BR112021010801A2 - Composições de metilobacterium para melhorar rendimento de milho - Google Patents

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Abstract

composições de metilobacterium para melhorar rendimento de milho. a presente invenção fornece composições compreendendo methylobacterium que melhoram rendimento, métodos para melhorar rendimento de milho e métodos parafazer as composições. também são providos methylobacterium que melhoram rendimento isolado.

Description

COMPOSIÇÕES DE METHYLOBACTERIUM PARA MELHORAR O RENDIMENTO DE MILHO REFERÊNCIA CRUZADA APEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício de U.S. 62/774.640, depositado em 3 de dezembro de 2018, e U.S. 62/878.164, depositado em 24 de julho de 2019, que estão cada um aqui incorporado por referência na sua totalidade.
DECLARAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] Uma listagem de sequência contendo o arquivo denominado “53907_190085 _ST25.txt” que tem 21493 bytes (medido em MS-Windows®) e criado em 26 de novembro de 2019, contém 73 sequências de nucleotídeos, é fornecida com este através do sistema EFS do USPTO e está incorporada aqui por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[003] Compostos orgânicos de um carbono, como metano e metanol, são encontrados extensivamente na natureza e são utilizados como fontes de carbono por bactérias classificadas como metanotrofos e metil otrofos. As bactérias metanotróficas incluem espécies dos gêneros Methylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum, e Methylocella (Lidstrom, 2006). Os metanotrofos possuem a enzima metano mono-oxigenase, que incorpora um átomo de oxigênio do O2 ao metano, formando o metanol. Todos os metanotróficos são usuários obrigatórios de um carbono que são incapazes de usar compostos contendo ligações carbono-carbono. Os metilotrofos, por outro lado, também podem utilizar compostos orgânicos mais complexos, como ácidos orgânicos, álcoois superiores, açúcares e semelhantes. Assim, as bactérias metilotróficas são metilotrofas facultativas. Bactérias metil otróficas incluem espécies dos gêneros Methylobacterium, Hyphomicrobium, Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Aminobacter, Methylorhabdus, Methylopila, Methylosulfonomonas, Marinosulfonomonas, Paracoccus, Xanthobacterus, Ancanthobacterus, Bacylobacterus, Bacylobacterus, Bacylobacterus, Rhodobocyclusus, Bacylobacterus, Bacylobacterus, Rhodobacterus, e Mycobacterium, Arthobacter e Nocardia (Lidstrom, 2006).
[004] A maioria das bactérias metilotróficas do gênero Methylobacterium são pigmentadas de rosa. Eles são convencionalmente referidas como bactérias PPFM, sendo metilotrofos facultativos de pigmentação rosa. Green (2005, 2006) identificou doze espécies validadas no gênero Methylobacterium, especificamente M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. Dicloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum e M. zatmanii. No entanto, M nidulans é Methylobacterium fixadora de nitrogênio que não é um PPFM (Sy et al., 2001). As Methylobacteriums são encontradas no solo, poeira, água doce, sedimentos e superfícies foliares, bem como em ambientes industriais e clínicos (Green, 2006).
SUMÁRIO
[005] Métodos para melhorar o rendimento da planta de milho que compreendem: (a) aplicar uma composição a uma planta de milho ou uma parte de planta de milho, em que a composição compreende (i) isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340), ou suas variantes, ou (ii) uma combinação de isolado de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma variante deste, e isolado de Methylobacterium NLS0017 (B- 50931) ou uma variante do mesmo; em que a referida composição compreende ainda pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em um ingrediente ativo adicional, um adjuvante aceitável em agricultura e um excipiente aceitável em agricultura; e, (b) cultivar a planta de milho até a maturidade, melhorando assim o rendimento da planta de milho. Em certas modalidades dos métodos, a composição é aplicada a uma semente de milho. Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende uma substância sólida com Methylobacterium crescido sobre a mesma e aderido a ela, ou uma emulsão tendo Methylobacterium crescido nela. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende Methylobacterium em um título de cerca de 1x106 CFU/g a cerca de 1x1014 CFU/g para uma composição sólida ou em um título de cerca de 1x106 CFU/mL a cerca de 1x1011 CFU/mL para uma composição líquida. Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742) ou uma variante do mesmo. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende NLS0109 ou uma variante do mesmo e NLS0017 ou uma variante do mesmo.
Em certas modalidades de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente, a variante de Methylobacterium é resistente ao glifosato ou resistente ao glufosinato.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição aplicada reveste ou reveste parcialmente o milho ou uma parte da mesma.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição é aplicada à folhagem da planta de milho.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende ainda um fungicida.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição é aplicada em cerca do estágio de desenvolvimento VE a cerca do V3, cerca do estágio de desenvolvimento V3 a cerca do V5, cerca do estágio de desenvolvimento V2 a V4 ou estágio de desenvolvimento V3. Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, os métodos compreendem ainda a etapa de colheita da semente da planta de milho madura.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, o rendimento da semente colhida é aumentado em comparação com o rendimento da semente colhida obtida de uma planta de milho de controle que não recebeu uma aplicação de Methylobacterium.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição é aplicada por pulverização, revestimento, revestimento parcial, imersão e/ou embebimento do milho ou parte da planta com a composição.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição aplicada reveste ou reveste parcialmente o milho ou uma parte da mesma, em que o revestimento parcial inclui o revestimento de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou cerca de 99,5% da área de superfície da planta de milho ou uma parte dela.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a parte da planta de milho é uma semente.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma combinação de isolados de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) e NLS0017 (B-50931). Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende ainda um ingrediente ativo adicional.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, o ingrediente ativo adicional é selecionado do grupo que consiste em um fungicida, inseticida,
nematicida e composto biológico.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, o composto biológico é um agente de biocontrole diferente de NLS0109. Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, o ingrediente ativo adicional é selecionado do grupo que consiste em clotianidina, Bacillus flrmus, abamectina, tiametoxame, imidacloprida, azoxistrobina, fluopirame, fluoxastrobina, ipconazol, mefenoxam, metalaxil, penflostrobina, protioconazol, protioconazol.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, o crescimento da planta de milho ocorre em um campo no território continental dos Estados Unidos localizado a leste do rio Mississippi.
Em certos modalidades dos métodos mencionados anteriormente, o crescimento da planta de milho ocorre em um campo no território continental dos Estados Unidos localizado a oeste do rio Mississippi.
Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende (i) Methylobacterium em que o DNA genômico cromossômico tem pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de NLS0807 (NRRL B- 67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741) ou NLS0109 (NRRL B-67340), ou (ii) uma combinação de isolados de Methylobacterium em que o DNA genômico cromossômico do referido isolados têm pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com o DNA genômico cromossômico de NLS0109 (NRRL B-67340) ou NLS0017 (B-50931). Em certas modalidades, a composição compreende (i) Methylobacterium tendo DNA genômico compreendendo um ou mais fragmentos de marcadores de polinucleotídeo de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos de SEQ ID NOS: 25-27, SEQ ID NOS: 37-39, SEQ ID NOS: 49-51 ou SEQ ID NOS: 1-3; ou (ii) uma combinação de isolados de Methylobacterium em que um primeiro isolado tem DNA genômico compreendendo um ou mais fragmentos de marcadores de polinucleotídeo de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1- 3 e um segundo isolado tem DNA genômico compreendendo um ou mais fragmentos de marcadores de polinucleotídeo de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos de SEQ ID NOS: 13-15. Em certas modalidades, Methylobacterium tem em seu genoma um ou mais fragmentos de marcadores compreendendo uma sequência com pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência em todo o comprimento de SEQ ID NOS: 9-11. Em certas modalidades dos métodos mencionados anteriormente, a composição compreende ainda um segundo composto biológico selecionado do grupo que consiste em ISO01 (NRRL B- 50929), ISO02 (NRRL B-50930), ISO03 (NRRL B-50931), ISO04 (NRRL B- 50932), ISO05 (NRRL B-50933), ISO06 (NRRL B-50934), ISO07 (NRRL B-50935), ISO08 (NRRL B-50936), ISO09 (NRRL B-50937), ISO10 (NRRL B-50938), ISO11 (NRRL B- 50939), ISO12 (NRRL B-50940), ISO13 (NRRL B-50941) e ISO14 (NRRL B-50942).
[006] Também são fornecidas plantas ou partes de plantas que são revestidas ou parcialmente revestidas com uma composição compreendendo Methylobacterium, em que Methylobacterium é (i) NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B- 67741), ou suas variantes, ou (ii) uma combinação de isolado de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma variante do mesmo, e isolado de Methylobacterium NLS0017 (B-50931) ou uma variante deste. Em certas modalidades, a composição compreende ainda pelo menos um segundo componente selecionado do grupo que consiste em um ingrediente ativo adicional, um adjuvante agricolamente aceitável e um excipiente agricolamente aceitável. Em certas modalidades mencionadas anteriormente, a composição compreende Methylobacterium em um título de cerca de 1x106 CFU/g a cerca de 1x1014 CFU/g para uma composição sólida ou em um título de cerca de 1x106 CFU/mL a cerca de 1x1011 CFU/mL para uma composição líquida. Em certas modalidades mencionadas, Methylobacterium é isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743) ou uma variante do mesmo. Em certas modalidades mencionadas, a parte da planta de milho é selecionada do grupo que consiste em uma semente, uma folha, uma espiga e uma borla. Em certas modalidades mencionadas, a composição compreende isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741) ou uma combinação de isolados de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) e NRRL B-67340 (NRRL B-67340) B-50931). Em certas modalidades mencionadas anteriormente, a composição compreende um ingrediente ativo adicional. Em certas modalidades mencionadas anteriormente, o ingrediente ativo adicional é selecionado do grupo que consiste em um fungicida, inseticida, nematicida e composto biológico. Em certas modalidades mencionadas anteriormente, o composto biológico é um agente de biocontrole diferente de NLS0109. Em certas modalidades mencionadas anteriormente, o ingrediente ativo adicional é selecionado do grupo que consiste em clotianidina, Bacillus flrmus, abamectina, tiametoxam, imidacloprida, azoxistrobina, fluopiram, fluoxastrobina, ipconazol, mefenoxam, metalaxil, penflufeno, protioconazol, piraclostrobina e sedaxano. Em certas modalidades mencionadas, a composição compreende (i) Methylobacterium em que o DNA genômico cromossômico tem pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com o DNA genômico cromossômico de NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741) ou NLS0109 (NRRL B-67340), ou (ii) uma combinação de isolados de Methylobacterium em que o DNA genômico cromossômico dos referidos isolados tem pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de NLS0109 (NRRL B-67340) ou NLS0017 (B-50931). Em certas modalidades mencionadas, a composição compreende ainda um segundo composto biológico selecionado do grupo que consiste em ISOOl (NRRL B-50929), ISO02 (NRRL B-50930), ISO03 (NRRL B-50931), ISO04 (NRRL B-50932), ISO05 (NRRL B-50933), ISO06 (NRRL B-50934), ISO07 (NRRL B-50935), ISO08 (NRRL B- 50936), ISO09 (NRRL B-50937), ISO10 (NRRL B-50938), ISO11 (NRRL B-50939), ISO12 (NRRL B-50940), ISO13 (NRRL B-50941) e ISO14 (NRRL B-50942).
DESCRIÇÃO Definições
[007] O termo “e/ou”, quando usado neste documento, deve ser considerado como divulgação específica de cada uma das duas características ou componentes especificadas com ou sem o outro. Assim, o termo “e/ou” conforme usado em uma frase como “A e/ou B” neste documento se destina a incluir “A e B”, “A ou B”, “A” (sozinho) e “B” (sozinho). Da mesma forma, o termo” e/ou “conforme usado em uma frase como “A, B e/ou C” se destina a abranger cada uma das seguintes modalidades: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).
[008] Onde um termo é fornecido no singular, modalidades compreendendo o plural desse termo também são fornecidas.
[009] Conforme usado neste documento, os termos “incluem”, “inclui” e “incluindo” devem ser interpretados como tendo pelo menos as características ou abrangendo os itens aos quais se referem, embora não excluindo quaisquer características não especificadas adicionais ou itens não especificados.
[010] Conforme usado neste documento, as frases “aderido a ela” e “aderente” se referem a Methylobacterium que estão associadas a uma substância sólida por crescimento, ou tendo crescido, em uma substância sólida.
[011] Conforme usado neste documento, a frase “ingrediente ativo” se refere a um produto composto biológico ou pesticida em uma composição para tratamento de plantas e/ou partes de plantas.
[012] Conforme usado neste documento, o termo “composto biológico” se refere a um componente de uma composição para o tratamento de plantas ou partes de plantas compreendidas ou derivadas de um microrganismo. Os produtos composto biológicos incluem agentes de biocontrole, outros microrganismos benéficos, extratos microbianos, produtos naturais, ativadores de crescimento de plantas ou agentes de defesa de plantas. Exemplos não limitativos de agentes de biocontrole incluem bactérias, fungos, nematóides benéficos e vírus.
[013] Conforme usado neste documento, a frase “adjuvante agricolamente aceitável” se refere a uma substância que melhora o desempenho de um produto composto biológico ou pesticida em uma composição para tratamento de plantas e/ou partes de plantas. Em certas composições, um produto composto biológico pode compreender uma monocultura ou co-cultura de Methylobacterium.
[014] Conforme usado neste documento, a frase “excipiente agricolamente aceitável” se refere a uma substância essencialmente inerte que pode ser usada como um diluente e/ou carreador para um produto composto biológico ou pesticida em uma composição para tratamento de plantas e/ou plantas partes. Em certas composições, um produto composto biológico pode compreender uma monocultura ou co-cultura de Methylobacterium.
[015] Conforme usado neste documento, o termo “cepa” deve incluir todos os isolados de tal cepa.
[016] Conforme usado neste documento, a frase “planta de controle” se refere a uma planta que não recebeu tratamento com um Methylobacterium de aumento de rendimento ou composição compreendendo o mesmo na semente ou em nenhum estágio subsequente do desenvolvimento da planta de controle. Em certas modalidades, uma planta de controle pode ser uma planta que foi tratada com um ingrediente ativo adicional ou um Methylobacterium neutro de rendimento.
