CN117795063A - Epsps突变体及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了植物EPSP合酶(EPSPS)突变体及其在植物中的应用。与具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的野生型EPSPS相比，EPSPS突变体在403位置处包含V至A突变。
Description
技术领域
本发明的领域涉及分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及赋予草甘膦耐受性的氨基酸突变及其在草甘膦耐受性植物中的应用。
背景技术
由EPSPS基因编码的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是莽草酸途径中的第六种酶。这种酶催化磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)和3-磷酸莽草酸酯(S3P)转化为磷酸和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3磷酸酯(EPSP)。莽草酸途径广泛存在于植物、细菌和真菌中，但在动物中没有这种途径。草甘膦是世界上最畅销的化学除草剂之一。它的结构是PEP的结构类似物。通过竞争性抑制EPSPS和PEP的结合，导致阻碍下游芳香族氨基酸的合成，以及下游生物合成和代谢的失衡，从而有效杀死杂草。草甘膦除草剂几乎对所有植物都是致命的。除了植物中的EPSPS，一些细菌中也存在对草甘膦敏感的EPSPS。这些对草甘膦敏感的EPSPS被归类为I类，一些微生物中的EPSPS的蛋白质结构与植物中的EPSPS的蛋白质结构相似，但与I类EPSPS序列的氨基酸序列相似性小于50％，如CP4EPSPS、G2-aroA等，这种对草甘膦不敏感的EPSPS酶，被归类为II类。
草甘膦因其广谱、高效、低毒、低成本而成为最受欢迎的化学除草剂之一。在农田中使用它可以大大节省除草成本，增加农民收入。对草甘膦的抗性是生物技术创造的植物品种中最受欢迎的性状之一。到目前为止，在大约221个被批准的转基因事件中，大约有7个基因。只有两个基因(mEPSPS和2mEPSPS)来自植物，其他五个基因来自微生物。随着公众关注将外源基因引入转基因作物的安全性，化学诱变和基因编辑的产物在世界范围内越来越被接受。此外，基因编辑技术因其高效性、位点特异性而成为研发抗草甘膦作物的新方向。只要对植物的基因进行较少的突变，就有可能获得具有理想性状和高商业价值的目标植物。
本发明人发现植物原始EPSPS酶的某些氨基酸突变可以使植物对草甘膦具有抗性，而不影响原始酶的功能。本发明人还开发了这些蛋白质突变体及其编码基因在转基因植物、基因编辑植物或其他植物育种中的应用，可用于培育具有草甘膦抗性的植物，特别是农作物，如农业植物。
发明内容
本公开涉及突变的EPSPS的氨基酸的突变位置和突变类型。还提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。
在一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变G172A和V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变P177S和V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、P177S和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变T173I、P177S和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变T173I、P177T和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
还在另一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变V->A，其中，该位置对应于与SEQ IDNO:1的位置403对齐的原始EPSPS氨基酸序列的位置。
还在另一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变G->A和V->A，其中，该位置对应于与SEQ ID NO:1的位置172和403对齐的原始EPSPS氨基酸序列的位置。
还在另一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变P->S和V->A，其中，该位置对应于与SEQ ID NO:1的位置177和403对齐的原始EPSPS氨基酸序列的位置。
还在另一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变G->A、P->S和/或V->A，其中，该位置对应于与SEQ ID NO:1的位置172、177和/或403对齐的原始EPSPS氨基酸序列的位置。
还在另一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变T->I、P->S和/或V->A，其中，该位置对应于与SEQ ID NO:1的位置173、177和/或403对齐的原始EPSPS氨基酸序列的位置。
还在另一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变T->I、P->T和/或V->A，其中，该位置对应于与SEQ ID NO:1的位置173、177和/或403对齐的原始EPSPS氨基酸序列的位置。
还在另一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、P177S和/或V403A以及至少一个或多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置。
还在另一个方面，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、P177S和/或V403A以及至少一个或多个选自以下的类似氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQID NO:1中所示的类似氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变A70V、G172A、P177S、V403A和/或R514S，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变A73T、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、P177S、V403A和/或F502V，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、P177S、Y252F和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、P177S、N246D和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，突变的EPSPS多肽包含突变V113M、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本公开还提供了重组DNA构建体，其包含用于编码本公开所述多肽的多核苷酸；还提供了包含本公开所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组DNA构建体的植物细胞。在一些实施例中，植物细胞是水稻细胞。在一些实施方案中，植物是水稻。
在一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，该构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，该构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含G172A和V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，该构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含P177S和V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，所述方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S和/或V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含所述重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，所述方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含T173I、P177S和/或V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含所述重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，所述方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含T173I、P177T和/或V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含所述重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，所述方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该多肽包含G172A、P177S和/或V403A以及至少一个或多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含类似于V403A的氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含类似于G172A的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法。该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含类似于T173I的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码包含类似于T173I的氨基酸突变、类似于P177T的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，该方法包括在可再生植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该多肽包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变以及至少一个或多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A70V、G172A、P177S、V403和/或R514S，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A73T、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、V403A和/或F502V，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、N247D和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在其它实施方案中，该方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含V113M、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，以及产生在其基因组中包含该重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A和V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含P177S和V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、P177S和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含T173I、P177S和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含T173I、P177T和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
还在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个选自以下的氨基酸：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出耐草甘膦的植物。
在一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于G172A的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于P177S的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于T173I的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于T173I的氨基酸突变、类似于P177T的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
还在另一个方面，本文提供了产生草甘膦耐受性植物的方法，其中，内源植物EPSPS基因(在植物细胞中)被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变以及至少一个选自以下的类似氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置；并且从该植物细胞中生长出草甘膦耐受植物。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A70V、G172A、P177S、V403和/或R514S，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73T、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、V403A和/或F502V，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、N247D和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其它实施方案中，经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含V113M、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
内源植物EPSPS基因可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行修饰，包括但不限于：CRISPR/Cas指导RNA介导的系统、锌指核酸酶介导的系统、巨核酸酶介导的系统和/或寡核苷酸碱基介导的系统。
本文提供了在植物细胞中提供引导RNA的多核苷酸构建体，其中，所述引导RNA靶向植物细胞的内源EPSPS基因，并且多核苷酸构建体还包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A和V403A，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含P177S和V403A，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S和/或V403A，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含T173I、P177S和/或V403A，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含T173I、P177T和/或V403A，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个或多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含类似于G172A的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含类似于P177S的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含类似于T173I的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含类似于T173I的氨基酸突变、类似于P177T的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含A70V、G172A、P177S、V403A和/或R514S，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含A73T、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、V403A和/或F502V，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、N247D和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含一个或多个多核苷酸修饰模板，以产生编码植物EPSPS多肽的修饰的内源EPSPS基因，所述植物EPSPS多肽包含V113M、G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸突变位置。
