JP2024504485A - Ｅｐｓｐｓ突然変異体及びその応用方法 - Google Patents

Ｅｐｓｐｓ突然変異体及びその応用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）突然変異体及びその植物における応用を提供する。ＥＰＳＰＳ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列を有する野生型ＥＰＳＰＳに比べて、４０３位置にＶ～Ａ突然変異を含む。【選択図】図１

Description

本発明の分野は、分子生物学分野に関する。より具体的には、本発明は、グリホサート耐性を付与するアミノ酸突然変異及びそのグリホサート耐性植物における応用に関する。
５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ遺伝子によってコードされる５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）は、シキミ酸経路における６番目の酵素である。この酵素は、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）とシキミ酸－３－リン酸（Ｓ３Ｐ）からリン酸と５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸（ＥＰＳＰ）への変換を触媒する。シキミ酸経路は、植物、細菌、真菌に広く存在するが、動物にはこのような経路がない。グリホサートは、世界で最も販売されている化学除草剤の１つである。その構造は、ＰＥＰの構造類似体である。ＥＰＳＰＳとＰＥＰの結合を競合的に抑制することにより、下流の芳香族アミノ酸の合成を妨げ、下流の生合成と代謝の不均衡が生じ、それにより雑草を効果的に殺す。グリホサート除草剤は、すべての植物にとってほぼ致死的である。植物におけるＥＰＳＰＳ以外、いくつかの細菌にもグリホサートに感受性の高いＥＰＳＰＳが存在する。グリホサートに感受性の高いこれらのＥＰＳＰＳは、Ｉ類に分類され、いくつかの微生物におけるＥＰＳＰＳのタンパク質構造は、植物におけるＥＰＳＰＳのタンパク質構造と類似するが、Ｉ類ＥＰＳＰＳ配列のアミノ酸配列との類似性が５０％よりも小さく、例えば、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ、Ｇ２－ａｒｏＡなどが挙げられ、グリホサートに感受性の低いこのようなＥＰＳＰＳ酵素は、ＩＩ類に分類される。
グリホサートは、その広域性、高効率、低毒性、低コストのため、最も人気のある化学除草剤の１つとなっている。農地で使用すると、除草コストを大幅に節約し、農家の収入を増加することができる。グリホサート抵抗性は、バイオテクノロジーによって作られた植物品種の中で最も人気のある形質の１つである。現在までは、約２２１個の承認された遺伝子組換えイベントの中で約７つの遺伝子が含まれている。２つの遺伝子（ｍＥＰＳＰＳと２ｍＥＰＳＰＳ）のみは、植物由来であり、他の５つの遺伝子は、微生物由来である。一般の人々が外因性遺伝子を遺伝子組換え作物に導入する安全性に注目するにつれて、化学的突然変異誘発と遺伝子編集による生成物は、世界中で受け入れられるようになる。なお、遺伝子編集技術は、その高効率、部位特異性により、グリホサート耐性作物の開発の新しい方向となっている。植物遺伝子を少なく突然変異させるだけで、理想的な形質を有し且つ商品価値の高い目的植物を得ることができる。
本発明者は、植物の元のＥＰＳＰＳ酵素のいくつかのアミノ酸突然変異により、元の酵素の機能に影響を与えることなく、植物にグリホサート抵抗性を与えることができることを発見した。本発明者は、これらのタンパク質突然変異体及びそのコード遺伝子の、遺伝子組換え植物、遺伝子編集植物又は他の植物育種における応用をさらに開発した。これらは、グリホサート抵抗性を有する植物、特に農作物例えば農業植物の育成に用いることができる。
本開示は、突然変異したＥＰＳＰＳのアミノ酸の突然変異位置及び突然変異タイプに関する。グリホサート耐性植物を生成する方法をさらに提供する。
１つの態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｖ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
１つの態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
１つの態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
１つの態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
１つの態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
１つの態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
さらに別の態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｖ→Ａを含み、該位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置４０３に位置合わせされた元のＥＰＳＰＳアミノ酸配列の位置に対応する。
さらに別の態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ→Ａ及びＶ→Ａを含み、該位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置１７２と４０３に位置合わせされた元のＥＰＳＰＳアミノ酸配列の位置に対応する。
さらに別の態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｐ→Ｓ及びＶ→Ａを含み、該位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置１７７と４０３に位置合わせされた元のＥＰＳＰＳアミノ酸配列の位置に対応する。
さらに別の態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ→Ａ、Ｐ→Ｓ及び／又はＶ→Ａを含み、該位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置１７２、１７７及び／又は４０３に位置合わせされた元のＥＰＳＰＳアミノ酸配列の位置に対応する。
さらに別の態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｔ→Ｉ、Ｐ→Ｓ及び／又はＶ→Ａを含み、該位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置１７３、１７７及び／又は４０３に位置合わせされた元のＥＰＳＰＳアミノ酸配列の位置に対応する。
さらに別の態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｔ→Ｉ、Ｐ→Ｔ及び／又はＶ→Ａを含み、該位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置１７３、１７７及び／又は４０３に位置合わせされた元のＥＰＳＰＳアミノ酸配列の位置に対応する。
さらに別の態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸突然変異とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
さらに別の態様において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上の類似アミノ酸突然変異とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｓを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、突然変異したＥＰＳＰＳポリペプチドは、突然変異Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本開示は、本開示に記載のポリペプチドをコードするためのポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物をさらに提供し、本開示に記載のポリヌクレオチドを含む又はこのポリヌクレオチドの組換えＤＮＡ構築物を含む植物細胞をさらに提供する。いくつかの実施例では、植物細胞は、イネ細胞である。いくつかの実施形態において、植物は、イネである。
１つの態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｖ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
１つの態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
１つの態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、前記ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳ ＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに前記組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、前記ポリヌクレオチドは、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに前記組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、前記ポリヌクレオチドは、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに前記組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることを含み、前記ポリヌクレオチドは、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸突然変異とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
１つの態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｖ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
１つの態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、及びＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
１つの態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｔ１７３Ｉに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、該ポリヌクレオチドは、Ｔ１７３Ｉに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｔに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を再生可能な植物細胞において発現させることであって、前記ポリヌクレオチドは、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異と、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異と、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸突然変異とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３及び／又はＲ５１４Ｓを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４７Ｄ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
他の実施形態において、該方法は、植物細胞において組換えＤＮＡ構築物を発現させることであって、前記組換えＤＮＡ構築物は、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに該組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
１つの態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｖ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
さらに別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
１つの態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｖ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応し、該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、及びＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異、及びＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｔ１７３Ｉに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｔ１７３Ｉに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｔに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
さらに別の態様において、本明細書は、グリホサート耐性植物を生成する方法を提供し、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、（植物細胞において）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾され、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異と、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異と、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つの類似アミノ酸突然変異とを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応し、且つ該植物細胞からグリホサート耐性植物を成長させる。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３及び／又はＲ５１４Ｓを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４７Ｄ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、修飾された内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含むグリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、当業者に知られている任意の方法によって修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ媒介系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介系、メガヌクレアーゼ媒介系及び／又はオリゴヌクレオチド塩基媒介系を含むが、これらに限定されない。
本明細書は、植物細胞においてガイドＲＮＡを提供するポリヌクレオチド構築物を提供し、前記ガイドＲＮＡは、植物細胞の内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を標的とし、且つポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートをさらに含むことで、Ｖ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸突然変異とを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｖ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、及びＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異、及びＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｔ１７３Ｉに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｔ１７３Ｉに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｔに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｓを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４７Ｄ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド構築物は、１つ以上のポリヌクレオチド修飾テンプレートを含むことで、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする修飾された内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸突然変異位置に対応する。