[017] Conforme usado neste documento, a frase “co-cultura de Methylobacterium” se refere a uma cultura de Methylobacterium compreendendo pelo menos duas cepas de Methylobacterium ou pelo menos duas espécies de Methylobacterium.
[018] Conforme usado neste documento, a frase “microrganismo contaminante” se refere a microrganismos em uma cultura, caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação ou composição que não foram identificados antes da introdução na cultura, caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação, ou composição.
[019] Conforme usado neste documento, “variante” quando usado no contexto de um isolado de Methylobacterium, se refere a qualquer isolado que tenha DNA genômico cromossômico com pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% identidade de sequência para DNA genômico cromossômico de um isolado de Methylobacterium depositado fornecido aqui. Uma variante de um isolado pode ser obtida de várias fontes, incluindo solo, plantas ou material vegetal e água, particularmente água associada a plantas e/ou agricultura. As variantes incluem derivados obtidos de isolados depositados. Isolados ou cepas de Methylobacterium podem ser sequenciados (por exemplo, conforme ensinado por Sanger et al. (1977), Bentley et al. (2008) ou Caporaso et al. (2012)) e comparação à escala do genoma das sequências conduzidas (Konstantinos et al. (2005)) usando ferramentas de análise de sequência (por exemplo, BLAST, conforme ensinado por Altschul et al. (1990)).
[020] Conforme usado neste documento, “derivado” quando usado no contexto de um isolado de Methylobacterium, se refere a qualquer Methylobacterium que é obtido a partir de um isolado de Methylobacterium depositado fornecido neste documento. Os derivados de um isolado de Methylobacterium incluem, mas não estão limitados a, derivados obtidos por seleção, derivados selecionados por mutagênese e seleção e Methylobacterium geneticamente transformado obtido de um isolado de Methylobacterium. Um “derivado” pode ser identificado, por exemplo, com base na identidade genética com a cepa ou isolado a partir do qual foi obtido e geralmente exibirá DNA genômico cromossômico com sequência de pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7,
99,6% ou 99,5% identidade com o DNA genômico cromossômico da cepa ou isolado do qual foi derivado.
[021] Conforme usado neste documento, o termo “emulsão” se refere a uma mistura coloidal de dois líquidos imiscíveis, em que um líquido é a fase contínua e o outro líquido é a fase dispersa. Em certas modalidades, a fase contínua é um líquido aquoso e a fase dispersa é um líquido que não é miscível, ou parcialmente miscível, no líquido aquoso.
[022] Conforme usado neste documento, a frase “essencialmente livre de microrganismos contaminantes” se refere a uma cultura, caldo de fermentação, produto de fermentação ou composição em que pelo menos cerca de 95% dos microrganismos presentes por quantidade ou tipo na cultura, caldo de fermentação, produto de fermentação ou composição são Methylobacterium desejado ou outros micro-organismos desejados de identidade pré-determinada.
[023] Conforme usado neste documento, a frase “substância sólida inanimada” se refere a uma substância que é insolúvel ou parcialmente solúvel em água ou soluções aquosas e que não é viva ou que não faz parte de um organismo ainda vivo do qual foi derivado.
[024] Conforme usado neste documento, a frase “monocultura de Methylobacterium” se refere a uma cultura de Methylobacterium consistindo em uma única cepa de Methylobacterium.
[025] Conforme usado neste documento, um “pesticida” se refere a um inseticida, fungicida, nematocida, bactericida, ou qualquer combinação dos mesmos.
[026] Conforme usado neste documento, a frase “agente bacteriostático” se refere a agentes que inibem o crescimento de bactérias, mas não matam as bactérias.
[027] Conforme usado neste documento, a frase “pesticida não inibe substancialmente o crescimento do referido Methylobacterium” se refere a qualquer pesticida que, quando fornecido em uma composição compreendendo um produto de fermentação compreendendo uma substância sólida em que uma monocultura ou co-cultura de Methylobacterium é aderida a ela, resulta em não mais do que 50% de inibição de crescimento de Methylobacterium quando a composição é aplicada a uma planta ou parte da planta em comparação com uma composição sem o pesticida. Em certas modalidades, o pesticida resulta em não mais do que 40%, 20%, 10%, 5% ou 1% de inibição do crescimento de Methylobacterium quando a composição é aplicada a uma planta ou parte da planta em comparação com uma composição sem o pesticida.
[028] Conforme usado neste documento, o termo “Methylobacterium” se refere a gêneros e espécies na família methylobacteriaceae, incluindo espécies bacterianas no gênero Methylobacterium e gênero proposto Methylorubrum (Green e Ardley (2018)). Methylobacterium inclui bactérias metilotróficas facultativas pigmentadas de rosa (PPFM) e também abrange as Methylobacterium nodulans não pigmentadas de rosa, bem como mutantes incolores de isolados de Methylobacterium. Por exemplo, e não como forma de limitação, Methylobacterium se refere a bactérias das espécies listadas a seguir, bem como qualquer nova espécie de Methylobacterium que ainda não foi relatada ou descrita que pode ser caracterizada como Methylobacterium ou Methylorubrum com base na análise filogenética: Methylobacterium adhaesivum; Methylobacterium oryzae; Methylobacterium aerolatum; Methylobacterium oxalidis; Methylobacterium aquaticum; Methylobacterium persicinum; Methylobacterium brachiatum; Methylobacterium phyllosphaerae; Methylobacterium brachythecii; Methylobacterium phyllostachyos; Methylobacterium bullatum; Methylobacterium platani; Methylobacterium cerastii; Methylobacterium pseudosasicola; Methylobacterium currus; Methylobacterium radiotolerans; Methylobacterium dankookense; Methylobacterium soli; Methylobacterium frigidaeris; Methylobacterium specialis; Methylobacterium fujisawaense; Methylobacterium tardum; Methylobacterium gnaphalii; Methylobacterium tarhaniae; Methylobacterium goesingense; Methylobacterium thuringiense; Methylobacterium gossipiicola; Methylobacterium trifolii; Methylobacterium gregans; Methylobacterium variabile; Methylobacterium haplocladii; Methylobacterium aminovorans (Methylorubrum aminovorans); Methylobacterium hispanicum; Methylobacterium extorquens (Methylorubrum extorquens); Methylobacterium indicum; Methylobacterium podarium (Methylorubrum podarium); Methylobacterium iners; Methylobacterium populi (Methylorubrum populi); Methylobacterium isbiliense; Methylobacterium pseudosasae (Methylorubrum pseudosasae); Methylobacterium jeotgali; Methylobacterium rhodesianum (Methylorubrum rhodesianum); Methylobacterium komagatae; Methylobacterium rhodinum (Methylorubrum rhodinum); Methylobacterium longum; Methylobacterium salsuginis (Methylorubrum salsuginis); Methylobacterium marchantiae; Methylobacterium suomiense (Methylorubrum suomiense; Methylobacterium mesophilicum; Methylobacterium thiocyanatum (Methylorubrum thiocyanatum); Methylobacterium nodulans; Methylobacterium zatmanii (Methylorubrum zatmanii); Methylobacterium organophilum.
[029] Conforme usado neste documento, a frase “substância sólida” se refere a uma substância que é insolúvel ou parcialmente solúvel em água ou soluções aquosas.
[030] Conforme usado neste documento, a frase “fase sólida que pode ser suspensa na mesma” se refere a uma substância sólida que pode ser distribuída em um líquido por agitação.
[031] Conforme usado neste documento, o termo “não regenerável” se refere a uma parte da planta ou produto vegetal processado que não pode ser regenerado em uma planta inteira.
[032] Conforme usado neste documento, a frase “substancialmente toda a fase sólida está suspensa na fase líquida” se refere a meios em que pelo menos 95%, 98% ou 99% de substância(s) sólida(s) compreendendo a fase sólida são distribuídas por todo o líquido por agitação.
[033] Conforme usado neste documento, a frase “substancialmente toda a fase sólida não está suspensa na fase líquida” se refere a meios em que menos de 5%, 2% ou 1% do sólido está em uma forma particulada que é distribuído no meio por agitação.
[034] Na medida em que qualquer uma das definições anteriores é inconsistente com as definições fornecidas em qualquer referência de patente ou não patente incorporada neste documento por referência, qualquer referência de patente ou não patente citada neste documento, ou em qualquer patente ou não - referência da patente encontrada em outro lugar, entende-se que a definição anterior será usada neste documento.
Methylobacterium que melhora o rendimento, composições que compreendem Methylobacterium que melhora o rendimento, métodos de seu uso e métodos de fabricação
[035] Vários isolados de Methylobacterium que melhora o rendimento, composições compreendendo estes Methylobacterium, métodos de uso das composições para melhorar o rendimento da planta de milho e métodos de preparação das composições são fornecidos aqui. Em certas modalidades, isolados de Methylobacterium que aumentam o rendimento incluem NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B- 67741), NLS0109 (NRRL B-67340) ou suas variantes, ou uma combinação de isolado de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma variante do mesmo e isolado de Methylobacterium NLS0017 (B-50931) ou uma variante do mesmo. Quantidades das composições que compreendem Methylobacterium que melhora o rendimento suficiente para fornecer um rendimento de planta de milho melhorado podem ser determinadas medindo qualquer ou todas as mudanças no rendimento em relação a plantas ou partes de plantas não tratadas. Em certas modalidades, o rendimento pode ser avaliado medindo a produção de sementes por unidade de área (ou seja, alqueires por acre, quilogramas por hectare e semelhantes), onde as plantas tratadas com Methylobacterium que aumentam o rendimento ou que crescem a partir de sementes tratadas com Methylobacterium são cultivadas com aproximadamente a mesma densidade das plantas de controle. Em certas modalidades, o rendimento pode ser avaliado medindo a produção por planta ou por parte da planta (gramas de semente por planta, gramas de semente por espiga, grãos por planta, grãos por espiga e semelhantes) das plantas tratadas com Methylobacterium que melhora o rendimento em comparação com plantas de controle não tratadas.
[036] Methylobacterium isoladas que melhoram o rendimento são fornecidas aqui. Em certas modalidades, Methylobacterium é selecionada do grupo que consiste em M. radiotolerans, M. komagatae e M. gregans. Em certas modalidades, o isolado de Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340) e variantes destes. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento é uma combinação de isolados de Methylobacterium NLS0109 e NLS0017 (NRRL B-50931). Em certas modalidades, o isolado de Methylobacterium que melhora o rendimento pode aumentar o rendimento quando aplicado a uma semente de milho, quando aplicado em estágios vegetativos de desenvolvimento de milho, ou quando aplicado durante estágios reprodutivos de desenvolvimento de milho. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento tem um DNA genômico cromossômico com pelo menos 99%, 99,9, 99,8,
99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B -67742), NLS0648 (NRRL B-67741) ou NLS0109 (NRRL B-67340); ou Methylobacterium que melhora o rendimento é uma combinação de variantes de Methylobacterium de NLS0109 e NLS0017 tendo DNA genômico cromossômico com pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de NLS0109 (NRRL B- 67340) e NLS0017. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento fornece pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8 %, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 15% de melhora no rendimento de uma planta tratada ou uma planta decorrente de uma semente tratada em comparação com plantas de controle não tratadas ou plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas. Em certas modalidades, a Methylobacterium qu emelhora o rendimento fornece pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, a pelo menos cerca de 10% ou pelo menos cerca de 20% de melhora no rendimento de uma planta tratada ou uma planta cultivada a partir de uma semente tratada em comparação com plantas de controle não tratadas ou plantas provenientes de sementes não tratadas.
[037] Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento proporciona maior rendimento quando aplicada a uma semente. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento proporciona melhora no rendimento quando aplicada à semente no sulco no plantio. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento fornece melhora no rendimento quando aplicada durante estágios vegetativos de desenvolvimento. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento proporciona melhora no rendimento quando aplicada imediatamente antes ou durante os estágios reprodutivos de desenvolvimento. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, a composição compreende uma substância sólida em que uma monocultura ou co-cultura de Methylobacterium é aderida à mesma. Em certas modalidades em que Methylobacterium está aderida a uma substância sólida, a composição compreende um coloide formado pela substância sólida em que uma monocultura ou co-cultura de Methylobacterium está aderida a ela e um líquido. Em certas modalidades, o coloide é um gel. Em certas modalidades de certas composições mencionadas anteriormente, a composição é uma emulsão que não contém uma substância sólida. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742) e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionados anteriormente, a Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340) e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é uma combinação de Methylobacterium NLS0109 e NLS0017. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento tem um DNA genômico cromossômico com pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B -67742), NLS0648 (NRRL B-67741) ou NLS0109 (NRRL B-67340); ou Methylobacterium que melhora o rendimento é uma combinação de variantes de Methylobacterium de NLS0109 e NLS0017 com DNA genômico cromossômico com pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de NLS0109 (NRRL B- 67340) e NLS0017 (NRRL B -50931).
[038] Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento isolado pode ser identificado tratando uma planta, uma semente, solo no qual a planta ou uma planta resultante da semente são cultivadas ou outro meio de crescimento de planta em que a planta ou uma planta resultante da semente são cultivadas e testando para elevado rendimento.
[039] Em certas modalidades, sementes de milho ou plantas de milho nos estágios vegetativos de desenvolvimento são tratados com Methylobacterium que melhora o rendimento. Os estágios vegetativos do milho são os seguintes: VE (emergência do coleóptilo imediatamente antes do primeiro colar da folha), V1 (primeira folha com colar), V 2 (primeira e segunda folha com colar), V3 (primeira até a terceira folha com colar), V4 (primeira até a quarta folha com colar), V5 (primeira até a quinta folha com colar), V6 (primeira até sexta folha com colar) e assim por diante até V1 8 (plantas com a 18ª folha com colar). Uma descrição dos estágios vegetativos pode ser encontrada na rede mundial de computadores (internet) em agronext.iastate.edu/com/production/management/growth/ComGrowthandDevelopment .html e em “Com Growth and Development”, Abendroth et al. Publicação PMR 1009 de Extensão da Universidade do Estado de Iowa, março de 2011). Em certas modalidades, as Methylobacterium que melhoram o rendimento são aplicadas em torno do estágio de desenvolvimento VE a cerca do V4, V5 ou V6. Em certas modalidades, as Methylobacterium que melhoram o rendimento são aplicadas a cerca do estágio de desenvolvimento VE, V1, V2 ou V3 a cerca do V4, V5 ou V6. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento que é aplicada à semente ou durante um estágio vegetativo é NLS0807 (NRRL B-67743.