本文还提供了草甘膦耐受植物，其表达具有V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受植物，其表达具有G172A和V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受植物，其表达具有P177S和V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受植物，其表达具有G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受植物，其表达具有T173I、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受植物，其表达具有T173I、P177T和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本文还提供了表达内源性EPSPS多肽的草甘膦耐受植物，该内源性EPSPS多肽具有G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个或多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:3所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有G172A和V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:4所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有P177S和V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:5所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:6所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有T173I、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:37所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有T173I、P177T和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:38所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了表达内源性EPSPS多肽的草甘膦耐受性水稻植物，该内源性EPSPS多肽具有G172A、P177S和/或V403A以及至少一个或多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有A70V、G172A、P177S、V403和/或R514S的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:10中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有A73T、G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:11中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:12中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:13中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有G172A、P177S、V403A和/或F502V的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:14中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有G172A、P177S、Y252F和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:15中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:16中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:17中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:18中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:19中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:20中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有G172A、P177S、N247D和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:21中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:22中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:23中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:24中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性水稻植物，其表达具有V113M、G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性水稻植物可以表达具有SEQ ID NO:25中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性亚麻植物，其表达具有V403A的内源性EPSPS多肽，其中，所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性亚麻植物可以表达具有SEQ ID NO:27中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性亚麻植物，其表达具有T173I和P177T的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性亚麻植物可以表达具有SEQ ID NO:28中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性亚麻植物，其表达具有T173I、P177T和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性亚麻植物可以表达具有SEQ ID NO:29中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性亚麻植物，其表达具有G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性亚麻植物可以表达具有SEQ ID NO:30中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性亚麻植物，其表达内源性EPSPS多肽，该内源性EPSPS多肽具有G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个或多个选自以下的类似氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受性小麦植物，其表达具有V403A的内源性EPSPS多肽，其中，所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性小麦植物可以表达具有SEQ ID NO:32中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性小麦植物，其表达内源性EPSPS多肽，该内源性EPSPS多肽具有G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个或多个选自以下的类似氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。
本文还提供了草甘膦耐受性大豆植物，其表达具有V403A的内源性EPSPS多肽，其中，所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。草甘膦耐受性大豆植物可以表达具有SEQ ID NO:34中所示序列的植物EPSPS多肽。
本文还提供了草甘膦耐受性大豆植物，其表达内源性EPSPS多肽，该内源性EPSPS多肽具有G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个或多个选自以下的类似氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。还提供了一种生产草甘膦耐受植物的方法。该方法包括将具有突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞中，该突变EPSPS基因表达在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置V403处或EPSPS同源物中的类似氨基酸残基处突变的EPSPS蛋白，其中V403变为A；选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；以及从所述选择的植物细胞再生具有突变EPSPS基因的抗除草剂或耐受性植物。
还提供了一种生产耐草甘膦植物的方法。该方法包括将具有突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞中，该突变EPSPS基因表达在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置G172和V403处或在EPSPS同源物中的类似氨基酸残基处突变的EPSPS蛋白，其中G172变为A，V403变为A；选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；以及从所述选择的植物细胞再生具有突变EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
还提供了一种生产耐草甘膦植物的方法。该方法包括将具有突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞中，该突变EPSPS基因表达在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置P177和V403处或在EPSPS同源物中的类似氨基酸残基处突变的EPSPS蛋白，其中P177变为S，V403变为A；选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；以及从所述选择的植物细胞再生具有突变EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
还提供了一种生产耐草甘膦植物的方法。该方法包括将具有突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞中，该突变EPSPS基因表达在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置G172、P177和/或V403处或在EPSPS同源物中的类似氨基酸残基处突变的EPSPS蛋白，其中G172变为A，P177变为S和/或V403变为A；选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；以及从所述选择的植物细胞再生具有突变EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
还提供了一种生产耐草甘膦植物的方法。该方法包括将具有突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞中，该突变EPSPS基因表达在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置T173、P177和/或V403处或在EPSPS同源物中的类似氨基酸残基处突变的EPSPS蛋白，其中T173变为I，P177变为S和/或V403变为A；选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；以及从所述选择的植物细胞再生具有突变EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
还提供了一种生产耐草甘膦植物的方法。该方法包括将具有突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞中，该突变EPSPS基因表达在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置T173、P177和/或V403处或在EPSPS同源物中的类似氨基酸残基处突变的EPSPS蛋白，其中T173变为I，P177变为T和/或V403变为A；选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；以及从所述选择的植物细胞再生具有突变EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
附图说明
图1显示了SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:33之间的多重比对。
图2显示了表达具有G172A、P177S和/或V403A突变体及其组合突变体的水稻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长。
图3显示了表达具有T173I、P177S/T和/或V403A突变体及其组合突变体的水稻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长。
图4显示了表达具有V403A突变体的亚麻或小麦或大豆EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长状态。
图5显示了表达具有G172A、P177S和V403A突变体的亚麻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞和表达CP4 EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长状态比较。
图6显示了表达具有G172A、T173I、P177T/S和/或V403A突变体的亚麻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长状态。
图7显示了在125ml草甘膦除草剂浓度下，表达水稻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞与多个突变体的草甘膦抗性比较。
图8显示了构建体pKED2载体。
图9显示了包含本发明一个实施方案的pk510载体。
图10显示了野生型水稻植物和转基因水稻植物之间的比较以及它们抗草甘膦的能力。
具体实施方式
因此，术语“EPSPS同源物”或任何变体是指在另一种植物物种中发现的EPSPS基因或EPSPS基因产物，其执行与本文公开的EPSPS基因相同或基本相同的生物学功能，并且其中如下所述的核酸序列或多肽序列(EPSPS基因产物)被称为“相同”或至少50％相似(也称为“百分比同一性”或“基本相同”)。如果两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸残基序列在如下所述进行最大对应比对时分别相同，则这两个多核苷酸或多肽是相同的。在上下文中的两个或多个核酸或多肽序列中，术语“相同”或“百分比同一性”是指两个或多个序列或子序列，当使用下列比对算法之一或通过人工比对和目测，在比较窗内进行最大对应性的比较和比对时，相同或具有相同的特定百分比的氨基酸残基或核苷酸。对于保守取代序列不同的多肽，序列百分比同一性可以向上调节，以校正取代的保守性质。用于进行这种调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守取代作为部分错配而非完全错配来评分，从而增加序列同一性的百分比。因此，例如，当相同的氨基酸得分为1、非保守取代得分为0时，保守取代得分在0和1之间。保守取代的评分根据例如Meyers&Miller，ComputerApplic的算法Bio l.Sci.4:11-17(1988)e.g.,例如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.,USA)中实施的。
在上下文中两个核酸或多肽的，短语“基本上相同”和“百分比同一性”是指当使用以下序列比较算法之一或通过人工比对和目测进行比对，在比较窗内进行最大对应性比对时，具有至少50％、有利地60％、优选地70％、更优选地80％以及最优选地90-95％的核苷酸或氨基酸残基同一性的序列或子序列。该定义也指测试序列的互补序列，当测试序列与参考序列具有实质同一性时，其具有实质性序列或子序列互补性。
“可操作地连接”是指遗传元件的并置，其中，元件处于允许它们以预期方式操作的关系中。例如，如果5’调控序列的功能是启动编码序列的转录，则5’调控序列可操作地连接到编码序列。
如本文所用，“草甘膦抗性”细胞或植物是指在特定浓度的草甘膦存在下能够存活或继续生长的细胞或植物，所述特定浓度的草甘膦通常杀死或抑制其它细胞或植物的生长。例如，生长包括光合作用、生根增加、高度增加、质量增加或新叶的发育。在一个实施方案中，草甘膦抗性细胞可以在含有50mg/L或更多草甘膦的培养基上生长和分裂。优选地，草甘膦抗性细胞可以在含有100mg/L或更多例如200mg/L、300mg/L或400mg/L的草甘膦的培养基上生长和分裂。更优选地，草甘膦抗性细胞可以在含有500mg/L或更多例如600mg/L的草甘膦的培养基上生长和分裂。为了本发明的目的，术语“草甘膦”包括任何除草有效形式的N-膦酰基甲基甘氨酸(包括其任何盐)和导致在植物中产生草甘膦阴离子的其它形式。
序列表说明
SEQ ID NO:1是野生型水稻EPSPS蛋白的全长氨基酸序列(GenBank登录号XP_015643046.1)，其中，其N-末端包含叶绿体转运肽。SEQ ID NO:1在本文中用作参考EPSPS序列，并且所有突变位置根据SEQ ID NO:1标记。
SEQ ID NO:2是野生型水稻EPSPS蛋白的氨基酸序列。与SEQ ID NO:1相比，从SEQID NO:2中去除了叶绿体转运肽。
SEQ ID NO:3是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含V403A突变。
SEQ ID NO:4是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A和V403A突变。
SEQ ID NO:5是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含P177S和V403A突变。
SEQ ID NO:6是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S或V403A突变。
SEQ ID NO:7是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A突变。
SEQ ID NO:8是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含P177S突变。
SEQ ID NO:9是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A和P177S突变。
SEQ ID NO:10是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A70V、G172A、P177S、V403A和R514S突变。
SEQ ID NO:11是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73T、G172A、P177S和V403A突变。
SEQ ID NO:12是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73T、E86G、G172A、P177S和V403A突变。