本明細書は、Ｖ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸突然変異とを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性植物をさらに提供し、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｖ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸突然変異とを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３及び／又はＲ５１４Ｓを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４７Ｄ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性イネ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性イネ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｖ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性亜麻植物をさらに提供し、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性亜麻植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｔを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性亜麻植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性亜麻植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性亜麻植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性亜麻植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性亜麻植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性亜麻植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上の類似アミノ酸突然変異とを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性亜麻植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｖ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性コムギ植物をさらに提供し、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性コムギ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上の類似アミノ酸突然変異とを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性コムギ植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
本明細書は、Ｖ４０３Ａを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性大豆植物をさらに提供し、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性大豆植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示す配列を有する植物ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
本明細書は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上の類似アミノ酸突然変異とを有する内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させるグリホサート耐性大豆植物をさらに提供し、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。グリホサート耐性植物を生産する方法をさらに提供する。該方法は、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する組換えオリゴヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、該突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、イネＥＰＳＰＳタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）におけるアミノ酸位置Ｖ４０３又はＥＰＳＰＳホモログにおける類似アミノ酸残基で突然変異するＥＰＳＰＳタンパク質を発現させ、Ｖ４０３は、Ａに変異することと、対応する野生型植物細胞に比べてグリホサートに対する耐性が向上した植物細胞を選択することと、前記選択された植物細胞から、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は耐性植物を再生することとを含む。
グリホサート耐性植物を生産する方法をさらに提供する。該方法は、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する組換えオリゴヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、該突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、イネＥＰＳＰＳタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）におけるアミノ酸位置Ｇ１７２及びＶ４０３又はＥＰＳＰＳホモログにおける類似アミノ酸残基で突然変異するＥＰＳＰＳタンパク質を発現させ、Ｇ１７２は、Ａに変異し、Ｖ４０３は、Ａに変異することと、対応する野生型植物細胞に比べてグリホサートに対する耐性が向上した植物細胞を選択することと、前記選択された植物細胞から、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は除草剤耐性植物を再生することとを含む。
グリホサート耐性植物を生産する方法をさらに提供する。該方法は、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する組換えオリゴヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、該突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、イネＥＰＳＰＳタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）におけるアミノ酸位置Ｐ１７７及びＶ４０３又はＥＰＳＰＳホモログにおける類似アミノ酸残基で突然変異するＥＰＳＰＳタンパク質を発現させ、Ｐ１７７は、Ｓに変異し、Ｖ４０３は、Ａに変異することと、対応する野生型植物細胞に比べてグリホサートに対する耐性が向上した植物細胞を選択することと、前記選択された植物細胞から、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は除草剤耐性植物を再生することとを含む。
グリホサート耐性植物を生産する方法をさらに提供する。該方法は、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する組換えオリゴヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、該突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、イネＥＰＳＰＳタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）におけるアミノ酸位置Ｇ１７２、Ｐ１７７及び／又はＶ４０３又はＥＰＳＰＳホモログにおける類似アミノ酸残基で突然変異するＥＰＳＰＳタンパク質を発現させ、Ｇ１７２は、Ａに変異し、Ｐ１７７は、Ｓに変異し及び／又はＶ４０３は、Ａに変異することと、対応する野生型植物細胞に比べてグリホサートに対する耐性が向上した植物細胞を選択することと、前記選択された植物細胞から、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は除草剤耐性植物を再生することとを含む。
グリホサート耐性植物を生産する方法をさらに提供する。該方法は、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する組換えオリゴヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、該突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、イネＥＰＳＰＳタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）におけるアミノ酸位置Ｔ１７３、Ｐ１７７及び／又はＶ４０３又はＥＰＳＰＳホモログにおける類似アミノ酸残基で突然変異するＥＰＳＰＳタンパク質を発現させ、Ｔ１７３は、Ｉに変異し、Ｐ１７７は、Ｓに変異し及び／又はＶ４０３は、Ａに変異することと、対応する野生型植物細胞に比べてグリホサートに対する耐性が向上した植物細胞を選択することと、前記選択された植物細胞から、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は除草剤耐性植物を再生することとを含む。
グリホサート耐性植物を生産する方法をさらに提供する。該方法は、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する組換えオリゴヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、該突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、イネＥＰＳＰＳタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）におけるアミノ酸位置Ｔ１７３、Ｐ１７７及び／又はＶ４０３又はＥＰＳＰＳホモログにおける類似アミノ酸残基で突然変異するＥＰＳＰＳタンパク質を発現させ、Ｔ１７３は、Ｉに変異し、Ｐ１７７は、Ｔに変異し及び／又はＶ４０３は、Ａに変異することと、対応する野生型植物細胞に比べてグリホサートに対する耐性が向上した植物細胞を選択することと、前記選択された植物細胞から、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は除草剤耐性植物を再生することとを含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３との間の多重アライメントを示す図である。 Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異体及びその組み合わせ突然変異体を有するイネＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞の、異なるグリホサート濃度の培地における成長を示す図である。 Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ／Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異体及びその組み合わせ突然変異体を有するイネＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞の、異なるグリホサート濃度の培地における成長を示す図である。 Ｖ４０３Ａ突然変異体を有する亜麻又はコムギ又は大豆ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞の、異なるグリホサート濃度の培地における成長状態を示す図である。 Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異体を有する亜麻ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞とＣＰ４ ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞との、異なるグリホサート濃度の培地における成長状態の比較を示す図である。 Ｇ１７２Ａ、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ／Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異体を有する亜麻ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞の、異なるグリホサート濃度の培地における成長状態を示す図である。 １２５ｍｌのグリホサートの除草剤濃度で、イネＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞と複数の突然変異体とのグリホサート抵抗性の比較を示す図である。 構築物ｐＫＥＤ２ベクターを示す図である。 本発明の一実施形態を含むｐｋ５１０ベクターを示す図である。 野生型イネ植物と遺伝子組換えイネ植物との間の比較及びそれらのグリホサート耐性能力を示す図である。
用語の「ＥＰＳＰＳホモログ」又は任意の変異体は、別の植物種で見出されるＥＰＳＰＳ遺伝子又はＥＰＳＰＳ遺伝子生成物を意味し、それは、本明細書に開示されるＥＰＳＰＳ遺伝子と同じ又は実質的に同じ生物学的機能を実行し、且つ下記に記載の核酸配列又はポリペプチド配列（ＥＰＳＰＳ遺伝子生成物）は、「同一である」又は少なくとも５０％類似すると呼ばれる（「パーセント同一性」又は「実質的に同一である」とも呼ばれる）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が下述の通り、最大に一致してアライメントされるときにそれぞれ同じである場合、この２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドは、同じである。文脈における２つ以上の核酸又はポリペプチド配列では、用語の「同一である」又は「パーセント同一性」は、下記アライメントアルゴリズムのうちの１つを用いて、又は手動アライメント及び目視測定によって、比較ウィンドウ上で最大に一致して比較及びアライメントされるときに、同一である、又は同一である特定のパーセントのアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、２つ以上の配列又は部分配列を意味する。配列が保存置換において異なるポリペプチドに対して、配列パーセント同一性は、置換の保存性性質を補正するように上方に調節されてよい。この調節のための方法は、当業者に周知である。通常、これは、完全なミスフィットというよりむしろ部分的ミスフィットとして保存置換をスコア化することにより配列同一性のパーセントを増加させることに関する。従って、例えば、同一であるアミノ酸が１のスコアを付与され、非保存置換がゼロのスコアを付与される場合、保存置換は、ゼロから１の間のスコアを付与される。保存置換のスコア化は、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＡｐｐｌｉｃのアルゴリズムＢｉｏ ｌ． Ｓｃｉ． ４：１１－１７（１９８８）ｅ．ｇ．に従って、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）に実施される。
文脈における２つの核酸又はポリペプチドの、語句の「実質的に同一である」と「パーセント同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、又は手動アライメント及び目視測定によってアライメントを行うと、比較ウィンドウ上で最大に一致してアライメントされるときに、少なくとも５０％、有利には６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％及び最も好ましくは９０％－９５％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する、配列又は部分配列を意味する。該定義は、参照配列と実質的な同一性を有する場合に、実質的な配列又は部分配列相補性を有するテスト配列の相補配列にも言及する。
「作動可能に連結された」は、遺伝要素の並置を指し、要素は、それらが予想されるように作動することを可能にする関係にある。例えば、５’調節配列の機能がコード配列の転写を開始する場合、５’調節配列は、コード配列に作動可能に連結される。
本明細書で使用されるように、「グリホサート抵抗性」細胞又は植物は、通常他の細胞又は植物の成長を死滅させるか又は抑制する特定の濃度のグリホサートの存在下で存生又は成長し続けることができる細胞又は植物を意味する。例えば、成長は、光合成、発根の増加、高さの増加、質量の増加又は新しい葉の発達を含む。一実施形態において、グリホサート抵抗性細胞は、５０ｍｇ／Ｌ以上のグリホサートを含む培地上で増殖し、分裂することができる。好ましくは、グリホサート抵抗性細胞は、１００ｍｇ／Ｌ以上、例えば２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ又は４００ｍｇ／Ｌのグリホサートを含む培地上で増殖し、分裂することができる。より好ましくは、グリホサート抵抗性細胞は、５００ｍｇ／Ｌ以上、例えば６００ｍｇ／Ｌのグリホサートを含む培地上で増殖し、分裂することができる。本発明の目的上、用語の「グリホサート」は、除草に有効な形態の任意のＮ－ホスホノメチルグリシン（その任意の塩を含む）と、植物においてグリホサートアニオンの生成をもたらす他の形式とを含む。