[040] Em certas modalidades, as Methylobacterium que melhoram o rendimento são aplicadas em cerca do es tágio de desenvolvimento V5, V6 a cerca do Vn ou VT a cerca do estágio de desenvolvimento R2, R3, R4, R5 ou R6. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento é aplicada em cerca do estágio de desenvolvimento V1 2, V1 6, V1 8, Vn ou VT até o estágio de desenvolvimento R2, R3 ou R4. Em certas modalidades, as Methylobacterium que melhoran o rendimento são aplicadas em torno do estágio de desenvolvimento R1.
[041] Em certas modalidades, as Methylobacterium que melhoram o rendimento são aplicadas a uma planta transgênica de milho que é tolerante a herbicida, inseto ou doença. Em certas modalidades, as Methylobacterium que melhoram o rendimento são aplicadas antes, durante ou após a aplicação de glifosato a uma planta transgênica de milho que é tolerante ao glifosato. As formulações de glifosato disponíveis comercialmente que podem ser usadas incluem, mas não estão limitadas a, Roundup Original MAX®, Roundup PowerMAX®, Roundup UltraMax® ou RoundUp WeatherMAX® (Monsanto Co., St. Louis, MO., EUA); Touchdown IQ® ou Touchdown Total® (Syngenta, Wilmington, Delaware, EUA); Glyphomax®, Glyphomax Plus® ou Glyphomax XRT® (Dow Agrosciences LLC, Indianapolis, IN, EUA). As plantas de milho são tipicamente pulverizadas com glifosato por volta do estágio de desenvolvimento vegetativo V3 e/ou V6. Em certas modalidades, a Methylobacterium que melhora o rendimento que é aplicada antes, durante ou após a aplicação de glifosato e Methylobacterium que é selecionada para resistência ao glifosato. As seleções para bactérias resistentes ao glifosato que foram descritas (Comai et al. (1983)) podem ser adaptadas para a seleção de Methylobacterium que melhora o rendimento. A seleção e o uso de Methylobacterium que melhroam o rendimento resistentes ao glifosato de populações mutagenizadas ou outras de Methylobacterium, tal como NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B- 67742), NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340), e suas variantes são fornecidas aqui.
[042] Vários isolados de Methylobacterium fornecidos neste documento são divulgados na Tabela 1. Tabela 1. Isolados de Methylobacterium N.º do Nº. do N.º NRRL do ARS Identificador de depósito de USDA isolado NLS 1
[043] Número de depósito para a cepa depositada com AGRICULTURAL RESEARCH SERVICE CULTURE COLLECTION (NRRL) do Centro Nacional de
Pesquisa de Utilização Agrícola, Serviço de Pesquisa Agrícola, Departamento de Agricultura dos EUA, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA sob os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Fins de Procedimento de Patente. Sujeito ao 37 CFR § 1.808 (b), todas as restrições impostas pelo depositante sobre a disponibilidade ao público do material depositado serão irrevogavelmente removidas após a concessão de qualquer patente deste pedido de patente.
[044] As variantes de um isolado de Methylobacterium listado na Tabela 1 incluem isolados obtidos a partir dele por transformação genética, mutagênese e/ou inserção de uma sequência heteróloga. Em algumas modalidades, tais variantes são identificadas pela presença de DNAs genômicos cromossômicos com pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com o DNA genômico cromossômico da cepa da qual foi derivado. Em certas modalidades, tais variantes são distinguidas pela presença de uma ou mais sequências de DNA únicas que incluem: (i) uma sequência única de SEQ ID NOs: 1 a 3, SEQ ID NOs: 13 a 15, SEQ ID NOs: 25- 27, SEQ ID NOs: 37- 39, SEQ ID NOs: 49 a 51, e SEQ ID NOs: 61-73; ou (ii) sequências com pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência em todo o comprimento das SEQ ID NOs: 1 a 3, SEQ ID NOs: 13 a 15, SEQ ID NOs: 25-27, SEQ ID NOs: 37-39, SEQ ID NOs: 49 a 51 e SEQ ID NOs: 61-73.
[045] Pedidos de patentes codesignados que divulgam usos específicos adicionais de certas cepas de Methylobacterium da Tabela 1, tais como: aumentar o rendimento de soja (Publicação do Pedido de Patente U.S. 20160302423); melhorar o cultivo da alface (USPN 10.212.939); melhorar o crescimento do tomate (Publicação do Pedido de Patente U.S. 20170086464); melhorar o rendimento de milho (Publicação do Pedido de Patente U.S. 20160295868); melhorar o rendimento da soja (US2016/0302423); melhorar a produção de frutas (USPN 10.111.438); controlar com rootworm (US 20170238553); controlar nemátodos de lesão de raiz (US20170164618); controlar nemátodos de nós de raiz (US20170135352); e controlar doenças fúngicas (US20180295841 e WO2018106899) e estão cada um aqui incorporado por referência.
[046] Também são fornecidos neste documento métodos para melhorar o rendimento de milho que compreendem a aplicação de qualquer uma das composições supracitadas fornecidas neste documento a uma planta ou uma parte da planta em uma quantidade que proporciona maior rendimento de milho na planta, parte da planta ou uma planta obtida a partir dela em relação ao rendimento de uma planta de controle, parte da planta ou planta obtida a partir da mesma que não recebeu uma aplicação da composição. Em certas modalidades, a parte da planta é selecionada a partir do grupo que consiste em uma folha, um caule, uma flor, uma raiz, uma espiga e uma semente. Em certas modalidades, o método compreende ainda a etapa de colher pelo menos uma parte da planta selecionada do grupo que consiste em uma folha, um caule, uma flor, uma raiz, uma espiga ou uma semente da planta ou parte da planta. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente, os métodos compreendem ainda a obtenção de um alimento processado ou composição de ração a partir da planta ou parte da planta. Em certas modalidades, o alimento processado ou composição de ração é uma refeição ou uma pasta. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741) ou NLS0109 (NRRL B -67340), e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é uma combinação de Methylobacterium NLS0109 e NLS0017, ou suas variantes.
[047] Também são fornecidos métodos para preparar as composições úteis para melhorar o rendimento de milho que compreendem a combinação de um Methylobacterium que melhora o rendimento com um excipiente agricolamente aceitável e/ou com um adjuvante agricolamente aceitável. Em certas modalidades dos métodos, Methylobacterium adere a uma substância sólida. Em certas modalidades dos métodos, a Methylobacterium aderida à substância sólida é combinada com um líquido para formar uma composição que é um coloide. Em certas modalidades dos métodos, o coloide é um gel. Em certas modalidades dos métodos, Methylobacterium aderida à substância sólida é fornecidoa por cultura do Methylobacterium na presença da substância sólida. Em certas modalidades dos métodos, a composição compreende uma emulsão. Em certas modalidades dos métodos, a Methylobacterium é fornecida cultivando Methylobacterium em uma emulsão. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742) e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340) e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora e rendimento é uma combinação de Methylobacterium NLS0109 e NLS0017, ou suas variantes.
[048] Métodos em que Methylobacterium são cultivados em meio bifásico compreendendo uma fase líquida e uma substância sólida foram encontrados para aumentar significativamente o rendimento resultante de Methylobacterium em relação aos métodos onde Methylobacterium é cultivada em meio líquido sozinho. Em certas modalidades, os métodos podem compreender o crescimento de Methylobacterium em meio líquido com uma substância sólida em partículas que pode ser suspensa no líquido por agitação sob condições que proporcionam o crescimento de Methylobacterium. Em certas modalidades em que são utilizadas substâncias sólidas em partículas, pelo menos substancialmente toda a fase sólida pode ser suspensa na fase líquida por agitação. Essas substâncias sólidas em partículas podem compreender materiais que têm cerca de 1 milímetro ou menos de comprimento ou diâmetro. Em certas modalidades, o grau de agitação é suficiente para fornecer distribuição uniforme da substância sólida particulada na fase líquida e/ou níveis ideais de aeração da cultura. No entanto, em outras modalidades fornecidas neste documento, pelo menos substancialmente toda a fase sólida não está suspensa na fase líquida, ou porções da fase sólida são suspensas na fase líquida e porções da fase sólida não estão suspensas na fase líquida. Substâncias sólidas não particuladas podem ser usadas em certos meios bifásicos onde a fase sólida não está suspensa na fase líquida. Essas substâncias sólidas não particuladas incluem, mas não estão limitadas a, materiais que são maiores do que cerca de 1 milímetro de comprimento ou diâmetro. Essas substâncias sólidas particuladas e não particuladas também incluem, mas não estão limitadas a, materiais que são porosos, fibrosos ou de outra forma configurados para fornecer áreas de superfície aumentadas para o crescimento aderente da Methylobacterium. Os meios bifásicos em que porções da fase sólida estão suspensas na fase líquida e porções da fase sólida não estão suspensas na fase líquida podem compreender uma mistura de substâncias sólidas em partículas e não em partículas.
Tais substâncias sólidas particuladas e não particuladas utilizadas em qualquer um dos meios bifásicos mencionados também incluem, mas não estão limitados a, materiais que são porosos, fibrosos ou configurados de outra forma para fornecer áreas de superfície aumentadas para o crescimento aderente da Methylobacterium.
Em certas modalidades, o meio compreende um coloide formado por uma fase sólida e uma fase líquida.
Um coloide compreendendo um sólido e um líquido pode ser pré-formado e adicionado ao meio líquido ou pode ser formado em meio contendo um sólido e um líquido.
Os coloides compreendendo um sólido e um líquido podem ser formados submetendo certas substâncias sólidas a uma mudança química e/ou térmica.
Em certas modalidades, o coloide é um gel.
Em certas modalidades, a fase líquida do meio é uma emulsão.
Em certas modalidades, a emulsão compreende um líquido aquoso e um líquido que não é miscível, ou apenas parcialmente miscível, no líquido aquoso.
Os líquidos que não são miscíveis, ou apenas parcialmente miscíveis, em água incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos seguintes: (1) líquidos com uma miscibilidade em água que é igual ou inferior à do pentanol, hexanol ou heptanol a 25 graus C; (2) líquidos que compreendem um álcool, um aldeído, uma cetona, um ácido graxo, um fosfolipídeo ou qualquer combinação dos mesmos; (3) álcoois selecionados do grupo que consiste em álcoois alifáticos contendo pelo menos 5 carbonos e esteróis; (4) um óleo animal, óleo microbiano, óleo sintético, óleo vegetal ou uma combinação dos mesmos; e/ou, (5) um óleo vegetal é selecionado do grupo que consiste em milho, soja, algodão, amendoim, girassol, azeitona, linho, coco, palma, colza, semente de gergelim, cártamo e suas combinações.
Em certas modalidades, o líquido imiscível ou parcialmente imiscível pode compreender pelo menos cerca de 0,02% a cerca de 20% da fase líquida em massa.
Em certas modalidades, os métodos podem compreender obter um meio de cultura bifásico compreendendo o líquido, o sólido e Methylobacterium e incubar a cultura sob condições que proporcionam o crescimento do Methylobacterium.
Os meios de cultura bifásicos compreendendo o líquido, o sólido e Methylobacterium podem ser obtidos por uma variedade de métodos que incluem, mas não estão limitados a, qualquer um de: (a) inocular um meio bifásico compreendendo o líquido e a substância sólida com
Methylobacterium; (b) inocular a substância sólida com Methylobacterium e, em seguida, introduzir a substância sólida compreendendo Methylobacterium no meio líquido; (c) inocular a substância sólida com Methylobacterium, incubar Methylobacterium na substância sólida e, em seguida, introduzir a substância sólida compreendendo Methylobacterium no meio líquido; ou (d) qualquer combinação de (a), (b) ou (c). Métodos e composições para o cultivo de Methylobacterium em meio bifásico compreendendo um líquido e um sólido são divulgados nas Patentes US 9.181.541 e
9.845.462, que estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade, e no Pedido de Patente Internacional WO2013181610 publicado em 5 de dezembro de 2013, que está incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[049] Os métodos em que Methylobacterium são cultivados em meios compreendendo uma emulsão também foram encontrados para aumentar significativamente o rendimento resultante de Methylobacterium em relação aos métodos onde as Methylobacterium são cultivadas em meio líquido sozinho. Em certas modalidades, os métodos para preparar as composições aqui fornecidas podem compreender o crescimento da Methylobacterium que melhora o rendimento em uma emulsão sob condições que proporcionamo crescimento de Methylobacterium. Meios que compreendem a emulsão e Methylobacterium que melhora o rendimento podem ser obtidos por uma variedade de métodos que incluem, mas não estão limitados a, qualquer um de: (a) inocular um meio compreendendo a emulsão com Methylobacterium; (b) inocular o líquido aquoso com Methylobacterium, introduzir o líquido não aquoso e misturar para formar uma emulsão; (c) inocular o líquido aquoso com Methylobacterium, introduzir o líquido não aquoso e misturar para formar uma emulsão; ou (d) qualquer combinação de (a), (b) ou (c). Em certas modalidades, a emulsão compreende um líquido aquoso e um líquido que não é miscível, ou apenas parcialmente miscível, no líquido aquoso. Líquidos não aquosos que não são miscíveis, ou apenas parcialmente miscíveis, em água incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos seguintes: (1) líquidos com uma miscibilidade em água igual ou inferior à do n-pentanol, n-hexanol ou n-heptanol a 25 graus C; (2) líquidos que compreendem um álcool, um aldeído, uma cetona, um ácido graxo, um fosfolipídeo ou qualquer combinação dos mesmos; (3) álcoois são selecionados a partir do grupo que consiste em álcoois alifáticos contendo pelo menos 5, 6 ou 7 carbonos e esteróis; (4) um óleo animal, óleo microbiano, óleo sintético, óleo vegetal ou uma combinação dos mesmos; e/ou, (5) um óleo vegetal é selecionado do grupo que consiste em milho, soja, algodão, amendoim, girassol, azeitona, linho, coco, palma, colza, semente de gergelim, cártamo e suas combinações. Em certas modalidades, o líquido não aquoso imiscível ou parcialmente imiscível pode compreender pelo menos cerca de 0,02% a cerca de 20% da emulsão em massa. Em certas modalidades, o líquido não aquoso imiscível ou parcialmente imiscível pode compreender pelo menos cerca de 0,05%, 0,1%, 0,5% ou 1% a cerca de 3%, 5%, 10% ou 20% da emulsão em massa. Métodos e composições para o cultivo de Methylobacterium em meios compreendendo uma emulsão são divulgadas na Patente US 10.287.544 codesignada e na Publicação de Patente Internacional WO2014194189, publicada em 4 de dezembro de 2014, que está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[050] Em algumas modalidades, a composição ou método divulgado neste documento pode compreender um ou mais componentes adicionais. Em algumas modalidades, um segundo componente pode ser um ingrediente ativo adicional, por exemplo, um pesticida ou um segundo produto composto biológico. O pesticida pode ser, por exemplo, um inseticida, um fungicida, um herbicida ou um nematicida. O segundo composto biológico pode ser um agente de controle composto biológico.
