ES2788631T3 - Composiciones y métodos de mejora de la producción de tomate - Google Patents

Abstract

Un método de aumento de la velocidad de crecimiento de la raíz del tomate, crecimiento de hojas, crecimiento de plantas de semillero o disminución del tiempo de ciclo desde la siembra de la semilla de tomate hasta la producción del fruto de tomate cuando se compara con una planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de una semilla no tratada, que comprende aplicar una composición que comprende Methylobacterium a una planta de tomate, una parte de la misma o a una semilla de tomate, en donde dicha composición comprende una cepa de Methylobacterium seleccionada del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B- 50931), NLS0037 (NRRL B-50941) y NLS0066 (NRRL B-50940).

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos de mejora de la producción de tomate

ANTECEDENTES

Los compuestos orgánicos de un carbono tales como el metano y el metanol se encuentran ampliamente en la naturaleza y son utilizados como fuentes de carbono por bacterias clasificadas como metanotrofas y metilotrofas. Las bacterias metanotrofas incluyen especies en los géneros Methylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum y Methylocella (Lidstrom, 2006). Los metanotrofos poseen la enzima metano monooxigenasa, que incorpora un átomo de oxígeno del O² en el metano, formando metanol. Todos los metanotrofos son utilizadores de un carbono estrictos que son incapaces de usar compuestos que contienen enlaces carbono-carbono. Los metilotrofos, por otra parte, también pueden utilizar compuestos orgánicos más complejos, tales como ácidos orgánicos, alcoholes superiores, azúcares y similares. Así, las bacterias metilotróficas son metilotrofos facultativos. Las bacterias metilotróficas incluyen especies en los géneros Methylobacterium, Hyphomicrobium, Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Aminobacter, Methylorhabdus, Methylopila, Methylosulfonomonas, Marinosulfonomonas, Paracoccus, Xanthobacter, Ancylobacter (también conocidas como Microcyclus), Thiobacillus, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Acetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Arthobacter y Nocardia (Lidstrom, 2006).

La mayoría de las bacterias metilotróficas del género Methylobacterium están pigmentadas de rosa. Se denominan convencionalmente bacterias PPFM, que son metilotrofos facultativos pigmentados de rosa. Green (2005, 2006) identificó doce especies validadas en el género Methylobacterium, específicamente M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum y M. zatmanii. Sin embargo, M. nidulans es una Methylobacterium fijadora de nitrógeno que no es una PPFM (Sy et al., 2001). Las Methylobacterium son ubicuas en la naturaleza, siendo encontradas en la tierra, el polvo, agua dulce, sedimentos y superficies de hojas, así como en entornos industriales y clínicos (Green, 2006).

La publicación de solicitud de patente PCT WO2013/181610 desvela métodos para la producción de Methylobacterium donde se usan medios de cultivo bifásicos que comprenden una fase sólida y una fase líquida. También se desvela la estimulación del crecimiento de la raíz nodal del maíz por Methylobacterium.

Joe, M.M. et al. (J. Applied Microbiology 116(2):408-423, 2013) desvelan estudios en cámaras de tratamiento in vitro donde plantas de semillero de tomate germinadas se cultivaron bajo estrés acuoso en presencia y ausencia de las cepas de Methylobacterium CBMB20 y CBMB110 para proporcionar una reducción en el estrés acuoso.

Madhaiyan et al. (Chemosphere 69(2): 220-228, 2007) desvelan reducciones en la toxicidad del níquel y el cadmio, así como la estimulación del crecimiento de plantas de semillero de tomate en condiciones gnotobióticas y la longitud de la raíz del tomate en un invernadero por la cepa de Methylobacterium CBMB20.

Ryu, J. et al. (J. Microbiol. Biotechnol. 16 (1): 1622-1628, 2006) desvelan la estimulación de la germinación de semillas de tomate y el crecimiento de raíces en ensayos in vitro por las cepas de Methylobacterium CBMB20 y CBMB110. La publicación de solicitud de patente PCT WO2015/085063 desvela las cepas de Methylobacterium NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0037 (NRRL B-50941) y NLS0066 (NRRL B-50940), así como composiciones que comprenden las cepas y plantas o partes de la planta tratadas con las cepas.

La publicación de solicitud de patente PCT WO2015/085063 desvela las cepas de Methylobacterium NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0037 (NRRL B-50941) y NLS0066 (NRRL B-50940), así como composiciones que comprenden las cepas y plantas o partes de la planta tratadas con las cepas.

Sumario

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método de aumento de la velocidad de crecimiento de la raíz del tomate, crecimiento de hojas, crecimiento de plantas de semillero o disminución del tiempo de ciclo desde la siembra de la semilla de tomate hasta la producción del fruto de tomate cuando se compara con una planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de una semilla no tratada, que comprende aplicar una composición que comprende Methylobacterium a una planta de tomate, una parte de la misma o a una semilla de tomate, en donde dicha composición comprende una cepa de Methylobacterium seleccionada del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0037 (NRRL B-50941) y NLS0066 (NRRL B-50940).

En otro aspecto, la invención se refiere a una planta de tomate o semilla de tomate que está recubierta o parcialmente recubierta con una composición que comprende una Methylobacterium seleccionada del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0037 (NRRL B-50941) y NLS0066 (NRRL B-50940) o que se sumerge o sumerge parcialmente en la composición.

Descripción

Definiciones

Como se usa en el presente documento, las expresiones "adherido a la misma" y "adherente" se refieren a Methylobacterium que se asocia con una sustancia sólida creciendo, o habiendo crecido, sobre una sustancia sólida. Como se usa en el presente documento, la expresión "adyuvante agrícolamente aceptable" se refiere a una sustancia que potencia el rendimiento de un agente activo en una composición para el tratamiento de plantas y/o partes de la planta. En ciertas composiciones, un agente activo puede comprender un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium.

Como se usa en el presente documento, la expresión "excipiente agrícolamente aceptable" se refiere a una sustancia esencialmente inerte que se puede usar como diluyente y/o vehículo para un agente activo en una composición para el tratamiento de plantas y/o partes de la planta. En ciertas composiciones, un agente activo puede comprender un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium.

Como se usa en el presente documento, el término "Methylobacterium" se refiere a bacterias que son metilotrofos facultativos del género Methylobacterium. El término Methylobacterium, como se usa en el presente documento, entonces no engloba incluye especies en los géneros Methylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum y Methylocella, que son metanotrofos estrictos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "co-cultivo de Methylobacterium" se refiere a un cultivo de Methylobacterium que comprende al menos dos cepas de Methylobacterium o al menos dos especies de Methylobacterium.

Como se usa en el presente documento, la expresión "microorganismo contaminante" se refiere a microorganismos en un cultivo, caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición que no se identificaron antes de la introducción en el cultivo, caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición.

Como se usa en el presente documento, la expresión "derivados de la misma", cuando se usa en el contexto de una cepa de Methylobacterium, se refiere a cualquier cepa que se obtiene de la cepa de Methylobacterium. Los derivados de una cepa de Methylobacterium incluyen, pero no se limitan a, variantes de la cepa obtenidas por selección, variantes de la cepa seleccionadas por mutagénesis y selección, y cepas aisladas genéticamente transformadas obtenidas de la cepa de Methylobacterium.

Como se usa en el presente documento, el término "emulsión" se refiere a una mezcla coloidal de dos líquidos inmiscibles en donde un líquido es la fase continua y el otro líquido es la fase dispersa. En ciertos aspectos, la fase continua es un líquido acuoso y la fase dispersa es un líquido que no es miscible, o parcialmente miscible, en el líquido acuoso.

Como se usa en el presente documento, la expresión "esencialmente libre de microorganismos contaminantes" se refiere a un cultivo, caldo de fermentación, producto de fermentación o composición donde al menos aproximadamente 95 % de los microorganismos presentes por cantidad o tipo en el cultivo, caldo de fermentación, producto de fermentación o composición son los microorganismos de Methylobacterium u otros microorganismos deseados de identidad predeterminada.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancia sólida inanimada" se refiere a una sustancia que es insoluble o parcialmente soluble en agua o disoluciones acuosas y que es o inerte o que no es una parte de un organismo aún vivo del que se obtuvo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "mono-cultivo de Methylobacterium" se refiere a un cultivo de Methylobacterium que consiste en una única cepa de Methylobacterium.

Como se usa en el presente documento, el término "péptido" se refiere a cualquier polipéptido de 50 restos de aminoácidos o menos.

Como se usa en el presente documento, el término "tomate" se refiere a cualquier híbrido de Solanum lycopersicum o variedad que tiene o un hábitat de crecimiento determinante o indeterminante.

Como se usa en el presente documento, la expresión "plantas de semillero de tomate" incluye plantas de tomate desde la etapa de germinación hasta todas las etapas vegetativas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "plantas de tomate" incluye plantas de semillero de tomate desde la etapa de germinación gasta todas las etapas vegetativas y plantas de tomate en todas las etapas reproductivas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "planta de tomate" incluye tanto plantas de semillero de tomate como plantas de tomate en todas las etapas reproductivas.

Como se usa en el presente documento, el término "proteína" se refiere a cualquier polipéptido que tiene 51 o más restos de aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, un "pesticida" se refiere a un agente que es insecticida, fungicida, nematocida, bactericida, o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente bacteriostático" se refiere a agentes que inhiben el crecimiento de bacterias, pero no matan las bacterias.