配列表についての説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、野生型イネＥＰＳＰＳタンパク質の全長アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０１５６４３０４６．１）であり、そのＮ－末端は、葉緑体輸送ペプチドを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、本明細書において参照ＥＰＳＰＳ配列として用いられ、且つすべての突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従ってマークされている。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、野生型イネＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に比べて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から葉緑体輸送ペプチドが除去される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｐ１７７Ｓ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ及びＰ１７７Ｓ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及びＲ５１４Ｓ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及びＤ４７２Ｅ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及びＦ５０２Ｖ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及びＴ４６６Ｓ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及びＦ５１２Ｉ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及びＲ５１４Ｋ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６は、Ｌｕｓ１００００７８８（Ｓａｕｅｒ Ｎ Ｊ，Ｎａｒｖａｅｚ－Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｊａｖｉｅｒ，Ｍｏｚｏｒｕｋ Ｊ ，ｅｔ ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１６：１９１７－１９２８．）から翻訳された野生型亜麻ＥＰＳＰＳ２のアミノ酸配列であり、ここで、その葉緑体輸送ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６から除去されている。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７は、亜麻由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８は、亜麻由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｔ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９は、亜麻由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０は、亜麻由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１は、野生型コムギＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＬＫ２７１６３．１として表され、その葉緑体輸送ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１から除去されている。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２は、コムギ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３は、野生型大豆ＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列であり、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＸＰ＿００３５２１８５７．１として表され、その葉緑体輸送ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３から除去されている。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４は、大豆由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｓ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｔ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９は、ＣＰ４（アグロバクテリウム）由来の野生型ＥＰＳＰＳのアミノ酸配列である。
１．構成
Ａ．ＥＰＳＰＳポリペプチド
ＥＰＳＰＳ活性を有する突然変異ポリペプチドを使用する様々な方法及び組成物を提供する。このようなＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｖ４０３Ａ突然変異を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。このようなＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａ突然変異を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。このようなＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
いくつかの実施形態において、ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
いくつかの実施形態において、ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
いくつかの実施形態において、ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓと、Ｖ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸突然変異とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３及び／又はＲ５１４Ｓ突然変を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋ突然変異を含む。他の実施形態において、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。
本明細書に開示されるＥＰＳＰＳポリペプチド突然変異体は、野生型ＥＰＳＰＳポリペプチドに比べて、グリホサートの存在下で改良された触媒能力を有する可能性がある。
本明細書に開示されるように、Ｖ４０３Ａを含むＥＰＳＰＳ突然変異体は、植物のグリホサート抵抗性を向上させるとともに、それ自体の生物学的酵素の触媒活性を依然として維持することができる。ただし、このようなアミノ酸Ｖ４０３のＥＰＳＰＳにおける位置は、他の異なる植物種において異なる可能性がある。類似する位置での類似突然変異Ｖ→Ａも、他の植物のグリホサート抵抗性を向上させることができる。突然変異位置は、２つのステップで決定することができる。第１ステップは、野生型植物ＥＰＳＰＳとイネＥＰＳＰＳ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とをアライメントさせることである。第２ステップは、イネＥＰＳＰＳ配列上の位置４０３に対応する位置を見つけることである。
以前の研究には、Ｇ１７２とＰ１７７もほとんどのＥＰＳＰＳ配列上の２つの保存位置であることがさらに開示されている。ただし、該アミノ酸Ｇ１７２又はＰ１７７のＥＰＳＰＳ配列上の位置は、いくつかの他の種によって変わる可能性がある。類似する位置での類似突然変異Ｇ→Ａ、Ｐ→Ｓ及び／又はＶ→Ａも、いくつかの他の植物のグリホサート抵抗性を改善することができる。突然変異位置は、２つのステップで決定することができる。第１ステップは、野生型植物ＥＰＳＰＳとイネＥＰＳＰＳ配列とをアライメントさせることである。第２ステップは、イネＥＰＳＰＳ配列上の位置１７２、１７７及び／又は４０３に対応する位置を見つけることである。
以前の研究には、Ｔ１７３とＰ１７７もほとんどのＥＰＳＰＳ配列上の２つの保存位置であることがさらに開示されている。ただし、該アミノ酸Ｔ１７３又はＰ１７７のＥＰＳＰＳ配列上の位置は、いくつかの他の種によって変わる可能性がある。類似する位置での類似突然変異Ｔ→Ｉ、Ｐ→Ｓ／Ｔ及び／又はＶ→Ａも、いくつかの他の植物のグリホサート抵抗性を改善することができる。突然変異位置は、２つのステップで決定することができる。第１ステップは、野生型植物ＥＰＳＰＳとイネＥＰＳＰＳ配列とをアライメントさせることである。第２ステップは、イネＥＰＳＰＳ配列上の位置１７３、１７７及び／又は４０３に対応する位置を見つけることである。
ＥＰＳＰＳ活性を有する突然変異ポリペプチドを使用する様々な方法及び組成物を提供する。このようなＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｖ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。このようなＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、及びＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。このようなＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異、及びＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
いくつかの実施形態において、ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異、及びＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
いくつかの実施形態において、ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｔ１７３Ｉに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
いくつかの実施形態において、ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｔ１７３Ｉに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｔに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
他の実施形態において、ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異と、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異と、Ｖ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異と、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つ以上の類似アミノ酸突然変異とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
Ｂ．植物と興味がある他の宿主細胞
さらに、１種又は複数種のＥＰＳＰＳ配列又はその活性変異体又は断片で形質導入（形質転換又はトランスフェクション）された、操作された宿主細胞を提供する。ＥＰＳＰＳポリペプチドは、植物、酵母、真菌、細菌などの非動物細胞を含む任意の生物中で発現させることができる。
本明細書に開示されるＥＰＳＰＳ配列を有する植物、植物細胞、植物部分、種子及び穀物をさらに提供する。具体的な実施形態において、植物及び／又は植物部分は、本明細書に開示される少なくとも１種の異種ＥＰＳＰＳポリペプチド又はその活性変異体又は断片がすでに安定して結合されている。なお、興味がある植物又は生物は、複数のＥＰＳＰＳポリヌクレオチドを含んでもよい。
具体的な実施形態において、植物又は植物部分における異種植物ＥＰＳＰＳポリヌクレオチドは、異種調節要素に作動可能に連結され、異種調節要素は、例えば構成的、組織優先的又は植物における発現のための他のプロモーター又は構成的エンハンサーであるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるように、「植物」という用語には、植物細胞、植物プロトプラスト、植物を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物群落、及び植物又は植物部分における無処置の植物細胞、例えば、胚胎、カフン、胚珠、種子、葉、花、枝、穀粒、種の中身、穂、果柄、殻、茎、根、根端、葯などが含まれる。穀物は、種の栽培又は繁殖以外の目的で商業栽培者によって生産される成熟した種子を意味する。再生植物の子孫、変異体及び突然変異体も、これらの部分が導入されたポリヌクレオチドを含むという条件で、本開示の範囲内に含まれる。
本明細書に開示されるＥＰＳＰＳ配列及びその活性変異体と断片は、単子葉植物及び双子葉植物を含むがこれらに限定されない任意の植物種の形質転換に使用することができる。関連する植物種の例は、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ属植物（ｅ．ｇ．，Ｂ．ｎａｐｕｓ，Ｂ．ｒａｐａ，Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種子油源として用いられるアブラナ属種、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、甘いモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｄｏｃｈｎａ）、アワ（例えば、パールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ）、大麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）、ケンタッキーブルーグラス（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）、ヒロハノウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、ハイコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、亜麻（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、カッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、シトラス木（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、リンゴ木（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）、ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａＬ．）、キュウリ（Ｃ． ｓａｔｉｖｕｓ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａ）、カシューナッツ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンドＰｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、野菜、観賞植物、針葉樹、芝草（寒い季節の草及び熱い季節の草を含む）を含むが、これらに限定されない。
野菜は、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（ｅ．ｇ．，Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ豆（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｓｐｐ．）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｔｉｖｕｓ）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、及びメロン属のメンバー、例えば、マクワウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）及びメロン（Ｃ． ｍｅｌｏ）を含む。観賞植物は、ツツジ（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス属（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａｓｐｐ．）、水仙（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）及び菊を含む。