SEQ ID NO:13是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和D472E突变。
SEQ ID NO:14是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、V403A和F502V突变。
SEQ ID NO:15是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、Y252F和V403A突变。
SEQ ID NO:16是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含E137D、G172A、P177S、L253M和V403A突变。
SEQ ID NO:17是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、K399N、V403A和T466S突变。
SEQ ID NO:18是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和V403A突变。
SEQ ID NO:19是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和V403A突变。
SEQ ID NO:20是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和V403A突变。
SEQ ID NO:21是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、N246D和V403A突变。
SEQ ID NO:22是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和F512I突变。
SEQ ID NO:23是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73S、G172A、P177S、L214F和V403A突变。
SEQ ID NO:24是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和R514K突变。
SEQ ID NO:25是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含V113M、G172A、P177S和V403A突变。
SEQ ID NO:26为野生型亚麻EPSPS2的氨基酸序列，翻译自Lus10000788(Sauer NJ,Narváez-Vásquez,Javier,Mozoruk J,et al.Oligonucleotide-Mediated GenomeEditing Provides Precision and Function to Engineered Nucleases andAntibiotics in Plants[J].Plant Physiology,2016:1917-1928.)，其中，其叶绿体转运肽从SEQ ID NO:26中去除。
SEQ ID NO:27是来自亚麻EPSPS序列的突变体，其包含V403A突变。
SEQ ID NO:28是来自亚麻EPSPS序列的突变体，其包含T173I和P177T突变。
SEQ ID NO:29是来自亚麻EPSPS序列的突变体，其包含T173I、P177T和V403A突变。
SEQ ID NO:30是来自亚麻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S和V403A突变。
SEQ ID NO:31野生型小麦EPSPS蛋白的氨基酸序列，其是以GenBank条目ALK27163.1呈现，其中，其叶绿体转运肽从SEQ ID NO:31中去除。
SEQ ID NO:32是来自小麦EPSPS序列的突变体，其包含V403A突变。
SEQ ID NO:33野生型大豆EPSPS蛋白的氨基酸序列，其是以GenBank条目XP_003521857.1呈现，其中，其叶绿体转运肽从SEQ ID NO:33中去除。
SEQ ID NO:34是来自大豆EPSPS序列的突变体，其包含V403A突变。
SEQ ID NO:35是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含T173I和P177S突变。
SEQ ID NO:36是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含T173I和P177T突变。
SEQ ID NO:37是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含T173I、P177S和V403A突变。
SEQ ID NO:38是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含T173I、P177T和V403A突变。
SEQ ID NO:39是来自CP4(根癌农杆菌)的野生型EPSPS的氨基酸序列。
1、组成
A、EPSPS多肽
提供了使用具有EPSPS活性的突变多肽的各种方法和组合物。这种EPSPS多肽包含V403A突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。这种EPSPS多肽包含G172A和V403A突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。这种EPSPS多肽包含P177S和V403A突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一些实施方案中，EPSPS多肽包含G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一些实施方案中，EPSPS多肽包含T173I、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在一些实施方案中，EPSPS多肽包含T173I、P177T和/或V403A，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其他实施方案中，EPSPS多肽包含G172A、P177S、V403A以及至少一个或多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
在其他实施方案中，植物EPSPS多肽包含A70V、G172A、P177S、V403和/或R514S突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含A73T、G172A、P177S和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、V403A和/或F502V突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、N246D和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K突变。在其它实施方案中，植物EPSPS多肽包含V113M、G172A、P177S和/或V403A突变。
与野生型EPSPS多肽相比，本文公开的EPSPS多肽突变体在草甘膦存在下可能具有改进的催化能力。
如本文所公开的，包含V403A的EPSPS突变体可以提高植物对草甘膦的抗性，同时仍然保持其自身的生物酶催化活性。然而，这种氨基酸V403在EPSPS中的位置可能在其他不同的植物物种中有所不同。类似位置上的类似突变V->A也可以提高其他植物对草甘膦的抗性。突变位置可以分两步确定。第一步是将野生型植物EPSPS与水稻EPSPS序列(SEQ ID NO:1)进行比对。第二步是找到与水稻EPSPS序列上的位置403相对应的位置。
先前的研究还揭示了G172和P177也是大多数EPSPS序列上的两个保守位置。然而，该氨基酸G172或P177在EPSPS序列中的位置可能因一些其它物种而变化。类似位置上的类似突变G->A、P->S和/或V->A也可以改善一些其他植物对草甘膦的抗性。突变位置可以分两步确定。第一步是将野生型植物EPSPS与水稻EPSPS序列进行比对。第二步是找到与水稻EPSPS序列上的位置172、177和/或403相对应的位置。
先前的研究还揭示了T173和P177也是大多数EPSPS序列上的两个保守位置。然而，该氨基酸T173或P177在EPSPS序列中的位置可能因一些其他物种而变化。在类似位置上的类似突变T->I，P->S/T和/或V->A也可以改善一些其他植物对草甘膦的抗性。突变位置可以分两步确定。第一步是将野生型植物EPSPS与水稻EPSPS序列进行比对。第二步是找到与水稻EPSPS序列上的位置173、177和/或403相对应的位置。
提供了使用具有EPSPS活性的突变多肽的各种方法和组合物。这种EPSPS多肽包含类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。这种EPSPS多肽包含类似于G172A的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。这种EPSPS多肽包含类似于P177S的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ IDNO:1中列所示的类似氨基酸位置。
在一些实施方案中，EPSPS多肽包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。
在一些实施方案中，EPSPS多肽包含类似于T173I的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。
在一些实施方案中，EPSPS多肽包含类似于T173I的氨基酸突变、类似于P177T的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。
在其它实施方案中，EPSPS多肽包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变、类似于V403A的氨基酸突变以及至少一个或多个选自以下的类似氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。
B、植物和其他感兴趣的宿主细胞
进一步地，提供了用一种或多种EPSPS序列或其活性变体或片段转导(转化或转染)的工程化宿主细胞。EPSPS多肽可在任何生物体中表达，包括非动物细胞，如植物、酵母、真菌、细菌等。
还提供了具有本文公开的EPSPS序列的植物、植物细胞、植物部分和种子以及谷物。在具体的实施方案中，植物和/或植物部分已经稳定地结合了至少一种本文公开的异源EPSPS多肽或其活性变体或片段。此外，感兴趣的植物或生物可以包含多个EPSPS多核苷酸。
在具体实施方案中，植物或植物部分中的异源植物EPSPS多核苷酸可操作地连接到异源调控元件，例如但不限于组成型、组织优选型或用于在植物中表达的其他启动子或组成型增强子。
如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、可再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和在植物或植物部分中完整的植物细胞，如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、果柄、壳、茎、根、根尖、花药等。谷物是指商业种植者出于种植或繁殖物种以外的目的而生产的成熟种子。再生植物的子代、变体和突变体也包括在本公开的范围内，只要这些部分包含引入的多核苷酸。
本文公开的EPSPS序列及其活性变体和片段可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。相关植物物种的例子包括，但不限于，玉米(Zea mays)、芸苔属植物(e.g.,B.napus,B.rapa,B.juncea)、特别是那些用作种子油来源的芸苔属物种、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa)、紫苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、甜高粱(Sorghum dochna)、小米(如珍珠米(Pennisetum glaucum))、黍(Panicum miliaceum)、粟(Setaria italica)、手指小米(Eleusine coracana)、大麻(Cannabis sativa L.)、草地早熟禾(Poapratensis)、高羊茅(Festuca arundinacea)、匍匐翦股颖(Agrostisstolonifera)、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、亚麻(Linum usitatissimum)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、西红柿(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、苹果树(Maluspumila)、葡萄藤(Vitis viniferaL.)、黄瓜(C.sativus)、橄榄(Oleaeuropaea)、番木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、蔬菜、观赏植物、针叶树、草坪草(包括凉季草和暖季草)。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(e.g.,Lactuca sativa)、绿豆(Phaseolus vulgaris)、菜豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(Lathyrus spp.)、马铃薯(Solanum tuberosum)、胡萝卜(Daucus carota subsp.Sativus)、洋葱(Allium cepa))和甜瓜属成员如香瓜(C.sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、绣球花(Macrophyllahydrangea)、木槿属(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbiapulcherrima)和菊花。
其他相关的植物包括禾本科物种，如牛筋草、粗山羊草Aegliopstauschilsubse.Tausch、粟Setatia Italica、高粱、小麦、多花黑麦草、疣粒野生稻变种、双穗短柄草、雀麦、硬黑麦草、糜子、寡毛叉蕨、大麦、黍等。其他相关植物包括菊科物种，如加拿大飞蓬、青蒿、瓜叶菊等。其他相关植物包括槟榔科物种，如油棕、海枣等。其他相关植物包括兰科植物，如亚洲兰科植物、深圳链状石斛、蝴蝶兰等。其它相关植物包括蔷薇科植物，如草莓、中国蔷薇。
其他相关植物包括提供相关种子的谷类植物、含油种子植物和豆科植物。相关种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。含油种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆，豆类包括瓜尔豆、刺槐豆、葫芦巴、大豆、菜豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆等。
其他目标宿主细胞可以是真核细胞、原生质体、组织培养细胞、原核细胞和/或细菌细胞，例如大肠杆菌等。
例如，在一些实施方案中，提供了草甘膦耐受性水稻植物，其中，草甘膦耐受性水稻植物表达包含V403A的内源EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含G172A、P177S和/或V403A的内源EPSPS多肽，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含T173I、P177S和/或V403A的内源EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含T173I、P177T和/或V403A的内源EPSPS多肽，其中，每个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达内源EPSPS多肽，其包含G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含A70V、G172A、P177S、V403和/或R514S突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含A73T、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含G172A、P177S、V403A和/或F502V突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含G172A、P177S、N246D和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性水稻植物可以表达包含V113M、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。
例如，在一些实施方案中，提供了草甘膦耐受性亚麻植物，其中，草甘膦耐受性亚麻植物表达包含V403A的内源EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达内源性EPSPS多肽，其包含G172A、P177S和/或V403A以及至少一个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含A70V、G172A、P177S、V403和/或R514S突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含A73T、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含G172A、P177S、V403A和/或F502V突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含G172A、P177S、N246D和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性亚麻植物可以表达包含V113M、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。
例如，在一些实施方案中，提供了草甘膦耐受性小麦植物，其中，草甘膦耐受性小麦植物表达包含V403A的内源EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达内源性EPSPS多肽，其包含G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含A70V、G172A、P177S、V403A和/或R514S突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含A73T、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含G172A、P177S、V403A和/或F502V突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含G172A、P177S、N246D和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性小麦植物可以表达包含V113M、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。