[051] Exemplos não limitativos de inseticidas e nematicidas incluem carbamatos, diamidas, lactonas macrocíclicas, neonicotinóides, organofosfatos, fenilpirazol, piretrinas, espinosinas, piretróides sintéticos, ácidos tetrônico e tetrâmico. Em modalidades particulares, os inseticidas e nematicidas incluem abamectina, aldicarbe, aldoxicarbe, bifentrina, carbofurano, clorantranibporle, clotianidina, ciflutrina, cialotrina, cipermetrina, deltametrina, dinotefurano, emamectina, etiprol, fenamifos, fipronil, flubendiamida, fostiazato, imidacloprida, ivermectina, lambda-cialotrina, milbemectina, nitenpirame, oxamil, permetrina, tioxazafeno, espinetoram, espinosade, espirodiclofeno, espirotetramata, teflutrina, tiaclopride, tiametoxame e tiodicarbe.
[052] Exemplos não limitativos de fungicidas úteis incluem hidrocarbonetos aromáticos, benzimidazóis, benzotiadiazol, carboxamidas, amidas de ácido carboxílico, morfolinas, fenilamidas, fosfonatos, inibidores externos de quinona (por exemplo, estrobilurinas), tiazobdinas, tiofanatos, tiofenocarboxamidas e triazóis. Exemplos particulares de fungicidas incluem acibenzolar-S-metil, azoxistrobina, benalaxil, bixafen, boscabd, carbendazim, ciproconazol, dimetomorfo, epoxiconazol, fluopiram, fluoxastrobina, flutianil, flutolanil, fluxapiroxadol, meoximorfa, fosetil-alfenazole, fuxamiroxad, fosetil-al-metila, metalaxil, metconazol, micobutanil, orisastrobina, penflufen, pentiopirade, picoxistrobina, propiconazol, protioconazol, piraclostrobina, sedaxano, siltiofam, tebuconazol, tifluzamida, tiofanato, tolclofos-metil, trifloxistrobina e triticonazol.
[053] Exemplos não limitativos de herbicidas incluem inibidores de ACCase, acetanilidas, inibidores de AHAS, inibidores da biossíntese de carotenoides, inibidores de EPSPS, inibidores de glutamina sintetase, inibidores de PPO, inibidores de PS II e auxinas sintéticas. Exemplos particulares de herbicidas incluem acetocloro, clethodim, dicamba, flumioxazin, fomesafen, glifosato, glufosinato, mesotriona, quizalofop, saflufenacil, sulcotriona e 2,4-D.
[054] Em algumas modalidades, as composições ou métodos divulgados neste documento podem compreender um ingrediente ativo adicional que pode ser um segundo composto biológico. O segundo composto biológico pode ser um agente de biocontrole, outros microrganismos benéficos, extratos microbianos, produtos naturais, ativadores de crescimento de plantas ou um agente de defesa de plantas. Exemplos não limitativos de agentes de biocontrole incluem bactérias, fungos, nematóides benéficos e vírus.
[055] Em certas modalidades, o segundo produto composto biológico pode ser Methylobacterium. Em certas modalidades, o segundo composto biológico é Methylobacterium listada na Tabela 1. Em certas modalidades, o segundo composto biológico é selecionado a partir do grupo que consiste em ISO01 (NRRL B-50929), ISO02 (NRRL B-50930), ISO03 (NRRL B-50931), ISO04 (NRRL B-50932), ISO05 (NRRL B-50933), ISO06 (NRRL B-50934), ISO07 (NRRL B -50935), ISO08 (NRRL B- 50936), ISO09 (NRRL B-50937), ISO10 (NRRL B-50938), ISO11 (NRRL B-50939), ISO12 (NRRL B-50940), ISO13 (NRRL B- 50941) e ISO14 (NRRL B-50942). Em certas modalidades, o segundo composto biológico pode ser Methylobacterium com DNA genômico cromossômico com pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6% ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de ISO01 (NRRL B-50929), ISO02 (NRRL B-50930), ISO03 (NRRL B-50931), ISO04 (NRRL B-50932), ISO05
(NRRL B-50933), ISO06 (NRRL B-50934), ISO07 (NRRL B-50935), ISO08 (NRRL B -50936), ISO09 (NRRL B-50937), ISO10 (NRRL B-50938), ISO111 (NRRL B-50939), ISO12 (NRRL B-50940), ISO13 (NRRL B-50941) ou ISO14 (NRRL B -50942). Em certas modalidades, o segundo composto biológico pode ser Methylobacterium selecionada de M. gregans, M. radiotolerans, M. extorquens, M. populi, M. salsuginis, M. brachiatum e M. komagatae.
[056] Em certas modalidades, o segundo produto composto biológico pode ser uma bactéria do gênero Actinomicetes, Agrobacterium, Arthrobacter, Alcaligenes, Aureobacterium, Azobacter, Beijerinckia, Brevibacillus, Burkholderia, Chromobacterium, Clostridium, Clavibacter, Comomonas, Corynebacterium, Curtobacterium, Curtobacterium, Brevibacillus, Burkholderia, Chromobacterium, Clostridium, Clavibacter, Comomonas, Corynebacterium, Curtobacterium, Pyobacterium, Pianobacterium, Flavobacterium, Pianobacterium, Flavobacterium, Pianobacterium, Flavobacterium, Pianobacterium, Flavobacterium, Flobingobacterium, Flavobacterium, Flobingobacterium, Flavobacteria, Photorhabdus, Phyllobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Bradyrhizobium, Serratia, Stenotrophomonas, Variovorax e Xenorhadbus. Em modalidades particulares, a bactéria é selecionada a partir do grupo que consiste em Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus flrmus, Bacillus, lichenformis, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Chromobacterium sutts, Pasteuria penetruga, Pasteuria e Pseudomona fluorescens.
[057] Em certas modalidades, o segundo composto biológico pode ser um fungo do gênero Alternaria, Ampelomyces, Aspergillus, Aureobasidium, Beauveria, Colletotrichum, Coniothyrium, Gliocladium, Metarhisium, Muscodor, Paecilonyces, Trichoderma, Typhula, Ulocladium e Verticilium. Em modalidades particulares, o fungo é Beauveria bassiana, Coniothyrium minitans, Gliocladium vixens, Muscodor albus, Paecilomyces lilacinus ou Trichoderma polysporum.
[058] Em outras modalidades, o segundo composto biológico pode ser um ativador de crescimento de planta ou agente de defesa de planta incluindo, mas não se limitando a harpina, Reynoutria sachalinensis, jasmonato, lipocitooligossacarídeos e isoflavonas.
[059] Em outras modalidades, o segundo composto biológico pode incluir, mas não está limitado a, vários Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp., e Trichoderma sp. Os biopesticidas microbianos podem ser bactérias, fungos, vírus ou protozoários. Biopesticidas de micro-organismos particularmente úteis incluem várias cepas de Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Pseudomonas syringae, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens e Streptomyces lydicus. Outros micro-organismos que são adicionados podem ser isolados geneticamente modificados ou de tipo selvagem que estão disponíveis como culturas puras. Em certas modalidades, prevê-se que o agente de composto biológico ou de biocontrole pode ser fornecido no caldo de fermentação, produto do caldo de fermentação ou composição na forma de um esporo.
[060] Em certas modalidades, o caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação ou composições que compreendem Methylobacterium que melhora o rendimento podem compreender ainda um ou mais ingredientes ativos adicionais introduzidos ou micro- organismo de identidade pré-determinada diferente de Methylobacterium.
[061] Em certas modalidades, o meio de cultura líquido é preparado a partir de componentes baratos e prontamente disponíveis, incluindo, mas não se limitando a, sais inorgânicos, como fosfato de potássio, sulfato de magnésio e semelhantes, fontes de carbono, como glicerol, metanol, ácido glutâmico, ácido aspártico, ácido succínico e semelhantes, e misturas de aminoácidos, tais como peptona, triptona e semelhantes. Meios líquidos exemplificativos que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, meio de sais minerais de amônio (AMS) (Whittenbury el al, 1970), meio de cultura mínimo Vogel-Bonner (VB) (Vogel e Bonner, 1956) e caldo LB (“Caldo Luria -Bertani”).
[062] Em geral, uma substância sólida que pode ser usada nos métodos e composições para proporcionar o crescimento eficiente de Methylobacterium pode ser qualquer substância sólida adequada que seja insolúvel ou apenas parcialmente solúvel em água ou soluções aquosas. Essas substâncias sólidas adequadas também são não bactericidas ou não bacteriostáticas no que diz respeito à Methylobacterium que melhora o rendimento quando as substâncias sólidas são fornecidas no meio de cultura líquido. Em certas modalidades, tais substâncias sólidas adequadas também são substâncias sólidas que são facilmente obtidas na forma estéril ou tornadas estéreis. As substâncias sólidas podem ser esterilizadas por qualquer método que forneça a remoção de micro-organismos contaminantes e, portanto, incluem, mas não estão limitados a, métodos como autoclavagem, irradiação, tratamento químico e qualquer combinação dos mesmos.
Essas substâncias sólidas incluem substâncias naturais de origem animal, vegetal, microbiana, fúngica ou mineral, substâncias artificiais ou combinações de substâncias naturais e artificiais.
Em certas modalidades, as substâncias sólidas são substâncias sólidas inanimadas.
Substâncias sólidas inanimadas de origem animal, vegetal, microbiana ou fúngica podem ser obtidas de animais, plantas, micróbios ou fungos que são inviáveis (ou seja, não vivem mais) ou que se tornaram inviáveis.
As cascas de diatomáceas são, portanto, substâncias sólidas inanimadas quando as algas diatomáceas previamente associadas foram removidas ou tornadas inviáveis.
Uma vez que as conchas de diatomáceas são substâncias sólidas inanimadas, não são consideradas organismos fotossintéticos ou micro-organismos fotossintéticos.
Em certas modalidades, as substâncias sólidas incluem, mas não estão limitadas a, areia, silte, solo, argila, cinza, carvão, terra diatomácea e outros minerais semelhantes, vidro moído ou contas de vidro, materiais cerâmicos moídos, contas de cerâmica, bentonita, caulim, talco, perlita, mica, vermiculita, sílicas, pó de quartzo, montmorilonita e suas combinações.
Em certas modalidades, uma substância sólida pode ser um polímero ou grânulos poliméricos.
Os polímeros que podem ser usados como uma substância sólida incluem, mas não estão limitados a, vários polissacarídeos, como polímeros celulósicos e polímeros quitinosos que são insolúveis ou apenas parcialmente solúveis em água ou soluções aquosas, ágar (ou seja, galactanos) e combinações dos mesmos.
Em certas modalidades, uma substância sólida pode ser um cristal de sal insolúvel ou apenas parcialmente solúvel.
Os cristais de sal que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, carbonatos insolúveis ou apenas parcialmente solúveis, cromatos, sulfitos, fosfatos, hidróxidos, óxidos e sulfetos.
Em certas modalidades, uma substância sólida pode ser uma célula microbiana, célula fúngica, esporo microbiano ou esporo fúngico.
Em certas modalidades, uma substância sólida pode ser uma célula microbiana ou esporo microbiano em que a célula microbiana ou esporo microbiano não é um micro-organismo fotossintético.
Em certas modalidades, a célula microbiana ou esporo microbiano não é um micro-organismo fotossintético, em que o micro-organismo fotossintético é selecionado do grupo que consiste em algas,
cianobactérias, diatomáceas, Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Graciaia, Pleurochrysis carterae, Sargassum e Ulva. Em ainda outras modalidades, uma substância sólida pode ser uma célula microbiana inativada (isto é, inviável), célula fúngica, esporo microbiano ou esporo fúngico. Em ainda outras modalidades, uma substância sólida pode ser uma célula microbiana quiescente (isto é, viável, mas não ativamente em divisão), célula fúngica, esporo microbiano ou esporo fúngico. Em ainda outras modalidades, uma substância sólida pode ser detritos celulares de origem microbiana. Em ainda outras modalidades, uma substância sólida pode ser matéria particulada de qualquer parte de uma planta. As partes da planta que podem ser usadas para obter a substância sólida incluem, mas não estão limitadas a, espigas, cascas, cascas, folhas, raízes, flores, caules, cascas, sementes e combinações dos mesmos. Produtos obtidos a partir de partes de plantas processadas, incluindo, mas não se limitando a, bagaço, farelo de trigo, grãos de soja, torta de semente triturada, palha e semelhantes também podem ser usados. Essas partes da planta, plantas processadas e/ou partes da planta processada podem ser moídas para obter o material sólido em uma forma particulada que pode ser usada. Em certas modalidades, madeira ou um produto de madeira incluindo, mas não se limitando a, polpa de madeira, serragem, aparas e semelhantes podem ser usados. Em certas modalidades, a substância sólida pode ser uma matéria particulada de um animal(is) incluindo, mas não se limitando a, farinha de osso, gelatina, cascas moídas ou em pó, cabelo, pele macerada e semelhantes.