他の関連植物には、オヒシバ、タルホコムギＡｅｇｌｉｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｌｓｕｂｓｅ．Ｔａｕｓｃｈ、アワＳｅｔａｔｉａ Ｉｔａｌｉｃａ、ソルガム、コムギ、ネズミムギ、水稲野生種亜種、ミナトカモジグサ、ウマノチャヒキ、ボウムギ、コキビ、Ｄｉｃｈａｎｔｈｅｌｉｕｍオリゴサンテス、オオムギ、キビなどのイネ科の種が含まれる。他の関連植物には、ヒメムカシヨモギ、クソニンジン、シロバナムシヨケギクなどのキク科の種が含まれる。他の関連植物には、ギニアアブラヤシ、ナツメヤシなどのヤシ科の種が含まれる。他の関連植物には、ヤクシマラン科の植物、キバナノセッコク、胡蝶蘭などのラン科の植物が含まれる。
他の関連植物には、イチゴ、ロサ・キネンシスなどのバラ科の植物が含まれる。他の関連植物には、関連する種子を提供する穀物植物、油糧種子植物及びマメ科植物が含まれる。関連する種子には、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライ麦などの穀物種子が含まれる。油糧種子植物には、綿、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、シュロ、ココナッツなどが含まれる。マメ科植物には、豆類及びエンドウ豆が含まれ、豆類には、グアー豆、イナゴ豆、フェヌグリーク、大豆、インゲンマメ、ササゲ、緑豆、ライマメ、ソラマメ、レンズ豆、ヒヨコマメなどが含まれる。
他の目的宿主細胞は、真核細胞、プロトプラスト、組織培養細胞、原核細胞及び／又は細菌細胞、例えば大腸菌などであってもよい。
例えば、いくつかの実施形態において、グリホサート耐性イネ植物を提供し、グリホサート耐性イネ植物は、Ｖ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させ、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、各アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異とを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３及び／又はＲ５１４Ｓ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性イネ植物は、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
例えば、いくつかの実施形態において、グリホサート耐性亜麻植物を提供し、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｖ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させ、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異とを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３及び／又はＲ５１４Ｓ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性亜麻植物は、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
例えば、いくつかの実施形態において、グリホサート耐性コムギ植物を提供し、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｖ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させ、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異とを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｓ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、る、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性コムギ植物は、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
例えば、いくつかの実施形態において、グリホサート耐性大豆植物を提供し、グリホサート耐性大豆植物は、Ｖ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させ、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異とを含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができ、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｓ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。なお、グリホサート耐性大豆植物は、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む内因性ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることができる。
Ｃ．他の目的特徴のスタック
一実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチド構築物を有する遺伝子組換え植物に関し、前記ポリヌクレオチド構築物は、以上に記載の突然変異ＥＰＳＰＳに作動可能に連結されたプロモーターを有する。なお、他の除草剤耐性タンパク質を遺伝子組換え植物に挿入することで、複数種除草剤抵抗性植物を生成することができる。
本明細書で使用されるように、用語「スタックされた」は、同じ植物又は生物に複数種の形質が存在することを含む。本明細書で使用される形質とは、特定の配列又は配列群に由来する表現型である。一実施形態において、分子スタックは、同じ及び／又は異なるメカニズムによってグリホサート耐性を付与する少なくとも１つの配列の耐性も付与する少なくとも１種の追加のポリヌクレオチド、及び／又は第２の除草剤耐性を付与する少なくとも１種の追加のポリヌクレオチドを含む。
本明細書に開示されているＥＰＳＰＳ配列によって発生するグリホサート耐性メカニズムは、グリホサート及び１種又は複数種のほかの除草剤に耐性のある宿主細胞、植物、植物外植片及び植物細胞を提供するように、ほかの除草剤抵抗性モードと組み合わせることができる。例えば、ＥＰＳＰＳがグリホサート耐性を付与するメカニズムは本分野の公知のほかのグリホサート耐性モードと組み合わせることができる。他の実施形態において、ＥＰＳＰＳ配列又はその活性変異体又は断片を有する植物又は植物細胞又は植物部分は、例えば、ＡＬＳ阻害剤、ＨＰＰＤ阻害剤、２，４－Ｄ、ほかのフェノキシオーキシン除草剤、アリールオキシフェノキシプロピオン酸草本植物、ジカンバ、グルホシネート系除草剤、プロテアーゼを標的とする除草剤など耐性を付与する１つ又は複数の配列とスタックすることができる。
そのＥＰＳＰＳ配列を有する植物又は植物細胞又は植物部分は、複数種の所望の形質組み合わせを含む植物を製造するように少なくとも１種のほかの形質と組み合わせることもできる。例えば、ＥＰＳＰＳ配列又はその活性変異体又は断片を有する植物又は植物細胞又は植物部分は、殺虫及び／又は殺虫活性を有するポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドとスタックすることができるか、又はそのＥＰＳＰＳ配列を有する植物又は植物細胞又は植物部分は、植物病害抵抗性遺伝子と組み合わせることができる。
これらのスタックされた組み合わせは、任意の方法によって生成されてもよく、任意の通常の方法又は遺伝子形質転換によって植物を育成することを含むが、これらに限定されない。
２．使用方法
Ａ．グリホサート耐性植物を生成する方法
用語「グリホサート耐性」と「グリホサート抵抗性」は本明細書において交換して使用することができる。
Ｉ．導入
様々な方法を使用して目的配列を宿主細胞、植物又は植物部分に導入することができる。本開示の方法は配列を生物又は植物又は植物部分に導入する特定の方法に依存ぜず、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが生物又は植物の少なくとも１つの細胞の内部に入ることにのみ依存する。ポリヌクレオチド又はポリペプチドを植物に含まれる様々な生物に導入する方法は本分野の公知のものであり、安定形質転換法、一過性形質転換法、及びウイルス媒介法を含むが、これらに限定されない。
具体的な実施形態において、複数種の一過性形質転換法を使用してそのＥＰＳＰＳ配列を植物に提供することができる。この一過性形質転換法は、ＥＰＳＰＳタンパク質又はその活性変異体及び断片を植物に直接導入することを含むが、これに限定されない。これらの方法は、例えば、マイクロインジェクション又は粒子衝撃を含む。
他の実施形態において、本明細書に開示されているＥＰＳＰＳポリヌクレオチド又はその活性変異体は、植物がウイルス又はウイルス核酸と接触することによって植物に導入されてもよい。通常、これらの方法は、本発明のヌクレオチド構築物をＤＮＡ又はＲＮＡ分子に組み込むことを含む。
本分野では、ポリヌクレオチドを植物ゲノムの特定位置に標的挿入する方法が知られている。一実施形態において、部位特異的組換えシステムを使用して所望のゲノムの位置へのポリヌクレオチドの挿入を実現する。
形質転換された細胞は通常の方法に従って植物に成長させてもよい。次に、これらの植物は成長するか、又は同じ形質転換株菌株又は異なる菌株で授粉され、且つ得られた子孫が所望の表現型特徴の構成的発現を有するか否かを同定してもよい。所望の表現型特徴の発現を安定的に維持して遺伝することを確保するように、２世代以上成長させ、次に所望の表現型特徴の発現の実現を確保するように種子を収穫するようにしてもよい。このようにして、本発明は、形質転換された種子（遺伝子組換え種子とも言う）を提供し、そのゲノムは本明細書に開示されているポリヌクレオチドを、例えば、発現カセットの一部として安定的に組み込んでいる。
植物形質転換技術（以上検討されたそれらの技術を含む）から派生された形質転換植物細胞は、完全な植物を再生するように培養されてもよく、グリホサート又はグリホサート類似体の形質転換遺伝子型を有する。
当業者は、ＥＰＳＰＳ遺伝子を含む発現カセットを遺伝子組換え植物に組み入れ且つその操作可能であることを確認した後、有性交雑によってそれをほかの植物に導入することができることを認識するであろう。交雑する種に応じて、様々な標準的な育種技術のいずれか１種を使用することができる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することであって、前記ポリヌクレオチドは、Ｖ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに前記組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することであって、前記ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに前記組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することであって、前記ポリヌクレオチドは、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することであって、前記ポリヌクレオチドは、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することであって、前記ポリヌクレオチドは、植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、Ｇ１７２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応することと、ゲノムに組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３及び／又はＲ５１４Ｓ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記方法は、再生可能な植物細胞において発現させる方式により、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み、前記ポリヌクレオチドは、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。
ＩＩ．修飾
通常、宿主ゲノムＤＮＡを修飾又は改変する方法は、当業者に知られているものであり、取得可能である。例えば、宿主植物における既存の又は内因性のＥＰＳＰＳ配列は１つ又は複数の部位特異的エンジニアリングシステムを使用して部位特異性的に修飾又は改変を行う。宿主のＤＮＡ配列、又は調節要素、コード配列及び非コード配列を含む既存の遺伝子組換え配列を改変することを含む。これらの方法はさらにゲノム中の予め設計された標的認識配列に核酸を標的することに用いられる。例えば、本明細書に記載される遺伝的修飾された細胞又は植物は、植物ゲノムを修飾することにより生成されたメガヌクレアーゼなど「カスタム」又はエンジニアリング化されたエンドヌクレアーゼを使用して生成される。もう１つの部位指向性エンジニアリングは、ジンクフィンガードメインを使用して結合制限酵素の制限特性を認識することである。転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ修飾酵素（ＴＡＬＥ又はＴＡＬＥＮ）は植物ゲノムのエンジニアリング改変にも用いられる。
植物ゲノムの部位特異的修飾は、ＣＲＩＳＰＲシステム（クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復配列）を使用して行われてもよい。例えば、研究者は、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して植物ゲノムの特位部位にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムを使用して開示されている突然変異を生成することができる。特定の突然変異は、外来ＤＮＡドナー（ドナー）のガイド下での正確な塩基置換により得られてもよい。この塩基編集ツールは、シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）及び／又はアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）を含むが、これらに限定されない。又は、プライマー編集システムを使用してもよく、ｐｅｇＲＮＡ中のＰＢＳ（プライマー結合部位）配列は、標的編集配列を含む逆転写テンプレート（ＲＴテンプレート）を使用して突然変異をゲノムに導入することで、これらの突然変異を生成する。
植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｖ４０３Ａを含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及び／又はＶ４０３Ａを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１９２Ａと、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａと、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異とを含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する。
植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｖ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異を含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１にリストされる類似アミノ酸位置に対応する。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａに類似するアミノ酸突然変異と、Ｐ１７７Ｓに類似するアミノ酸突然変異及び／又はＶ４０３Ａに類似するアミノ酸突然変異と、（１）Ａ７０Ｖ、（２）Ａ７３Ｔ／Ｖ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、（３）Ｖ１１３Ｍ、（４）Ｄ１１４Ｈ、（５）Ｌ１３４Ｆ、（６）Ｖ１３６Ｍ、（７）Ｅ１３７Ｄ、（８）Ａ１４５Ｇ、（９）Ｋ１６１Ｅ、（１０）Ｅ１６３Ｋ、（１１）Ｍ１７５Ａ、（１２）Ｖ２０８Ａ、（１３）Ｌ２１４Ｆ、（１４）Ａ２１６Ｖ、（１５）Ｙ２５２Ｆ、（１６）Ｌ２５３Ｍ、（１７）Ｍ２５８Ｌ、（１８）Ａ２６０Ｔ、（１９）Ｌ２６４Ｈ、（２０）Ｇ２６５Ｖ、（２１）Ｎ３１６Ｄ、（２２）Ｋ３５６Ｅ、（２３）Ｓ３７４Ｒ、（２４）Ｈ３８９Ｒ、（２５）Ｋ３９９Ｎ、（２６）Ｔ４４２Ｓ、（２７）Ｔ４６６Ｓ、（２８）Ｄ４７２Ｅ、（２９）Ｆ５０２Ｖ、（３０）Ｆ５１２Ｉ及び（３１）Ｒ５１４Ｓ／Ｋから選択される少なくとも１つの類似アミノ酸突然変異を含み、各アミノ酸突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す類似アミノ酸位置に対応する。
植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３及び／又はＲ５１４Ｓ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及び／又はＤ４７２Ｅ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５０２Ｖ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＴ４６６Ｓ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｆ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＦ５１２Ｉ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及び／又はＲ５１４Ｋ突然変異を含む。植物細胞における内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするように修飾されることができ、該タンパク質は、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。