例如，在一些实施方案中，提供了草甘膦耐受性大豆植物，其中，草甘膦耐受性大豆植物表达包含V403A的内源EPSPS多肽，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含G172A、P177S和/或V403A的内源性EPSPS多肽，其中，所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达内源性EPSPS多肽，其包含G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含A70V、G172A、P177S、V403A和/或R514S突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含A73T、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含G172A、P177S、V403A和/或F502V突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含G172A、P177S、N246D和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K突变的内源EPSPS多肽。此外，草甘膦耐受性大豆植物可以表达包含V113M、G172A、P177S和/或V403A突变的内源EPSPS多肽。
C、堆叠其他目标特征
在一个实施方案中，本发明涉及具有多核苷酸构建体的转基因植物，所述多核苷酸构建体具有与如上所述的突变EPSPS可操作连接的启动子。此外，可以将其它除草剂耐受蛋白插入转基因植物中，以产生多种除草剂抗性植物。
如本文所用，术语“堆叠的”包括在相同植物或生物体中存在多种性状。本文所用的性状是指来源于特定序列或序列组的表型。在一个实施方案中，分子堆叠包含至少一种额外的多核苷酸，该多核苷酸也赋予通过相同和/或不同的机制赋予草甘膦耐受性的至少一个序列的耐受性，和/或至少一种额外的多核苷酸，该多核苷酸赋予第二除草剂的耐受性。
本文公开的EPSPS序列产生的草甘膦耐受性机制可以与其它除草剂抗性模式相组合，以提供耐受草甘膦和一种或多种其它除草剂的宿主细胞、植物、植物外植体和植物细胞。例如，EPSPS赋予草甘膦耐受性的机制可以与本领域已知的其他草甘膦耐受性的模式相组合。在其它实施方案中，具有EPSPS序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分可以与例如一个或多个赋予以下耐受性的序列堆叠：ALS抑制剂、HPPD抑制剂、2，4-D、其他苯氧基生长素除草剂、芳氧基苯氧丙酸酯草本植物、麦草畏；草膦类除草剂；针对质子酶的除草剂。
具有其EPSPS序列的植物或植物细胞或植物部分也可以与至少一种其它性状组合，以产生进一步包含多种所需性状组合的植物。例如，具有EPSPS序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分可以与编码具有杀虫和/或杀虫活性的多肽的多核苷酸堆叠，或者具有其EPSPS序列的植物或植物细胞或植物部分可以与植物抗病基因组合。
这些堆叠的组合可以通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规方法或遗传转化培育植物。
2、使用方法
A、产生草甘膦耐受性植物的方法
术语“草甘膦耐受性”和“草甘膦抗性”在本文中可以互换使用。
Ⅰ、介绍
可以使用各种方法将目标序列引入宿主细胞、植物或植物部分。本公开的方法不依赖于将序列引入生物体或植物或植物部分的特定方法，仅依赖于多核苷酸或多肽进入生物体或植物的至少一个细胞内部。将多核苷酸或多肽引入包括植物在内的各种生物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
在具体实施方案中，可以使用多种瞬时转化法向植物提供其EPSPS序列。这种瞬时转化法包括但不限于将EPSPS蛋白或其活性变体和片段直接导入植物中。这些方法包括，例如，显微注射或粒子轰击。
在其它实施方案中，本文公开的EPSPS多核苷酸或其活性变体可通过将植物与病毒或病毒核酸接触而导入植物中。通常，这些方法包括将本发明的核苷酸构建体整合到DNA或RNA分子中。
本领域已知将多核苷酸靶向插入植物基因组特定位置的方法。在一个实施方案中，使用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需基因组位置的插入。
已经转化的细胞可以按照常规方法生长成植物。然后，这些植物可以生长，或者用相同的转化菌株或者不同的菌株授粉，并且鉴定所得到的子代是否具有所需表型特征的组成型表达。可以生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达得到稳定地维持和遗传，然后收获种子以确保实现所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了转化的种子(也称为转基因种子)，其基因组稳定地结合了本文公开的多核苷酸，例如，作为表达盒的一部分。
通过植物转化技术(包括上文讨论的那些技术)衍生的转化植物细胞可以被培养以再生出完整的植物，其具有草甘膦或草甘膦类似物的转化基因型。
本领域技术人员将认识到，在将含有EPSPS基因的表达盒整合到转基因植物中并被确认其可操作之后，可以通过有性杂交将其引入到其它植物中。根据要杂交的物种，可以使用许多标准育种技术中的任何一种。
在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含V403A的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，并且产生在其基因组中包含所述重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S和/或V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，并且产生在其基因组中包含所述重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含T173I、P177S和/或V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，并产生在其基因组中包含重组DNA构建体的草甘膦耐受植物。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含T173I、P177T和/或V403A的植物EPSPS多肽，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，并产生在其基因组中包含重组DNA构建体的草甘膦耐受植物。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码植物EPSPS多肽，所述多肽包含G172A、P177S和/或V403A，以及至少一个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置，并产生在其基因组中包含重组DNA构建体的草甘膦耐受性植物。
在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A70V、G172A、P177S、V403和/或R514S突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73T、G172A、P177S和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、V403A和/或F502V突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、N246D和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K突变的植物EPSPS多肽。在一些实施方案中，所述方法包括通过在可再生植物细胞中表达的方式引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含V113M、G172A、P177S和/或V403A突变的植物EPSPS多肽。
Ⅱ、修饰
通常，修饰或改变宿主基因组DNA的方法是本领域技术人员已知和可获得的。例如，宿主植物中预先存在的或内源性EPSPS序列可以使用一个或多个位点特异性工程系统以位点特异性的方式进行修饰或改变。这包括改变宿主DNA序列或预先存在的转基因序列，包括调控元件、编码序列和非编码序列。这些方法还可用于将核酸靶向基因组中预先设计的靶识别序列。例如，本文所述的遗传修饰的细胞或植物是使用“定制的”或工程化的核酸内切酶产生的，如修饰植物基因组而产生的大核酸酶。另一个定点工程是通过使用锌指结构域识别结合限制酶的限制特性。转录激活因子样(TAL)效应DNA修饰酶(TALE或TALEN)也用于工程改造植物基因组。
植物基因组的位点特异性修饰也可以使用CRISPR系统(成簇的规则间隔的短回文重复序列)进行。例如，研究人员可以使用CRISPR系统在植物基因组的特定位点产生DNA双链断裂(DSB)，并使用易于出错的非同源末端连接(NHEJ)机制来产生所公开的突变。特定的突变也可以在外源DNA供体(供体)的指导下通过精确的碱基置换获得。这种碱基编辑工具包括但不限于胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和/或腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。或者也可以使用引物编辑系统，pegRNA中的PBS(引物结合位点)序列通过使用包含靶编辑序列的逆转录模板(RT模板)将突变导入基因组以产生这些突变。
植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含V403A，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含T173I、P177S和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含T173I、P177T和/或V403A，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G192A、P177S和/或V403A，以及至少一个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中列出的类似氨基酸位置。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，以及至少一个选自以下的类似氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置。
植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含A70V、G172A、P177S、V403和/或R514S突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含A73T、G172A、P177S和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、P177S、V403A和/或F502V突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含A73G、L134F、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、P177S、N246D和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K突变。植物细胞中的内源性植物EPSPS基因可以被修饰以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该蛋白包含V113M、G172A、P177S和/或V403A突变。
内源性植物EPSPS基因可以通过CRISPR/Cas指导RNA介导的系统、锌指核酸酶介导的系统、巨核酸酶介导的系统、寡核苷酸碱基介导的系统、TALEN或本领域普通技术人员已知的任何基因修饰系统进行修饰。此外，为了本文的目的，内源性植物EPSPS基因包括编码DNA以及编码DNA内和周围的基因组DNA，例如启动子、内含子和终止子序列。
实施例
在下面的实施例中，应该理解的是，这些实施例虽然说明了本发明的实施方案，但仅仅是为了举例说明。从以上讨论和这些例子中，本领域技术人员可以对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。这种修改也旨在落入所附实施例的范围内。
实施例1：水稻EPSPS和其他植物EPSPS序列的比对
使用水稻(Oryza sativa)全长EPSPS(SEQ ID NO:1)作为参照，我们比对了水稻EPSPS(SEQ ID NO:2)、亚麻EPSPS(SEQ ID NO:26)、小麦EPSPS(SEQ ID NO:31)和大豆EPSPS(SEQ ID NO:33)。比对结果如图1所示。它显示了所描述的突变位置和在每个植物物种中的相应位置。根据SEQ ID NO:1标记所有公开的突变位置。
实施例2：对每个水稻EPSPS突变体在突变位置403上的草甘膦抗性测试
本发明人发现水稻EPSPS序列上的V403在草甘膦的敏感性中起作用。本发明人在天然水稻EPSPS序列的403位进行了饱和诱变，以发现该位点的突变是否能降低水稻EPSPS对草甘膦的敏感性。使用NNK(其中N代表腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶，K代表胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷酸)引物作为待突变位置的简并密码子，将水稻EPSPS多肽第403位上的氨基酸V突变为其它19个氨基酸。使用表达OsWt的构建体pKED 2(SEQ ID NO:2)(图8)作为模板，以V403 F61作为正向引物、V403 R61作为反向引物，进行突变PCR产物的扩增。V403F61引物序列为AATGCCTGATNNKGCCATGACCC。V403 R61引物序列为TTGTTCATGTTGACATCAACAG。
实验步骤和结果如下。
a)PCR体系：根据上表中靶载体对应的引物和模板混合PCR体系，正向引物1.25μl，反向引物1.25μl，模板质粒2μl，Q5 PCR主反应混合物12.5μl，以及ddH2O 18μl。
b)PCR反应条件：
c)取出5μl上述PCR产物，加入到琼脂糖凝胶电泳的缓冲液中。如果获得大小约为4.5kb的PCR产物，则扩增成功。
d)用NEB公司的KLD酶混合物除去PCR产物中的模板，然后连接产物。连接系体系为：KLD缓冲液5μl，KLD混合液1μl，PCR产物1μl，ddH2O3μl。室温下连接5分钟后，将PCR产物转化到大肠杆菌中。
e)将连接产物转化到EPSPS缺陷型感受态大肠杆菌Dh5α中，并通过公知的Red同源重组方法构建EPSPS缺陷型大肠杆菌菌株。(Guangxing Bai,Zhiwei Sun,Ying Huang,etal.Knockout of E.coli ClpP gene using Red recombination system[J].ChineseJournal of Biochemistry and Molecular Biology(1):45-48.)。大肠杆菌转化方法和检测方法都是本领域常规已知的方法。复苏后，用M9培养基洗涤细胞两次，然后将洗涤过的细胞铺在含有0.2mM草甘膦的M9培养基上并培养48小时。对每个生长的单菌落测序(测序及其分析由Tsingke Biological Technology Co.,Ltd完成)，仅发现V403A突变体对0.2mM草甘膦有抗性。
实施例3：水稻EPSPS突变体中草甘膦抗性的比较。
实施例2显示水稻EPSPS上的突变V403A可以影响水稻EPSPS对草甘膦的敏感性。本发明人设计了这个实验来测试在其它位置的任何突变是否也能提高突变水稻EPSPS对草甘膦的敏感性。
详细的实验步骤和测试结果如下。
表2：水稻OsGA、OsPS、OsGAVA、OsPSVA、OsGAPS、OsGPV、OsTIPS、OsTIPT、OsTIPSVA和OsTIPTVA突变体的构建体。
具体实验步骤如下：
i：获得并保存所需的水稻EPSPS突变体
a)PCR体系：根据上表中靶载体对应的引物和模板混合PCR体系，正向引物1.25μl，反向引物1.25μl，模板质粒2μl，Q5 PCR主反应混合物12.5μl，以及ddH2O 18μl。
b)PCR反应条件如下：根据上表中靶载体对应的退火温度设置退火温度。
*按照上表设置退火温度。
c)取出获得的PCR产物5μl，加入琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液中。大小约为4.5kb的条带被认为是成功的。
d)使用NEB的KLD酶混合物去除模板并连接PCR产物。连接体系为5μl KLD缓冲液、1μl KLD混合液、1μl PCR产物和3μl ddH2O，在室温下连接5min后，将其转化到大肠杆菌中。
e)将连接产物转化到缺乏EPSPS的Dh5α感受态大肠杆菌中。复苏后，用M9培养基洗涤细胞两次，然后将洗涤过的细胞铺在M9培养基上并培养48小时。对生长的单菌落进行测序(Tsingke Biological Technology Co.,Ltd.)，并选择正确的突变体以保存备用。
选择以下突变体进行测试：
OsWt代表野生型水稻EPSPS(SEQ ID NO:2)。OsVA代表具有突变V403A的突变水稻EPSPS(SEQ ID NO:3)。OsGA代表具有突变G172A的突变水稻EPSPS(SEQ ID NO:7)。OsPS代表具有突变P177S的突变水稻EPSPS(SEQ ID NO:8)。OsGAPS代表具有突变G172A和P177S的突变水稻EPSPS(SEQ ID NO:9)。OsGAVA代表具有突变G172A和V403A的突变水稻EPS PS(SEQID NO:4)。OsPSVA代表具有突变P177S和V403A的突变水稻EPS PS(SEQ ID NO:5)。OsGPV代表具有突变G172A、P177S和V403A的突变水稻EPS PS(SEQ ID NO:6)。OsTIPS代表具有突变T173I和P177S的突变水稻EPSPS(SEQ ID NO:35)。OsTIPT代表具有突变T173I和P177T的突变水稻EPSPS(SEQ ID NO:36)。OsTIPSVA代表具有突变T173I、P177S和V403A的突变水稻EPSPS(SEQ ID NO:37)。OsTIPTVA代表具有突变T173I、P177T和V403A的突变水稻EPSPS(SEQID NO:38)。cp4代表来自根癌土壤杆菌的野生型EPSPS(SEQ ID NO:39)。
ii：水稻EPSPS突变体对草甘膦的抗性比较
将从上述步骤获得的每个产物转化到缺乏EPSPS的大肠杆菌中。通过检测转化的大肠杆菌在含有不同草甘膦浓度(0mM、0.5mM、2mM、4mM、5mM、25mM、75mM、100mM)的M9培养基上的生长情况，此处1mM草甘膦相当于169mg/mL草甘膦酸，验证了水稻EPSPS突变体对草甘膦的抗性。结果如图2所示。
