦耐受性植物的方法，该方法包括：
a)在可再生植物细胞中表达包含可操作地连接到至少一种调节序列的多核苷酸的重组DNA构建体，其中该多核苷酸编码植物EPSP合酶（EPSPS）多肽，该EPSPS多肽选自SEQ IDNOs:5、10、11、12、18、19和20；以及
b)产生该草甘膦耐受性植物，其中该草甘膦耐受性植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽由SEQ ID NO: 5中列出的氨基酸序列组成。
6.一种产生草甘膦耐受性植物的方法，所述方法包括：
a.修饰植物细胞中的内源植物EPSP合酶（EPSPS）基因以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白由选自SEQ ID NOs:5、10、11、12、18、19和20的氨基酸序列组成；以及
b.从所述植物细胞生长植物，其中所述植物是对草甘膦耐受的。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白由SEQ ID NO: 5中列出的氨基酸序列组成。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过CRISPR/Cas指导RNA介导的系统进行修饰。
9.如权利要求6或7所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过锌指核酸酶介导的系统进行修饰。
10.如权利要求6或7所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过大范围核酸酶介导的系统进行修饰。
11.如权利要求6或7所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过寡核碱基介导的系统进行修饰。
12.一种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体在植物细胞中提供指导RNA，其中该指导RNA靶向植物细胞的内源EPSP合酶（EPSPS）基因，并且所述多核苷酸构建体进一步包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽选自SEQ ID NOs:5、10、11、12、18、19和20。
13.如权利要求12所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽由SEQ ID NO: 5中列出的氨基酸序列组成。
14.一种用于生产草甘膦耐受性植物的方法，该方法包括：
a)提供指导RNA、至少一种多核苷酸修饰模板、以及至少一种Cas内切核酸酶至植物细胞，其中该至少一种Cas内切核酸酶在该植物细胞中的内源EPSP合酶（EPSPS）基因处引入双链断裂，并且其中所述多核苷酸修饰模板用于产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的EPSPS基因，该植物EPSPS多肽选自SEQ ID NOs:5、10、11、12、18、19和20；
b)从 (a) 的植物细胞获得植物；以及
d)从 (b) 的植物产生没有所述指导RNA和Cas内切核酸酶的草甘膦耐受性子代植物。
15.如权利要求14所述的方法，其中该至少一种多核苷酸修饰模板产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽由SEQ ID NO: 5中列出的氨基酸序列组成。
16.一种杂草控制的方法，该方法包括将有效量的草甘膦施用在草甘膦耐受性植物群体上，其中所述草甘膦耐受性植物包含如权利要求1所述的多核苷酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述草甘膦耐受性植物是玉米植物。
18.如权利要求16所述的方法，其中施加的有效量的草甘膦是50克酸当量/英亩至2000克酸当量/英亩。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108291236B (zh) * 2015-09-30 2022-07-26 先锋国际良种公司 植物epsp合酶和使用方法
CN106636025B (zh) * 2016-12-28 2017-11-14 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种水稻epsps突变体及其编码基因和应用
US20200392528A1 (en) * 2017-03-30 2020-12-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Improved plant epsp synthases and methods of use

Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997004103A2 (fr) * 1995-07-19 1997-02-06 Rhone-Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
WO2001024615A1 (en) * 1999-10-07 2001-04-12 Valigen (Us), Inc. Non-transgenic herbicide resistant plants
CN101285057A (zh) * 2007-04-11 2008-10-15 中国农业科学院生物技术研究所 高抗草甘膦的epsp合酶及其编码序列
CN101429499A (zh) * 2007-11-09 2009-05-13 中国农业科学院生物技术研究所 高耐受草甘膦的epsp合酶及其编码序列
US7615685B2 (en) * 1990-01-22 2009-11-10 Dekalb Genetics Corporation Methods of producing human or animal food from stably transformed, fertile maize plants
CN101932701A (zh) * 2008-02-01 2010-12-29 阿森尼克斯公司 Grg31和grg36 epsp合酶的定向进化
WO2011034936A1 (en) * 2009-09-15 2011-03-24 Sapphire Energy, Inc. Herbicide resistant organisms