Como se usa en el presente documento, la expresión "pesticida no inhibe sustancialmente el crecimiento de dicha Methylobacterium" se refiere a cualquier pesticida que cuando se proporciona en una composición que comprende un producto de fermentación que comprende una sustancia sólida en donde un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium se adhiere a la misma, da como resultado no más de 50 % de inhibición del crecimiento de Methylobacterium cuando la composición se aplica a una planta o parte de la planta en comparación con una composición que carece del pesticida. En ciertos aspectos, el pesticida da como resultado no más de 40 %, 20 %, 10 %, 5 %, o 1 % de inhibición del crecimiento de Methylobacterium cuando la composición se aplica a una planta o parte de la planta en comparación con una composición que carece del pesticida.

Como se usa en el presente documento, el término "bacteria PPFM" se refiere sin limitación a especies bacterianas en el género Methylobacterium distintas de M. nodulans.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancia sólida" se refiere a una sustancia que es insoluble o parcialmente soluble en agua o disoluciones acuosas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fase sólida que se puede suspender en su interior" se refiere a una sustancia sólida que se puede distribuir en un líquido por agitación.

Como se usa en el presente documento, el término "no regenerable" se refiere o a una parte de la planta o producto de la planta procesado que no se puede regenerar en una planta completa.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente toda la fase sólida se suspende en la fase líquida" se refiere a medios en donde al menos 95 %, 98 %, o 99 % de sustancia(s) sólida(s) que comprenden la fase sólida se distribuyen en el líquido por agitación.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente toda la fase sólida no se suspende en la fase líquida" se refiere a medios donde menos de 5 %, 2 %, o 1 % del sólido está en una forma de partícula que se distribuye en los medios por agitación.

Como se usa en el presente documento, la expresión "microorganismo residente" se refiere a bacterias, hongos o levaduras residentes.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancia que promueve el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla" se refiere a una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y combinaciones de las mismas.

Composiciones que contienen Methylobacterium agotadas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, métodos de su uso y métodos de preparación

Se describen en el presente documento composiciones que comprenden Methylobacterium que están agotadas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, métodos de uso de las composiciones para mejorar la producción de tomates y métodos de preparación de las composiciones. En ciertos aspectos de cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas, la composición comprende una sustancia sólida en donde un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium se adhiere a la misma. En ciertos aspectos donde la Methylobacterium se adhiere a una sustancia sólida, la composición comprende un coloide formado por la sustancia sólida en donde un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium se adhiere a la misma y un líquido. En ciertos aspectos, el coloide es un gel. En ciertos aspectos de ciertas composiciones anteriormente mencionadas, la composición es una emulsión que no contiene una sustancia sólida.

Se describen composiciones que comprenden una sustancia sólida con Methylobacterium adherente cultivada encima. En ciertos aspectos, la Methylobacterium adherente puede ser un título de al menos aproximadamente 5 x 108 UFC/g a al menos aproximadamente 5 x 1013 UFC/g o aproximadamente 1 x 1014 UFC/g y la composición está agotada de sustancias que promueven el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla. En ciertos aspectos, las composiciones que contienen Methylobacterium descritas o usadas en el presente documento están agotadas de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes cuando una o más de las sustancias están ausentes o están esencialmente ausentes. En ciertos aspectos, la composición está agotada de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes cuando las sustancias están presentes a un porcentaje de no más de aproximadamente 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % o 0,1 % de la masa total, masa/ volumen total o volumen total de la composición. En ciertos aspectos, la sustancia que promueve el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla se selecciona del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio y combinaciones de las mismas. Las fuentes de carbono incluyen, pero no se limitan a, alcoholes, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, lípidos, ácidos grasos y similares. Los alcoholes que están agotados incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, glicerol y similares. Las fuentes de nitrógeno incluyen, pero no se limitan a, amoniaco y diversos compuestos que contienen grupos amino que se pueden metabolizar por microorganismos. En ciertos aspectos, la sustancia que está agotada es una fuente de dos o más de una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre y una fuente de magnesio. Por ejemplo, la composición que está agotada de aminoácidos o péptidos y carece de otras fuentes de carbono o de nitrógeno está agotada de tanto una fuente de carbono como una de nitrógeno. En ciertos aspectos, la composición comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable.

Los microorganismos residentes en la planta o semilla incluyen, pero no se limitan a, bacterias, hongos y levaduras. Las sustancias que promueven el crecimiento de dichos microorganismos se pueden identificar por métodos que incluyen, pero no se limitan a, ensayo de la superficie de la planta o semilla para la cantidad o número de microorganismos presentes antes de la exposición de la planta o semilla a la sustancia (o a una composición que contiene la sustancia), exposición de la planta o semilla ensayada a la sustancia o composición en paralelo con una composición de control que carece de la sustancia, y luego re-ensayo de la superficie de la planta o semilla para la cantidad o número de microorganismos presentes después de un intervalo de tiempo adecuado y en condiciones adecuadas de temperatura para permitir el crecimiento de los microorganismos residentes. Los ensayos para los números de microorganismos incluyen, pero no se limitan a, determinaciones de unidades formadoras de colonias por una cantidad de planta o semilla expuesta a la sustancia y el control.

Sin pretender estar limitado por la teoría, se cree que las composiciones que contienen Methylobacterium descritas o usadas en el presente documento que están agotadas de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes pueden dar como resultado resultados superiores en comparación con otras composiciones que contienen dichas sustancias cuando se aplican a las plantas, partes de la planta o semillas. Se cree que dichos resultados superiores incluyen, pero no se limitan a, rendimiento mejorado de las plantas, resistencia a patógenos, resistencia a insectos, maduración de frutos y similares. Aunque no se busca estar limitado por la teoría, se cree que las composiciones que contienen Methylobacterium que están agotadas de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes permiten una colonización más eficiente y o amplia de la planta, parte de la misma o semilla, ya que se reduce la competición por uno o más del espacio o nutrientes por los microorganismos residentes.

Como la invención en el presente documento se proporcionan aquí los métodos para aumentar la velocidad de crecimiento de la raíz del tomate, crecimiento de hojas, crecimiento de plantas de semillero o disminución del tiempo de ciclo desde la siembra de la semilla de tomate hasta la producción del fruto de tomate cuando se compara con una planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de una semilla no tratada, que comprende aplicar una composición que comprende Methylobacterium a una planta de tomate, una parte de la misma o a una semilla de tomate, en donde dicha composición comprende una cepa de Methylobacterium seleccionada del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0037 (NRRL B-50941) y NLS0066 (NRRL B-50940). En ciertas realizaciones, la composición recubre o recubre parcialmente la planta de tomate, parte de la planta o semilla. La planta de tomate tratada o planta cultiva a partir de la semilla presenta una elevada velocidad de crecimiento de plantas de semillero, elevada velocidad de crecimiento de raíces, una elevada velocidad de crecimiento de hojas, elevada producción de semillas, un tiempo de ciclo reducido (desde la siembra de la semilla hasta la producción de semillas, rizomas, vástagos o frutos) y/o elevada biomasa total en comparación con una planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de semilla no tratada, obteniéndose así producción mejorada de tomates. En ciertas realizaciones, la aplicación de la composición proporciona al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 % o 40 % de aumento en la velocidad de crecimiento de raíces, velocidad de crecimiento de hojas, velocidad de producción de semillas, rizomas, vástagos o frutos, y/o elevada biomasa total en la planta de tomate, parte de la planta de tomate o una planta de tomate derivada de la misma en comparación con una planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de una semilla no tratada. En ciertas realizaciones, la aplicación de la composición proporciona aproximadamente un 5 % o 10 % a aproximadamente un 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 % o 70 % de aumento en la velocidad de crecimiento de raíces, velocidad de crecimiento de hojas, velocidad de crecimiento de plantas de semillero, producción de semillas, producción de frutos y/o elevada biomasa total en la planta, parte de la planta o una planta derivada de la misma en comparación con una planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de una semilla no tratada. En ciertas realizaciones, la aplicación de la composición proporciona al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 % o 40 % de disminución en el tiempo de ciclo (es decir, tiempo desde la semilla hasta la progenie de la semilla, hasta rizoma utilizable, hasta vástago, injerto o fruto utilizable) en la planta de tomate tratada o una planta de tomate cultivada a partir de una semilla tratada en comparación con la planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de una semilla no tratada. En ciertas realizaciones, la aplicación de la composición proporciona aproximadamente un 5 % o 10 % a aproximadamente un 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, o 50 % de disminución en el tiempo de ciclo en la planta de tomate tratada o una planta de tomate cultivada a partir de una semilla tratada en comparación con una planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de una semilla no tratada. En ciertas realizaciones, la parte de la planta de tomate es una hoja, un tallo, una flor, una raíz, un tubérculo o una semilla.