在含有0mM草甘膦的培养基上，除了缺乏含有OsGAPS的EPSPS的大肠杆菌不能生长外，表达所有其他基因的菌株都可以正常生长。这一结果表明，除OsGAPS突变体外，所有其它水稻EPSPS突变体都能在大肠杆菌中表达，以补偿大肠杆菌中原始EPSPS的功能。
OsGA、OsPS和OsVAEPSPS突变体可以在0.5mM草甘膦培养基上生长，但OsWt不能生长，表明G172A、P177S或V403A单一突变可以提高水稻EPSPS突变体的草甘膦抗性。在这里，V403A是一种新发现的可以提高EPSPS对草甘膦的耐受性的突变。
图2显示OsGAVA可以在75mM草甘膦培养基或任何含有小于75mM草甘膦的培养基上生长，OsPSVA可以在4mM草甘膦培养基或任何含有小于4mM草甘膦的培养基上生长。V403A突变与G172A或P177S突变相结合可以提高水稻EPSPS突变体对草甘膦的抗性。
图2进一步显示OsGPV可以在100mM草甘膦培养基上生长，同时草甘膦抗性与来自CP4 EPSPS的草甘膦抗性相当。V403A的额外突变可以提高OsGAVA或OsGAPS的草甘膦抗性。
图3进一步显示了OsTIPTVA可以在100mM草甘膦培养基上生长，而OsTIPTVA可以在75mM草甘膦培养基上生长。V403A的额外突变可以提高OsTIPS或OsTIPT的草甘膦抗性。
实施例4：亚麻EPSPS突变体的草甘膦抗性
i：获得亚麻EPSPS突变体
合成亚麻(Linum usitatissimum)EPSPS突变体序列(SEQ ID NO:27)，将其并克隆到pKED2载体中以获得载体LuVA。通过PCR引入A403V突变后，构建了载体LuWt。
具体实验步骤如下：
a)PCR体系：根据上表中靶载体对应的引物和模板混合PCR体系，正向引物1.25μl，反向引物1.25μl，模板质粒2μl，Q5 PCR主反应混合物12.5μl，以及ddH2O18μl。
b)PCR反应条件如下：根据上表中对应于靶载体的退火温度设定退火温度。
c)取出5μl获得的PCR产物，并将其加入琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液中。大小约为4.5kb的条带被认为是成功的。
d)使用NEB的KLD酶混合物除去模板，然后连接PCR产物。连接体系是5μl KLD缓冲液、1μl KLD混合物、1μl PCR产物和3μl ddH2O。在室温下连接5分钟后，将其转化到大肠杆菌中。
e)将连接产物转化到缺乏EPSPS的Dh5α感受态大肠杆菌中。复苏后，用M9培养基洗涤细胞两次，然后将洗涤后的细胞铺在M9培养基上，培养48h。对生长的单菌落(TsingkeBiological Technology Co.,Ltd.)进行测序，并选择正确的突变体以保存备用。
ii：亚麻EPSPS突变体的抗性试验及与野生型的比较
抗性结果如图4所示：LuWt(SEQ ID NO:26)代表野生型亚麻EPSPS基因，LuVA(SEQID NO:27)代表亚麻EPSPS的V403A单点突变体。
在1mM和2mM草甘膦存在下，LuVA的生长状况明显好于LuWt，表明V403A突变可以增加亚麻EPSPS对草甘膦的抗性。
实施例5：大豆EPSPS突变体的草甘膦抗性
i：获得所需的大豆EPSPS突变体
根据大豆(Glycine max)EPSPS(SEQ ID NO:36)的野生型序列信息，合成该基因并插入到载体pKED2中以获得载体GmWt。通过PCR将GmWt的V403位点突变为A，并获得表达含有V403A突变的大豆EPSPS突变蛋白的载体GmVA。具体实验步骤如下:
a)PCR体系：根据上表中靶载体对应的引物和模板混合PCR体系，正向引物1.25μl，反向引物1.25μl，模板质粒2μl，Q5 PCR主反应混合物12.5μl，以及ddH2O18μl。
b)PCR反应条件如下：根据上表中对应于靶载体的退火温度设定退火温度。
c)取出5μl获得的PCR产物并将其加入琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液中。大小约为4.5kb的条带被认为是成功的。
d)使用NEB的KLD酶混合物去除模板并连接PCR产物。连接体系是5μl KLD缓冲液、1μl KLD混合物、1μl PCR产物和3μl ddH2O。在室温下连接5分钟后，将其转化到大肠杆菌中。
e)将连接产物转化到缺乏EPSPS的Dh5α感受态大肠杆菌中。复苏后，用M9培养基洗涤细胞两次，然后将洗涤后的细胞铺在M9培养基上，培养48h。对生长的单菌落(TsingkeBiological Technology Co.,Ltd.)进行测序，并选择正确的突变体以保存备用。
ii：大豆EPSPS突变体的抗性试验及与野生型的比较
抗性结果如图4所示：GmWt(SEQ ID NO:33)代表野生型大豆EPSPS基因，GmVA(SEQID NO:34)代表大豆EPSPS的V403A单点突变体。
在0.5mM草甘膦压力下，GmVA的生长状态明显高于GmWt，表明V403A突变可以增加大豆EPSPS对草甘膦的抗性。
实施例6：小麦EPSPS突变体的草甘膦抗性
i：获得小麦EPSPS突变体的实验步骤
根据小麦A基因组第7号染色体上EPSPS基因的V403A突变序列信息(SEQ ID NO:32)合成该基因，并将其插入到载体pKED2中，以获得含有V403A突变的小麦(Triticumvulgare)EPSPS突变表达载体TaVA。通过PCR将TaVA的A403位点突变回V，获得了在小麦A基因组的7号染色体上表达EPSPS野生型基因的TaWt载体。
具体实验步骤如下：
a)PCR体系：根据上表中靶载体对应的引物和模板混合PCR体系，正向引物为1.25μl，反向引物为1.25μl，模板质粒为2μl，Q5-PCR主反应混合物为12.5μl，以及ddH2O为18μl。
b)PCR反应条件如下：根据上表中对应于靶载体的退火温度设定退火温度。
c)取出5μl获得的PCR产物，并将其加入琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液中。大小约为4.5kb的条带被认为是成功的。
d)使用NEB的KLD酶混合物去除模板并连接PCR产物。连接体系为5μl KLD缓冲液、1μl KLD混合液、1μl PCR产物和3μl ddH2O。在室温下连接5分钟后，转化大肠杆菌。
e)将连接产物转化到缺乏EPSPS的Dh5α感受态大肠杆菌中。复苏后，用M9培养基洗涤细胞两次，然后将洗涤后的细胞铺在M9培养基上，培养48h。对生长的单菌落(TsingkeBiological Technology Co.,Ltd.)进行测序，并选择正确的突变体以保存备用。
ii：小麦EPSPS突变体的抗性测定及其与野生型的比较
抗性结果如图4所示：TaWt(SEQ ID NO:31)代表小麦A基因组第7号染色体上的野生型EPSPS基因，TaVA(SEQ ID NO:32)代表小麦EPSPS的V403A单点突变体。
在0.2mM草甘膦压力下，TaVA的生长状态明显高于TaWt，表明V403A突变可以增加小麦EPSPS对草甘膦的抗性。
实施例7：亚麻EPSPS突变体LuGPV、LuTIPT、LuTIPTVA的抗性鉴定
通过PCR将LuVA的G172位和P177位同时突变为A和S，获得了一个3点突变的LuGPV。
通过PCR将LuWT的T173和P177位置同时突变为I和T，获得了一个3点突变体LuTIPT。
通过PCR将LuVA的T173和P177位置同时突变为I和T，获得了一个3点突变体LuTIPTVA。
具体实验步骤如下：
a)PCR体系：根据上表中靶载体对应的引物和模板混合PCR体系，正向引物为1.25μl，反向引物为1.25μl，模板质粒2μl，Q5 PCR主反应混合物12.5μl，以及ddH2O 18μl。
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b)PCR反应条件如下：根据上表中对应于靶载体的退火温度设定退火温度。
c)取出5μl获得的PCR产物，并将其加入琼脂糖凝胶电泳的上样缓冲液中。大小约为4.5kb的条带被认为是成功的。
d)使用NEB的KLD酶混合物除去模板并连接PCR产物。连接体系为5μl KLD缓冲液、1μl KLD混合液、1μl PCR产物和3μl ddH2O，在室温下连接5min后，将其转化到大肠杆菌中。
e)将连接产物转化到缺乏EPSPS的Dh5α感受态大肠杆菌中。复苏后，用M9培养基洗涤细胞两次，然后将洗涤后的细胞铺在M9培养基上，培养48h。对生长的单菌落(TsingkeBiological Technology Co.,Ltd.)进行测序，并选择正确的突变体以保存备用。
ii：亚麻EPSPS突变体的抗性测定及与野生型的比较
抗性结果如图5所示：LuWt(SEQ ID NO:26)代表亚麻的EPSPS2基因，LuGPV(SEQ IDNO:30)代表亚麻G172A+P177S+V403A三点突变体。抗性结果如图6所示：LuTIPT(SEQ ID NO:28)是亚麻T173I+P177S双点突变体，LuTIPTVA(SEQ ID NO:29)是亚麻T173I+P177T+V403A三点突变体。
结果表明，亚麻GPV突变体具有较强的草甘膦抗性。从100mM草甘膦压力下的菌落饱和度来看，LuGPV的抗性高于CP4。LuTIPTVA的抗性高于LuTIPT，表明V403A也能显著提高亚麻EPSPS基因中突变体的抗性水平。
实施例7：对其他水稻突变体的抗性试验
为了进一步提高水稻对草甘膦的抗性，培育出能够满足商业化生产要求的高抗性水稻EPSPS突变体，我们使用OsGPV作为模板进行随机突变，进行高浓度草甘膦筛选，鉴定出能提高草甘膦抗性的EPSPS突变体。
i.获得水稻突变体
1)易错PCR
我们使用OsGPV(SEQ ID NO:6)作为模板进行易错PCR。(使用GeneMorph II随机突变试剂盒，#200550,Agilent Technologies)
反应要求：
| 10×MutazymeII反应缓冲液 | 5μl |
| dNTP混合(每个最终为200μM) | 1μl |
| EP OsF | 0.5μl |
| EP OsR | 0.5μl |
| MutazymeIIDNA聚合酶(2.5U/μl) | 1μl |
| ddH2O | Xμl |
| OsGPV | 300ng |
| Total | 50μl |
引物序列如下：
EP OsF：tgtgaattcatggcggcgaaggcggaggagatc
EP OsR：gatcctgcaggtcagttcctgacgaaagtgc
PCR反应步骤：
2)对获得的PCR产物进行PCR产物回收和纯化
3)回收的产物和载体主链消化
a)回收的产物用EcoRI和SbfI消化，然后再用T4 DNA连接酶进行同样的双酶消化后连接到pKED2载体上以获得连接产物，从而获得携带水稻EPSPS基因突变体的载体。
b)将上述载体转化到敲除了EPSPS基因的大肠杆菌DH5α中。转化步骤如下：将上述连接产物加入50μl敲除EPSPS基因的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混合均匀，在冰上孵育30分钟，然后在42℃热激90秒后，取出后立即置于冰上冰浴2分钟。冰浴后，加入500μl LB液体培养基，在37℃以180r/min复苏45min。转化的大肠杆菌是以OsGPV为模板获得的一个表达水稻EPSPS突变基因的突变文库。
4)抗性筛选
将以上获得的转化产物以3000rpm离心5分钟，弃去上清液，然后将其重悬于1mlM9液体培养基中，加入200μl M9液体培养基至进行重悬，并将其接种在含有75mM草甘膦的M9平板上。在37度下孵化24小时。
5)挑选并保存在上述筛选平板中生长的单菌落，并进行进一步的抗性鉴定和测序
ii.水稻突变体的抗性测试。在本实施例中，将本研究中获得的野生型水稻EPSPS基因OsWT、最广泛使用的抗草甘膦商业化基因CP4EPSPS、与抗草甘膦商业化玉米GA21具有相同突变类型的水稻突变体OsTIPS和具有高抗草甘膦水稻EPSPS突变基因的水稻突变体OsGPV转化为对照，并将新获得的水稻EPSPS突变体转化为实验组，比较对照和突变体之间的草甘膦抗性。将对照组和实验组的单克隆细菌分别接种到含0、100mM和125mM草甘膦的培养基中，观察各组菌落的生长情况。
样本的顺序(从左到右)：
1st行：1-8，1-13，1-19，1-24，1-27，1-37，1-38
2nd行：1-42，1-68，1-88，1-93，1-98，1-125，1-139
3rd行：1-193，1-150，1-217，1-246，1-250，1-265，1-386
4th行：1-411，1-547，1-552，1-599，1-614，1-631，1-130
5th行：2-5，2-43，2-45，2-46，2-47，2-63，2-121
6th行：2-114，2-133，3-8，3-25，3-27，3-30，3-32
7th行：3-33，OsTIPS，3-36，CP4，Os Wt，Os GPV
在上述结果中，在100mM草甘膦的压力下，除了3-32和OsTIPS没有生长外，其他所有实验和对照样品都能够耐受/抵抗草甘膦，但菌落的生长状态不一致。基于125mM草甘膦压力下的菌落生长状态，16个突变体(1-68(SEQ ID NO:10)，1-98(SEQ ID NO:11)，1-139(SEQ ID NO:12)，1-246(SEQ ID NO:13)，1-386(SEQ ID NO:14)，1-411(SEQ ID NO:15)，1-547(SEQ ID NO:16)，1-552(SEQ ID NO:17)，1-599(SEQ ID NO:18),(SEQ ID NO:19),2-5(SEQ ID NO:20),2-46(SEQ ID NO:21),2-47(SEQ ID NO:22),(SEQ ID NO:23)，3-33(SEQID NO:24)，3-36(SEQ ID NO:25)在菌落生长状态上显著高于OsGPV，并且一些突变体的抗性显著高于CP4，显示出抗性增加。其他16个突变体的菌落生长状况显示出比OsGPV更低的抗性。在图7中，其他12个突变体与OsGPV的抗性没有显著差异。
实施例8：转基因水稻对草甘膦除草剂的抗性。
在本实施例中使用的水稻种子是公开可获得的RICE KENG XIANG DAO08-169。
1.获得表达载体。
根据常规方法，将编码OsGPV突变体(包含G172A、P177S和V403A)(SEQ ID NO:6)的核酸序列插入植物表达载体中，以获得表达OsGPV基因的pk510载体(参见图9)。
2.水稻愈伤组织转基因实验。
1)将转基因载体pk510导入农杆菌EHA105以获得重组农杆菌。
2)在转化实验前1-5天，将重组农杆菌接种在含有50mg/L卡那霉素和15mg/L利福霉素的YEB固体培养基上。用3M胶带将培养基密封在培养皿中；在黑暗中以倒置培养皿的方式在28℃的温度下培养1-5天。
3)用接种环刮去细菌“Z”形尾部，轻轻悬浮于含2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸的100μmNB液体培养基中，使菌液浓度达到约O.D.600＝0.1，然后留制备的农杆菌感染溶液。
4)除去水稻种皮后，将水稻种子置于三角瓶中，用无菌水洗涤3次。加入75％的乙醇浸泡种子，轻轻摇晃1分钟，弃去乙醇。然后，加入2.5％氯酸钠水溶液，并以150-170rpm摇动该溶液25分钟。然后，加入无菌水，轻轻摇动5-8次，然后倒掉水。种子接种在愈伤组织诱导培养基上，并于30℃在黑暗中培养4-6周，获得水稻愈伤组织。
5)将步骤4中获得的水稻愈伤组织浸泡在农杆菌感染溶液中10分钟，然后将其置于覆盖有两层无菌滤纸的共培养基上，并于22℃在黑暗中培养三天。
6)将步骤5获得的水稻愈伤组织置于复苏培养基上，30℃培养4-7天。
7)将步骤6中获得的水稻愈伤组织置于潮霉素选择培养基上，在30℃培养两周。
8)将步骤7中获得的水稻愈伤组织置于潮霉素选择培养基上，在30℃培养2周。
9)将生长旺盛的愈伤组织转移到分化培养基成分中，在30℃培养20-30天。植物由黄色或绿色的愈伤组织产生。
10)选择高度大于3cm的健壮再生绿苗，转移到生根培养基中，培养7-14天，获得水稻T0苗。
培养基成分：
共培养基成分：含2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸的NB固体培养基
复苏培养基成分：含200mg/L特美汀(timentin)的NB固体培养基潮霉素选择培养基成分：含30-50mg/L潮霉素的NB固体培养基
分化培养基成分：含0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L脯氨酸、2mg/L卡那霉素和0.2mg/Lα-萘乙酸的NB固体培养基。
生根培养基成分：含0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L脯氨酸、0.2mg/Lα-萘乙酸的MS固体培养基。
转基因水稻T0幼苗在人工气候室中培养直至收获，并获得T1代水稻种子用于草甘膦抗性测试。
2.T1代转基因水稻对草甘膦的抗性鉴定。
转基因水稻T0幼苗在人工气候室中培养直至收获，并获得T1代水稻种子用于草甘膦抗性测试。
1)选择在紫外光下转基因呈阳性的T1代种子。由于植物表达载体是通过串联表达OsGPV和能表达红色荧光蛋白的DsRed基因而构建的，可通过暴露于紫外光而来区分T1代种子。红光的种子是同时含有DsRed和OsGPV载体的种子。
2)加速发芽：从非转基因对照种子和含有OsGPV基因的T1转基因种子中各取20粒种子，在清水中浸泡4小时，使种子充分吸水。然后将种子转移到底部有两层滤纸的培养皿中，并在其中加入少量清水保持湿润。水量不应使种子过满。
3)按照上述方法培养2天后，将种子转移到底部有两层滤纸的培养皿(直径9cm)中，加入少量5ml 100ppm草甘膦水溶液(向上舍入Round up，加入41％异丙胺盐溶液稀释10000倍)并培养10天。
4)随机挑选10株水稻幼苗并拍照，见图10。
在图10中，显示了作为对照的野生型水稻的在100ppm草甘膦溶液中生长显著被抑制，并且根长度也显著被抑制。在随后的观察中，野生型全部死亡和烂根。含有OsGPV突变体的转基因水稻没有受到草甘膦除草剂的显著影响，继续生长，表明含有OsGPV突变体的水稻植株对草甘膦具有耐受性/抗性。
图1显示了SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:33之间的多重比对。
图2显示了表达具有G172A、P177S和/或V403A突变体及其组合突变体的水稻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长。
图3显示了表达具有T173I、P177S/T和/或V403A突变体及其组合突变体的水稻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长。
图4显示了表达具有V403A突变体的亚麻或小麦或大豆EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长状态。
图5显示了表达具有G172A、P177S和V403A突变体的亚麻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞和表达CP4 EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长状态比较。
图6显示了表达具有G172A、T173I、P177T/S和/或V403A突变体的亚麻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度培养基中的生长状态。
图7显示了在125ml草甘膦除草剂浓度下，表达水稻EPSPS蛋白的大肠杆菌细胞与多个突变体的草甘膦抗性比较。
图8显示了构建体pKED2载体。