CN102108360A (zh) * 2009-12-24 2011-06-29 上海市农业科学院 一种来源于荧光假单胞菌的epsp合酶基因及其应用
CN102533844A (zh) * 2011-12-21 2012-07-04 中国农业科学院生物技术研究所 含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体及其应用
CN102559745A (zh) * 2012-01-30 2012-07-11 中国农业科学院生物技术研究所 Epsp合酶基因水稻叶绿体表达载体及其应用
CN102776161A (zh) * 2012-08-14 2012-11-14 浙江新安化工集团股份有限公司 分离自土壤的高抗草甘膦epsp合酶及其编码序列的制备和用途
CN102876690A (zh) * 2012-10-09 2013-01-16 上海市农业科学院 来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的epsp合酶基因及其应用
CN103205404A (zh) * 2013-03-26 2013-07-17 上海市农业科学院 来源于苹果的epsp合酶多位点突变体及其编码基因与应用
UA84562U (uk) * 2013-04-18 2013-10-25 Институт Кормов И Сельского Хозяйства Подолья Наан Спосіб запобігання появи резистентних біотипів бур'янів у посівах кукурудзи
CN103827305A (zh) * 2011-07-28 2014-05-28 吉奈克蒂夫公司 草甘膦耐受性玉米事件vco-φ1981-5及用于其检测的试剂盒和方法
WO2014187728A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Syngenta Participations Ag Seed soaking apparatus and method
CN104202969A (zh) * 2012-02-01 2014-12-10 陶氏益农公司 新的草甘膦抗性基因类别
CN104878097A (zh) * 2015-04-30 2015-09-02 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测玉米植物dbn9981的核酸序列及其检测方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ20013856A3 (cs) * 1999-04-29 2002-04-17 Syngenta Ltd. Herbicidně rezistentní rostliny
WO2003013226A2 (en) 2001-08-09 2003-02-20 Cibus Genetics Non-transgenic herbicide resistant plants
AU2002329759A1 (en) * 2001-08-17 2003-03-03 Monsanto Technology Llc Methyltransferase genes and uses thereof
CN101500421B (zh) * 2006-06-06 2015-04-15 孟山都技术有限公司 用于控制杂草的方法
EP2103211A1 (en) * 2008-03-20 2009-09-23 Cognis IP Management GmbH Adjuvant compositions
CN101864403A (zh) * 2010-05-14 2010-10-20 中国农业大学 高粱epsp合酶突变体及其编码基因与应用
US9187762B2 (en) * 2010-08-13 2015-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) activity
EP2702157A1 (en) * 2011-04-29 2014-03-05 Keygene N.V. Glyphosate resistance enhancement
CN104540951B (zh) * 2012-06-07 2017-07-04 美国陶氏益农公司 使用芸苔属双向组成型启动子表达转基因的构建体和方法
CN102911950A (zh) * 2012-10-23 2013-02-06 中国农业大学 一种高粱抗草甘膦5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)及其应用
EP3611268A1 (en) 2013-08-22 2020-02-19 E. I. du Pont de Nemours and Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
BR112016008489A2 (pt) * 2013-10-18 2017-10-03 Pioneer Hi Bred Int Sequências de glifosato-n-acetiltransferase (glyat) e métodos de uso
US10676754B2 (en) * 2014-07-11 2020-06-09 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
CN104232600B (zh) * 2014-07-31 2019-08-06 上海市农业科学院 草甘膦抗性提高的葡萄epsps突变体的制备及其应用
CN108473996A (zh) * 2015-07-02 2018-08-31 阿凯笛亚生物科学公司 由于5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3磷酸合酶改变而对草甘膦具有抗性的小麦
CN108291236B (zh) * 2015-09-30 2022-07-26 先锋国际良种公司 植物epsp合酶和使用方法
US20200392528A1 (en) * 2017-03-30 2020-12-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Improved plant epsp synthases and methods of use