También se describen métodos de preparación de una planta de tomate o composición de tratamiento de una semilla de planta de tomate que comprende Methylobacterium y está agotada de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. Dicho método comprende (i) cultivar un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium en medio que comprenden una fase acuosa, una fase líquida y una fase sólida, o una emulsión, obteniendo así medio que contiene Methylobacterium; (ii) separar la Methylobacterium de al menos otra porción del medio que contiene Methylobacterium; y (iii) reconstituir la Methylobacterium en una matriz que carece de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. En ciertos aspectos, la etapa de separación se efectúa por centrifugación, filtración o sedimentación del medio que contiene Methylobacterium y retirada del exceso de líquido o emulsión del mismo. En ciertos aspectos, la sustancia que promueve el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla se selecciona del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y combinaciones de las mismas. En ciertos aspectos, la matriz es un líquido, una emulsión o uno o más sólidos, y comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable. Aún en ciertos aspectos, la Methylobacterium se cultiva en medios que comprenden una fase líquida y una sustancia sólida con Methylobacterium adherente cultivada encima. La sustancia sólida se separa de la fase líquida del medio que contiene Methylobacterium, y la sustancia sólida con Methylobacterium adherente cultivada encima se reconstituye en la matriz anteriormente mencionada. En ciertos aspectos de los métodos, Methylobacterium sp. se selecciona del grupo que consiste en M. aminovorans, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. nodulans, M. phyllosphaerae, M thiocyanatum y M. oryzae. En ciertos aspectos de los métodos, Methylobacterium no es M. radiotolerans ni M. oryzae. En ciertos aspectos de los métodos, la Methylobacterium se adhiere a una sustancia sólida. En ciertos aspectos de los métodos, la Methylobacterium adherida a la sustancia sólida se combina con un líquido para formar una composición que es un coloide. En ciertos aspectos de los métodos, el coloide es un gel. En ciertos aspectos de los métodos, la Methylobacterium adherida a la sustancia sólida se proporciona cultivando la Methylobacterium en presencia de la sustancia sólida. En ciertos aspectos de los métodos, la composición comprende una emulsión. En ciertos aspectos de los métodos, la Methylobacterium se proporciona cultivando la Methylobacterium en una emulsión.

Se ha encontrado que los métodos donde Methylobacterium se cultiva en medios bifásicos que comprenden una fase líquida y una sustancia sólida aumentan significativamente el rendimiento resultante de Methylobacterium con respecto a los métodos donde la Methylobacterium se cultiva en medios líquidos solo. En ciertos aspectos, los métodos pueden comprender cultivar Methylobacterium en medios líquidos con una sustancia sólida en partículas que se puede suspender en el líquido por agitación en condiciones que proporcionan el crecimiento de Methylobacterium. En ciertos aspectos donde se usan sustancias sólidas en partículas, al menos sustancialmente toda la fase sólida se puede suspender en la fase líquida tras la agitación. Dichas sustancias sólidas en partículas pueden comprender materiales que tienen aproximadamente 1 milímetro o menos de longitud o diámetro. En ciertos aspectos, el grado de agitación es suficiente para proporcionar la distribución uniforme de la sustancia sólida en partículas en la fase líquida y/o niveles óptimos de aireación del cultivo. Sin embargo, en otros aspectos descritos en el presente documento, al menos sustancialmente toda la fase sólida no se suspende en la fase líquida, o porciones de la fase sólida se suspenden en la fase líquida y porciones de la fase sólida no se suspenden en la fase líquida. Se pueden usar sustancias sólidas no en partículas en ciertos medios bifásicos donde la fase sólida no se suspende en la fase líquida. Dichas sustancias sólidas no en partículas incluyen, pero no se limitan a, materiales que son mayores de aproximadamente 1 milímetro de longitud o diámetro. Dichas sustancias sólidas en partículas y no en partículas también incluyen, pero no se limitan a, materiales que son porosos, fibrosos o configurados de otro modo para proporcionar elevadas áreas superficiales para el crecimiento adherente de la Methylobacterium. Los medios bifásicos donde porciones de la fase sólida se suspenden en la fase líquida y porciones de la fase sólida no se suspenden en la fase líquida pueden comprender una mezcla de sustancias sólidas en partículas y no en partículas. Dichas sustancias sólidas en partículas y no en partículas usadas en cualquiera de los medios bifásicos anteriormente mencionados también incluyen, pero no se limitan a, materiales que son porosos, fibrosos o configurados de otro modo para proporcionar elevadas áreas superficiales para el crecimiento adherente de Methylobacterium. En ciertos aspectos, el medio comprende un coloide formado por una fase sólida y una líquida. Se puede forma previamente un coloide que comprende un sólido y un líquido y añadir a medio líquido o se puede formar en medio que contiene un sólido y un líquido. Los coloides que comprenden un sólido y un líquido se pueden formar sometiendo ciertas sustancias sólidas a un cambio químico y/o térmico. En ciertos aspectos, el coloide es un gel. En ciertos aspectos, la fase líquida del medio es una emulsión. En ciertos aspectos, la emulsión comprende un líquido acuoso y un líquido que no es miscible, o solo parcialmente miscible, en el líquido acuoso. Los líquidos que no son miscibles, o solo parcialmente miscibles, en agua incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes: (1) líquidos que tienen una miscibilidad en agua que es igual o inferior a la de pentanol, hexanol o heptanol a 25 °C; (2) líquidos que comprenden un alcohol, un aldehído, una cetona, un ácido graso, un fosfolípido o cualquier combinación de los mismos; (3) alcoholes seleccionados del grupo que consiste en alcoholes alifáticos que contienen al menos 5 carbonos y esteroles; (4) un aceite animal, aceite microbiano, aceite sintético, aceite vegetal o combinación de los mismos; y/o, (5) un aceite vegetal se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, cacahuete, girasol, oliva, lino, coco, palma, colza, semilla de sésamo, alazor y combinaciones de los mismos. En ciertos aspectos, el líquido inmiscible o parcialmente inmiscible puede comprender al menos aproximadamente 0,02 % a aproximadamente 20 % de la fase líquida en masa. En ciertos aspectos, los métodos pueden comprender obtener un medio bifásico de cultivo que comprende el líquido, el sólido y Methylobacterium e incubar el cultivo en condiciones que proporcionan el crecimiento de la Methylobacterium. Los medios bifásicos de cultivos que comprenden el líquido, el sólido y Methylobacterium se pueden obtener mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de: (a) inocular un medio bifásico que comprende el líquido y la sustancia sólida con Methylobacterium; (b) inocular la sustancia sólida con Methylobacterium y luego introducir la sustancia sólida que comprende la Methylobacterium en el medio líquido; (c) inocular la sustancia sólida con Methylobacterium, incubar la Methylobacterium en la sustancia sólida y luego introducir la sustancia sólida que comprende Methylobacterium en el medio líquido; o (d) cualquier combinación de (a), (b) o (c). Los métodos y composiciones para el cultivo de Methylobacterium en medios bifásicos que comprenden un líquido y un sólido se desvelan en la solicitud de patente de E^e . UU. de cesión común US 2013-0324407 A1 presentada el 31 de mayo de 2013 y en la solicitud de patente internacional de cesión común WO 2013/181610 presentada el 31 de mayo de 2013.

También se ha encontrado que métodos donde Methylobacterium se cultiva en medios que comprenden una emulsión aumentan significativamente el rendimiento resultante de Methylobacterium con respecto a métodos donde Methylobacterium se cultiva en medio líquido solo. En cierta PCT/US13/43722, los métodos para la preparación de las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden comprender cultivar el agente de Methylobacterium en una emulsión en condiciones que proporcionan el crecimiento de Methylobacterium. Se pueden obtener medios que comprenden la emulsión y Methylobacterium mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de: (a) inocular un medio que comprenden la emulsión con Methylobacterium; (b) inocular el líquido acuoso con Methylobacterium, introducir el líquido no acuoso y mezclar para formar una emulsión; (c) inocular el líquido acuoso con Methylobacterium, introducir el líquido no acuoso y mezclar para formar una emulsión; o (d) cualquier combinación de (a), (b) o (c). En cierta PCT/US13/43722, la emulsión comprende un líquido acuoso y un líquido que no es miscible, o solo parcialmente miscible, en el líquido acuoso. Líquidos no acuosos que no son miscibles, o solo parcialmente miscibles, en el agua incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes: (1) líquidos que tienen una miscibilidad en agua que es igual o inferior a la del n-pentanol, n-hexanol, o nheptanol a 25 °C; (2) líquidos que comprenden un alcohol, un aldehído, una cetona, un ácido graso, un fosfolípido, o cualquier combinación de los mismos; (3) alcoholes que están seleccionados del grupo que consiste en alcoholes alifáticos que contienen al menos 5, 6 o 7 carbonos y esteroles; (4) un aceite animal, aceite microbiano, aceite sintético, aceite vegetal, o combinación de los mismos; y/o, (5) un aceite vegetal que está seleccionado del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, cacahuete, girasol, oliva, lino, coco, palma, semilla de colza, semilla de sésamo, alazor y combinaciones de los mismos. En cierta PCT/US13/43722, el líquido inmiscible o parcialmente inmiscible no acuoso puede comprender al menos aproximadamente 0,02 % a aproximadamente 20 % de la emulsión en masa. En cierta PCT/US13/43722, el líquido inmiscible o parcialmente inmiscible no acuoso puede comprender al menos aproximadamente cualquiera de aproximadamente 0,05 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % a aproximadamente 3 %, 5 %, 10 % o 20 % de la emulsión en masa.

En ciertos aspectos, el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación, o composiciones que comprenden Methylobacterium sp., pueden comprender además uno o más microorganismos introducidos de identidad predeterminada distintos de Methylobacterium. Otros microorganismos que se pueden añadir incluyen, pero no se limitan a, microorganismos que son biopesticidas o proporcionan algún otro beneficio cuando se aplican a una planta o parte de la planta. Los microorganismos biopesticidas o de otro modo beneficiosos incluyen así, pero no se limitan a, diversos Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp. y Trichoderma sp. Los biopesticidas microbianos pueden ser una bacteria, hongo, virus o protozoo. Los microorganismos biopesticidas particularmente útiles incluyen diversas cepas de Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Pseudomonas syringae, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens y Streptomyces lydicus. Otros microorganismos que se añaden pueden estar genéticamente manipulados o ser cepas aisladas que existen de forma natural que están disponibles como cultivos puros. En ciertos aspectos, se tiene previsto que el microorganismo bacteriano o fúngico se pueda proporcionar en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición en forma de una espora.