内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ媒介系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介系、メガヌクレアーゼ媒介系、オリゴヌクレオチド塩基媒介系、ＴＡＬＥＮ又は当業者に知られている任意の遺伝子修飾システムによって修飾を行うことができる。また、本明細書の目的のために、内因性植物ＥＰＳＰＳ遺伝子は、例えば、プロモーター、イントロン及びターミネーター配列などのコードＤＮＡ及びコードＤＮＡ内や周囲のゲノムＤＮＡを含む。
実施例
以下の実施例では、これらの実施例は、本発明の実施形態を示すとともに、例を挙げて説明するものにすぎないことを理解すべきである。上記の議論及びこれらの例によれば、当業者は、様々な用途及び条件に適合させるために本発明に様々な変更及び修正を行うことができる。このような修正は、添付の実施例の範囲内に入ることも意図される。
実施例１：イネＥＰＳＰＳと他の植物ＥＰＳＰＳの配列のアライメント
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）全長ＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を基準として、イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と、亜麻ＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）と、コムギＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）と、大豆ＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）とをアライメントした。アライメント結果は、図１に示した。それは、説明された突然変異位置と各植物種における対応位置を示した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に基づいて、すべての開示されている突然変異位置をマークした。
実施例２：各イネＥＰＳＰＳ突然変異体の突然変異位置４０３におけるグリホサート抵抗性テスト
本発明者は、イネＥＰＳＰＳ配列上のＶ４０３がグリホサートに対する感受性において役割を果たしていることを発見した。本発明者は、天然イネＥＰＳＰＳ配列の４０３位置で飽和突然変異誘発を行うことによって、該部位の突然変異がイネＥＰＳＰＳのグリホサートに対する感受性を低下させることができるかどうかを発見した。ＮＮＫ（Ｎは、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンを表し、Ｋは、チミンとチミンヌクレオチドを表す）プライマーを突然変異しようとする位置の縮重コドンとして使用し、イネＥＰＳＰＳポリペプチドの４０３位置でのアミノ酸Ｖを他の１９個のアミノ酸に突然変異した。ＯｓＷｔを発現させる構築物ｐＫＥＤ ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）（図８）をテンプレートとし、Ｖ４０３ Ｆ６１を順方向プライマーとし、Ｖ４０３ Ｒ６１を逆方向プライマーとし、突然変異ＰＣＲ生成物の増幅を行った。Ｖ４０３ Ｆ６１プライマー配列は、ＡＡＴＧＣＣＴＧＡＴＮＮＫＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣであった。Ｖ４０３ Ｒ６１プライマー配列は、ＴＴＧＴＴＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＧであった。
実験ステップ及び結果は、以下のとおりであった。
ａ）ＰＣＲ系：上記表におけるターゲットベクターに対応するプライマーとテンプレートの混合ＰＣＲ系によると、順方向プライマーは、１．２５μｌであり、逆方向プライマーは、１．２５μｌであり、テンプレートプラスミドは、２μｌであり、Ｑ５ ＰＣＲマスターミックスは、１２．５μｌであり、ｄｄＨ２Ｏは、１８μｌであった。
ｂ）ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった。
ｃ）上記ＰＣＲ生成物を５μｌ取り出し、アガロースゲル電気泳動の緩衝液に加えた。大きさが約４．５ｋｂのＰＣＲ生成物を得ると、増幅は、成功した。
ｄ）ＮＥＢ社のＫＬＤ酵素混合物を使用してＰＣＲ生成物におけるテンプレートを除去し、次に生成物をライゲーションした。ライゲーション系は、ＫＬＤ緩衝液５μｌ、ＫＬＤ混合液１μｌ、ＰＣＲ生成物１μｌ、ｄｄＨ２Ｏ ３μｌであった。室温で５分ライゲーションした後、ＰＣＲ生成物を大腸菌に形質転換した。
e）ライゲーション生成物をＥＰＳＰＳ欠損コンピテント大腸菌Ｄｈ５αに形質転換し、公知のＲｅｄ相同組換え方法によってＥＰＳＰＳ欠損大腸菌菌株を構築した。（Ｇｕａｎｇｘｉｎｇ Ｂａｉ，Ｚｈｉｗｅｉ Ｓｕｎ，Ｙｉｎｇ Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ． Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ＣｌｐＰ ｇｅｎｅ ｕｓｉｎｇ Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１）：４５－４８．）。大腸菌形質転換方法と検出方法は、いずれも、本分野における従来の周知方法である。蘇生後、細胞をＭ９培地で２回洗浄し、次に洗浄した細胞を０．２ｍＭのグリホサートを含むＭ９培地に広げて４８時間培養した。各成長した単一コロニーを配列決定し（配列決定及びその分析は、Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄにより行われる）、Ｖ４０３Ａ突然変異体のみが０．２ｍＭのグリホサートに対して抵抗性があることを発見した。
実施例３：イネＥＰＳＰＳ突然変異体におけるグリホサート抵抗性の比較。
実施例２は、イネＥＰＳＰＳ上の突然変異Ｖ４０３ＡがイネＥＰＳＰＳのグリホサートに対する感受性に影響を及ぼす可能性があることを示した。本発明者は、他の位置での任意の突然変異も突然変異イネＥＰＳＰＳのグリホサートに対する感受性を向上できるかどうかをテストするために、この実験を設計した。
詳細な実験ステップとテスト結果は、以下のとおりであった。
具体的な実験ステップは、以下のとおりであった。
ｉ：必要なイネＥＰＳＰＳ突然変異体の取得及び保存
ａ）ＰＣＲ系：上記表におけるターゲットベクターに対応するプライマーとテンプレートの混合ＰＣＲ系によると、順方向プライマーは、１．２５μｌであり、逆方向プライマーは、１．２５μｌであり、テンプレートプラスミドは、２μｌであり、Ｑ５ ＰＣＲマスターミックスは、１２．５μｌであり、ｄｄＨ２Ｏは、１８μｌであった。
ｂ）ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった。上記表におけるターゲットベクターに対応するアニール温度に基づいて、アニール温度を設定した。
＊上記表に従ってアニール温度を設定した。
ｃ）得られたＰＣＲ生成物５μｌを取り出し、アガロースゲル電気泳動のアプライ緩衝液に加えた。大きさが約４．５ｋｂのバンドは、成功したと見なされた。
ｄ）ＮＥＢのＫＬＤ酵素混合物を使用してテンプレートを除去し且つＰＣＲ生成物をライゲーションした。ライゲーション系は、５μｌのＫＬＤ緩衝液、１μｌのＫＬＤ混合液、１μｌのＰＣＲ生成物及び３μｌのｄｄＨ２Ｏであり、室温で５分ライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。
ｅ）ライゲーション生成物をＥＰＳＰＳ欠損のＤｈ５αコンピテント大腸菌に形質転換した。蘇生後、細胞をＭ９培地で２回洗浄し、次に洗浄した細胞をＭ９培地に広げて４８時間培養した。成長した単一コロニーを配列決定し（Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、正しい突然変異体を選択して保存して使用に備えた。
以下の突然変異体を選択してテストした。
ＯｓＷｔは、野生型イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を表している。ＯｓＶＡは、突然変異Ｖ４０３Ａを有する突然変異イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を表している。ＯｓＧＡは、突然変異を有するＧ１７２Ａの突然変異イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を表している。ＯｓＰＳは、突然変異Ｐ１７７Ｓを有する突然変異イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を表している。ＯｓＧＡＰＳは、突然変異Ｇ１７２Ａ及びＰ１７７Ｓを有する突然変異イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を表している。ＯｓＧＡＶＡは、突然変異Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａを有する突然変異イネＥＰＳ ＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を表している。ＯｓＰＳＶＡは、突然変異Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを有する突然変異イネＥＰＳ ＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を表している。ＯｓＧＰＶは、突然変異Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを有する突然変異イネＥＰＳ ＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を表している。ＯｓＴＩＰＳは、突然変異Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｓを有する突然変異イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）を表している。ＯｓＴＩＰＴは、突然変異Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｔを有する突然変異イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）を表している。ＯｓＴＩＰＳＶＡは、突然変異Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを有する突然変異イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）を表している。ＯｓＴＩＰＴＶＡは、突然変異Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及びＶ４０３Ａを有する突然変異イネＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を表している。ｃｐ４は、アグロバクテリウム由来の野生型ＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）を表している。
ｉｉ：イネＥＰＳＰＳ突然変異体のグリホサート抵抗性比較
上記ステップにおいて得られた各生成物をＥＰＳＰＳ欠損の大腸菌に形質転換した。形質転換した大腸菌の、異なるグリホサート濃度（０ｍＭ、０．５ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、２５ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ）のＭ９培地上での成長状況を検出することで、イネＥＰＳＰＳ突然変異体のグリホサート抵抗性を検証し、ここで、１ｍＭのグリホサートは、１６９ｍｇ／ｍＬのグリホサート酸に相当した。結果は、図２に示した。
０ｍＭのグリホサートを含む培地上で、ＯｓＧＡＰＳを含むＥＰＳＰＳ欠損の大腸菌が成長できないことを除いて、すべての他の遺伝子を発現させる菌株は、いずれも正常に成長することができた。この結果によれば、ＯｓＧＡＰＳ突然変異体を除くすべての他のイネＥＰＳＰＳ突然変異体がいずれも大腸菌において発現でき、大腸菌における元のＥＰＳＰＳの機能を補償することが示された。
ＯｓＧＡ、ＯｓＰＳ及びＯｓＶＡ ＥＰＳＰＳ突然変異体は、０．５ｍＭのグリホサート培地上で成長できるが、ＯｓＷｔは、成長できず、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ又はＶ４０３Ａ単一突然変異がイネＥＰＳＰＳ突然変異体のグリホサート抵抗性を向上できることが示された。ここで、Ｖ４０３Ａは、新たに発見された、ＥＰＳＰＳのグリホサートに対する耐性を向上できる突然変異であった。
図２は、ＯｓＧＡＶＡが７５ｍＭのグリホサート培地又は７５ｍＭよりも小さいグリホサートを含む任意の培地上で成長でき、ＯｓＰＳＶＡが４ｍＭのグリホサート培地又は４ｍＭよりも小さいグリホサートを含む任意の培地上で成長できることを示した。Ｖ４０３Ａ突然変異とＧ１７２Ａ又はＰ１７７Ｓ突然変異との組み合わせによって、イネＥＰＳＰＳ突然変異体のグリホサート抵抗性を向上させることができた。
図２は、ＯｓＧＰＶが１００ｍＭのグリホサート培地上で成長できるとともに、グリホサート抵抗性がＣＰ４由来のＥＰＳＰＳグリホサート抵抗性に匹敵することをさらに示した。Ｖ４０３Ａのさらなる突然変異は、ＯｓＧＡＶＡ又はＯｓＧＡＰＳのグリホサート抵抗性を向上させることができた。
図３は、ＯｓＴＩＰＴＶＡが１００ｍＭのグリホサート培地上で成長でき、ＯｓＴＩＰＴＶＡが７５ｍＭのグリホサート培地上で成長できることをさらに示した。Ｖ４０３Ａのさらなる突然変異は、ＯｓＴＩＰＳ又はＯｓＴＩＰＴのグリホサート抵抗性を向上させることができた。
実施例４：亜麻ＥＰＳＰＳ突然変異体のグリホサート抵抗性
ｉ：亜麻ＥＰＳＰＳ突然変異体の取得
亜麻（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）ＥＰＳＰＳ突然変異体配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を合成し、ｐＫＥＤ２ベクターにクローンしてベクターＬｕＶＡを得た。ＰＣＲによってＡ４０３Ｖ突然変異を導入した後、ベクターＬｕＷｔを構築した。
具体的な実験ステップは、以下のとおりであった。
ａ）ＰＣＲ系：上記表におけるターゲットベクターに対応するプライマーとテンプレートの混合ＰＣＲ系によると、順方向プライマーは、１．２５μｌであり、逆方向プライマーは、１．２５μｌであり、テンプレートプラスミドは、２μｌであり、Ｑ５ ＰＣＲマスターミックスは、１２．５μｌであり、ｄｄＨ２Ｏは、１８μｌであった。
ｂ）ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった。上記表におけるターゲットベクターに対応するアニール温度をアニール温度として設定した。
ｃ）得られたＰＣＲ生成物を５μｌ取り出し、アガロースゲル電気泳動のアプライ緩衝液に加えた。大きさが約４．５ｋｂのバンドは、成功したと見なされた。
ｄ）ＮＥＢのＫＬＤ酵素混合物を使用してテンプレートを除去し、次にＰＣＲ生成物をライゲーションした。ライゲーション系は、５μｌのＫＬＤ緩衝液、１μｌのＫＬＤ混合物、１μｌのＰＣＲ生成物及び３μｌのｄｄＨ２Ｏであった。室温で５分ライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。
ｅ）ライゲーション生成物をＥＰＳＰＳ欠損のＤｈ５αコンピテント大腸菌に形質転換した。蘇生後、細胞をＭ９培地で２回洗浄し、次に洗浄後の細胞をＭ９培地に広げて４８ｈ培養した。成長した単一コロニー（Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を配列決定し、正しい突然変異体を選択して保存して使用に備えた。
ｉｉ：亜麻ＥＰＳＰＳ突然変異体の抵抗性試験及び野生型との比較
抵抗性結果は、図４に示した。ＬｕＷｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）は、野生型亜麻ＥＰＳＰＳ遺伝子を表し、ＬｕＶＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）は、亜麻ＥＰＳＰＳのＶ４０３Ａ単一点突然変異体を表した。
１ｍＭと２ｍＭのグリホサートの存在下で、ＬｕＶＡの成長状況は、ＬｕＷｔよりも著しく良好であり、Ｖ４０３Ａ突然変異が亜麻ＥＰＳＰＳのグリホサート抵抗性を向上できることが示された。
実施例５：大豆ＥＰＳＰＳ突然変異体のグリホサート抵抗性
ｉ：必要な大豆ＥＰＳＰＳ突然変異体の取得
大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＥＰＳＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）の野生型配列情報に基づいて、該遺伝子を合成してベクターｐＫＥＤ２に挿入することでベクターＧｍＷｔを得た。ＰＣＲによってＧｍＷｔのＶ４０３部位をＡに突然変異し、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む大豆ＥＰＳＰＳ突然変異タンパク質を発現させるベクターＧｍＶＡを得た。具体的な実験ステップは、以下のとおりであった。
ａ）ＰＣＲ系：上記表におけるターゲットベクターに対応するプライマーとテンプレートの混合ＰＣＲ系によると、順方向プライマーは、１．２５μｌであり、逆方向プライマーは、１．２５μｌであり、テンプレートプラスミドは、２μｌであり、Ｑ５ ＰＣＲマスターミックスは、１２．５μｌであり、ｄｄＨ２Ｏは、１８μｌであった。
