CN103060346A - 来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，全长1278bp，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。经酶动力学特性分析和功能试验验证，本发明合成的该5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因具有较高的草甘膦耐受性，可用于转基因作物的培育中。

Description

来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及应用

技术领域

本发明涉及一种按植物密码子偏爱合成的来源于嗜碱菌（Alkaliphilusmetalliredigens）的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及应用，特别具体涉及该5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的原核表达、纯化及其在转基因作物培育中的应用。

背景技术

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种之一。但是该除草剂同样是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。为了在农业生产中使用草甘膦，必须培育出具有草甘膦抗性或者降解性的农作物。

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate）毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性。该合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）生物合成过程中的一个关键酶，该酶由aroA基因编码。

目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断扩大，占全球种植转基因作物的78%以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和南非等七国的主要商品化转基因农作物。耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的62%。然而现在应用于生产的抗草甘膦基因仅有两个，且都受到专利的保护，因此发掘新型的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因对于培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因作物将是非常有必要的。

最近，来自于极端微生物体内的好多酶都已成为研究的热点，主要是因为微生物生长在极端环境中从而使这些酶可能具有潜在的特殊的生物功能。嗜碱菌（Alkaliphilusmetalliredigens）是一种革兰氏阴性菌，该菌能够在pH=8.0-11.0的碱性环境中生存。其全基因组测序已于2009年完成（NCBI Reference Sequence:NC_009633.1）在过去的几年时间里，很多来自该碱性微生物中的酶被分离出来并进行研究了。然而来自该菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶还从未研究过，也未见对该酶功能的研究报告。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于嗜碱菌（Alkaliphilusmetalliredigens）的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用。

所述的来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示，它是根据植物密码偏爱通过化学合成方法得到的。即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成（PTDS）（Nucleic Acids Research，2004，32：e98）。

具体合成方法包括以下步骤：

引物设计：设计长度大概为60bp左右的覆盖整个5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的寡核苷酸的序列44个，其中每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。

PCR扩增：利用PCR进行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶扩增。其中，在100μl反应体系中，P2~P43共42个引物的添加量为2ng，两个外侧引物P1和P44的添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min，94℃30s，50℃30s，72℃10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。

转化：PCR结束后，用1%琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，在DH5α感受态中高效转化，获得长度为1293bp的SEQ ID No1序列的阳性克隆，即为本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，经序列测定，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

将上述获得的阳性克隆直接与原核表达载体pYM 4087（Curr Microbiol，2011，62：833-839）相连，4℃连接2小时。然后将该载体转化感受态大肠杆菌TOP 10（Invitrogen）。将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基（15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH=7.5）37℃过夜培养。次日，挑取3-5个菌落，接种于50ml液体LB培养基（5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH=7.5）中，37℃摇床直到菌液的浓度达到OD₆₀₀为1.0时停止培养。培养液在5,000g重力加速度下离心5min，无菌水清洗1次。所得的细胞沉淀用1mL磷酸裂解缓冲液重悬，然后将其转移到微量离心管中。使用超声波仪裂解菌液30min，以12,000g离心30min。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP（Amersham Biosciences公司）对其进行蛋白表达纯化。然后对其进行酶动力学特性分析。

采用蘸花法（Nature Protocol,2006,(2):641-646）将上述获得的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因转入拟南芥，进行草甘膦萌发根长和草甘膦喷洒处理试验，结果表明：本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，因而说明该基因可应用于转化拟南芥中，这些特征为用于转基因作物的培育提供可能。

本发明通过对所合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的动力学参数以及在植物中草甘膦抗性的研究，发现该酶可用于培育高耐受草甘膦的转基因作物。

附图说明

图1为本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量MARKER，2为用HisTrap HP试剂盒纯化的来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白，3代表在大肠杆菌BL21（DE3）过量表达的来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白。

图2为转本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的拟南芥在含有不同浓度草甘膦（从左到右草甘膦浓度依次为：0，200，500和1000μM）平板上的萌发实验，其中，Am1，Am3，Am4分别代表转本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的不同的拟南芥株系；CK代表对照。