En ciertos aspectos, el medio de cultivo líquido se prepara a partir de componentes económicos y fácilmente disponibles que incluyen, pero no se limitan a, sales inorgánicas tales como fosfato de potasio, sulfato de magnesio y similares, fuentes de carbono tales como glicerol, metanol, ácido glutámico, ácido aspártico, ácido succínico y similares, y mezclas de aminoácidos tales como peptona, triptona y similares. Medios líquidos a modo de ejemplo que se puede usar incluyen, pero no se limitan a, medio de sales minerales de amonio (AMS) (Whittenbury et al., 1970), medio de cultivo mínimo de Vogel-Bonner (VB) (Vogel y Bonner, 1956) y caldo de LB ("caldo de Luria-Bertani").

En general, la sustancia sólida usada en los métodos y las composiciones que proporcionan el crecimiento eficiente de Methylobacterium puede ser cualquier sustancia sólida adecuada que sea insoluble o solo parcialmente soluble en agua o disoluciones acuosas. Dichas sustancias sólidas adecuadas también son no bactericidas o no bacteriostáticas con respecto a Methylobacterium cuando las sustancias sólidas se proporcionan en el medio de cultivo líquido. En ciertos aspectos, dichas sustancias sólidas adecuadas también son sustancias sólidas que se obtienen fácilmente en forma estéril o se convierten en estériles. Las sustancias sólidas usadas en el presente documento se pueden esterilizar por cualquier método que proporcione eliminación de microorganismos contaminantes y así incluyen, pero no se limitan a, métodos tales como esterilización en autoclave, irradiación, tratamiento químico y cualquier combinación de los mismos. Estas sustancias sólidas incluyen sustancias naturales de origen animal, vegetal, microbiano, fúngico, o mineral, sustancias artificiales, o combinaciones de sustancias naturales y artificiales. En ciertos aspectos, las sustancias sólidas son sustancias sólidas inanimadas. Las sustancias sólidas inanimadas de origen animal, vegetal, microbiano o fúngico se pueden obtener de animales, plantas, microbios u hongos que son inviables (es decir, que ya no viven) o que ya se han convertido en inviables. Las conchas de las diatomeas son así sustancias sólidas inanimadas cuando se han quitado las algas diatomeas previamente asociadas o de otro modo se han convertido en inviables. Como las conchas de las diatomeas son sustancias sólidas inanimadas, no se considera que sean organismos fotosintéticos o microorganismos fotosintéticos. En ciertos aspectos, las sustancias sólidas incluyen, pero no se limitan a, arena, limo, tierra, arcilla, ceniza, carbón vegetal, tierra de diatomeas y otros minerales similares, vidrio molido o perlas de vidrio, materiales cerámicos molidos, perlas cerámicas, bentonita, caolín, talco, perlita, mica, vermiculita, sílices, polvo de cuarzo, montmorillonita y combinaciones de los mismos. En ciertos aspectos, la sustancia sólida puede ser un polímero o perlas poliméricas. Los polímeros que se pueden usar como una sustancia sólida incluyen, pero no se limitan a, diversos polisacáridos tales como polímeros celulósicos y polímeros quitinosos que son insolubles o solo parcialmente solubles en agua o disoluciones acuosas, agar (es decir, galactanos) y combinaciones de los mismos. En ciertos aspectos, la sustancia sólida puede ser un cristal de sal insoluble o solo parcialmente soluble. Los cristales de sales que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, carbonatos, cromatos, sulfitos, fosfatos, hidróxidos, óxidos y sulfuros insolubles o solo parcialmente solubles. En ciertos aspectos, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, célula fúngica, espora microbiana, o espora fúngica. En ciertos aspectos, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana o espora microbiana en donde la célula microbiana o espora microbiana no es un microorganismo fotosintético. En ciertos aspectos, la célula microbiana o espora microbiana no es un microorganismo fotosintético, donde el microorganismo fotosintético está seleccionado del grupo que consiste en algas, cianobacterias, diatomeas, Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Gracilaria, Pleurochrysis carterae, Sargassum y Ulva. En aún otros aspectos, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, célula fúngica, espora microbiana o espora fúngica inactivada (es decir, inviable). En aún otros aspectos, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, célula fúngica, espora microbiana o espora fúngica quiescente (es decir, viable pero no activamente divisora). En aún otros aspectos, la sustancia sólida puede ser residuo celular de origen microbiano. En aún otros aspectos, la sustancia sólida puede ser materia en partículas de cualquier parte de una planta. Las partes de la planta que se pueden usar para obtener la sustancia sólida incluyen, pero no se limitan a, mazorcas, cascarillas, vainas, hojas, raíces, flores, tallos, cortezas, semillas y combinaciones de los mismos. También se pueden usar los productos obtenidos de partes de la planta procesados que incluyen, pero no se limitan a, bagazo, salvado de trigo, sémola de soja, torta de semillas trituradas, hojas y tallos, y similares. Se pueden moler dichas partes de la planta, plantas procesadas y/o partes de la planta procesadas para obtener el material sólido en una forma en partículas que se pueda usar. En ciertos aspectos, se puede usar madera o un producto de madera que incluye, pero no se limitan a, pulpa de madera, serrín, virutas y similares. En ciertos aspectos, la sustancia sólida puede ser una materia en partículas de un animal(s), que incluye, pero no se limitan a, harina de huesos, gelatina, conchas molidas o en polvo, pelo, cuero macerado y similares.

En ciertos aspectos, la sustancia sólida se proporciona en una forma en partículas que proporciona distribución de la sustancia sólida en los medios de cultivo. En ciertos aspectos, la sustancia sólida comprende partículas de aproximadamente 2 micrómetros a aproximadamente 1000 micrómetros en longitud promedio o diámetro promedio. En ciertos aspectos, la sustancia sólida comprende partículas de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 1000 micrómetros de longitud promedio o diámetro promedio. En ciertos aspectos, la sustancia sólida es una partícula de aproximadamente 1,2, 4, 10, 20 o 40 micrómetros a cualquiera de aproximadamente 100, 200, 500, 750 o 1000 micrómetros en longitud promedio o diámetro promedio. Características deseables de partículas usadas en los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen humectabilidad adecuada de forma que las partículas se puedan suspender en todo los medios con agitación.

En ciertos aspectos, la sustancia sólida se proporciona en el medio como coloide en donde la fase continua es un líquido y la fase dispersa es el sólido. Sólidos adecuados que se pueden usar para formar coloides en medios líquidos usados para cultivar Methylobacterium incluyen, pero no se limitan a, diversos sólidos que se denominan hidrocoloides. Dichos hidrocoloides usados en los medios, métodos y composiciones proporcionadas en el presente documento pueden ser polímeros hidrófilos, de origen vegetal, animal, microbiano o sintético. Los polímeros de hidrocoloide usados en los métodos pueden contener muchos grupos hidroxilo y/o puede ser polielectrolitos. Los polímeros de hidrocoloide usados en las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, agar, alginato, arabinoxilano, carragenina, carboximetilcelulosa, celulosa, curdlano, gelatina, gellan, p-glucano, goma guar, goma arábiga, goma de semilla de algarrobo, pectina, almidón, goma xantana y mezclas de los mismos. En ciertos aspectos, el coloide usado en los medios, métodos y composiciones descritos en el presente documento puede comprender un polímero de hidrocoloide y una o más proteínas.

En ciertos aspectos, la sustancia sólida puede ser una sustancia sólida que proporciona crecimiento adherente de Methylobacterium sobre la sustancia sólida. Las Methylobacterium que se adhieren a una sustancia sólida son Methylobacterium que no se pueden eliminar sustancialmente lavando simplemente la sustancia sólida con la Methylobacteríum adherente con medios de crecimiento, mientras que la Methylobacteríum no adherente puede ser eliminada sustancialmente lavando la sustancia sólida con medio de crecimiento líquido. En este contexto, "eliminar sustancialmente" significa que al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de la Methylobacteríum presente se elimina cuando la sustancia sólida se lava con tres volúmenes de medio de crecimiento líquido. Dicho lavado se puede efectuar mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, decantar líquido de una fase sólida lavada o pasar líquido a través de una fase sólida sobre un filtro que permite el flujo a través de las bacterias en el líquido. En ciertos aspectos, las Methylobacteríum adherentes que están asociadas al sólido pueden incluir o Methylobacteríum que están directamente unidas al sólido y/o Methylobacteríum que están indirectamente unidas a la sustancia sólida. Methylobacteríum que están indirectamente unidas a la sustancia sólida incluyen, pero no se limitan a, Methylobacteríum que están unidas a otra Methylobacteríum o a otro microorganismo que está unido a la sustancia sólida, Methylobacteríum que están unidas a la sustancia sólida uniéndose a otra sustancia que está unida a la sustancia sólida, y similares. En ciertos aspectos, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % de Methylobacteríum en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación, o composiciones, son Methylobacteríum que están adheridas a la sustancia sólida. En ciertos aspectos, las Methylobacteríum adherentes pueden estar presentes sobre la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición a una densidad de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/20 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/10 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/10 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/5 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/2 micrómetros cuadrados, o de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/micrómetro cuadrado. En ciertos aspectos, las Methylobacteríum adherentes pueden estar presentes sobre la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación, o composición, a una densidad de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/20 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/5 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/micrómetro cuadrado, o de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/2 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/micrómetro cuadrado. En ciertos aspectos, las Methylobacteríum adherentes pueden estar presentes sobre la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación, 0 composición, a una densidad de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/20 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/2 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/ 2 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/ 2 micrómetros cuadrados, o de al menos aproximadamente 1 Methylobacteríum/5 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 Methylobacteríum/2 micrómetros cuadrados. Los caldos de fermentación bifásicos descritos en el presente documento pueden comprender una fase líquida que contiene Methylobacteríum no adherente. En ciertos aspectos, los títulos de Methylobacteríum no adherente en la fase líquida pueden ser inferiores a aproximadamente 100.000, 10.000 o 1.000 UFC/mL.