ｂ）ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった。上記表におけるターゲットベクターに対応するアニール温度をアニール温度として設定した。
ｃ）ＰＣＲ生成物を５μｌ取り出し取得し、アガロースゲル電気泳動のアプライ緩衝液に加えた。大きさが約４．５ｋｂのバンドは、成功したと見なされた。
ｄ）ＮＥＢのＫＬＤ酵素混合物を使用してテンプレートを除去し且つＰＣＲ生成物をライゲーションした。ライゲーション系は、５μｌのＫＬＤ緩衝液、１μｌのＫＬＤ混合物、１μｌのＰＣＲ生成物及び３μｌのｄｄＨ２Ｏであった。室温で５分ライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。
ｅ）ライゲーション生成物をＥＰＳＰＳ欠損のＤｈ５αコンピテント大腸菌に形質転換した。蘇生後、細胞をＭ９培地で２回洗浄し、次に洗浄後の細胞をＭ９培地に広げて４８ｈ培養した。成長した単一コロニー（Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を配列決定し、正しい突然変異体を選択して保存して使用に備えた。
ｉｉ：大豆ＥＰＳＰＳ突然変異体の抵抗性試験及び野生型との比較
抵抗性結果は、図４に示した。ＧｍＷｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）は、野生型大豆ＥＰＳＰＳ遺伝子を表し、ＧｍＶＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）は、大豆ＥＰＳＰＳのＶ４０３Ａ単一点突然変異体を表した。
０．５ｍＭのグリホサートの圧力で、ＧｍＶＡの成長状態は、ＧｍＷｔよりも著しく良好であり、Ｖ４０３Ａ突然変異が大豆ＥＰＳＰＳのグリホサート抵抗性を向上できることが示された。
実施例６：コムギＥＰＳＰＳ突然変異体のグリホサート抵抗性
ｉ：コムギＥＰＳＰＳ突然変異体を取得する実験ステップ
コムギＡゲノムの第７染色体上のＥＰＳＰＳ遺伝子のＶ４０３Ａ突然変異配列情報（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）に基づいて該遺伝子を合成して、ベクターｐＫＥＤ２に挿入することで、Ｖ４０３Ａ突然変異を含むコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）ＥＰＳＰＳ突然変異発現ベクターＴａＶＡを得た。ＰＣＲによってＴａＶＡのＡ４０３部位をＶに突然変異し、コムギＡゲノムの第７染色体上でＥＰＳＰＳ野生型遺伝子を発現させるＴａＷｔベクターを得た。
具体的な実験ステップは、以下のとおりであった。
ａ）ＰＣＲ系：上記表におけるターゲットベクターに対応するプライマーとテンプレートの混合ＰＣＲ系によると、順方向プライマーは、１．２５μｌであり、逆方向プライマーは、１．２μｌであり、テンプレートプラスミドは、２μｌであり、Ｑ５－ＰＣＲマスターミックスは、１２．５μｌであり、ｄｄＨ２Ｏは、１８μｌであった。
ｂ）ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった。上記表におけるターゲットベクターに対応するアニール温度をアニール温度として設定した。
ｃ）得られたＰＣＲ生成物を５μｌ取り出し、アガロースゲル電気泳動のアプライ緩衝液に加えた。大きさが約４．５ｋｂのバンドは、成功したと見なされた。
ｄ）ＮＥＢのＫＬＤ酵素混合物を使用してテンプレートを除去し且つＰＣＲ生成物をライゲーションした。ライゲーション系は、５μｌのＫＬＤ緩衝液、１μｌのＫＬＤ混合液、１μｌのＰＣＲ生成物及び３μｌのｄｄＨ２Ｏであった。室温で５分ライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。
ｅ）ライゲーション生成物をＥＰＳＰＳ欠損のＤｈ５αコンピテント大腸菌に形質転換した。蘇生後、細胞をＭ９培地で２回洗浄し、次に洗浄後の細胞をＭ９培地に広げて４８ｈ培養した。成長した単一コロニー（Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を配列決定し、正しい突然変異体を選択して保存して使用に備えた。
ｉｉ：コムギＥＰＳＰＳ突然変異体の抵抗性測定及びその野生型との比較
抵抗性結果は、図４に示した。ＴａＷｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）は、コムギＡゲノムの第７染色体上の野生型ＥＰＳＰＳ遺伝子を表し、ＴａＶＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）は、コムギＥＰＳＰＳのＶ４０３Ａ単一点突然変異体を表した。
０．２ｍＭのグリホサートの圧力で、ＴａＶＡの成長状態は、ＴａＷｔよりも著しく良好であり、Ｖ４０３Ａ突然変異がコムギＥＰＳＰＳのグリホサート抵抗性を向上できることが示された。
実施例７：亜麻ＥＰＳＰＳ突然変異体ＬｕＧＰＶ、ＬｕＴＩＰＴ、ＬｕＴＩＰＴＶＡの抵抗性同定
ＰＣＲによってＬｕＶＡのＧ１７２位置とＰ１７７位置をＡ及びＳに同時に突然変異し、３点突然変異のＬｕＧＰＶを得た。
ＰＣＲによってＬｕＷＴのＴ１７３とＰ１７７位置をＩとＴに同時に突然変異し、３点突然変異体ＬｕＴＩＰＴを得た。
ＰＣＲによってＬｕＶＡのＴ１７３とＰ１７７位置をＩとＴに同時に突然変異し、３点突然変異体ＬｕＴＩＰＴＶＡを得た。
具体的な実験ステップは、以下のとおりであった。
ａ）ＰＣＲ系：上記表におけるターゲットベクターに対応するプライマーとテンプレートの混合ＰＣＲ系によると、順方向プライマーは、１．２５μｌであり、逆方向プライマーは、１．２５μｌであり、テンプレートプラスミドは、２μｌであり、Ｑ５ ＰＣＲマスターミックスは、１２．５μｌであり、ｄｄＨ２Ｏは、１８μｌであった。

ｂ）ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった。上記表におけるターゲットベクターに対応するアニール温度をアニール温度として設定した。
ｃ）得られたＰＣＲ生成物を５μｌ取り出し、アガロースゲル電気泳動のアプライ緩衝液に加えた。大きさが約４．５ｋｂのバンドは、成功したと見なされた。
ｄ）ＮＥＢのＫＬＤ酵素混合物を使用してテンプレートを除去し且つＰＣＲ生成物をライゲーションした。ライゲーション系は、５μｌのＫＬＤ緩衝液、１μｌのＫＬＤ混合液、１μｌのＰＣＲ生成物及び３μｌのｄｄＨ２Ｏであり、室温で分ライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。
ｅ）ライゲーション生成物をＥＰＳＰＳ欠損のＤｈ５αコンピテント大腸菌に形質転換した。蘇生後、細胞をＭ９培地で２回洗浄し、次に洗浄後の細胞をＭ９培地に広げて４８ｈ培養した。成長した単一コロニー（Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を配列決定し、正しい突然変異体を選択して保存して使用に備えた。
ｉｉ：亜麻ＥＰＳＰＳ突然変異体の抵抗性テスト及び野生型との比較
抵抗性結果は、図５に示した。ＬｕＷｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）は、亜麻ＥＰＳＰＳ２遺伝子を表し、ＬｕＧＰＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）は、亜麻Ｇ１７２Ａ＋Ｐ１７７Ｓ＋Ｖ４０３Ａ ３点突然変異体を表した。抵抗性結果は、図６に示した。ＬｕＴＩＰＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）は、亜麻Ｔ１７３Ｉ＋Ｐ１７７Ｓ ２点突然変異体であり、ＬｕＴＩＰＴＶＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）は、亜麻Ｔ１７３Ｉ＋Ｐ１７７Ｔ＋Ｖ４０３Ａ ３点突然変異体であった。
結果によれば、亜麻ＧＰＶ突然変異体が比較的強いグリホサート抵抗性を有することが示された。１００ｍＭのグリホサートの圧力でのコロニー飽和率から見ると、ＬｕＧＰＶの抵抗性は、ＣＰ４よりも高く、ＬｕＴＩＰＴＶＡの抵抗性は、ＬｕＴＩＰＴよりも高く、Ｖ４０３Ａも亜麻ＥＰＳＰＳ遺伝子における突然変異体の抵抗性レベルを著しく向上させることができることが示された。
実施例７：他のイネ突然変異体の抵抗性試験
イネのグリホサート抵抗性をさらに向上させ、商業生産要件を満たす高抵抗性イネＥＰＳＰＳ突然変異体を育成するために、ＯｓＧＰＶをテンプレートとしてランダム突然変異を行い、高濃度グリホサートスクリーニングを行い、グリホサート抵抗性を高めることができるＥＰＳＰＳ突然変異体を同定した。
ｉ．イネ突然変異体の取得
１）エラープローンＰＣＲ
ＯｓＧＰＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）をテンプレートとしてエラープローンＰＣＲを行った（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム突然変異キット、＃２００５５０， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを使用した）。
反応条件は、以下のとおりであった。
プライマー配列は、以下のとおりであった。
ＥＰ ＯｓＦ：ｔｇｔｇａａｔｔｃａｔｇｇｃｇｇｃｇａａｇｇｃｇｇａｇｇａｇａｔｃ
ＥＰ ＯｓＲ：ｇａｔｃｃｔｇｃａｇｇｔｃａｇｔｔｃｃｔｇａｃｇａａａｇｔｇｃ
ＰＣＲ反応ステップは、以下のとおりであった。
２）得られたＰＣＲ生成物の回収と精製
３）回収した生成物とベクター骨格の消化
ａ）回収した生成物をＥｃｏＲＩとＳｂｆＩで消化し、次にＴ４ ＤＮＡリガーゼで同じ二重消化を行った後にｐＫＥＤ２ベクターにライゲーションしてライゲーション生成物を得ることにより、によりイネＥＰＳＰＳ遺伝子突然変異体を有するベクターを得た。
ｂ）上記ベクターをＥＰＳＰＳ遺伝子をノックアウトした大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。形質転換ステップは、以下のとおりであった。上記ライゲーション生成物をＥＰＳＰＳ遺伝子をノックアウトした大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに５０μｌ加え、均一に混合し、氷上で３０分間インキュベートし、次に４２℃で９０秒ヒートショックした後、取り出してすぐに氷に置いて２分氷浴した。氷浴後、５００μｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１８０ｒ／分で４５分蘇生した。形質転換した大腸菌は、ＯｓＧＰＶをテンプレートとして得られた、イネＥＰＳＰＳ突然変異遺伝子を発現させる突然変異ライブラリーであった。
４）抵抗性スクリーニング
以上に得られた形質転換生成物を３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を捨て、次に１ｍｌのＭ９液体培地に再懸濁し、２００μｌのＭ９液体培地を加えて再懸濁し、７５ｍＭのグリホサートを含むＭ９プレートに接種した。３７度で２４時間インキュベートした。
５）上記スクリーニングプレートに成長した単一コロニーを選択して保存し、さらなる抵抗性同定と配列決定を行った。
ｉｉ．イネ突然変異体の抵抗性テスト。本実施例では、本研究において得られた野生型イネＥＰＳＰＳ遺伝子ＯｓＷＴ、最も広く使用されている市販のグリホサート耐性遺伝子ＣＰ４ＥＰＳＰＳ、市販のグリホサート耐性トウモロコシＧＡ２１と同じ突然変異タイプを有するイネ突然変異体ＯｓＴＩＰＳ、及び高いグリホサート耐性のイネＥＰＳＰＳ突然変異遺伝子を有するイネ突然変異体ＯｓＧＰＶを対照として形質転換し、新たに得られたイネＥＰＳＰＳ突然変異体を実験群として形質転換し、対照と突然変異体のグリホサート抵抗性とを比較した。対照群と実験群のモノクローナル細菌をそれぞれ０、１００ｍＭと１２５ｍＭのグリホサートを含む培地に接種し、各群のコロニーの成長状況を観察した。
サンプルの順序（左から右へ）：
第１行：１－８，１－１３，１－１９，１－２４，１－２７，１－３７，１－３８
第２行：１－４２，１－６８，１－８８，１－９３，１－９８，１－１２５，１－１３９
第３行：１－１９３，１－１５０，１－２１７，１－２４６，１－２５０，１－２６５，１－３８６
第４行：１－４１１，１－５４７，１－５５２，１－５９９，１－６１４，１－６３１，１－１３０
第５行：２－５，２－４３，２－４５，２－４６，２－４７，２－６３，２－１２１
第６行：２－１１４，２－１３３，３－８，３－２５，３－２７，３－３０，３－３２
第７行：３－３３，ＯｓＴＩＰＳ，３－３６，ＣＰ４，Ｏｓ Ｗｔ，Ｏｓ ＧＰＶ
上記結果において、１００ｍＭのグリホサートの圧力で、３－３２とＯｓＴＩＰＳが成長していないことを除いて、他のすべての実験サンプルと対照サンプルは、いずれもグリホサートに耐える／抵抗することができるが、コロニー成長状態は一致しなかった。１２５ｍＭのグリホサートの圧力でのコロニー成長状態に基づいて、１６個の突然変異体（１－６８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、１－９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、１－１３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、１－２４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、１－３８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、１－４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、１－５４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、１－５５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、１－５９９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、２－５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２－４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、２－４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、３－３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、３－３６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）のコロニー成長状態は、ＯｓＧＰＶよりも著しく良好であり、いくつかの突然変異体の抵抗性は、ＣＰ４よりも著しく高く、抵抗性の向上を示した。他の１６個の突然変異体のコロニー成長状況は、ＯｓＧＰＶよりも低い抵抗性を示した。図７では、他の１２個の突然変異体のＯｓＧＰＶに対する抵抗性には有意な差はなかった。
実施例８：遺伝子組換えイネのグリホサート除草剤に対する抵抗性
本実施例で使用されるイネ種子は、公開された、取得できるＲＩＣＥ ＫＥＮＧ ＸＩＡＮＧ ＤＡＯ０８－１６９であった。
１．発現ベクターの取得。
通常の方法に基づいて、ＯｓＧＰＶ突然変異体（Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを含む）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）をコードする核酸配列を植物発現ベクターに挿入することで、ＯｓＧＰＶ遺伝子を発現させるｐｋ５１０ベクターを得た（図９を参照）。
２．イネカルスの遺伝子組換え実験。
１）遺伝子組換えベクターｐｋ５１０をアグロバクテリウムＥＨＡ１０５に導入して組換えアグロバクテリウムを得た。
２）形質転換実験の１～５日前に、組換えアグロバクテリウムを５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと１５ｍｇ／Ｌのリファンピシンを含むＹＥＢ固体培地に接種した。３Ｍのテープで培地を培養皿に密封し、培養皿を逆さまにして２８℃の温度、暗所で１－５日培養した。
３）接種リングで細菌のＺ字形尾部を接種リングで掻き取り、２ｍｇ／Ｌの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸を含む１００μｍのＮＢ液体培地に軽く懸濁させ、菌液濃度を約Ｏ．Ｄ．６００＝０．１にし、次に調製されたアグロバクテリウム感染溶液を保存した。
４）イネ種皮を除去した後、イネ種子を三角フラスコに入れ、無菌水で３回洗浄した。７５％のエタノールを加えて種子を浸し、１分軽く振とうし、エタノールを捨てた。次に、２．５％の塩酸ナトリウム水溶液を加え、１５０－１７０ｒｐｍで該溶液を２５分振とうした。次に、無菌水を加え、５－８回軽く振とうし、次に水を注ぎ出した。種子をカルス誘導培地に接種し、３０℃、暗所で４－６週間培養し、イネカルスを得た。
５）ステップ４において得られたイネカルスをアグロバクテリウム感染溶液に１０分浸し、次に滅菌濾紙を２枚敷いた共培地に置き、２２℃、暗所で３日培養した。
６）ステップ５において得られたイネカルスを蘇生培地に置き、３０℃で４－７日培養した。
７）ステップ６において得られたイネカルスをハイグロマイシン選択培地に置き、３０℃で２週間培養した。
８）ステップ７において得られたイネカルスをハイグロマイシン選択培地に置き、３０℃で２週間培養した。
９）旺盛に成長したカルスを分化培地成分に移し、３０℃で２０－３０日培養した。植物は、黄色や緑色のカルスから生成された。
１０）高さが３ｃｍよりも大きい緑色の健康な再生苗を選択し、発根培地に移し、７－１４日培養し、イネＴ０苗を得た。
培地成分は、以下のとおりであった。
共培地成分：２ｍｇ／Ｌの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸を含むＮＢ固体培地