[063] Em certas modalidades, uma substância sólida é fornecida em uma forma particulada que fornece a distribuição da substância sólida no meio de cultura. Em certas modalidades, uma substância sólida é composta por partículas de cerca de 2 mícrons a cerca de 1.000 mícrons de comprimento médio ou diâmetro médio. Em certas modalidades, uma substância sólida é composta por partículas de cerca de 1 mícron a cerca de 1.000 mícrons de comprimento médio ou diâmetro médio. Em certas modalidades, uma substância sólida é uma partícula de cerca de 1, 2, 4, 10, 20 ou 40 mícrons a qualquer um de cerca de 100, 200, 500, 750 ou 1.000 mícrons de comprimento médio ou diâmetro médio. As características desejáveis das partículas utilizadas nos métodos e composições aqui fornecidas incluem molhabilidade adequada de modo que as partículas possam ser suspensas ao longo do meio após agitação.
[064] Em certas modalidades, uma substância sólida é fornecida no meio como um coloide, em que a fase contínua é um líquido e a fase dispersa é o sólido. Sólidos adequados que podem ser usados para formar coloides em meios líquidos para crescer Methylobacterium que melhoram o rendimento incluem, mas não estão limitados a, vários sólidos que são referidos como hidrocoloides. Esses hidrocoloides usados nos meios, métodos e composições aqui fornecidos podem ser polímeros hidrofílicos de origem vegetal, animal, microbiana ou sintética. Os polímeros hidrocoloides usados nos métodos podem conter muitos grupos hidroxila e/ou podem ser polieletrólitos. Polímeros hidrocoloides usados nas composições e métodos aqui fornecidos incluem, mas não estão limitados a, ágar, alginato, arabinoxilano, carragenina, carboximetilcelulose, celulose, curdlana, gelatina, gelano, b-glucana, goma guar, goma arábica, goma de alfarroba, pectina, amido, goma xantana e suas misturas. Em certas modalidades, um coloide usado nos meios, métodos e composições aqui fornecidos pode compreender um polímero hidrocoloide e uma ou mais proteínas.
[065] Em certas modalidades, uma substância sólida pode fornecer crescimento aderente do Methylobacterium que melhora o rendimento na substância sólida. Methylobacteriums que melhoram o rendimento que estão aderidas a uma substância sólida são Methylobacteriums que não podem ser substancialmente removidas simplesmente lavando a substância sólida com Methylobacterium que melhora o rendimento aderente com meio de crescimento, enquanto que Methylobacterium não aderente pode ser substancialmente removida por lavagem da substância sólida com meio de crescimento líquido . Neste contexto, “substancialmente removido” significa que pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% das Methylobacteriums presentes são removidas quando a substância sólida é lavada com três volumes de meio de crescimento líquido. Tal lavagem pode ser efetuada por uma variedade de métodos incluindo, mas não se limitando a, decantação do líquido de uma fase sólida lavada ou passagem do líquido através de uma fase sólida em um filtro que permite o fluxo de bactérias no líquido. Em certas modalidades, Methylobacterium que melhoram o rendimento aderentes associadas ao sólido podem incluir Methylobacterium que estão diretamente ligadas a um sólido e/ou Methylobacterium que estão indiretamente ligadas a uma substância sólida. Methylobacterium que estão indiretamente ligadas a uma substância sólida incluem, mas não estão limitados a, Methylobacterium que estão ligadas a outra Methylobacterium ou a outro micro-organismo que está ligado a uma substância sólida, Methylobacterium que está ligada a uma substância sólida por estar ligada a outra substância que está ligada a uma substância sólida e semelhantes.
Em certas modalidades, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% da Methylobacterium no caldo de fermentação, produto do caldo de fermentação ou composições são Methylobacterium que aderiram a uma substância sólida.
Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento aderente pode estar presente na superfície de uma substância sólida no caldo de fermentação, produto do caldo de fermentação ou composição a uma densidade de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/20 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/10 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/10 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/5 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/2 micrômetros quadrados, ou de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/micrômetro quadrado.
Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento aderente pode estar presente na superfície de uma substância sólida no caldo de fermentação, produto do caldo de fermentação ou composição a uma densidade de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/ 20 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/micrômetro quadrado, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/10 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/micrômetro quadrado, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/10 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/micrômetro quadrado, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/ 5 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/micrômetro quadrado, ou de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/2 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/micrômetro quadrado.
Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento aderente pode estar presente na superfície de uma substância sólida no caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação ou composição a uma densidade de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/2 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/ 2 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/10 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/2 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/10 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/2 micrômetros quadrados, ou de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/5 micrômetros quadrados a cerca de 1 Methylobacterium/2 micrômetros quadrados. Os caldos de fermentação bifásicos fornecidos neste documento podem compreender uma fase líquida que contém Methylobacterium não aderente. Em certas modalidades, os títulos de Methylobacterium não aderente na fase líquida podem ser inferiores a cerca de 100.000, 10.000 ou 1.000 CFU/ml. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0807 (NRRL B- 67743), NLS0662 (NRRL B-67742) e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340) e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é uma combinação de Methylobacterium NLS0109 e NLS0017, ou suas variantes.
[066] Caldos de fermentação com Methylobacterium que melhora o rendimento a um título superior a cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mililitro, a um título superior a cerca de 1x109 unidades formadoras de colônia por mililitro, a um título superior a cerca de 1x1010 colônia unidades formadoras por mililitro, em um título de pelo menos cerca de 3x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro são fornecidas aqui. Em certas modalidades, os caldos de fermentação fornecidos neste documento podem compreender Methylobacterium que melhora o rendimento a um título de pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 3x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 5x108 colônia unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 4x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro. Em certas modalidades, os caldos de fermentação aqui fornecidos podem compreender Methylobacterium que melhora o rendimento a um título de pelo menos cerca de 1x109 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 3x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x109 colônia unidades de formação por mililitro a pelo menos cerca de 4x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 1xx109 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro. Em certas modalidades, os caldos de fermentação fornecidos neste documento compreenderão Methylobacterium que melhora o rendimento a um título de pelo menos cerca de 1x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 3x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x1010 colônia unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 4x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 1x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro. Em certas modalidades, os caldos de fermentação aqui fornecidos compreenderão o rendimento de Methylobacterium potenciador a um título de, pelo menos cerca de 3x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 4x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 3x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742) e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340) e suas variantes. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium que melhora o rendimento é uma combinação de Methylobacterium NLS0109 e NLS0017, ou suas variantes.
[067] Methylobacterium que melhora o rendimento pode ser obtido como produtos de fermentação e usado para fazer várias composições úteis para o tratamento de plantas ou partes de plantas para melhorar o rendimento de milho. As composições de Methylobacterium podem ser aplicadas a plantas ou partes de plantas em várias formas, incluindo, por exemplo, como composições líquidas ou como composições secas, por exemplo, pós secos. Plantas ou partes de plantas que foram pelo menos parcialmente revestidas ou revestidas com os produtos do caldo de fermentação ou composições compreendendo Methylobacterium que melhora o rendimento são assim fornecidas.
Em certas modalidades, a parte da planta é uma semente.
O revestimento parcial de uma planta ou parte da planta, como uma semente, inclui, mas não está limitado a, revestir pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou cerca de 99,5% da área de superfície da planta, parte da planta ou semente da planta.
Também são fornecidos produtos vegetais processados que contêm os produtos ou composições de caldo de fermentação com Methylobacterium que melhora o rendimento ou Methylobacterium que melhora o rendimento aderente.
Em algumas modalidades, substâncias sólidas com Methylobacterium que melhora o rendimento aderente podem ser usadas para fazer várias composições que são particularmente úteis para o tratamento de sementes de plantas.
Sementes que foram pelo menos parcialmente revestidas com os produtos ou composições de caldo de fermentação são assim fornecidas.
O revestimento parcial de uma semente inclui, mas não está limitado a, revestir pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98 %, 99% ou cerca de 99,5% da área de superfície da semente.
Também são fornecidos produtos de sementes processados incluindo, mas não se limitando a, pap, farinha, ração e flocos que contêm os produtos ou composições de caldo de fermentação aqui fornecidos.
Em certas modalidades, o produto vegetal processado será não regenerável (ou seja, será incapaz de se desenvolver em uma planta). Em certas modalidades, a substância sólida usada no produto ou composição de fermentação que reveste pelo menos parcialmente a planta ou parte da planta ou que está contida na planta processada ou produto da parte da planta compreende uma substância sólida e Methylobacterium que melhora o rendimento associada ou aderida que pode ser facilmente identificada comparando uma planta tratada e uma não tratada ou parte da planta ou produto processado das mesmas.
Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0807 (NRRL B- 67743), NLS0662 (NRRL B-67742) e suas variantes.
Em certas modalidades, Methylobacterium que melhora o rendimento é selecionada do grupo que consiste em NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340) e suas variantes.
Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente,
Methylobacterium que melhora o rendimento é uma combinação de Methylobacterium NLS0109 e NLS0017, ou suas variantes.
[068] As composições úteis para o tratamento de plantas ou partes de plantas que compreendem Methylobacterium que melhora o rendimento também podem compreender ainda componentes adicionais, incluindo um ingrediente ativo, um adjuvante aceitável em agricultura ou um excipiente aceitável em agricultura. Um adjuvante agricolamente aceitável ou um excipiente agricolamente aceitável é tipicamente um ingrediente que não causa fitotoxicidade indevida ou outros efeitos adversos quando exposto a uma planta ou parte da planta. Em certas modalidades, uma substância sólida usada em um caldo de fermentação pode ser ela própria um adjuvante aceitável em agricultura ou um excipiente aceitável em agricultura, desde que não seja bactericida ou bacteriostática para a Methylobacterium. Em algumas modalidades, adjuvantes e/ou excipientes agricolamente aceitáveis são adicionados à Methylobacterium para aumentar a estabilidade e/ou vida útil. Em outras modalidades, a composição compreende ainda pelo menos um de um adjuvante agricolamente aceitável ou um excipiente agricolamente aceitável. Qualquer uma das composições mencionadas anteriormente também pode compreender ainda um ingrediente ativo adicional. Em certas modalidades, o ingrediente ativo adicional é um pesticida usado na composição que não inibe substancialmente o crescimento da Methylobacterium. Como as Methylobacteriums são bactérias gram negativas, os bactericidas adequados usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, bactericidas que exibem atividade contra bactérias gram positivas, mas não bactérias gram negativas. As composições aqui fornecidas também podem compreender um agente bacteriostático que não inibe substancialmente o crescimento das Methylobacterium. Os agentes bacteriostáticos adequados para uso em composições aqui fornecidas incluem, mas não estão limitados a, os que exibem atividade contra bactérias gram positivas, mas não bactérias gram negativas. Qualquer uma das composições mencionadas anteriormente também pode ser um produto essencialmente seco (isto é, tendo cerca de 5% ou menos de teor de água), uma mistura da composição com uma emulsão ou uma suspensão.
[069] Os adjuvantes agricolamente aceitáveis usados nas composições que compreendem Methylobacterium que melhora o rendimento incluem, mas não estão limitados a, componentes que aumentam a eficácia do produto e/ou produtos que aumentam a facilidade de aplicação do produto. Os adjuvantes que aumentam a eficácia do produto podem incluir vários umidificadores/espalhadores que promovem a adesão e espalhamento da composição nas partes da planta, adesivos que promovem a adesão à parte da planta, penetrantes que podem promover o contato do agente ativo com os tecidos internos, extensores que aumentam o meia-vida do agente ativo por inibição da degradação ambiental e umectantes que aumentam a densidade ou o tempo de secagem das composições pulverizadas. Umidificadores/espalhadores usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, surfactantes não iônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfotéricos, tensoativos organo-silicatos e/ou tensoativos acidificados. Os adesivos usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, substâncias à base de látex, terpeno/pinoleno e substâncias à base de pirrolidona. Os penetrantes podem incluir óleo mineral, óleo vegetal, óleo vegetal esterificado, tensoativos organo-silicatos e tensoativos acidificados. Os extensores usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, sulfato de amônio ou substâncias à base de menteno. Os umectantes usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, glicerol, propilenoglicol e dietilglicol. Os adjuvantes que melhoram a facilidade de aplicação do produto incluem, mas não estão limitados a, agentes acidificantes/tamponantes, agentes antiespumantes/desespumantes, agentes de compatibilidade, agentes redutores de deriva, corantes e condicionadores de água. Os agentes antiespumantes/desespumantes usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, dimetopolissiloxano. Os agentes de compatibilidade usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, sulfato de amônio. Os agentes redutores de deriva usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, poliacrilamidas e polissacarídeos. Os condicionadores de água usados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, sulfato de amônio.
[070] Métodos de tratamento de plantas e/ou partes de plantas com caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação e composições compreendendo Methylobacterium que melhora o rendimento também são fornecidos aqui. As plantas tratadas e as partes das plantas tratadas obtidas a partir das mesmas incluem, mas não se limitam a, milho. As partes da planta de milho que são tratadas incluem, mas não estão limitadas a, folhas, caules, raízes primárias, raízes nodais, sementes, frutos, borlas, sedas, cascas, bainhas, hastes, coleópteis e semelhantes. Sementes ou outros propágulos de qualquer uma das plantas de milho mencionadas anteriormente podem ser tratados com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação e/ou composições aqui fornecidos.