Los métodos de cultivo bifásico proporcionados pueden dar caldos de fermentación con Methylobacteríum a un título superior a aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, a un título superior a aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, a un título superior a aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, a un título de al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En ciertos aspectos, los caldos de fermentación descritos en el presente documento pueden comprender Methylobacteríum a un título de al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En ciertos aspectos, los caldos de fermentación descritos en el presente documento pueden comprender Methylobacteríum a un título de al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En ciertos aspectos, los caldos de fermentación descritos en el presente documento comprenderán Methylobacteríum a un título de al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En ciertos aspectos, los caldos de fermentación descritos en el presente documento comprenderán Methylobacteríum a un título de, al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro.

Se pueden obtener sustancias sólidas con Methylobacterium adherente como productos de fermentación que se pueden usar para preparar diversas composiciones útiles para tratar plantas o partes de la planta para mejorar el rendimiento de la planta, resistencia a insectos de la planta, resistencia a enfermedades fúngicas de la planta y/o para mejorar la producción de tomate. En ciertos aspectos, la composición comprende Methylobacterium y está agotada en sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes. Las composiciones descritas en el presente documento que comprenden Methylobacterium, sustancias sólidas con Methylobacterium cultivado encima, o que comprenden emulsiones con Methylobacterium cultivado en su interior, se pueden usar para tratar plantas o partes de la planta. Así se describen plantas, partes de la planta y, en particular, semillas de la planta que han sido al menos recubiertas parcialmente o recubiertas con los productos del caldo de fermentación o composiciones que comprenden Methylobacterium. También se describen productos de la planta procesados que contienen los productos del caldo de fermentación o composiciones con Methylobacterium o Methylobacterium adherente. Se pueden usar sustancias sólidas con Methylobacterium adherente para preparar diversas composiciones que son particularmente útiles para tratar semillas de la planta. Así se describen semillas que han sido al menos parcialmente recubiertas con los productos del caldo de fermentación o composiciones. También se describen productos de semilla procesados, que incluyen, pero no se limitan a, maicena, harina, comida y copos que contienen los productos del caldo de fermentación o composiciones descritas en el presente documento. En ciertos aspectos, el producto de la planta procesado no será regenerable (es decir, será incapaz de desarrollarse dentro de una planta). En ciertos aspectos, la sustancia sólida usada en el producto de fermentación o composición que recubre al menos parcialmente la planta, parte de la planta o semilla de planta, o que está contenida en la planta procesada, parte de la planta o producto de semilla, comprende una sustancia sólida y Methylobacterium asociado o adherente que se puede identificar fácilmente comparando una planta tratada y una no tratada, parte de la planta, semilla de planta o producto procesado de la misma. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de la planta, o una semilla incluye, pero no se limita a, recubrimiento de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente 99,5 % del área superficial de la planta, parte de la planta o semilla de la planta.

También se describen en el presente documento métodos de preparación de una composición de tratamiento de planta o de semilla de planta que comprende Methylobacterium y está agotada en sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. Dichos métodos pueden comprender (i) cultivar un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium en medios que comprenden: (a) una fase acuosa; (b) una fase líquida y una fase sólida; o (c) una emulsión, obteniéndose así un medio que contiene Methylobacterium; (ii) separar la Methylobacterium de al menos otra porción del medio que contiene Methylobacterium; y (iii) reconstituir la Methylobacterium en una matriz que carece de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. En ciertos aspectos, la etapa de separación se efectúa por centrifugación, filtración o sedimentación del medio que contiene Methylobacterium y eliminación del exceso de líquido o emulsión de los mismos. En ciertos aspectos donde la Methylobacterium se cultiva en presencia de una sustancia sólida, la separación proporcionará una fracción que contiene Methylobacterium con crecimiento adherente a la sustancia sólida y algunos Methylobacterium no adherentes que se pueden reconstituir en la matriz. En ciertos aspectos, la sustancia que promueve el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla está seleccionada del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio y combinaciones de las mismas. En ciertos aspectos, la matriz es un líquido, una emulsión, o uno o más sólidos, y comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable. En ciertos aspectos, la Methylobacterium se cultiva en medios que comprenden una fase líquida y una sustancia sólida con Methylobacterium adherente cultivada encima. La sustancia sólida se separa de la fase líquida del medio que contiene Methylobacterium, y la sustancia sólida con Methylobacterium adherente cultivada encima se reconstituye en la matriz anteriormente mencionada. En ciertos aspectos, la matriz puede ser un líquido que incluye, pero no se limitan a, agua y tampón acuoso agotado de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, o una disolución acuosa agotada de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla.

En ciertos aspectos, las Methylobacterium sp. que mejoran la producción de tomate se pueden identificar probando Methylobacterium sp. candidatas recientemente aisladas para la presencia de secuencias de ácidos nucleicos polimórficas que están presentes en las Methylobacterium sp. a modo de ejemplo proporcionadas en el presente documento que mejoran las velocidades de crecimiento de plantas de semillero de tomate y que están ausentes de Methylobacterium sp. que no mejoran las velocidades de crecimiento de plantas de semillero de tomate. En ciertos aspectos, las secuencias de ácidos nucleicos polimórficas que están presentes en las Methylobacterium sp. identificadas que mejoran la producción de tomate también están presentes en una o más de las cepas aisladas NLS0037 de Methylobacterium sp. a modo de ejemplo proporcionadas en el presente documento que mejoran la velocidad de crecimiento de plantas de semillero de tomate, pero están ausentes de una o más de las cepas aisladas de Methylobacterium sp. que no mejoran las velocidades de crecimiento de plantas de semillero de tomate. Dichos polimorfismos de ácido nucleico que se producen en las Methylobacterium sp. que mejoran la producción de tomate pueden incluir, pero no se limitan a, polimorfismos de un solo nucleótido, RFLP, AFLP y/u otras variaciones de ADN tales como secuencias repetitivas, secuencias de inserción, transposones e islas genómicas que se producen como resultado de inserciones, deleciones y sustituciones (Indel) en el genoma bacteriano que incluyen tanto el ADN cromosómico, además de cualquier elemento de ácido nucleico extracromosómico que pueda estar presentes en las Methylobacterium sp. que mejora la producción de tomate. Dichos elementos de ácido nucleico extracromosómico incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, ADN o ARN de bacteriófago y similares. Los métodos usados para identificar dichos polimorfismos de nucleótidos incluyen, pero no se limitan a, técnicas de extensión de una sola base (SBE), hibridación específica de alelo (ASH), detección por PCR en tiempo real (por ejemplo, TaqMan™; las patentes de EE. UU. N° 5.804.375; 5.538.848; 5.487.972; y 5.210.015), combinaciones de A^s H y RT-PCR (sistemas de detección KASPTM, LGC Genomics, Middlesex, RU) y técnicas de secuenciación profunda (solicitud de patente de EE. UU. N° 20120264632).

En el presente documento también se describen composiciones, métodos de preparación de las composiciones y según la invención se proporcionan métodos de uso de las composiciones para aumentar la velocidad de crecimiento de la raíz del tomate, crecimiento de hojas, crecimiento de plantas de semillero o disminución del tiempo de ciclo desde la semilla de tomate hasta la producción del fruto de tomate en comparación con una planta de tomate de control no tratada. Según la invención, los métodos comprenden o usan cualquiera de las siguientes cepas de Methylobacterium, NLS0017, NLS0037 o NLS0066.

Tabla 1. Cepas aisladas de Methylobacterium sp.

1 Número de depósito de la cepa que se va a depositar en el AGRICULTURAL RESEARCH SERVICE CULTURE COLLECTION (N^r RL) del National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EE. UU., bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes. Sujeto al Título 37 del CFR párrafo 1.808(b), todas las restricciones impuestas por el depositario sobre la disponibilidad al público del material depositado se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de cualquier patente de la presente la solicitud de patente.

Las solicitudes de patente de cesión común que desvelan usos específicos adicionales de las cepas de Methylobacterium de la Tabla 1 tales como: (1) aumento del rendimiento de maíz (solicitud internacional WO2015085115A1 presentada el 04/12/2014); (2) aumento del rendimiento de soja (solicitud internacional WO2015/085116A1 presentada el 04/12/2014); (3) mejora del cultivo de lechuga (solicitud de patente internacional WO2015/088063 presentada el 04/12/2014); (4) proporciona resistencia a enfermedades fúngicas. La solicitud internacional WO 2015/085063 A1 presentada el 04/12/2014 y que reivindica beneficio del documento de patente US 61/954840, presentado el 18/03/2014, y el documento de patente US 61/911516, presentado el 04/12/2013, desvela las secuencias genómicas de ácidos nucleicos de NLS017, NLS020, NLS037, NLS042, NLS065 y NLS066. Dichas secuencias genómicas de ácidos nucleicos se pueden usar para identificar composiciones, partes de la planta, semillas de la planta o productos de la planta procesados que comprenden NLS017, NLS020, NLS037, NLS042, NLS065y NLS066.