图3为转本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的拟南芥用15mM草甘膦喷洒处理7天后观察到的情况（Am1，Am3，Am4分别代表转本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的不同的拟南芥株系；CK代表对照）。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书【J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社】。

实施例1 按植物密码子偏爱化学合成的来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因

根据来源于嗜碱菌（Alkaliphilus metalliredigens）的aroA序列（NCBI Reference Sequence:NC_009633.1）采取连续延伸PCR（Nucleic Acids Research,2004,32,e98）按照植物密码子偏爱合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，设计44对引物用于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的人工合成。所设计的引物如下：

1.P1:Tm=54,60mer

GGATCCATGCTGGTCACTAACAAAGTCGAGAAGTTGGAAGGCAAGATGACTGTTCCAGGT

2.P2:Tm=54,60mer

TAGAAGACAGCATGATAGCTCTATGAGAGATGGACTTGTCACCTGGAACAGTCATCTTGC

3.P3:Tm=54,60mer

GACAAGTCCATCTCTCATAGAGCTATCATGCTGTCTTCTATCTCCAAAGGCACCTCCAGA

4.P4:Tm=54,60mer

TGGTAGACAGGCAATCCTCACCTCTCAGAAAGCCTTTGACTCTGGAGGTGCCTTTGGAGA

5.P5:Tm=54,60mer

GTCAAAGGCTTTCTGAGAGGTGAGGATTGCCTGTCTACCATCTCCTGCTTCAGAGACCTT

6.P6:Tm=54,60mer

GGATGATGATCTCAGTGCCTCTGTCTTCAATGTCAATGCCAAGGTCTCTGAAGCAGGAGA

7.P7:Tm=54,60mer

GGCATTGACATTGAAGACAGAGGCACTGAGATCATCATCCAGGGTAAGGGTCTGCATGGT

8.P8:Tm=54,60mer

CAGAGTTGCCTGCATCAAGGACATTCAGTGGTTCAGACAGACCATGCAGACCCTTACCCT

9.P9:Tm=54,60mer

CTGTCTGAACCACTGAATGTCCTTGATGCAGGCAACTCTGGCACCACCATCAGACTGATC

10.P10:Tm=54,60mer

TGACGATGGTCAAGAACTTCTGACCTGCCAAGATGCCAGAGATCAGTCTGATGGTGGTGC

11.P11:Tm=54,60mer

TCTGGCATCTTGGCAGGTCAGAAGTTCTTGACCATCGTCACTGGTGATGCTTCTCTGAGA

12.P12:Tm=54,60mer

TCTTTCTCAGTGGAGTGGCAATTCTCTCCATAGGTCTCTTTCTCAGAGAAGCATCACCAG

13.P13:Tm=54,60mer

AAGAGACCTATGGAGAGAATTGCCACTCCACTGAGAAAGATGGGTGCTTTCATTGAAGGC

14.P14:Tm=54,60mer

CACCTCTGATGACCAATGGTGCAAGATTACCGTAGTCTCTGCCTTCAATGAAAGCACCCA

15.P15:Tm=54,60mer

AGAGACTACGGTAATCTTGCACCATTGGTCATCAGAGGTGGCAACCTGAAGGGTATGGAC

16.P16:Tm=54,60mer

TTGCAGACTTGACTTGTGCAGAGGAGACTGGAGATGCATAGTCCATACCCTTCAGGTTGC

17.P17:Tm=54,60mer

TATGCATCTCCAGTCTCCTCTGCACAAGTCAAGTCTGCAATCTTGCTTGCTGGACTGTAT

18.P18:Tm=54,60mer

TGGAGGTGATCTTCTCTCTGACAATGGTGTCTCCTTCACCATACAGTCCAGCAAGCAAGA

19.P19:Tm=54,60mer

GGTGAAGGAGACACCATTGTCAGAGAGAAGATCACCTCCAGAGATCACACTGAGAAGATG

20.P20:Tm=54,60mer

CACCTTGGTCAGTGGAGATGTTGGCACCAAGACCTTTCAGCATCTTCTCAGTGTGATCTC