[071] Em certas modalidades, as plantas e/ou partes da planta são tratadas aplicando os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação e composições que compreendem Methylobacterium que melhora o rendimento como um spray. Essas aplicações de pulverização incluem, mas não estão limitadas a, tratamentos de uma única parte da planta ou qualquer combinação de partes da planta. A pulverização pode ser realizada com qualquer dispositivo que irá distribuir os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação e composições para a planta e/ou parte(s) da planta. Dispositivos de pulverização úteis incluem um pulverizador de barra, um pulverizador manual ou de mochila, espanadores (ou seja, pulverização aérea) e semelhantes. Dispositivos de pulverização e/ou métodos que fornecem a aplicação dos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação e composições em uma ou ambas as superfícies adaxial e/ou abaxial também podem ser usados. Plantas e/ou partes de plantas que são pelo menos parcialmente revestidas com qualquer caldo de fermentação bifásico, um produto de caldo de fermentação, produto de fermentação ou composições que compreendem uma substância sólida com Methylobacterium que melhora o rendimento aderido a ela também são fornecidos neste documento. Em certas modalidades, a parte da planta é uma semente. O revestimento parcial de uma planta ou parte da planta inclui, mas não está limitado a, revestir pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou cerca de 99,5% da área de superfície da planta ou parte da planta. Em algumas modalidades, a parte da planta é uma semente e o revestimento parcial inclui, mas não está limitado a, revestir pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou cerca de 99,5% da área de superfície da semente. Também são fornecidos neste documento produtos vegetais processados que compreendem uma substância sólida com Methylobacterium que melhora o rendimento aderido a ela.
[072] Em certas modalidades, as sementes são tratadas expondo as sementes aos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação e composições que compreendem as sementes de Methylobacterium que melhora o rendimento podem ser tratadas com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação e composições aqui fornecidas por métodos incluindo, mas não se limitando a, embebimento, revestimento, pulverização e semelhantes.
Os tratamentos de sementes podem ser realizados com tratadores de sementes contínuos e/ou descontínuas.
Em certas modalidades, as sementes revestidas podem ser preparadas em pasta de sementes com uma composição de revestimento contendo um caldo de fermentação ou produto de caldo de fermentação compreendendo Methylobacterium que melhora o rendimento e secagem ao ar do produto resultante.
A secagem ao ar pode ser realizada em qualquer temperatura que não seja prejudicial para a semente ou para Methylobacterium, mas a temperatura normalmente não será superior a 30 graus centígrados.
A proporção de revestimento que compreende uma substância sólida e o aumento de rendimento de Methylobacterium inclui, mas não está limitado a, uma faixa de 0,1 a 25% em peso da semente, 0,5 a 5% em peso da semente e 0,5 a 2,5% em peso da semente.
Em certas modalidades, uma substância sólida usada no revestimento ou tratamento da semente terá o aumento de rendimento de Methylobacterium aderido à mesma.
Em certas modalidades, uma substância sólida usada no revestimento ou tratamento da semente será Methylobacterium que melhora o rendimento associada e estará presente em um caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação ou composição obtida pelos métodos aqui fornecidos.
Várias composições de tratamento de sementes e métodos para o tratamento de sementes divulgados nas Patentes US 5.106.648, 5.512.069 e 8.181.388 estão incorporados aqui por referência na sua totalidade e podem ser adaptados para uso com um agente ativo compreendendo os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação ou composições fornecidas aqui.
Em certas modalidades, a composição usada para tratar a semente pode conter excipientes agricolamente aceitáveis que incluem, mas não estão limitados a, farinhas de madeira, argilas, carvão ativado, terra diatomácea, sólidos inorgânicos de grão fino, carbonato de cálcio e semelhantes.
Argilas e sólidos inorgânicos que podem ser usados com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação ou composições aqui fornecidas incluem, mas não estão limitados a, bentonita de cálcio,
caulim, argila da China, talco, perlita, mica, vermiculita, sílicas, pó de quartzo, montmorilonita e suas misturas. Adjuvantes agrícolas aceitáveis que promovem a aderência à semente que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, poli(acetatos de vinila), copolímeros de poli(acetato de vinila), poli(acetatos de vinila) hidrolisados, copolímero de acetato de polivinilpirrolidona-vinil, álcoois polivinílicos, copolímeros de álcool polivinílico éter metílico, copolímero de polivinil metil éter- anidrido maleico, ceras, polímeros de látex, celuloses incluindo etilceluloses e metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilcelulose, hidroximetilpropilceluloses, polivinil pirrolidonas, alginatos, dexissacarinas, malto- dextrinas, proteínas, malto-carxtrinas, goma jaguar, goma de tragacanto, gomas de polissacarídeo, mucilagem, goma arábica, goma laca, polímeros e copolímeros de cloreto de vinilideno, polímeros e copolímeros de proteína à base de soja, lignossulfonatos, copolímeros acrílicos, amidos, polivinilacrilatos, polivinilacrilatos, zeínas, polivinilacrilatos, gelatina de polivinilacrilato, zeínas, polivinilacrilatos, gelatina, polímeros e copolímeros de acrilamida, acrilato de poli-hidroxietila, monômeros de metilacrilamida, alginato, etilcelulose, policloropreno e xaropes ou suas misturas. Outros adjuvantes agricolamente aceitáveis que podem promover o revestimento incluem, mas não estão limitados a, polímeros e copolímeros de acetato de vinila, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinila e ceras solúveis em água. Vários tensoativos, dispersantes, agentes antiaglomerantes, agentes de controle de espuma e corantes divulgados neste documento e na Patente US 8.181.388 podem ser adaptados para uso com um agente ativo compreendendo os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação ou composições aqui fornecidas.
[073] São fornecidas aqui composições que compreendem Methylobacterium que melhora o rendimento que proporcionam aumento do rendimento de plantas de milho em relação a plantas não tratadas, partes de plantas e plantas obtidas a partir das mesmas que não foram expostas às composições. Em certas modalidades, as partes da planta, incluindo, mas não se limitando a, uma semente, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz ou um coleóptilo podem ser tratadas com as composições aqui fornecidas para aumentar o rendimento da planta de milho. Os tratamentos ou aplicações podem incluir, mas não estão limitados a, pulverização, revestimento, revestimento parcial, imersão e/ou embebimento da planta ou partes da planta com as composições aqui fornecidas. O revestimento parcial de uma planta de milho ou uma parte da planta de milho inclui, mas não está limitado a, revestir pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 95%, 98%, 99% ou cerca de 99,5% da área de superfície da planta de milho ou parte da planta de milho. Em algumas modalidades, a parte da planta do milho que é parcialmente revestida é uma semente da planta do milho. Em certas modalidades, uma semente, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz, uma espiga ou um coleóptilo pode ser imerso e/ou embebido com um líquido, semilíquido, emulsão ou pasta de uma composição aqui fornecida. Tal imersão ou embebimento da semente pode ser suficiente para fornecer um rendimento aumentado em uma planta de milho tratada ou planta de milho cultivada a partir de uma semente tratada em comparação com uma planta de milho não tratada ou planta de milho cultivada a partir de uma semente não tratada. Em certas modalidades, as sementes das plantas podem ser imersas e/ou embebidas por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Tal imersão e/ou embebimento pode, em certas modalidades, ser conduzida a temperaturas que não são prejudiciais para a semente da planta ou para Methylobacterium. Em certas modalidades, as sementes podem ser tratadas a cerca de 15 a cerca de 30 graus centígrados ou a cerca de 20 a cerca de 25 graus centígrados. Em certas modalidades, a embebimento e/ou imersão das sementes pode ser realizada com agitação suave. Em certas modalidades, a semente e/ou coleóptilo é exposto à composição ao fornecer a composição no sulco. O fornecimento da composição no sulco representa um dos vários métodos aqui fornecidos para a aplicação de uma composição a uma semente de milho ou a uma planta de milho na fase de VE de desenvolvimento da planta de milho ou antes dela.
[074] Espera-se, portanto, que as composições fornecidas neste documento compreendendo Methylobacterium que melhora o rendimento e métodos relacionados sejam úteis para melhorar o rendimento em uma ampla variedade de plantas de milho incluindo, mas não se limitando a, vários híbridos, consanguíneos, haploides, subespécies e variedades de Zea mays. Em certas modalidades, o rendimento pode ser melhorado em dent com (Zea mays var. Indentata), milho flint (Zea mays var. indurata), farinha de milho (Zea mays var. amylacea), pipoca (Zea mays var. everta), pod com (Zea mays var. tunicata Larranaga ex A. St. Hil.) milho listrado (Zea mays var. japonica), milho doce
(Zea mays var. saccharata e Zea mays var. rugosa) e/ou cera com (Zea mays var. ceratina).
[075] Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição fornecida neste documento que é suficiente para fornecer maior rendimento de milho pode ser uma composição com aumento de rendimento de Methylobacterium a um título de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por mililitro, em pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x109 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 3x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro. Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição fornecida neste documento que é suficiente para fornecer maior rendimento de milho a uma planta ou parte da planta pode ser uma composição com Methylobacterium que melhora o rendimento a um título de cerca de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônias por mililitro, em pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro de um líquido ou uma emulsão. Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição fornecida neste documento que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado pode ser um produto de caldo de fermentação com um título de Methylobacterium que melhora o rendimento de uma fase sólida desse produto é de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônias por mililitro, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por grama a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama da fase sólida. Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui fornecida que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado pode ser uma composição com um título de Methylobacterium de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por grama, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por grama, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por grama, ou pelo menos cerca de 5xx108 unidades formadoras de colônia por grama a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama de partículas na composição contendo as partículas que compreendem uma substância sólida em que uma monocultura ou co-cultura de Methylobacterium que melhora o rendimento é aderida às mesmas.
Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui fornecida que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado para uma planta ou parte da planta pode ser uma composição com um título de Methylobacterium de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por mL, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mL, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por mL, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mL a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por mL em uma composição que compreende um emulsão em que uma monocultura ou co-cultura de um Methylobacterium que melhora o rendimento aderido a uma substância sólida é fornecida ou cultivada nela.
Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui fornecida que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado para uma planta ou parte da planta pode ser uma composição com um título de Methylobacterium de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por mL, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mL, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por mL, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mL a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por mL em uma composição que compreende uma emulsão em que uma monocultura ou co-cultura de um Methylobacterium que melhora o rendimento é fornecida ou cultivada nela.
Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, Methylobacterium é selecionada do grupo que consiste em (i) isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL El-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340), ou suas variantes, ou (ii) uma combinação de isolado de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma variante do mesmo, e isolado de Methylobacterium NLS0017 (B-50931) ou uma variante deste.
[076] Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui fornecida que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado pode ser uma composição com um Methylobacterium em um título de pelo menos cerca de 1x104 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x105 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mililitro, em pelo menos cerca de 1x109 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 3x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro.
Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição fornecida neste documento que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado pode ser uma composição com Methylobacterium em um título de pelo menos cerca de 1x104 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 1x105 unidades formadoras de colônia por mililitro, cerca de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mililitro, pelo menos cerca de l x107 unidades formadoras de colônia por mililitro, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mililitro a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia por mililitro de um líquido ou uma emulsão.
Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição fornecida neste documento que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado pode ser um produto de caldo de fermentação com um título de Methylobacterium de uma fase sólida desse produto é de pelo menos cerca de 1x104 unidades formadoras de colônia por grama, pelo menos cerca de 1x105 unidades formadoras de colônia por grama, pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por grama, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por grama, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por grama, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por grama a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama, pelo menos cerca de 1x1011 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama, pelo menos cerca de 1x1012 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama, pelo menos cerca de 1x1013 unidades formadoras de colônias de Methylobacterium por grama, ou pelo menos cerca de 5x1013 unidades formadoras de colônias de Methylobacterium por grama da fase sólida.
Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui fornecida que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado pode ser uma composição com um título de Methylobacterium de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por grama, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por grama, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por grama, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por grama a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama, pelo menos cerca de 1x1011 colônia unidades formadoras de Methylobacterium por grama, pelo menos cerca de 1x1012 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama, pelo menos cerca de 1x1013 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama, ou pelo menos cerca de 5x1013 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por grama de partículas na composição contendo as partículas que compreendem uma substância sólida em que uma monocultura ou co-cultura de Methylobacterium é aderida a ela.
Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui fornecida que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado pode ser uma composição com um título de Methylobacterium de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por mL, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mL, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por mL, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mL a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por mL em uma composição que compreende uma emulsão em que um monocultura ou co-cultura de Methylobacterium aderida a uma substância sólida é fornecida ou cultivada nela.
Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui fornecida que é suficiente para fornecer um rendimento de milho aumentado pode ser uma composição com um título de Methylobacterium de pelo menos cerca de 1x106 unidades formadoras de colônia por mL, pelo menos cerca de 5x106 unidades formadoras de colônia por mL, pelo menos cerca de 1x107 unidades formadoras de colônia por mL, ou pelo menos cerca de 5x108 unidades formadoras de colônia por mL a pelo menos cerca de 6x1010 unidades formadoras de colônia de Methylobacterium por mL em uma composição compreendendo uma emulsão em que uma monocultura ou co-cultura de uma Methylobacterium é fornecida ou cultivada nele. Em certas modalidades de qualquer uma das composições mencionadas anteriormente, a Methylobacterium é o isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340) ou variantes do mesmo, ou (ii) uma combinação de isolado de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma variante do mesmo, e isolado de Methylobacterium NLS0017 (B-50931) ou uma variante do mesmo. Também são fornecidos com plantas e partes de plantas de milho (por exemplo, sementes) que são revestidas ou parcialmente revestidas com qualquer uma das composições mencionadas anteriormente. Também são fornecidos métodos para melhorar o rendimento de milho usando qualquer uma das composições mencionadas anteriormente
EXEMPLOS
[077] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades ilustrativas e não limitativas da divulgação. Será reconhecido pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelos Requerentes para funcionar bem na prática da invenção. No entanto, os versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, reconhecer que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas, embora ainda obtenham resultados semelhantes ou semelhantes, sem se afastar do escopo da divulgação. Exemplo 1. Aumentos na produção de milho pela aplicação de composições de Methylobacterium em testes de campo de 2018
[078] Em 2018, os ensaios de campo com foram estabelecidos em doze locais com o propósito de avaliar 4 isolados de PPFM (metilotróficos facultativos com pigmentação rosa da espécie Methylobacterium) e uma combinação de dois isolados diferentes de Methylobacterium aplicados em sulco no plantio de plantas de milho. O experimento em Frankfort, IN não foi incluído na análise do experimento comum devido a uma parte do experimento ter sofrido danos. Desenho Experimental
[079] O ensaio foi estabelecido usando um Projeto de Bloco Completo Randomizado (RCBD) com 4 repetições por local.