En el presente documento también se describen Methylobacterium sp. que proporcionan la producción de tomate mejorada donde las Methylobacterium sp. tienen cualquiera de: (i) al menos un gen que codifica al menos una proteína que es ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-4594; o (ii) al menos un gen que codifica al menos una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia de la Tabla 4. Una Methylobacterium sp. tiene al menos un gen que es ortólogo a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 1-4594, o a la SEQ ID NO correspondiente de una proteína de referencia de la Tabla 4, cuando un cromosoma y/o cualquier ADN extracromosómico en esa Methylobacterium sp. contiene un gen que codifica una proteína que tiene al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencias a través de la longitud entera de la secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 1-4594. Las Methylobacterium sp. también pueden tener al menos dos, tres, cuatro, seis, ocho, 10, 15 o 20 genes que codifican proteínas que son ortólogas a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-4594 o que codifican proteínas que son ortólogas a la SEQ ID NO correspondiente de una proteína de referencia de la Tabla 4. En ciertos aspectos, las Methylobacterium sp. pueden contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1- 2684 de la Tabla 4. En ciertos aspectos, las Methylobacterium sp. pueden contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2585-4594 de la Tabla 4. En ciertos aspectos, las Methylobacterium sp. pueden contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2969 o 212 de la Tabla 4. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 2969 incluyen, pero no se limitan a, las proteínas ortólogas identificadas como proteínas de la familia XRE de reguladores de la transcripción de SEQ ID NO: 2969 y 399 que se proporcionan en la Tabla 4. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 212 incluyen, pero no se limitan a, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212 y 2828 que son similares a proteínas identificadas como miembros de los reguladores de la transcripción de la familia LysR. También se describen composiciones que comprenden cualquiera de las Methylobacterium sp. anteriormente mencionadas y un excipiente agrícolamente aceptable, adyuvante, o combinación de los mismos, junto con semillas u hojas de tomate que están al menos parcialmente recubiertas con dichas composiciones y métodos de uso de dichas composiciones como tratamientos de semilla o foliares.

Se puede determinar que una Methylobacterium sp. contiene un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-4594 mediante una variedad de técnicas diferentes. En ciertos aspectos, se puede determinar que una Methylobacterium sp. contiene un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-4594 por ensamblaje de una secuencia genómica electrónica completa que comprende secuencias de ADN cromosómico y extracromosómico presentes en esa Methylobacterium sp. con un ordenador y software asociado, y determinar si cualquiera de los marcos de lectura abiertos (ORF) presentes en esa secuencia de ADN codifica una proteína que tiene el porcentaje de identidad de secuencias anteriormente mencionado. En dichos aspectos, el ORF se puede identificar realizando una traducción de seis vías de la secuencia electrónicamente ensamblada y buscando la traducida con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-4594 o la SEQ ID NO: correspondiente de una proteína de referencia de la Tabla 4. En otros aspectos, la presencia o ausencia de una secuencia dada dentro de una Methylobacterium sp. de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-4594 o la SEQ ID NO: correspondiente de una proteína de referencia de la Tabla 4 se puede determinar por un análisis de ácidos nucleicos o técnica de análisis de proteínas. Ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de SEQ ID NO: 1-4594 incluyen, pero no se limitan a, SEQ ID NO: 4595-9188, respectivamente. Dichos análisis de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, técnicas basadas en hibridación de ácidos nucleicos, reacciones en cadena de la polimerasa, espectroscopía de masas, detección basada en nanoporos, análisis de ADN ramificado, combinaciones de los mismos y similares. Técnicas de análisis de proteínas incluyen, pero no se limitan a, inmunodetección, espectroscopía de masas, combinaciones de los mismos y similares.

Las composiciones descritas en el presente documento que son útiles para tratar plantas de tomate o partes de la planta que comprenden Methylobacterium, y/o están agotadas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, contienen una sustancia sólida con Methylobacterium adherente cultivado encima, o que comprenden emulsiones con Methylobacterium cultivado en su interior también pueden comprender además un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable . Un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable normalmente es un componente que no produce excesiva fitotoxicidad u otros efectos adversos cuando se expone a una planta o parte de la planta. En ciertos aspectos, la sustancia sólida puede ser ella misma un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable, mientras que no sea bactericida o bacteriostático para la Methylobacterium. En otros aspectos, la composición comprende además al menos uno de un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable. Cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas también puede comprender además un pesticida. Los pesticidas usados en la composición incluyen, pero no se limitan a, un insecticida, un fungicida, un nematicida y un bactericida. En ciertos aspectos, el pesticida usado en la composición es un pesticida que no inhibe sustancialmente el crecimiento de Methylobacterium. Como Methylobacterium son bacterias Gram-negativas, bactericidas adecuados usadas en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, bactericidas que presentan actividad contra bacterias Gram-positivas, pero no bacterias Gram-negativas. Las composiciones descritas en el presente documento también pueden comprender un agente bacteriostático que no inhibe sustancialmente el crecimiento de Methylobacterium. Los agentes bacteriostáticos adecuados para su uso en las composiciones descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, aquellos que presentan actividad contra bacterias Gram-positivas, pero no bacterias Gram-negativas. Cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas también puede ser un producto esencialmente seco (es decir, que tiene aproximadamente 5 % o menos de contenido de agua), una mezcla de la composición con una emulsión, o una suspensión. Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento se puede usar para recubrir o recubrir parcialmente una planta, parte de la planta o semilla de la planta. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de la planta, o una semilla, incluye, pero no se limita a, recubrimiento de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente 99,5 %, del área superficial de la planta, parte de la planta o semilla de la planta.

Adyuvantes agrícolamente aceptables usados en las composiciones que comprenden Methylobacterium incluyen, pero no se limitan a, componentes que potencian la eficacia de los productos y/o productos que potencian la facilidad de aplicación del producto. Adyuvantes que potencian la eficacia de los productos pueden incluir diversos humectantes/agentes de extensión que promueven la adhesión a y extensión de la composición sobre partes de la planta, adhesivos que promueven la adhesión a la parte de la planta, penetrantes que pueden promover el contacto del agente activo con tejidos interiores, sustancias de relleno que aumentan la semivida del agente activo inhibiendo la degradación medioambiental, y humectantes que aumentan la densidad o tiempo de secado de las composiciones pulverizadas. Los humectantes/agentes de extensión usados en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos anfóteros, tensioactivos de organosilicato y/o tensioactivos acidificados. Los adhesivos en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, sustancias basadas en látex, terpeno/pinoleno y sustancias basadas en pirrolidona. Los penetrantes pueden incluir aceite mineral, aceite vegetal, aceite vegetal esterificado, tensioactivos de organosilicato y tensioactivos acidificados. Las sustancias de relleno usadas en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, sulfato de amonio, o sustancias basadas en menteno. Los humectantes usados en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, glicerol, propilenglicol y dietilglicol. Los adyuvantes que mejoran la facilidad de aplicación del producto incluyen, pero no se limitan a, agentes acidificantes/de tamponamiento, agentes antiespumantes/desespumantes, agentes de compatibilidad, agentes reductores de la deriva, colorantes y acondicionadores del agua. Los agentes antiespumantes/desespumantes usados en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, dimetopolisiloxano. Los agentes de compatibilidad usados en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, sulfato de amonio. Los agentes reductores de la deriva usados en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, poliacrilamidas y polisacáridos. Los acondicionadores del agua usados en las composiciones pueden incluir, pero no se limitan a, sulfato de amonio.

También se describen en el presente documento métodos de tratamiento de plantas y/o partes de la planta con los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación y composiciones que comprenden Methylobacterium. Las plantas tratadas, y las partes de la planta tratadas obtenidas a partir de las mismas, incluyen, pero no se limitan a, una planta de tomate. Las partes de la planta que se tratan incluyen, pero no se limitan a, hojas, tallos, flores, raíces, semillas, fruto, tubérculos, coleóptilos y similares. Se pueden tratar semillas u otras propágulas de cualquiera de las plantas anteriormente mencionadas con los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación, productos de fermentación y/o composiciones descritas en el presente documento.

En ciertos aspectos, las plantas y/o las partes de la planta se tratan aplicando los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones que comprenden Methylobacterium como una pulverización. Dichas aplicaciones por pulverización incluyen, pero no se limitan a, tratamientos de una única parte de la planta o cualquier combinación de partes de la planta. La pulverización se puede lograr con cualquier dispositivo que distribuirá los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones a la planta y/o parte(s) de la planta. Dispositivos de pulverización útiles incluyen un pulverizador de barras, un pulverizador manual o de mochila, aviones fumigadores (por ejemplo, pulverización aérea) y similares. También se pueden usar dispositivos de pulverización y o métodos que proporcionan la aplicación de los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones a tanto una como a ambas de la superficie adaxial y/o superficie abaxial. También se describen en el presente documento plantas y/o partes de la planta que son al menos parcialmente recubiertas con cualquiera de un caldo de fermentación bifásico, un producto de caldo de fermentación, producto de fermentación, o composiciones que comprenden una sustancia sólida con Methylobacterium adherido a ella. En el presente documento también se proporcionan productos de la planta procesados que comprenden una sustancia sólida con Methylobacterium adherido a ella. Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento se puede usar para recubrir o recubrir parcialmente una planta, parte de la planta o semilla de la planta. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de la planta, o una semilla, incluye, pero no se limita a, recubrimiento de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente 99,5 % del área superficial de la planta, parte de la planta o semilla de la planta.