蘇生培地成分：２００ｍｇ／Ｌのチメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）を含むＮＢ固体培地
ハイグロマイシン選択培地成分：３０－５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含むＮＢ固体培地
分化培地成分：０．５ｇ／Ｌのグルタミン、０．５ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのカナマイシンと０．２ｍｇ／Ｌのα－ナフタリン酢酸を含むＮＢ固体培地
発根培地成分：０．５ｇ／Ｌのグルタミン、０．５ｇ／Ｌのプロリン、０．２ｍｇ／Ｌのα－ナフタリン酢酸を含むＭＳ固体培地。
遺伝子組換えイネＴ０苗を収穫まで人工気象室で培養し、グリホサート抵抗性テストのためにＴ１世代イネ種子を得た。
２．Ｔ１世代遺伝子組換えイネのグリホサート抵抗性の同定
遺伝子組換えイネＴ０苗を収穫まで人工気象室で培養し、グリホサート抵抗性テストのためにＴ１世代イネ種子を得た。
１）紫外線で遺伝子組換え陽性のＴ１世代種子を選択した。植物発現ベクターは、ＯｓＧＰＶと赤色蛍光タンパク質を発現できるＤｓＲｅｄ遺伝子を直列に発現することで構築されるため、紫外線に曝すことでＴ１世代種子を分化させることができた。赤色光の種子は、ＤｓＲｅｄとＯｓＧＰＶベクターの両方を含む種子であった。
２）発芽促進：非遺伝子組換え対照種子とＯｓＧＰＶ遺伝子を含むＴ１遺伝子組換え種子のそれぞれから種子２０個を採取し、浄水に４時間浸すことで、種子を完全に吸水させた。次に種子を底部に２層の濾紙がある培養皿に移し、湿った状態に保つために少量の浄水を加えた。水の量は、種子をいっぱいにしてはならなかった。
３）上記方法に従って２日培養した後、種子を底部に２層の濾紙がある培養皿（直径９ｃｍ）に移し、１００ｐｐｍのグリホサート水溶液を５ｍｌ加え（ラウンドアップ（Ｒｏｕｎｄ ｕｐ）し、４１％のイソプロピルアミン塩溶液を加えて１００００倍希釈し）て１０日培養した。
４）１０個のイネ苗をランダムに選んで写真を撮り、図１０に示した。
図１０は、対照である野生型イネの１００ｐｐｍのグリホサート溶液における成長が著しく抑制され、根の長さも著しく抑制されることを示した。その後の観察では、野生型は、すべて死んで根が腐っていた。ＯｓＧＰＶ突然変異体を含む遺伝子組換えイネは、グリホサート除草剤による大きな影響を受けず、成長を続け、ＯｓＧＰＶ突然変異体を含むイネ株がグリホサートに対して耐性／抵抗性があることが示された。
図１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３との間の多重アライメントを示す。
図２は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異体及びその組み合わせ突然変異体を有するイネＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞の、異なるグリホサート濃度の培地における成長を示す。
図３は、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ／Ｔ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異体及びその組み合わせ突然変異体を有するイネＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞の、異なるグリホサート濃度の培地における成長を示す。
図４は、Ｖ４０３Ａ突然変異体を有する亜麻又はコムギ又は大豆ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞の、異なるグリホサート濃度の培地における成長状態を示す。
図５は、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異体を有する亜麻ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞とＣＰ４ ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞との、異なるグリホサート濃度の培地における成長状態の比較を示す。
図６は、Ｇ１７２Ａ、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ／Ｓ及び／又はＶ４０３Ａ突然変異体を有する亜麻ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞の、異なるグリホサート濃度の培地における成長状態を示す。
図７は、１２５ｍｌのグリホサートの除草剤濃度で、イネＥＰＳＰＳタンパク質を発現させる大腸菌細胞と複数の突然変異体とのグリホサート抵抗性の比較を示す。
図８は、構築物ｐＫＥＤ２ベクターを示す。
図９は、本発明の一実施形態を含むｐｋ５１０ベクターを示す。
図１０は、野生型イネ植物と遺伝子組換えイネ植物との間の比較及びそれらのグリホサート耐性能力を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、野生型イネＥＰＳＰＳタンパク質の全長アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０１５６４３０４６．１）であり、そのＮ－末端は、葉緑体輸送ペプチドを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、本明細書において参照ＥＰＳＰＳ配列として用いられ、且つすべての突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従ってマークされている。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、野生型イネＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に比べて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から葉緑体輸送ペプチドが除去されている。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ又はＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｐ１７７Ｓ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ及びＰ１７７Ｓ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及びＲ５１４Ｓ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及びＤ４７２Ｅ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及びＦ５０２Ｖ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ｍａａｋａｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｙｖｄｎｌｌｉｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｌｓｖｅａｄｋｖａｋｒａｗｗｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｋｅｅｖｑｌｆｌｇｎａａｔａｍｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｗｖｇｌｋｑｌｇａｄｖｄｃｆｉｌｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｆｌｓａｌｌｍａａｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔｉｒｌｍｅｒｆｇｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｈｌｋａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｌｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｉｔｐｐｅｋＩｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｆｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ｍａａｋａｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｙｖｄｎｌｌｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｌｓｖｄａｄｋｖａｋｒａｖｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｋｅｅｖｑｌｆｌｇｎａａｔａｍｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｖｖｇｌｋｑｌｇａｄｖｄｃｆｌｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｍｓａｌｌｍａａｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔｉｒｌｍｅｒｆｇｙｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｈｌｋａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｌｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｔｐｐｅｋＩｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｆｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及びＴ４６６Ｓ突然変異を含む。
ｍａａｋａｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｙｖｄｎｌｌｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｌｓｖｅａｄｋｖａｋｒａｗｗｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｋｅｅｖｑｌｆｌｇｎａａｔａｍｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｗｖｇｌｋｑｌｇａｄｖｄｃｆｌｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｌｓａｌｌｍａａｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔｉｒｌｍｅｒｆｇｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｈｌｋａｖｄｖｎｍｎｎｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｉｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｔｐｐｅｋＩｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｆｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ｍａａｋｇｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｙｖｄｎｌＩｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｆｓｖｅａｄｋｖａｋｒａｖｗｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｋｅｅｖｑｌｆｌｇｎａａｔａｍｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｖｇｌｋｑｌｇａｄｖｄｃｆｌｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｌｓａｌｌｍａａｐｌａｌｖｄｖｅｉｅｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔＩｒｌｍｅｒｆｇｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｒｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｈｌｋａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｌｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｉｔｐｐｅｋｌｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｆｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ｍａａｋｋｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｙｖｈｎｌＩｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｌｓｍｅａｄｋｖａｋｒａｖｗｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｅｅｅｖｑｌｆｌｇｎａａｔａｍｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｖｖｇｌｋｑｌｇａｄｖｄｃｆｌｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｌｓａｌｌｍａｔｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔｉｒｌｍｅｒｆｇｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｈｌｋａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｌｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｉｔｐｐｅｋＩｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｆｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ｍａａｋａｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｖｖｄｎｌＩｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｌｓｖｅａｄｋｖａｋｒａｖｖｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｋｅｋｖｑｌｆｌｇｎａａｔａｍｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｖｖｇｌｋｑｌｇｖｄｖｄｃｆｌｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｍｓａｌｌｍａａｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔｉｒｌｍｅｒｆｇｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｒｌｋａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｌｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｉｔｐｐｅｋＩｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｆｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４６Ｄ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ｍａａｋａｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｖｖｄｎｌｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｌｓｖｅａｄｋｖａｋｒａｖｙｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｋｅｅｖｑｌｆｌｇｎａａｔａｍｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｖｖｇｌｋｑｌｇａｄｖｄｃｆｌｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｌｓａｌｌｍａａｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔｉｒｌｍｅｒｆｇｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｄａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｈｌｋａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｌｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｉｔｐｐｅｋｌｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｆｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及びＦ５１２Ｉ突然変異を含む。
ｍａａｋａｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｙｖｄｎｌｌｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｌｓｖｅａｄｋｖａｋｒａｗｗｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｋｅｅｖｑｌｆｌｇｎａａｔａａｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｖｖｇｌｋｑｌｇａｄｖｄｃｆｌｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｌｓａｌｌｌａａｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔｉｒｌｍｅｒｆｇｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｅｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｈｌｋａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｌｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｉｔｐｐｅｋＩｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｉｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
ｍａａｋｓｅｅｉｖｌｑｐｉｒｅｉｓｇａｖｑｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌｓａｌｓｅｇｔｔｖｖｄｎｌＩｎｓｅｄｖｈｙｍｌｅａｌｋａｌｇｌｓｖｅａｄｋｖａｋｒａｖｗｖｇｃｇｇｋｆｐｖｅｋｄａｋｅｅｖｑｌｆｌｇｎａａｔａｍｒｓｌｔａａｖｔａａｇｇｎａｔｙｖｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｗｖｇｌｋｑｆｇａｄｖｄｃｆｉｇｔｅｃｐｐｖｒｖｋｇｉｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｌｓａｌｌｍａａｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｉｄｋｌｉｓｉｐｙｖｅｍｔｉｒｌｍｅｒｆｇｖｋａｅｈｓｄｓｗｄｒｆｙｉｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｖｔｖｑｇｃｇｔｔｓｌｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｍｍｇａｋｖｔｗｔｄｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｅｐｙｇｋｋｈｌｋａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄａａｍｔｌａｖｖａｌｆａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｖａｉｒｔｅｌｔｋｌｇａｓｖｅｅｇｐｄｙｃｉｉｔｐｐｅｋＩｎｉｔａｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｒｋｔｆｐｎｙｆｄｖｌｓｔｆｖｒｎ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及びＲ５１４Ｋ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６は、野生型亜麻ＥＰＳＰＳ２のアミノ酸配列であり、Ｌｕｓ１００００７８８（Ｓａｕｅｒ Ｎ Ｊ ， Ｎａｒｖａｅｚ－Ｖａｓｑｕｅｚ， Ｊａｖｉｅｒ， Ｍｏｚｏｒｕｋ Ｊ ， ｅｔ ａｌ． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２０１６：１９１７－ １９２８．）から翻訳され、その葉緑体輸送ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６から除去されている。
ｍｔｖｐｅｅｉｖｌｑｐｉｋｄｉｓｇｉｖｔｌｐｇｓｋｓｌｓｎｒｉｌｌａａｌｓｅｇｋｔｙｖｄｎｌＩｎｓｄｄｖｈｙｍｌｇａｌｋｔｌｇＩｎｖｅｈｓｓｅｑｋｒａｉｖｅｇｒｇｇｖｆｐｖｇｋｌｇｋｎｄｉｅｌｆｌｇｎａｇｔａｍｒｐｌｔａａｖｔａａｇｇｎｓｓｙｉｌｄｇｖｐｒｍｒｅｒｐｉｇｄｌｖｖｇｌｋｑｌｇａｄｖｓｃｓｓｔｓｃｐｐｖｈｖｎａｋｇｇｌｐｇｇｋｖｋｌｓｇｓｉｓｓｑｙｌｔａｌｌｍａａｐｌａｌｇｄｖｅｉｅｉｖｄｋｌｉｓｖｐｙｖｄｍｔｌｋｌｍｅｒｆｇｖａｖｅｈｓｇｓｗｄｒｆｆｖｋｇｇｑｋｙｋｓｐｇｎａｙｖｅｇｄａｓｓａｓｙｆｌａｇａａｉｔｇｇｔｉｔｖｅｇｃｇｔｓｓＩｑｇｄｖｋｆａｅｖｌｅｋｍｇａｋｖｔｗｔｅｔｓｖｔｖｔｇｐｐｒｄａｓｇｋｋｈｌｒａｖｄｖｎｍｎｋｍｐｄｖａｍｔｌａｖｖａｌｙａｄｇｐｔａｉｒｄｖａｓｗｒｖｋｅｔｅｒｍｉａｖｃｔｅｌｒｋｌｇａｔｖｅｅｇｐｄｙｃｉｉｔｐｐｅｋｌｓｉａｅｉｄｔｙｄｄｈｒｍａｍａｆｓｌａａｃａｄｖｐｖｔｉｒｄｐｇｃｔｋｋｔｆｐｄｙｆｅｖｌｅｒｙｔｋｈ＊
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７は、亜麻由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８は、亜麻由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｔ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９は、亜麻由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０は、亜麻由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１は、野生型コムギＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列であり、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＬＫ２７１６３．１として表され、その葉緑体輸送ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１から除去されている。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２は、コムギ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３は、野生型大豆ＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列であり、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＸＰ＿００３５２１８５７．１として表され、その葉緑体輸送ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３から除去されている。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４は、大豆由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｖ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｓ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３ＩとＰ１７７Ｔ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８は、イネ由来のＥＰＳＰＳ配列の突然変異体であり、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及びＶ４０３Ａ突然変異を含む。
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９は、ＣＰ４（アグロバクテリウム）由来の野生型ＥＰＳＰＳのアミノ酸配列である。
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Claims (31)

  1. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、アミノ酸Ａに突然変異するアミノ酸Ｖを含み、突然変異位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＶ４０３の位置に対応する前記植物ＥＰＳＰＳアミノ酸配列におけるアミノ酸Ｖの位置である、ポリヌクレオチド。
  2. ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ及びＶ４０３Ａアミノ酸突然変異植物を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する、ポリヌクレオチド。
  3. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する、ポリヌクレオチド。
  4. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する、ポリヌクレオチド。
  5. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する、ポリヌクレオチド。
  6. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記植物ＥＰＳＰＳポリペプチドは、Ｔ１７３Ｉ、Ｐ１７７Ｔ及びＶ４０３Ａアミノ酸突然変異を含み、アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸位置に対応する、ポリヌクレオチド。
  7. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ａ７０Ｖ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及びＲ５１４Ｓを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  8. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ａ７３Ｔ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  9. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ａ７３Ｔ、Ｅ８６Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  10. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ａ１４５Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ、Ｔ４４２Ｓ及びＤ４７２Ｅを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  11. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ４０３Ａ及びＦ５０２Ｖを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  12. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｙ２５２Ｆ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  13. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｅ１３７Ｄ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２５３Ｍ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  14. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｋ３９９Ｎ、Ｖ４０３Ａ及びＴ４６６Ｓを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  15. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ａ７３Ｇ、Ｌ１３４Ｇ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｇ２６５Ｖ、Ｓ３７４Ｒ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  16. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ａ７３Ｋ、Ｄ１１４Ｈ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１６１Ｅ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｔ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  17. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｅ１６３Ｋ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ｌ２５３Ｍ、Ｈ３８９Ｒ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  18. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｎ２４７Ｄ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  19. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｇ１７２Ａ、Ｍ１７５Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｍ２５８Ｌ、Ｋ３５６Ｅ、Ｖ４０３Ａ及びＦ５１２Ｉを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  20. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ａ７３Ｓ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｌ２１４Ｆ及びＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  21. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ、Ｖ２０８Ａ、Ｌ２６４Ｈ、Ｖ４０３Ａ及びＲ５１４Ｋを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  22. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｖ１１３Ｍ、Ｇ１７２Ａ、Ｐ１７７Ｓ及び／又はＶ４０３Ａを含む植物ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  23. 請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物。
  24. 請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項２３に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む、植物細胞。
  25. イネ細胞である、請求項２４に記載の植物細胞。
  26. ゲノムに請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項２３に記載の組換えＤＮＡ構築物が含まれる、植物。
  27. トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、エンバク、ソルガム、アワ、亜麻、大麻、ケンタッキーブルーグラス、ヒロハノウシノケグサ、ハイコヌカグサ、アブラナ属植物、テンサイ、大豆、エンドウ豆、アルファルファ、タバコ、綿、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、リンゴ木、ヴィティス・ヴィニフェラ、シトラス木、キュウリ又はペチュニアである、請求項２６に記載の植物。
  28. イネである、請求項２６に記載の植物。
  29. グリホサート耐性植物を生成する方法であって、
    （ａ）再生可能な植物細胞において請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ構築物を発現させることと、
    （ｂ）ゲノムに前記組換えＤＮＡ構築物が含まれるグリホサート耐性植物を生成することとを含む、方法。
  30. テストすることで、植物が少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を含むかどうかを決定するステップを含むグリホサート耐性植物を同定する方法であって、
    前記ポリヌクレオチドは、植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、方法。
  31. 植物ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの用途であって、前記ポリペプチドは、請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、用途。
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