21.P21:Tm=54,60mer

CTGAAAGGTCTTGGTGCCAACATCTCCACTGACCAAGGTGTCACTAGACTTGGTAAGTCT

22.P22:Tm=54,60mer

AAATGTCTCCTGGAACTTCGATGGACTGACCGTACAGCTCAGACTTACCAAGTCTAGTGA

23.P23:Tm=54,60mer

GAGCTGTACGGTCAGTCCATCGAAGTTCCAGGAGACATTTCCTCTGCTGCCTTCTTCATG

24.P24:Tm=54,60mer

CAGTGATCAAGAAGGAGCCTGGAAGAGCTGCTGCACCAGCCATGAAGAAGGCAGCAGAGG

25.P25:Tm=54,60mer

GCTGGTGCAGCAGCTCTTCCAGGCTCCTTCTTGATCACTGAAGGTGTTGGTCTGAACCCA

26.P26:Tm=54,60mer

CACCCATGTCTCTCAGAACATCGATGATACCAGTTCTGGTTGGGTTCAGACCAACACCTT

27.P27:Tm=54,60mer

ACCAGAACTGGTATCATCGATGTTCTGAGAGACATGGGTGGTGACATTGAGATCCATAAC

28.P28:Tm=54,60mer

TCATGATGTCACCAATCTCTTCACCACCAGACTGTCTCAGGTTATGGATCTCAATGTCAC

29.P29:Tm=54,60mer

CTGAGACAGTCTGGTGGTGAAGAGATTGGTGACATCATGATCAGAGGCAAGAAGCTGTAT

30.P30:Tm=54,60mer

CAATCAGTCTTGGAATGATCTCTTTGCCAATCTCAGTGCCATACAGCTTCTTGCCTCTGA

31.P31:Tm=54,60mer

GGCACTGAGATTGGCAAAGAGATCATTCCAAGACTGATTGACGAGATTCCAGTCCTTGCC

32.P32:Tm=54,60mer

CAGTGATGATGGTCTTGCCTTCAGCAGTAGCAGCAATGATGGCAAGGACTGGAATCTCGT

33.P33:Tm=54,60mer

ATCATTGCTGCTACTGCTGAAGGCAAGACCATCATCACTGGTGCAGAGGAGCTGAAAGTC

34.P34:Tm=54,60mer

GCATCTCAGTGACCATAGCAGTAATTCTGTTGGACTCCTTGACTTTCAGCTCCTCTGCAC

35.P35:Tm=54,60mer

AAGGAGTCCAACAGAATTACTGCTATGGTCACTGAGATGCAGAAAGTCGGAATCAAGGTC

36.P36:Tm=54,60mer

CCTGTCCACCTTCAATCTCCATGCCATCTGGAAGCTCAGTGACCTTGATTCCGACTTTCT

37.P37:Tm=54,60mer

ACTGAGCTTCCAGATGGCATGGAGATTGAAGGTGGACAGGTCATCACTGGAGGCAGAGTT

38.P38:Tm=54,60mer

TAGCCATAGCCATAGCGATTCTATGATCACCATAAGACTCAACTCTGCCTCCAGTGATGA

39.P39:Tm=54,60mer

GAGTCTTATGGTGATCATAGAATCGCTATGGCTATGGCTATCTGTGGTCTGTTTGCTCAA

40.P40:Tm=54,60mer

AGATGTCGATGCATTGAGAGTCATTGATCTTGATTGGCTCTTGAGCAAACAGACCACAGA

41.P41:Tm=54,60mer

GAGCCAATCAAGATCAATGACTCTCAATGCATCGACATCTCCTTTCCAAACTTCGAAGAG

42.P42:Tm=54,60mer

AGTGGTGATGGTGATGGTGTCTGACAACAGCTTTCAACTTCTCTTCGAAGTTTGGAAAGG

43.P43:Tm=54,60mer

AACTTCGAAGAGAAGTTGAAAGCTGTTGTCAGACACCATCACCATCACCACTAAGAGCTC

44.P44:Tm=54,60mer

GAGCTCTTAGTGGTGATGGTGATGGTGTCTGACAACAGCTTTCAACTTCTCTTCGAAGTT

利用PCR进行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因扩增，在100μl反应体系中，P2至P43共44个内侧引物的添加量为2ng，外侧引物P1~P44添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，50℃30s，72℃2min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。

PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆，经序列测定其核苷酸序列与野生型有80.44%相似性（参看表1），其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，它包含1287个碱基，其编码氨基酸424个，序列如SEQ ID NO 2所示。

表1 本发明的按照植物密码子合成的源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因与原始基因的序列比对，其中上行序列是本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，下行序列是原始基因。

实施例2 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的大肠杆菌表达

将实施例1合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因用BamH I和Sac I酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a（NEB公司）得到重组质粒pET-paroA _{A.metalliredigens}并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司），将转化子涂布在LB固体培养基中培养24h。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP（Amersham Biosciences公司）对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测，蛋白大小约45kDa，与预测值相符（参看图1）。

实施例3 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的酶活测定和动力学参数的测定

1.测定方法

无机磷标准曲线：10mM无机磷按1:10稀释，分别取0、1、2、3……20μl与1.5mlEppendorf离心管中，加入纯水至100μl混匀，加入MAT溶液0.8ml混匀，计时三分钟后加入SC溶液100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD₆₆₀值，重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD₆₆₀值为纵坐标作图，得到无机磷标准曲线。

1）酶活测定：蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法。在冰上与1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μl，10mM S3P溶液2μl，0.5M HEPES溶液2μl，1mM(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl和双蒸水12μl混匀，与28℃温浴5min后各管样品间隔2s加入5μl纯化蛋白并计时，2min后再间隔2s依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl 34%SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD₆₆₀值。对照除不加纯化蛋白外，其余同样品管。样品管与对照管的OD₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到酶的酶活力（nkat/mg）。

2）半抑制量（IC₅₀）测定：上述反应液中添加0、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度（nkat/mg）为Y轴作图。

3）K_m（PEP）测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度（0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM）下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S]（Eadic-Hofstee）法作图。

4）K_i（glyphosate）测定：在不同草甘膦浓度（0、10、50、100μM）下测定PEP浓度为0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM时5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的酶反应速度。采取双倒数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦的浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为K_i(glyphosate)值。

2.测定结果

本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因酶活性为53.22±0.24nkat/mg，其动力学参数如下表2所示。

表2 本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的动力学参数

根据表2的动力学参数可知：本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性为将本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因用于转基因作物的培育提供了可能。

实施例4 拟南芥的转化及其草甘膦抗性的试验

（一）转基因拟南芥的获得

1.农杆菌的准备：

1）挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养20h。

2）取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD₆₀₀≈1.5。

3）8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5wt%蔗糖，0.05wt% Silwet L-77）并稀释至OD₆₀₀≈0.8。

2.拟南芥蘸花法转化

1）将拟南芥的花薹浸入渗透液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，托盘中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22℃避光培养，24h后去掉保鲜膜直立培养。

2）初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。

3）生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。

（二）转基因拟南芥的草甘膦耐受性试验

将T2代Am1，Am3，Am4三个株系和CK种子首先用1ml 75%乙醇消毒1min（不停摇晃振荡），8000rpm离心5秒，去上清。然后加入1ml过滤后的漂白粉消毒15min（不停摇晃振荡，充分消毒），8000rpm离心5秒，去上清，再用无菌水洗涤3-4次。

接下来将种子均匀的分布到含有不同浓度草甘膦的1/2MS平板上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16小时光照垂直培养6天观察种子萌发根长情况。草甘膦喷洒处理实验是将生长大约3周的小苗子用15mM草甘膦进行喷洒，7天后观察苗子生长情况。

结果发现：对照种子在草甘膦浓度为200μM根已经不能萌发生长，而转本发明的嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的种子在草甘膦浓度为1000μM则仍然生长良好，而且形态正常（参看图3）；草甘膦喷洒实验发现，CK拟南芥的叶子几乎全部变黄了，然而转本发明基因的拟南芥则仍然形态正常而且生长良好。

Claims (7)

1.一种按照植物密码子偏爱合成的来源于嗜碱菌Alkaliphilus metalliredigens的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.根据权利要求1所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

3.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在大肠杆菌表达中的应用。

4.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在拟南芥转化中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用蘸花法将所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因转入拟南芥中。

6.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在转基因作物培育中的应用。

7.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在高耐受草甘膦转基因作物培育中的应用。

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