En ciertos aspectos, las semillas de tomate se tratan exponiendo las semillas a los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones que comprenden Methylobacteríum. Las semillas se pueden tratar con los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación y composiciones descritas en el presente documento por métodos que incluyen, pero no se limitan a, imbibición, recubrimiento, pulverización y similares. En ciertos aspectos, las semillas esterilizadas en la superficie se tratan con una composición que comprende Methylobacteríum. En ciertos aspectos, las semillas no esterilizadas (es decir, semillas que no se han sometido a esterilización superficial) se tratan con una composición que comprende Methylobacteríum que está agotado en sustancias que promueven el crecimiento de microorganismos residentes en la semilla. El tratamiento de semillas se puede efectuar con o tratadores de semillas continuos y/o discontinuos. En ciertos aspectos, se pueden preparar semillas recubiertas suspendiendo las semillas con una composición de recubrimiento que contiene un caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composiciones que comprenden la sustancia sólida con Methylobacteríum y secando al aire el producto resultante. El secado al aire se puede llevar a cabo a cualquier temperatura que no sea perjudicial para la semilla o la Methylobacteríum, pero normalmente no será superior a 30 grados centígrados. La proporción de recubrimiento que comprende una sustancia sólida y Methylobacteríum incluye, pero no se limita a, un intervalo de 0,1 a 25 % en peso de la semilla, 0,5 a 5 % en peso de la semilla y 0,5 a 2,5 % en peso de la semilla. El recubrimiento parcial de una semilla puede incluir, pero no se limita a, recubrimiento de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente 99,5 % del área superficial de la semilla. En ciertos aspectos, una sustancia sólida usada en el recubrimiento o tratamiento de semillas tendrá Methylobacteríum adherido sobre ella. En ciertos aspectos, una sustancia sólida usada en el recubrimiento o tratamiento de semillas se asociará a Methylobacteríum y será un caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición obtenida por los métodos descritos en el presente documento. Se pueden adaptar diversas composiciones y métodos de tratamiento de semillas para el tratamiento de semillas descrito en las patentes de EE. UU. N° 5.106.648, 5.512.069 y 8.181.388 para su uso con un agente activo que comprende los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación o composiciones proporcionadas en el presente documento. En ciertos aspectos, la composición usada para tratar la semilla puede contener excipientes agrícolamente aceptables que incluyen, pero no se limitan a, harinas de madera, arcillas, carbono activo, tierra de diatomeas, sólidos inorgánicos de grano fino, carbonato cálcico y similares. Las arcillas y sólidos inorgánicos que se pueden usar con los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación o composiciones descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, bentonita de calcio, caolín, arcilla de China, talco, perlita, mica, vermiculita, sílices, polvo de cuarzo, montmorillonita y mezclas de los mismos. Los adyuvantes agrícolamente aceptables que promueven la adherencia a la semilla que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, poli(acetatos de vinilo), copolímeros de poli(acetato de vinilo), poli(acetatos de vinilo) hidrolizados, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinilo, poli(alcoholes vinílicos), copolímeros de poli(alcohol vinílico), polivinil metil éter, copolímero de polivinil metil éter-anhídrido maleico, ceras, polímeros de látex, celulosas que incluyen etilcelulosas y metilcelulosas, hidroximetilcelulosas, hidroxipropilcelulosa, hidroximetilpropilcelulosas, polivinilpirrolidonas, alginatos, dextrinas, malto-dextrinas, polisacáridos, grasas, aceites, proteínas, goma karaya, goma Jaguar, goma tragacanto, gomas de polisacárido, mucílago, gomas arábigas, Shellacs, polímeros y copolímeros de cloruro de vinilideno, polímeros y copolímeros de proteína basada en soja, lignosulfonatos, copolímeros acrílicos, almidones, poli(acrilato de vinilo), zeínas, gelatina, carboximetilcelulosa, quitosano, poli(óxido de etileno), polímeros y copolímeros de acrilamida, poli(acrilato de hidroxietilo), monómeros de metilacrilamida, alginato, etilcelulosa, policloropreno y jarabes o mezclas de los mismos. Otros adyuvantes agrícolamente aceptables útiles que pueden promover el recubrimiento incluyen, pero no se limitan a, polímeros y copolímeros de acetato de vinilo, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinilo y ceras solubles en agua. Se pueden adaptar diversos tensioactivos, dispersantes, agentes antiapelmazamiento, agentes de control de la espuma y colorantes descritos en el presente documento y en la patente de EE. UU. N° 8.181.388 para su uso con un agente activo que comprende los caldos de fermentación, productos del caldo de fermentación o composiciones descritas en el presente documento.

En ciertos aspectos, los PPFM que se usan para aumentar la producción de tomate también se podrían aplicar en una disolución hidropónica como una adición al conjunto hidropónico. Dichas disoluciones hidropónicas son disoluciones que comprenden al menos minerales necesarios para el crecimiento de las plantas de tomate. Las disoluciones hidropónicas adecuadas para el crecimiento de plantas de tomate y plantas de semillero incluyen, pero no se limitan, a aquellas descritas en las patentes de EE. UU. N° 8.091.275 y U.S. 7.818.916.

En el presente documento se proporcionan métodos que comprenden la aplicación de composiciones que comprenden las cepas de Methylobacteríum NLS0017, NLS0037 o NLS0066 que proporcionan el aumento de la producción de fruto de tomate, esquejes o de rizomas, y el aumento del crecimiento de plantas de semillero de tomate con respecto a las plantas no tratadas que no se han expuesto a las composiciones. En ciertos aspectos, las partes de la planta, que incluyen, pero no se limitan a, una semilla, una hoja, un fruto, un tallo, una raíz, un tubérculo o un coleóptilo, se pueden tratar con las composiciones para aumentar la producción de tomate. Tratamientos o aplicaciones pueden incluir, pero no se limitan a, pulverización, recubrimiento, recubrimiento parcial, inmersión y/o empapar la planta o partes de la planta con las composiciones proporcionadas en el presente documento. En ciertos aspectos, una semilla, una hoja, un fruto, un tallo, una raíz, un tubérculo o un coleóptilo se puede sumergir y/o empapar con un líquido, semilíquido, emulsión o suspensión de la composición. Dicha inmersión o empapamiento de semillas puede ser suficiente para proporcionar la producción de tomate mejorada en una planta tratada o parte de la planta en comparación con una planta no tratada o parte de la planta. La producción de tomate mejorada incluye, pero no se limita a, aumento del crecimiento de plantas de semillero, crecimiento de raíces, aumento del crecimiento de hojas, aumento de la producción de semillas, esquejes o de rizomas, y/o aumento de la biomasa total en comparación con plantas de control no tratadas. En ciertos aspectos, las semillas de la planta se pueden sumergir y/o empapar durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. Dicha inmersión y/o empapamiento se pueden realizar, en ciertos aspectos, a temperaturas que no son perjudiciales para la semilla de la planta o la Methylobacterium. En ciertos aspectos, las semillas se pueden tratar a aproximadamente 15 a aproximadamente 30 grados centígrados o a aproximadamente 20 a aproximadamente 25 grados centígrados. En ciertos aspectos, el empapamiento y/o la inmersión de las semillas se pueden realizar con agitación suave.

Por tanto, se espera que las composiciones descritas en el presente documento que comprenden Methylobacterium sean útiles en mejorar la producción de tomate. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición proporcionada en el presente documento que es suficiente para proporcionar la producción de tomate mejorada puede ser una composición con Methylobacterium a un título de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición descrita en el presente documento que es suficiente para proporcionar la mejora de la producción de tomate puede ser una composición con Methylobacterium a un título de aproximadamente al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro de un líquido o una emulsión. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición descrita en el presente documento que es suficiente para proporcionar la mejora de la producción de tomate puede ser un producto de caldo de fermentación con un título de Methylobacterium de una fase sólida de ese producto que es al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo de la fase sólida. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición descrita en el presente documento que es suficiente para proporcionar la mejora de la producción de tomate puede ser una composición con un título de Methylobacterium de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo de partículas en la composición que contiene las partículas que comprenden una sustancia sólida en donde un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium está adherido a ella. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición que es suficiente para proporcionar la mejora de la producción de tomate puede ser una composición con un título de Methylobacterium de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mL, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mL, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mL, o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mL a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por mL en una composición que comprende una emulsión en donde un mono-cultivo o co-cultivo de una Methylobacterium adherida a una sustancia sólida se proporciona en su interior o se cultiva en su interior. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición que es suficiente para proporcionar la mejora de la producción de tomate puede ser una composición con un título de Methylobacterium de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mL, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mL, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mL, o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mL a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por mL en una composición que comprende una emulsión en donde un mono-cultivo o co-cultivo de una Methylobacterium se proporciona en su interior o se cultiva en su interior.