图9显示了包含本发明一个实施方案的pk510载体。
图10显示了野生型水稻植物和转基因水稻植物之间的比较以及它们抗草甘膦的能力。
SEQ ID NO:1是野生型水稻EPSPS蛋白的全长氨基酸序列(GenBank登录号XP_015643046.1)，其中，其N-末端包含叶绿体转运肽。SEQ ID NO:1在本文中用作参考EPSPS序列，并且所有突变位置根据SEQ ID NO:1标记。maatmasnaaaaaavsldqavaasaafssrkqIrlpaaarggmrvrvrargrreavvvasassssvaapaakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttvdnllnsedvhymlealkalglsveadkvakravvgcggkfpvekdakeevqiflgnagtamrpltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglkqlgadvdcflgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdvamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdycitppeklnitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:2是野生型水稻EPSPS蛋白的氨基酸序列。与SEQ ID NO:1相比，从SEQID NO:2中去除了叶绿体转运肽。
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SEQ ID NO:3是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含V403A突变。maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttvvdnlInsedvhymlealkalglsveadkvakravyvgcggkfpvekdakeevqlflgngatamrpltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlyvglkqlgadvdcflgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppeklnitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:4是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A和V403A突变。
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SEQ ID NO:5是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含P177S和V403A突变。
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SEQ ID NO:6是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S或V403A突变。
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SEQ ID NO:7是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A突变。maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttyvdnllnsedvhymlealkalglsveadkvakrawwvgcggkfpvekdakeevqlflgnaatamrpltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlyvglkqlgadvdcfilgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdvamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppeklnitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:8是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含P177S突变。maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttyvdnllnsedvhymlealkalglsveadkvakrawwvgcggkfpvekdakeevqlflgnagtamrsltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglkqlgadvdcfigtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdvamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppekInitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:9是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A和P177S突变。
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SEQ ID NO:10是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A70V、G172A、P177S、V403A和R514S突变。
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SEQ ID NO:11是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73T、G172A、P177S和V403A突变。
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SEQ ID NO:12是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73T、E86G、G172A、P177S和V403A突变。
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SEQ ID NO:13是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和D472E突变。
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SEQ ID NO:14是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、V403A和F502V突变。
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SEQ ID NO:15是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、Y252F和V403A突变。
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SEQ ID NO:16是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含E137D、G172A、P177S、L253M和V403A突变。
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SEQ ID NO:17是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、K399N、V403A和T466S突变。
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SEQ ID NO:18是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和V403A突变。
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SEQ ID NO:19是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和V403A突变。
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SEQ ID NO:20是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和V403A突变。
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SEQ ID NO:21是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、N246D和V403A突变。maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttvvdnlnsedvhymlealkalglsveadkvakravyvgcggkfpvekdakeevqlflgnaatamrsltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglkqlgadvdcflgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgdayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppeklnitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:22是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和F512I突变。
maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttyvdnllnsedvhymlealkalglsveadkvakrawwvgcggkfpvekdakeevqlflgnaataarsltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglkqlgadvdcflgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsalllaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvefaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppekInitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstivrn*
SEQ ID NO:23是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含A73S、G172A、P177S、L214F和V403A突变。
maakseeivlqpireisgavqlpgskslsnrillsalsegttvvdnlInsedvhymlealkalglsveadkvakravwvgcggkfpvekdakeevqlflgnaatamrsltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlwvglkqfgadvdcfigtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppekInitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:24是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和R514K突变。
maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttyvdnllinsedvhymlealkalglsveadkvakrawwvgcggkfpvekdakeevqlflgnaatamrsltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlavglkqlgadvdcfigtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplahgdveieiidklisipyvemtIrlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppekInitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvkn*
SEQ ID NO:25是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含V113M、G172A、P177S和V403A突变。
maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttvmdnlInsedvhymlealkalglsveadkvakravyvgcggkfpvekdakeevqlflgnaatamrsltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdluvglkqlgadvdcflgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtIrlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdykfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppeklnitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:26是野生型亚麻EPSPS2的氨基酸序列，翻译自Lus10000788(Sauer NJ,Narváez-Vásquez,Javier,Mozoruk J,et al.Oligonucleotide-Mediated GenomeEditing Provides Precision and Function to Engineered Nucleases andAntibiotics in Plants[J].Plant Physiology,2016:1917-1928.)，其中，其叶绿体转运肽从SEQ ID NO:26中去除。
mtvpeeivlqpikdisgivtlpgskslsnrillaalsegktyvdnlInsddvhymlgalktlgInvehsseqkraivegrggvfpvgklgkndielflgnagtamrpltaavtaaggnssyildgvprmrerpigdlvvglkqlgadvscsstscppvhvnakgglpggkvklsgsissqyltallmaaplalgdveieivdklisvpyvdmtlklmerfgvavehsgswdrffvkggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtitvegcgtssIqgdvkfaevlekmgakvtwtetsvtvtgpprdasgkkhlravdvnmnkmpdvamtlavvalyadgptairdvaswrvketermiavctelrklgatveegpdyciitppeklsiaeidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctkktfpdyfevlerytkh*
SEQ ID NO:27是来自亚麻EPSPS序列的突变体，其包含V403A突变。mtvpeeivlqpikdisgivtlpgskslsnrillaalsegktyvdnlInsddvhymlgalktlgInvehsseqkraivegrggvfpvgklgkndielflgnagtamrpltaavtaaggnssyildgvprmrerpigdlvvglkqlgadvscsstscppvhvnakgglpggkvklsgsissqyltallmaaplalgdveieivdklisvpyvdmtlklmerfgvavehsgswdrffvkggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtitvegcgtssIqgdvkfaevlekmgakvtwtetsvtvtgpprdasgkkhlravdvnmnkmpdaamtlavvalyadgptairdvaswrvketermiavctelrklgatveegpdyciitppeklsiaeidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctkktfpdyfevlerytkh*
SEQ ID NO:28是来自亚麻EPSPS序列的突变体，其包含T173I和P177T突变。
mtvpeeivlqpikdisgivtlpgskslsnrilllaalsegktvvdnlInsddvhymlgalktlgInvehsseqkraivegrggvfpvgklgkndielflgnagiamrtltaavtaaggnssyildgvprmrerpigdlvvglkqlgadvscsstscppvhvnakgglpggkvklsgsissqyltallmaaplalgdveieivdklisvpyvdmtiklmerfgvavehsgswdrffvkggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtitvegcgtssIqgdvkfaevlekmgakvtwtetsvtvtgpprdasgkkhlravdvnmnkmpdvamtlavvalyadgptairdvaswrvketermiavctelrklgatveegpdyciitppeklsiaeidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctkktfpdyfevlerytkh*
SEQ ID NO:29是来自亚麻EPSPS序列的突变体，其包含T173I、P177T和V403A突变。
mtvpeeivlqpikdisgivtlpgskslsnrillaalsegktvvdnllnsddvhymlgalktlgInvehsseqkraivegrggvfpvgklgkndielflgnagiamrtltaavtaaggnssyildgvprmrerpigdlvvglkqlgadvscsstscppvhvnakgglpggkvklsgsissqyltallmaaplalgdveieivdklisvpyvdmtikImerfgvavehsgswdrffvkggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtitvegcgtsslqgdvkfaevlekmgakvtwtetsvtvtgpprdasgkkhlravdvnmnkmpdaamtlavvalyadgptairdvaswrvketermiavctelrklgatveegpdyciitppeklsiaeidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctkktfpdyfevlerytkh*
SEQ ID NO:30是来自亚麻EPSPS序列的突变体，其包含G172A、P177S和V403A突变。
mtvpeeivlqpikdisgivtlpgskslsnrillaalsegktvvdnlInsddvhymlgalktlgInvehsseqkraivegrggvfpvgklgkndielflgnaatamrsltaavtaaggnssyildgvprmrerpigdlvvglkqlgadvscsstscppvhvnakgglpggkvklsgsissqyltallmaaplalgdveieivdklisvpyvdmtiklmerfgvavehsgswdrffvkggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtitvegcgtssIqgdvkfaevlekmgakvtwtetsvtvtgpprdasgkkhiravdvnmnkmpdaamtlavvalyadgptairdvaswrvketermiavctelrklgatveegpdycitppeklsiaeidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctkktfpdyfevlerytkh*
SEQ ID NO:31野生型小麦EPSPS蛋白的氨基酸序列，其是以GenBank条目ALK27163.1呈现，其中，其叶绿体转运肽从SEQ ID NO:31中去除。magaeevwlqpireisgavqlpgskslsnrillsalsegttuvdnllnsedvhymlealealglsveadkvakrawwgcggrfpvekdakeevklfignagtamrpltaavvaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglqqlgadvdcfigtncppvringkgglpggkvklsgsissqylssllmaaplaledveieiidklisvpyvemtlklmehfgvtaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvegcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprqpfgrkhlkavdvnmnkmpdvamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgatveegpdycitppekinitaidtyddhrmamafslaacaevpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvkn*
SEQ ID NO:32是来自小麦EPSPS序列的突变体，其包含V403A突变。magaeevvlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttvvdnlInsedvhymlealealglsveadkvakravvgcggrfpvekdakeevklflgnagtamrpltaavvaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglqqlgadvdcfigtncppvringkgglpggkvklsgsissqylssllmaaplaledveieiidklisvpyvemtlkimehfgvtaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvegcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprqpfgrkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgatveegpdycitppekinitaidtyddhrmamafslaacaevpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvkn*
SEQ ID NO:33野生型大豆EPSPS蛋白的氨基酸序列，其是以GenBank条目XP_003521857.1呈现，其中，其叶绿体转运肽从SEQ ID NO:33中去除。maaaekpstapeivlepikdisgtitlpgskslsnrilllaalsegttvvdnllysedihymlgalrtlgIrveddqttkqaivegcgglfptikeskdeinlflgnagtamrpltaavvaaggnasyvldgvprmrerpigdlvaglkqlgadvdcflgtncppvrvngkgglpggkvklsgsissqyltallmaaplalgdveieivdklisvpyvemtlklmerfgvsvehsgnwdkflvhggqkykspgnafvegdassasyflagaavtggtitvngcgtnslqgdvkfaevlekmgakvtwsensvtvtgppqdssgqkvlqgidvnmnkmpdvamtlavvalfangqtairdvaswrvketermiaictelrklgatveegpdycvitppekInvtaidtyddhrmamafslaacgdvpvtikdpgctrktfpdyfevlerftrh*
SEQ ID NO:34是来自大豆EPSPS序列的突变体，其包含V403A突变。maaaekpstapeivlepikdisgtitlpgskslsnrillaalsegttyvdnllysedihymlgalrtlgIrveddqttkqaivegcgglfptikeskdeinlflgnagtamrpltaavvaaggnasyvldgvprmrerpigdlvaglkqlgadvdcfigtncppvrvngkgglpggkvklsgsissqyltallmaaplalgdveieivdklisvpyvemtilklmerfgvsvehsgnwdkfivhggqkykspgnafvegdassasyflagaavtggtitvngcgtnslqgdvkfaevlekmgakvtwsensvtvtgppqdssgqkvlqgidvnmnkmpdaamtlavvalfangqtairdvaswrvketermiaictelrklgatveegpdycvitppekInvtaidtyddhrmamafslaacgdvpvtikdpgctrktfpdyfevlerftrh*
SEQ ID NO:35是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含T173I和P177S突变。
maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttvvdnlnsedvhymlealkalglsveadkvakravyvgcggkfpvekdakeevqlflgnagiamrsltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglkqlgadvdcflgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdvamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdycitppekInitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:36是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含T173I和P177T突变。
maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttyvdnllinsedvhymlealkalglsveadkvakrawwvgcggkfpvekdakeevqlflgnagiamrtltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglkqlgadvdcfigtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdvamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppeklnitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:37是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含T173I、P177S和V403A突变。
maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttvvdnlInsedvhymlealkalglsveadkvakravwvgcggkfpvekdakeevqlflgnagiamrsltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvvglkqlgadvdcflgtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppekInitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:38是来自水稻EPSPS序列的突变体，其包含T173I、P177T和V403A突变。
maakaeeivlqpireisgavqlpgskslsnrilllsalsegttyvdnlInsedvhymlealkalglsveadkvakravvvgcggkfpvekdakeevqlflgnagiamrtltaavtaaggnatyvldgvprmrerpigdlvglkqlgadvdcfigtecppvrvkgigglpggkvklsgsissqylsallmaaplalgdveieiidklisipyvemtirlmerfgvkaehsdswdrfyikggqkykspgnayvegdassasyflagaaitggtvtvqgcgttslqgdvkfaevlemmgakvtwtdtsvtvtgpprepygkkhlkavdvnmnkmpdaamtlavvalfadgptairdvaswrvketermvairteltklgasveegpdyciitppekInitaidtyddhrmamafslaacadvpvtirdpgctrktfpnyfdvlstfvrn*
SEQ ID NO:39是来自CP4(根癌农杆菌)的野生型EPSPS的氨基酸序列。
mdpgmshgassrpatarkssglsgtvripgdksishrsfmfgglasgetritgllegedvintgkamqamgarirkegdtwiidgvgnggllapeapldfgnaatgcrltmglvgvydfdstfigdasltkrpmgrvInpIremgvqvksedgdrlpvtlrgpktptpityrvpmasaqvksavllagIntpgittviepimtrdhtekmlqgfganltvetdadgvrtirlegrgkitgqvidvpgdpsstafplvaallvpgsdvtilnvImnptrtgliltlqemgadievinprlaggedvadIrvrsstlkgvtvpedrapsmideypilavaaafaegatvmngleeIrvkesdrlsavanglkIngvdcdegetslvvrgrpdgkglgnasgaavathldhriamsflvmglvsenpvtvddatmiatsfpefmdlmaglgakielsdtkaa
Claims (107)
1.一种编码植物EPSP合成酶(EPSPS)多肽的多核苷酸，其中，所述植物EPSPS多肽包含突变为氨基酸A的氨基酸V，其中，突变位置是所述植物EPSPS氨基酸序列中对应于SEQ IDNO:1中列出的V403的位置的氨基酸V的位置。
2.一种编码植物EPSP合成酶(EPSPS)多肽的多核苷酸，其中，所述植物EPSPS多肽包含V403A氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
3.一种编码植物EPSP合成酶(EPSPS)多肽的多核苷酸，其中，所述植物EPSPS多肽包含G172A和V403A氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
4.一种编码植物EPSP合成酶(EPSPS)多肽的多核苷酸，其中，所述植物EPSPS多肽包含P177S和V403A氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
5.一种编码植物EPSP合成酶(EPSPS)多肽的多核苷酸，其中，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
6.一种编码植物EPSP合成酶(EPSPS)多肽的多核苷酸，其中，所述植物EPSPS多肽包含T173I、P177S和/或V403A氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
7.一种编码植物EPSP合成酶(EPSPS)多肽的多核苷酸，其中，所述植物EPSPS多肽包含T173I、P177T和/或V403A氨基酸突变，其中，氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
8.一种编码植物EPSP合成酶(EPSPS)多肽的多核苷酸，其中，所述植物EPSPS多肽包含G172A、P177S和/或V403A以及至少一个或两个或更多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24)H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A70V、G172A、P177S、V403A和/或R514S的植物EPSPS多肽。
10.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73T、G172A、P177S和/或V403A的植物EPSPS多肽。
11.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A的植物EPSPS多肽。
12.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E的植物EPSPS多肽。
13.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、V403A和/或F502V的植物EPSPS多肽。
14.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A的植物EPSPS多肽。
15.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A的植物EPSPS多肽。
16.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S的植物EPSPS多肽。
17.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A的植物EPSPS多肽。
18.权利要求8的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A的植物EPSPS多肽。
19.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A的植物EPSPS多肽。
20.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、N247D和/或V403A的植物EPSPS多肽。
21.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I的植物EPSPS多肽。
22.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A的植物EPSPS多肽。
23.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K的植物EPSPS多肽。
24.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码包含V113M、G172A、P177S和/或V403A的植物EPSPS多肽。
25.一种重组DNA构建体，其包含权利要求1-24中任意一项的多核苷酸。
26.一种植物细胞，其包含权利要求1-24中任意一项的多核苷酸或权利要求25的重组DNA构建体。
27.根据权利要求26所述的植物细胞，其中，所述植物细胞是水稻细胞。
28.一种植物，其基因组中包含权利要求1-24中任意一项的多核苷酸或权利要求25的重组DNA构建体。
29.根据权利要求28所述的植物，其中，所述植物是玉米、水稻、小麦、大麦、燕麦、高粱、粟、亚麻、大麻、肯塔基蓝草、高羊茅、匍匐翦股颖、芸苔属植物、甜菜、大豆、豌豆、苜蓿、烟草、棉花、向日葵、番茄、马铃薯、苹果树、葡萄藤、柑橘树、黄瓜或矮牵牛。
30.根据权利要求28所述的植物，其中，所述植物是水稻。
31.一种产生草甘膦耐受植物的方法，包括：
(a)在可再生植物细胞中表达权利要求1-24中任意一项的重组DNA构建体；
(b)产生草甘膦耐受植物，其中，在草甘膦耐受植物的基因组中包含重组DNA构建体。
32.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
33.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含G172A和V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
34.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含P177S和V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
35.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含G172A、P177S和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
36.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含G172A、P177S和/或V403A以及至少一个或两个或更多个选自以下的氨基酸突变：(1)A70V、(2)A73T/V/S/K/G、(3)V113M、(4)D114H、(5)L134F、(6)V136M、(7)E137D、(8)A145G、(9)K161E、(10)E163K、(11)M175A、(12)V208A、(13)L214F、(14)A216V、(15)Y252F、(16)L253M、(17)M258L、(18)A260T、(19)L264H、(20)G265V、(21)N316D、(22)K356E、(23)S374R、(24))H389R、(25)K399N、(26)T442S、(27)T466S、(28)D472E、(29)F502V、(30)F512I和(31)R514S/K，
其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