Métodos
[080] Em preparação para os testes de campo, as culturas de PPFM foram cultivadas em AMS + glicerol + peptona + terra de diatomáceas, a 30 °C por 6 dias. O meio AMS contém, por litro, 700 miligramas de fosfato de potássio dibásico anidro, 540 miligramas de fosfato de potássio monobásico anidro, um grama de sulfato de magnésio hepta- hidratado, 500 miligramas de cloreto de amônio anidro e 200 miligramas de cloreto de cálcio di-hidratado.
[081] Meio de base AMS foi preparado a partir de três soluções estoque, listadas abaixo:
[082] Solução estoque I: para um litro na concentração de 50X fosfato de potássio dibásico, anidro 35 gramas fosfato de potássio monobásico, anidro 27 gramas
[083] Solução estoque II: para um litro na concentração de 50X sulfato de magnésio hepta-hidratado 50 gramas cloreto de amônio, anidro 25 gramas
[084] Solução estoque III: para um litro na concentração de 50X cloreto de cálcio di-hidratado 10 gramas As soluções estoque I, II e III foram autoclavadas separadamente.
[085] Para preparar um litro de meio AMS líquido com glicerol, peptona e terra de diatomáceas, o seguinte foi adicionado a 920 ml de água destilada:
[086] 20 ml de solução estoque I
[087] 20 ml de solução estoque II
[088] 20 ml de solução estoque III
[089] 20 ml de uma solução estoque de glicerol a 50%
[090] 10 gramas de peptona
[091] 2 gramas de terra diatomácea A solução resultante com terra de diatomáceas suspensa foi esterilizada em autoclave. As culturas foram colhidas por centrifugação a 5.000 rpm durante 15 minutos e depois ressuspensas em AMS + glicerol + peptona com glicerol a 20% como crioprotector na concentração de 10X. As culturas foram divididas em alíquotas e congeladas a -80 ºC até serem descongeladas para uso. As preparações líquidas de PPFM foram feitas em sulco. Resultados
[092] A análise foi conduzida com JMP14 (SAS Institute), e os pressupostos de normalidade e variância igual são testados antes de executar a análise de variância (ANOVA). A ANOVA foi conduzida com a rotina Analyze - Fit Model. As comparações dos isolados com a verificação dentro do mesmo estágio de crescimento na aplicação foram realizadas com testes t bicaudais aplicados às diferenças entre pares entre as médias dos mínimos quadrados estimadas a partir do modelo ANOVA, sob a hipótese nula de que a diferença nas médias era zero.
[093] Análises entre locais para os onze locais foram conduzidas de acordo com o seguinte modelo:
[2] Yhijk = M + Ii + Sj + ISij + Lh + R(L)k(h) + LIhi+ IR(L)ik(h) + LShj + LIShij + ehijk, onde Yhijk é o rendimento no local h do isolado i no estágio j na réplica k, M representa a média geral, h é o efeito fixo do isolado i, Sj é o efeito fixo do estágio j, ISij é o efeito fixo da interação do isolado i e estágio j, Lh é o efeito aleatório da localização h, R(L)k(h) é o efeito aleatório da replicação k aninhada na localização h, LIhi é o efeito aleatório da interação de local h e isolado i, IR(L)ik(h) é o efeito aleatório da interação do isolado i e replicado k aninhado no local h, LShj é o efeito aleatório da interação do local h e estágio j, LIShij é o efeito aleatório da interação de três vias do local h com o isolado i e o estágio j, e ehijk é o erro aleatório.
[094] Os 4 isolados de PPFM e a combinação dos isolados NLS0109 e NLS0017 testados em 2018 mostraram um rendimento de resposta mais alto em comparação com o controle não tratado. Tabela 2. Rendimento médio em 2018 (itálico em negrito indica uma diferença significativa em p 0,05 usando teste LSD de Fishere LSD.) Rend. Diferença de Diferença Valor de p Taxa de médio de rend. de v. UTC vencedor (# Tratamento rend. de UTC (%) (teste LSD locs acima (Bu/A) UTC (Bu/A) de Fisher) UCT)
Exemplo 2. Aumentos na produção de milho pela aplicação de composições de Methylobacterium em ensaios de campo de 2017
[095] Este ensaio avaliou o aumento de rendimento por tratamentos com Methylobacterium em comparação com 2 tratamentos UTC. Methylobacterium foi aplicado como tratamento de sementes com um título de semente alvo de 106 UFC/semente para tratamentos de isolado único. Ele inclui 6 locais. O ensaio foi estabelecido usando um Projeto de Bloco Completo Randomizado (RCBD) com 4 repetições por local.
[096] O Projeto Experimental e os Métodos foram os mesmos do Exemplo 1.
[097] Todos os tratamentos com Methylobacterium produziram um rendimento mais alto do que o UTC. Os dois tratamentos UTC (UTC-1 e UTC-2) apresentaram rendimentos muito semelhantes e foram os dois tratamentos de menor rendimento no ensaio. Tabela 3. Rendimento médio em 2017. (Os valores de p são retirados do teste de Dunnett.) Rendi Dif. absoluta % de dif. Valor de p de Locais Tratamento de de UTC médio contraste v. acima de mento de UTC inoculação (Bu/A) médio UTC médio UTC (/6) (Bu/A) (Dunnett) UTC médio Exemplo 3. Efeitos do tratamento coma cepa NLS0807 de Methylobacterium (NRRL B-67743) de milho no teor de nutrientes
[098] Sementes de milho foram tratadas com Methylobacterium cepa NLS0807 a uma taxa de 106 CFU por semente e cultivadas em solo esterilizado (30 sementes por planta) em uma estufa em paralelo com sementes de milho não tratadas. Aos 22 dias após o plantio (estágio de crescimento V2), 15 ou mais plantas por planta foram escolhidas aleatoriamente e os brotos foram coletados cortando uma polegada acima da linha do solo. Os brotos foram incubados em sacos de amostra a 45 °C por 4 dias para secar e analisados quanto ao teor de macronutrientes e micronutrientes. Um teste t de variâncias desiguais de cauda única (Welch) foi usado para analisar os dados para determinar se o tratamento com NLS0807 resultou em um aumento significativo no teor de nutrientes. Methylobacterium NLS0807 aumentou significativamente o teor foliar de quatro nutrientes: fósforo (P), potássio (K), ferro (Fe) e manganês (Mn). Dos 12 nutrientes testados, 9 foram elevados ao longo do UTC pelo tratamento com NLS0807. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 4. Teores médios de nutrientes com base no peso seco, diferença percentual de NLS0807 do UTC e valores de p de contraste. (Negrito e itálico indicam p <0,05.) Exemplo 4 Detecção ou identificação de cepas, variantes e derivados de Methylobacterium
[099] Os ensaios são divulgados para a detecção ou identificação de cepas específicas de Methylobacterium e derivados intimamente relacionados. Fragmentos de DNA genômico exclusivos para uma cepa de Methylobacterium são identificados e ensaios baseados em ácido nucleico bloqueado (LNA) qPCR são desenvolvidos.
[100] Sequências de DNA genômico de cepas de Methylobacterium são comparadas por análise BLAST de fragmentos de aproximadamente 300 pb usando uma janela deslizante de 1-25 nucleotídeos para sequências de genoma completo de mais de 1.000 isolados públicos e proprietários de Methylobacterium. São identificados fragmentos de DNA genômico que têm alinhamentos BLAST fracos, indicativos de aproximadamente 60-95%
de identidade em todo o fragmento para fragmentos correspondentes de Methylobacterium de interesse. Fragmentos do genoma NLS0109 correspondentes às regiões de alinhamento fraco identificadas foram selecionados para o desenvolvimento do ensaio e são fornecidos como SEQ ID NOS: 1-3. Tabela 5. Sequências de fragmentos alvo de NLS0109
[101] Regiões nas SEQ ID NOS: 1-3 onde regiões correspondentes em outras cepas de Methylobacterium foram identificadas como tendo uma ou mais incompatibilidades de nucleotídeos da sequência NLS0109 foram selecionadas, e os iniciadores qPCR projetados usando o software Iniciador3 (Untergasser et al. (2012), Koressaar et al. (2007)) para flanquear as regiões de incompatibilidade, ter uma temperatura de fusão (Tm) na faixa de 55-60 graus e para gerar um fragmento de DNA de PCR de aproximadamente 100 bp. A sequência da sonda foi projetada com um corante repórter 5' FAM, um inibidor 3' Iowa Black FQ e contém uma a seis bases LNA (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa). Pelo menos 1 das bases do LNA está na posição de incompatibilidade, enquanto as outras bases do LNA são usadas para elevar a Tm. O Tm da sequência da sonda é direcionado para ser 10 graus acima do Tm dos iniciadores.
[102] Sequências de iniciador e sonda para detecção de detecção específica de NLS0109 são fornecidas como SEQ ID NOS: 4-12 na Tabela 6. Cada uma das sondas contém um corante repórter 5' FAM e um inibidor 3' Iowa Black FQ . Tabela 6 Sequências de iniciador e sonda para detecção específica de NLS0109 * As letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA
[103] Uso de conjuntos de iniciador/sonda em DNA isolado para detectar NLS0109 e distinguir de isolados de Methylobacterium relacionados
[104] Cada 10ul de reação qPCR contém 5 ul de Quantabio PerfeCTa qPCR ToughMix 2x Mastermix, Low ROX de VWR, 0,5 ul de 10 uM de iniciador direto, 0,5 ul de 10 uM de iniciador reverso, 1 ul de 2,5 uM sonda, lul água sem nuclease e 2 ul de molde de DNA. Aproximadamente 1 ng de molde de DNA é usado por reação. A reação é conduzida em um sistema de PCR em tempo real ThermoFisher QuantStudio™ 6 Flex com o seguinte programa: 95 °C por 3 min, em seguida, 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min. O software de análise no instrumento de PCR calcula um valor limiar e Ct para cada amostra. Cada amostra foi executada em triplicata na mesma placa qPCR. Um resultado positivo é indicado onde o delta Ct entre os controles positivo e negativo é de pelo menos 5.
[105] O uso dos três conjuntos de iniciador/sonda para distinguir NLS0109 de isolados intimamente relacionados por análise de DNA isolado é mostrado na Tabela 7 abaixo. A pontuação de semelhança mostrada para os isolados relacionados leva em consideração a identidade de nucleotídeos média e a fração de alinhamento entre os isolados e NLS0109. Uma das cepas testadas, NLS0730, foi usada como um controle positivo adicional. NLS0730 é um isolado clonal de NLS0109 que foi obtido a partir de uma cultura de NLS0109, que foi confirmado por sequenciamento do genoma completo como idêntico a NLS0109, e teve resultado positivo em todas as três reações. A pontuação de semelhança maior que 1.000 para esta cepa é provavelmente o resultado de uma montagem ligeiramente diferente do genoma para este isolado em comparação com NLS0109. O delta Ct de aproximadamente 15 ou mais entre os isolados NLS0109 e NLS0730 e o controle apenas com água é consistente com a confirmação da sequência da identidade desses isolados. A análise de outros isolados que estão menos intimamente relacionados com NLS0109 resulta em valores delta Ct semelhantes aos do controle apenas com água. Tabela 7
[106] Uso de iniciador/sondas para detecção de NLS0109 em materiais de plata tratados.
[107] Para a detecção de tratamento foliar por pulverização com NLS0109 em milho: sementes de milho não tratadas foram plantadas em solo de campo na câmara de crescimento e regadas com água R.O. Depois que as plantas germinaram e cresceram por aproximadamente 3 semanas, elas foram transferidas para a estufa. No estágio V5, as plantas foram divididas em 3 grupos para tratamento: pulverização foliar de NLS0109, pulverização foliar simulada e não tratada. As plantas que receberam a pulverização foliar de NLS0109 foram tratadas com estoque de glicerol 10x a uma taxa de 71,4 ul por planta usando pulverizadores Solo. Isso é convertido para a taxa de lOL/acre no campo. Plantas tratadas com simulação foram pulverizadas com 71,4 ul de água/planta. As plantas não tratadas não receberam tratamento por pulverização foliar. As folhas foram colhidas duas semanas após o tratamento por pulverização foliar em tubos estéreis e o DNA de bactérias nas folhas colhidas é isolado como descrito acima. Cada experimento foi cultivado pelo menos 2 vezes. Conforme mostrado na Tabela 8, NLS0109 é detectado em folhas colhidas de plantas de milho tratadas por uma aplicação de pulverização foliar das cepas de Methylobacterium usando todos os 3 conjuntos de sondas de iniciador, conforme demonstrado pelos valores delta Ct de aproximadamente 10 entre a amostra e os controles negativos. Tabela 8
[108] Os resultados acima demonstram o uso de iniciadors e sondas específicas do genoma para detectar cepa NLS0109 de Methylobacterium em vários tecidos vegetais após o tratamento com as cepas e fornecem métodos para distinguir NLS0109 de isolados intimamente relacionados. Métodos semelhantes são desenvolvidos para cepas adicionais de Methylobacterium, NLS0017, NLS0807, NLS0662 e NLS0648 usando fragmentos de sequência alvo e pares de iniciador/sonda como mostrado nas Tabelas abaixo. Tabela 9 Sequências de fragmento alvo de NLS0017
Tabela 10 Sequências de iniciador e sonda para detecção específica de NLS0017
* As letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA
Tabela 11 Sequências de fragmentos alvo de NLS0807
Tabela 12 Sequências de iniciador e sonda para detecção específica de NLS0807
* As letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA
[109] O uso dos conjuntos de iniciador/sonda para distinguir NLS0807 de isolados intimamente relacionados por análise de DNA isolado é mostrado na Tabela 13 abaixo. A pontuação de semelhança mostrada para os isolados relacionados leva em consideração a identidade de nucleotídeos média e a fração de alinhamento entre os isolados e NLS0807. Duas das cepas testadas, NLS0821 e NLS0044, foram usadas como controles positivos adicionais, uma vez que uma pontuação de semelhança de 1,00 indica que elas são quase idênticas a NLS0807. Valores de Ct consistentemente baixos de qPCR usando NLS0807 como o modelo de DNA e nenhuma detecção no controle apenas de água é consistente com a confirmação da sequência da identidade desses isolados. A análise de outros isolados que estão menos intimamente relacionados com NLS0807 resulta em nenhuma detecção semelhante àquelas para o controle apenas de água. Tabela 13 Tabela 14 Sequências de fragmentos alvo de NLS0648
Tabela 15 Sequências de iniciador e sonda para detecção específica de NLS0648
* As letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA
Tabela 16 Sequências de fragmentos alvo de NLS0662
Tabela 17 Sequências de iniciador e sonda para detecção específica de NLS0662
*As letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA
[111] Uso de iniciador/sondas para detecção de NLS0807 em materiais de planta tratados
[112] Detecção de NLS0807 a partir de raízes de milho tratadas em sulco
[113] No plantio, sementes de milho no solo foram encharcadas com NLS0807 e cepas de controle de estoque de glicerol congeladas para simular o tratamento no sulco. Para obter uma concentração final de 107 UFC/semente, 100 µl de cada cepa a x108 UFC/ml são inoculados em cada semente colocada nos orifícios do solo. Uma série de diluição 1/10 é feita para alvos de concentração mais baixos. Para o tratamento de controle, 100 ul de água Milli-Q são aplicados a cada semente de milho colocada nos orifícios de limpeza no solo. Os potes contendo sementes tratadas são colocados em uma câmara de crescimento por aproximadamente duas semanas e regados com água RO não fertilizada a cada 1-2 dias para manter o solo úmido. Após 2 semanas de crescimento, raízes de cerca de 9 plantas por amostra replicada foram colhidas em tubos estéreis. Cada tratamento teve pelo menos 2 amostras replicadas em cada experimento, e cada experimento foi conduzido pelo menos 3 vezes.