KR20210104068A (ko) * 2018-12-14 2021-08-24 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 게놈 편집을 위한 신규한 crispr-cas 시스템

Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7615685B2 (en) * 1990-01-22 2009-11-10 Dekalb Genetics Corporation Methods of producing human or animal food from stably transformed, fertile maize plants
WO1997004103A2 (fr) * 1995-07-19 1997-02-06 Rhone-Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
EP1217073A2 (fr) * 1995-07-19 2002-06-26 Aventis Cropscience S.A. Plantes transformées à tolérance accrue aux herbicides de la famille des phosphométhylglycines contenant un gène codant pour une 5-énol pyruvylshikimate-3- phosphate synthase mutée
WO2001024615A1 (en) * 1999-10-07 2001-04-12 Valigen (Us), Inc. Non-transgenic herbicide resistant plants
CN101285057A (zh) * 2007-04-11 2008-10-15 中国农业科学院生物技术研究所 高抗草甘膦的epsp合酶及其编码序列
CN101429499A (zh) * 2007-11-09 2009-05-13 中国农业科学院生物技术研究所 高耐受草甘膦的epsp合酶及其编码序列
CN101932701A (zh) * 2008-02-01 2010-12-29 阿森尼克斯公司 Grg31和grg36 epsp合酶的定向进化
WO2011034936A1 (en) * 2009-09-15 2011-03-24 Sapphire Energy, Inc. Herbicide resistant organisms
CN102108360A (zh) * 2009-12-24 2011-06-29 上海市农业科学院 一种来源于荧光假单胞菌的epsp合酶基因及其应用
CN103827305A (zh) * 2011-07-28 2014-05-28 吉奈克蒂夫公司 草甘膦耐受性玉米事件vco-φ1981-5及用于其检测的试剂盒和方法
CN102533844A (zh) * 2011-12-21 2012-07-04 中国农业科学院生物技术研究所 含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体及其应用
CN102559745A (zh) * 2012-01-30 2012-07-11 中国农业科学院生物技术研究所 Epsp合酶基因水稻叶绿体表达载体及其应用
CN104202969A (zh) * 2012-02-01 2014-12-10 陶氏益农公司 新的草甘膦抗性基因类别
CN102776161A (zh) * 2012-08-14 2012-11-14 浙江新安化工集团股份有限公司 分离自土壤的高抗草甘膦epsp合酶及其编码序列的制备和用途
CN102876690A (zh) * 2012-10-09 2013-01-16 上海市农业科学院 来源于肺炎克雷伯氏杆菌342的epsp合酶基因及其应用
CN103205404A (zh) * 2013-03-26 2013-07-17 上海市农业科学院 来源于苹果的epsp合酶多位点突变体及其编码基因与应用
UA84562U (uk) * 2013-04-18 2013-10-25 Институт Кормов И Сельского Хозяйства Подолья Наан Спосіб запобігання появи резистентних біотипів бур'янів у посівах кукурудзи
WO2014187728A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Syngenta Participations Ag Seed soaking apparatus and method
CN104878097A (zh) * 2015-04-30 2015-09-02 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测玉米植物dbn9981的核酸序列及其检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, partial [Zea mays]";Lebrun,M.等;《Genbank Dtabase》;20050318;Accession No:CAA44974.1 *
"Glyphosate tolerance in maize (Zea mays L .). 1 . Differential response among inbred lines";Giuseppe Forlani等;《Euphytica》;19951231(第82期);第157-164页 *
"PREDICTED: 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase 2 [Zea mays]";NDBI;《Genbank Database》;20140802;Accession No:XP_008659331.1 *
"水稻E P S P 合酶基因的克隆、结构分析和定位";徐军望等;《中国科学（C辑）》;20020420;第32卷(第2期);第97-104页 *
"草甘膦和抗草甘膦转基因作物";高德霖等;《精细化工原料及中间体》;20030605(第6期);第5-10页 *
"薤白EPSP 合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性";黄丽华等;《作物学报》;20090512;第35卷(第5期);第855-860页 *

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