37.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含T173I、P177S和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
38.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含T173I、P177T和/或V403A，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
39.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A70V、G172A、P177S、V403A和/或R514S。
40.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A。
41.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、V403A和/或F502V。
42.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A。
43.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A。
44.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或orT466S。
45.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A。
46.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A。
47.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A。
48.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、N247D和/或V403A。
49.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I。
50.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A。
51.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K。
52.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，其包含V113M、G172A、P177S和/或V403A。
53.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的类似氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
54.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含类似于G172A的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所述的类似氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
55.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含类似于P177S的氨基酸突变和类似于V403A的氨基酸突变，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所述的类似氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
56.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合成酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含类似于G172A的氨基酸突变、类似于P177S的氨基酸突变和/或类似于V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中列出的类似氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
57.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含类似T173I的氨基酸突变、类似P177S的氨基酸突变和/或类似V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所述的类似氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
58.一种产生草甘膦耐受植物的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞中修饰内源性植物EPSP合酶(EPSPS)基因，以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，所述蛋白包含类似T173I的氨基酸突变、类似P177T的氨基酸突变和/或类似V403A的氨基酸突变，其中，每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所述的卤代氨基酸位置；和
(b)从所述植物细胞中生长植物，其中，所述植物对草甘膦具有耐受性。
59.一种草甘膦耐受植物，其表达包含V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
60.一种草甘膦耐受植物，其表达包含G172A和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
61.一种草甘膦耐受植物，其表达包含P177S和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
62.一种草甘膦耐受植物，其表达包含G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
63.一种草甘膦耐受植物，其表达包含T173I、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
64.一种草甘膦耐受植物，其表达包含T173I、P177T和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
65.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
66.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含G172A和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
67.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含P177S和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
68.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
69.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含T173I、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
70.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含T173I、P177T和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
71.一种草甘膦耐受性亚麻植物，其表达包含V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
72.一种草甘膦耐受性亚麻植物，其表达包含G172A和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
73.一种草甘膦耐受性亚麻植物，其表达包含P177S和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
74.一种草甘膦耐受性亚麻植物，其表达包含G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
75.一种草甘膦耐受性亚麻植物，其表达包含T173I、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
76.一种草甘膦耐受性亚麻植物，其表达包含T173I、P177T和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
77.一种草甘膦耐受性小麦植物，其表达包含V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
78.一种草甘膦耐受性小麦植物，其表达包含G172A和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
79.一种草甘膦耐受性小麦植物，其表达包含P177S和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
80.一种草甘膦耐受性小麦植物，其表达包含G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
81.一种草甘膦耐受性大豆植物，其表达包含V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
82.一种草甘膦耐受性大豆植物，其表达包含G172A和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
83.一种草甘膦耐受性大豆植物，其表达包含P177S和V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
84.一种草甘膦耐受性大豆植物，其表达包含G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
85.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含A70V、G172A、P177S、V403A和/或R514S氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
86.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含A73T、G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
87.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含A73T、E86G、G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
88.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含A145G、G172A、P177S、V403A、T442S和/或D472E氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
89.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含G172A、P177S、V403A和/或F502V氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
90.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含G172A、P177S、Y252F和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
91.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含E137D、G172A、P177S、L253M和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
92.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含G172A、P177S、K399N、V403A和/或T466S氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
93.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含A73G、L134G、G172A、P177S、G265V、S374R和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
94.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含A73K、D114H、V136M、K161E、G172A、P177S、A260T和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
95.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含E163K、G172A、P177S、A216V、L253M、H389R和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
96.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含G172A、P177S、N247D和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
97.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含G172A、M175A、P177S、M258L、K356E、V403A和/或F512I氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
98.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含A73S、G172A、P177S、L214F和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
99.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含G172A、P177S、V208A、L264H、V403A和/或R514K氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
100.一种草甘膦耐受性水稻植物，其表达包含V113M、G172A、P177S和/或V403A氨基酸突变的植物EPSPS多肽，其中，氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。
101.一种鉴定草甘膦耐受植物的方法，包括测试以确定所述植物是否包含重组DNA构建体的步骤，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码植物EPSP合酶(EPSPS)多肽，所述多肽包含权利要求1-24所述的多核苷酸。
102.一种鉴定耐草甘膦水稻植物的方法，包括测试以确定所述植物是否包括重组DNA构建体的步骤，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列可操作连接的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码植物EPSP合酶(EPSPS)多肽，所述多肽包含权利要求1-24中所述的多核苷酸。
103.多核苷酸编码植物EPSP合成酶(EPSP)多肽的用途，所述多肽包含权利要求1-24中所述的多核苷酸。
104.一种产生抗除草剂或耐受除草剂的植物的方法，包括：
将具有表达EPSPS蛋白的突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞，其中，所述突变在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置V403处或在EPSPS同源物中的类似氨基酸残基处突变，其中V403变为A；
选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；和
从选择的植物细胞再生具有突变的EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
105.一种产生抗除草剂或耐受除草剂的植物的方法，包括：
将具有表达EPSPS蛋白的突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞，其中，所述突变在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置G172和V403处突变，或者在EPSPS同源物中的类似氨基酸残基处突变，其中G172变为A，V403变为A；
选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；和
从所述选择的植物细胞再生具有突变EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
106.一种产生抗除草剂或耐受除草剂的植物的方法，包括：
将具有表达EPSPS蛋白的突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞，其中，所述突变在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置P177和V403处突变，或在EPSPS同源物的类似氨基酸残基处突变，其中P177变为S，V403变为A；
选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；和
从所述选择的植物细胞再生具有突变的EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
107.一种产生抗除草剂或耐受除草剂的植物的方法，包括：
将具有表达EPSPS蛋白的突变EPSPS基因的重组寡核苷酸引入植物细胞，其中，所述突变在水稻EPSPS蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置G172、P177和V403处突变，或在EPSPS同源物的类似氨基酸残基处突变，其中G172变为A，P177变为S，V403变为A；
选择与相应的野生型植物细胞相比表现出对草甘膦的耐受性提高的植物细胞；和
从所述选择的植物细胞再生具有突变的EPSPS基因的抗除草剂或耐受除草剂的植物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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