[114] O DNA de bactérias nas raízes colhidas é isolado como segue. As raízes individuais são submersas em 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KC1 2,7 mM e um pH de 7,4) em tubos cônicos de 50mL. Os tubos são agitados em vórtex por 10 minutos e, em seguida, sonicados por 10 minutos. O tecido da raiz é removido e o sobrenadante restante de raízes múltiplas da mesma amostra são combinados e centrifugados a 7.500xg por 10 minutos. Este processo é repetido até que haja um tubo para cada amostra. O precipitado de solo úmido é agitado em vórtice até cobrir uniformemente a parede do tubo. Os tubos são colocados em uma capela de fluxo laminar com as tampas removidas e as extremidades abertas dos tubos voltadas para os ventiladores de ar. Depois de secas, as amostras são armazenadas à temperatura ambiente. 250 mg de solo seco é usado como entrada para a extração de DNA usando o kit Qiagen DNeasy PowerSoil HTP 96 (Cat # 12955-4) usando os protocolos do fabricante.
[115] Iniciadores e sondas para NLS0807 divulgados na Tabela 12 acima são usados em reações qPCR para detectar a presença de fragmentos específicos de NLS0807 fornecidos na Tabela 11. Cada 10ul de reação qPCR contém 5 ul de Quantabio PerfeCTa qPCR
ToughMix 2x Mastermix, Low ROX de VWR, 0,5 ul de iniciador direto 10 uM, 0,5 ul de iniciador reverso 10 uM, 1 ul de sonda 2,5 uM, água livre de nuclease lul e 2 ul de molde de DNA. Aproximadamente 1ng de molde de DNA é usado por reação. A reação é conduzida em um sistema de PCR em tempo real ThermoFisher QuantStudio™ 6 Flex com o seguinte programa: 95 °C por 3 min, em seguida, 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min. O software de análise no instrumento de PCR calcula um valor limiar e Ct para cada amostra. Cada amostra é executada em triplicata na mesma placa qPCR. Um resultado positivo é indicado onde o delta Ct entre os controles positivo e negativo é de pelo menos 5.
[116] Uso de iniciador/sondas para detecção de variantes de isolados de Methylobacterium da Tabela 1 adicional
[117] Variantes de isolados de Methylobacterium listados na Tabela 1 são identificados pela presença de fragmentos de DNA como descrito acima. Fragmentos únicos para uso em tais métodos são fornecidos na Tabela 18. Tabela 18.
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[118] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente divulgação, deve ser evidente para os versados na técnica que a invenção pode ser modificada em sua disposição e detalhes sem se afastar de tais princípios.
[119] Embora os materiais e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de várias modalidades e exemplos ilustrativos, será evidente para os versados na técnica que variações podem ser aplicadas aos materiais e métodos descritos neste documento, sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos esses substitutos e modificações semelhantes evidentes para os versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (45)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para melhorar rendimento de planta de milho, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) aplicar uma composição a uma planta de milho ou uma parte de planta de milho, em que a composição compreende (i) isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), NLS0109 (NRRL B-67340), ou variantes dos mesmos, ou (ii) uma combinação de isolado de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma variante do mesmo, e isolado de Methylobacterium NLS0017 (B-50931) ou uma variante do mesmo; em que a dita composição compreende ainda pelo menos um componente adicional selecionado a partir do grupo que consiste em um ingrediente ativo adicional, um adjuvante agricolamente aceitável, e um excipiente agricolamente aceitável; e, (b) cultivar a planta de milho até a maturidade, melhorando assim o rendimento da planta de milho.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada a uma semente de milho.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende uma substância sólida com o Methylobacterium cultivado nela e aderido a ela, ou uma emulsão tendo o Methylobacterium cultivado nela.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende o Methylobacterium em um título de cerca de 1x106 CFU/g a cerca de 1x1014 CFU/g para uma composição sólida ou em um título de cerca de 1x106 CFU/mL a cerca de 1x1011 CFU/mL para uma composição líquida.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), ou uma variante do mesmo.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende NLS0109 ou uma variante do mesmo e NLS0017 ou uma variante do mesmo.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante de Methylobacterium é resistente a glifosato ou resistente a glifosinato.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição aplicada reveste ou parcialmente reveste a planta de milho ou uma parte da mesma.
9, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada à folhagem da planta de milho.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o componente adicional é um fungicida.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada em torno do estágio de desenvolvimento VE a em torno do V3, em torno do estágio de desenvolvimento V3 a em torno do V5, em torno do estágio de desenvolvimento V2 a V4, ou V3.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de colher semente da planta de milho madura.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rendimento da semente colhida é aumentado em comparação com o rendimento da semente colhida obtida de uma planta de milho de controle que não recebeu uma aplicação do Methylobacterium.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita composição é aplicada por pulverização, revestimento, revestimento parcial, imersão e/ou embebimento da planta de milho ou parte da planta com a composição.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a composição aplicada reveste ou parcialmente reveste a planta de milho ou uma parte da mesma, em que revestimento parcial inclui revestir pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou cerca de 99,5% da área de superfície da planta de milho ou uma parte da mesma.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dita parte de planta de milho é uma semente.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a composição compreende isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741),
NLS0109 (NRRL B-67340), ou uma combinação de isolado de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) e NLS0017 (B-50931).
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a dita composição compreende ainda um ingrediente ativo adicional.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o ingrediente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em um fungicida, inseticida, nematicida, e um segundo produto biológico.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o segundo produto biológico é um agente de biocontrole que não NLS0109,
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o ingrediente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em clotianidina, Bacillus firmus, abamectina, tiametoxam, imidacloprida, azoxistrobina, fluopiram, fluoxastrobina, ipconazol, mefenoxam, metalaxila, penflufen, protioconazol, piraclostrobina e sedaxano.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o crescimento da planta de milho ocorre em um campo nos Estados Unidos continental localizado a leste do rio Mississippi.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o crescimento da planta de milho ocorre em um campo nos Estados Unidos continental localizado a oeste do rio Mississippi.
24. Planta de milho ou parte de planta de milho que é revestida ou parcialmente revestida com uma composição compreendendo um Methylobacterium, caracterizada pelo fato de que o Methylobacterium é (i) NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), ou variantes dos mesmos, ou (ii) uma combinação de isolado de Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma variante do mesmo, e isolado de Methylobacterium NLS0017 (B-50931) ou uma variante do mesmo.
25. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda pelo menos um componente adicional selecionado a partir do grupo que consiste em um ingrediente ativo adicional, um adjuvante agricolamente aceitável, e um excipiente agricolamente aceitável.
26. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a composição compreende o Methylobacterium em um título de cerca de 1x106 CFU/g a cerca de 1x1014 CFU/g para uma composição sólida ou em um título de cerca de 1x106 CFU/mL a cerca de 1x1011 CFU/mL para uma composição líquida.
27. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o Methylobacterium é isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743) ou uma variante do mesmo.
28. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizada pelo fato de que a parte de planta de milho é selecionada a partir do grupo que consiste em uma semente, uma folha, uma espiga, e um pendão.
29. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizada pelo fato de que a composição compreende isolado de Methylobacterium NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), ou uma combinação de isolado de Methylobacteriums NLS0109 (NRRL B-67340) e NLS0017 (B-50931).
30. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, caracterizada pelo fato de que o componente adicional é um ingrediente ativo adicional.
31. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o ingrediente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em um fungicida, inseticida, nematicida, e um segundo produto biológico.
32. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o segundo produto biológico é um agente de biocontrole que não NLS0109.
33. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o ingrediente ativo adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em clotianidina, Bacillus flrmus, abamectina, tiametoxam, imidacloprida, azoxistrobina, fluopiram, fluoxastrobina, ipconazol, mefenoxam, metalaxila, penflufen, protioconazol, piraclostrobina e sedaxano.
34. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 33, caracterizada pelo fato de que a composição compreende (i) um Methylobacterium, em que o DNA genômico cromossômico tem pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6%, ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), ou NLS0109 (NRRL B-67340), ou (ii) uma combinação de isolados de Methylobacterium, em que o DNA genômico cromossômico dos ditos isolados tem pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6%, ou 99,5% de identidade de sequência com DNA genômico cromossômico de NLS0109 (NRRL B-67340) ou NLS0017 (B-50931).
35. Planta de milho ou parte de planta de milho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 34 , caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um segundo produto biológico selecionado a partir do grupo que consiste em ISO01 (NRRL B-50929), ISO02 (NRRL B-50930), ISO03 (NRRL B-50931), ISO04 (NRRL B- 50932), ISO05 (NRRL B-50933), ISO06 (NRRL B-50934), ISO07 (NRRL B-50935), ISO08 (NRRL B-50936), ISO09 (NRRL B-50937), ISO10 (NRRL B-50938), ISO11 (NRRL B-50939), ISO12 (NRRL B-50940), ISO13 (NRRL B-50941), e ISO14 (NRRL B-50942).
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a composição compreende (i) um Methylobacterium, em que o DNA genômico cromossômico tem pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6%, ou 99,5% de identidade de sequência com o DNA genômico cromossômico de NLS0807 (NRRL B-67743), NLS0662 (NRRL B-67742), NLS0648 (NRRL B-67741), ou NLS0109 (NRRL B-67340), ou (ii) uma combinação de isolado de Methylobacteriums, em que o DNA genômico cromossômico dos ditos isolados tem pelo menos 99%, 99,9, 99,8, 99,7, 99,6%, ou 99,5% de identidade de sequência com p DNA genômico cromossômico de NLS0109 (NRRL B-67340) ou NLS0017 (B-50931).
37. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 23 ou 36, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um segundo produto biológico selecionado a partir do grupo que consiste em ISO01 (NRRL B-50929), ISO02 (NRRL B-50930), ISO03 (NRRL B-50931), ISO04 (NRRL B-50932), ISO05 (NRRL B-50933), ISO06 (NRRL B-50934), ISO07 (NRRL B-50935), ISO08 (NRRL B-50936), ISO09 (NRRL B-50937), ISO10 (NRRL B-50938), ISO11 (NRRL B-50939), ISO12 (NRRL B- 50940), ISO13 (NRRL B-50941), ISO14 (NRRL B-50942) e variantes dos mesmos.
38. Método para detectar a presença em uma amostra de (a) cepa NL0807 de Methylobacterium, ou uma variante da mesma; (b) NLS0648 ou uma variante da mesma; ou (c) NLS0662 ou uma variante da mesma, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende detectar a presença na amostra de um ácido nucleico compreendendo ou localizado na SEQ ID NO: 25, 26 e/ou 27, SEQ ID NO: 37, 38 e/ou 39, ou SEQ ID NO: 49, 50 e/ou 51, respectivamente.
39. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a detecção do ácido nucleico compreende uma reação em cadeia de polimerase, DNA ramificado, reação em cadeia de ligase, amplificação mediada por transcrição (TMA), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), nanoporo-, espectroscopia de massa, hibridização ou método baseado no sequenciamento direto ou qualquer combinação dos mesmos.
40. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a dita detecção compreende as etapas de: (i) colocar a amostra em contato com um par de iniciador de DNA, em que o dito par de iniciador em que o dito compreende iniciadores diretos e reversos para a amplificação de um fragmento de DNA compreendendo ou localizado na SEQ ID NO: 25, 26, 27, 37, 38, 39, 49, 50 ou 51, gerando assim um fragmento de DNA, (ii) colocar o dito fragmento de DNA em contato com uma sonda específica para a presença do dito fragmento de DNA, e (iii) comparar os resultados do dito contato com controles positivos e negativos para determinar a presença de SEQ ID NO: 25, 26, 27, 37, 38, 39, 49, 50 ou 51 na dita amostra.
41. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a dita amostra é um material de planta que foi tratado com uma ou mais das cepas de
Methylobacterium selecionadas a partir de NL0807, NLS0648, NLS0662 e variantes das mesmas.
42. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o dito material de planta é de folhas, raízes ou sementes.
43. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o material de planta é um produto de planta processado a partir de uma planta tratada com uma ou mais cepas de Methylobacterium selecionadas a partir de NL0807, NLS0648, NLS0662 e variantes das mesmas.
44. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a dita amostra é uma amostra de solo.
45. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 23 ou 36, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um segundo produto biológico selecionado a partir do grupo que consiste em ISO02 (NRRL B-50930), (ISO03 (NRRL B-50931), ISO04 (NRRL B-50932), e variantes dos mesmos.
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