En ciertos aspectos, una cantidad de una composición que es suficiente para proporcionar la producción de tomate mejorada puede ser una composición con una Methylobacterium sp. a un título de al menos aproximadamente 1x104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1x105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1x106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5x106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1x107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5x108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1x109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1x1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 3x1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición que es suficiente para proporcionar la producción de tomate mejorada puede ser una composición con Methylobacterium sp. a un título de al menos aproximadamente 1x104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1x105 unidades formadoras de colonias por mililitro, aproximadamente al menos aproximadamente 1x106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5x106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1x107 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 5x108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6x1010 unidades formadoras de colonias por mililitro de un líquido o una emulsión. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición que es suficiente para proporcionar la producción de tomate mejorada puede ser un producto de caldo de fermentación con un título de Methylobacterium sp. de una fase sólida de ese producto que es al menos aproximadamente 1x104 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1x105 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1x106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5x106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1x107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5x108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1x109 unidades formadoras de colonias por gramo, o al menos aproximadamente 5x109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6x1010 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo, al menos aproximadamente 1x1011 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo, al menos aproximadamente 1x1012 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo, al menos aproximadamente 1x1013 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo, o al menos aproximadamente 5x1013 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo de la fase sólida. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición que es suficiente para proporcionar la producción de tomate mejorada puede ser una composición con un título de Methylobacterium de al menos aproximadamente 1x106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5x106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1x107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5x108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1x109 unidades formadoras de colonias por gramo, o al menos aproximadamente 5x109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6x1010 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo, al menos aproximadamente 1x1011 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo, al menos aproximadamente 1x1012 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo, al menos aproximadamente 1x1013 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo, o al menos aproximadamente 5x1013 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por gramo de partículas en la composición que contiene las partículas que comprenden una sustancia sólida en donde un mono-cultivo o co-cultivo de Methylobacterium sp. está adherido a ella. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición que es suficiente para proporcionar la producción de tomate mejorada puede ser una composición con un título de Methylobacterium de al menos aproximadamente 1x106 unidades formadoras de colonias por mL, al menos aproximadamente 5x106 unidades formadoras de colonias por mL, al menos aproximadamente 1x107 unidades formadoras de colonias por mL, o al menos aproximadamente 5x108 unidades formadoras de colonias por mL a al menos aproximadamente 6x1010 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por mL en una composición que comprende una emulsión en donde un mono-cultivo o co-cultivo de una Methylobacterium sp. adherida a una sustancia sólida se proporciona en su interior o se cultiva en su interior. En ciertos aspectos, una cantidad de una composición que es suficiente para proporcionar la producción de tomate mejorada puede ser una composición con un título de Methylobacterium de al menos aproximadamente 1x106 unidades formadoras de colonias por mL, al menos aproximadamente 5x106 unidades formadoras de colonias por mL, al menos aproximadamente 1x107 unidades formadoras de colonias por mL, o al menos aproximadamente 5x108 unidades formadoras de colonias por mL a al menos aproximadamente 6x1010 unidades formadoras de colonias de Methylobacterium por mL en una composición que comprende una emulsión en donde un mono-cultivo o co-cultivo de una Methylobacterium sp. se proporciona en su interior o se cultiva en su interior.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos están incluidos para demostrar aspectos preferidos de la divulgación. Se apreciará por los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por los solicitantes que funcionan bien en la práctica de la invención, y así se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.

Ejemplo 1. Cultivo de cepas de PPFM en un medio de crecimiento líquido complementado con una sustancia sólida

El medio de crecimiento líquido usado para cultivar los cultivos de PPFM fue un medio de sales básicas complementado con glicerol, peptona y tierra de diatomeas. El medio de sales básicas usado fue medio de sales minerales de amonio (AMS). El medio AMS contiene, por litro, 700 miligramos de fosfato de potasio dibásico anhidro, 540 miligramos de fosfato de potasio monobásico anhidro, un gramo de sulfato de magnesio heptahidratado, 500 miligramos de cloruro de amonio anhidro y 200 miligramos de cloruro de calcio dihidratado.

Se preparó medio de base de AMS a partir de tres disoluciones madre, enumeradas a continuación:

Disolución madre I: para un litro a 50X concentración

fosfato de potasio dibásico, anhidro 35 gramos

fosfato de potasio monobásico, anhidro 27 gramos

Disolución madre II: para un litro a 50X concentración

sulfato de magnesio heptahidratado 50 gramos

cloruro de amonio, anhidro 25 gramos

Disolución madre III: para un litro a 50X concentración

cloruro de calcio dihidratado 10 gramos

Las disoluciones madre I, II y III se esterilizaron en autoclave por separado.

Para preparar un litro de medio AMS líquido con glicerol, peptona y tierra de diatomeas, se añadieron los siguientes a 920 mL de agua destilada:

20 mL de disolución madre I

20 mL de disolución madre II

20 mL de disolución madre III

20 mL de una disolución madre al 50 % de glicerol

10 gramos de peptona

2 gramos de tierra de diatomeas

La disolución resultante con tierra de diatomeas suspensa se esterilizó en autoclave.

Se dispusieron dos litros del medio de AMS anterior dentro de un matraz de cuatro litros. Se añadieron dos mililitros de PPFM de cultivo líquido al medio para la inoculación. El matraz se dispuso entonces en un agitador incubador a 240 rpm y 30 grados Celsius. Los cultivos se cultivaron durante seis días y luego se guardaron a 4 grados Celsius para uso futuro.

Ejemplo 2. Inoculación de semilla de tomates

Se trataron semillas de tomate Sweet Olive™ comerciales con la cepa NLS0037 de PPFM, y a continuación se cultivaron durante un periodo de tiempo de aproximadamente 12-14 días. El título de la cepa NLS0037 fue 2,0 x 107 UFC/mL. Se cultivaron inicialmente dos litros del cultivo en medio AMS-GP líquido más tierra de diatomeas a 2 gramos/litro (véase el Ejemplo 1). Se centrifugaron 100 mL de los medios de cultivo en una centrífuga para formar un sedimento. A continuación, el sobrenadante se drenó y se añadió agua de grifo a temperatura ambiente para llevar la disolución de nuevo a su volumen inicial de 100 mL. Las semillas se sembraron en hojas Horticube de 100 células (un medio de crecimiento artificial) y se trataron con 1 mL de disolución aplicada directamente a la semilla por pipeta en el momento de la siembra. Los medios de crecimiento y las prácticas de riego simulan un tratamiento hidropónico. Cada unidad experimental (control y tratada) contuvo 100 plantas de semillero de tomate. Se midió el peso húmedo de cada planta de semillero, informándose las medias en la Tabla 2.

Tabla 2. Pesos en húmedo de las plantas de semillero de tomate de control y tratadas con PPFM

Ejemplo 3. Identificación de polimorfismos de ácido nucleico presentes en Methylobacterium que mejoran la producción de tomate

Se generan bibliotecas de secuenciación del genoma completo para la plataforma de secuenciación de ultra-lectura Illumina™ para las cepas aisladas de Methylobacterium sp. proporcionadas en la Tabla 1 usando los kits de preparación de muestra de ADN Illumina TRUSEQ™ o NEXTERA™ (descritos en los sitios de internet res.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_truseq_dna_sample_prep_kits.pdf y res.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_nextera_dna_sample_prep.pdf) usando los métodos descritos por el fabricante. Las bibliotecas resultantes se someten entonces a pirosecuenciación (Siqueira JF et al. J Oral Microbiol. 2012; 4: 10.3402/jom.v4i0.10743).

Los datos sin procesar de la secuencia genómica generados por pirosecuenciación se someten a recorte basado en adaptador y en calidad para el control de calidad. El ensamblaje de secuencias aleatorias del genoma completo (1) se logra ensamblando datos basados en la calidad usando el ensamblador de novo Velvet (2). Para el hallazgo y la anotación génica, se hace uso de los datos de aprendizaje de referencia de TIGRFAM (9), Pfam, COG (10) y UniRef100 (11). Los ARNr se identifican con RNAmmer (5), los genes codificantes de proteína se identifican con Glimmer (3) o Maker (6), y los ARNt se identifican con tRNAscan-SE (4). Las funciones génicas se asignan con blastx (7), blastp (7), HMMER (8) e InterProScan contra bases de datos de proteínas completas descritas anteriormente (datos de referencia).

La detección de polimorfismos (SNP u otras variaciones de ADN que se producen como resultado de inserciones, deleciones y sustituciones (Indel)) en las cepas aisladas de Methylobacterium sp. de la Tabla 1 se realiza con BWA (12) y el paquete Samtools (en internet en samtools.sourceforge.net/), la variación estructural se identifica con BreakDancer (en internet en breakdancer.sourceforge.net/) y CoGE (en internet en genomevolution.org/CoGe/). Los polimorfismos diagnósticos para Methylobacterium que secretan agentes antifúngicos se identifican por comparaciones de las secuencias de la cepa aislada NLS0037 de Methylobacterium a modo de ejemplo que mejoran el crecimiento de plantas de semillero de tomate, pero que están ausentes de una o más cepas aisladas de Methylobacterium que no mejoran el tomate. Los polimorfismos presentes en la cepa NLS0037 de Methylobacterium a modo de ejemplo que mejoran la producción de tomate, pero que están ausentes en cepas aisladas de Methylobacterium a modo de ejemplo que no mejoran la producción de tomate, se usan entonces para identificar otras cepas aisladas de Methylobacterium que mejoran la producción de tomate.

Referencias para el Ejemplo 4

1. Miller JR, Koren S, Sutton G (2010) Assembly algorithms for next-generation sequencing data. Genomics 95: 315-327.

2. Zerbino DR, Birney E (2008) Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Res 18: 821-829.

3. Delcher AL, Bratke KA, Powers EC, Salzberg SL (2007) Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with Glimmer. Bioinformatics 23: 673-679.

4. Lowe TM, Eddy SR (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res 25: 955-964.

5. Lagesen K, Hallin P, Rodland EA, Staerfeldt HH, Rognes T, et al. (2007) RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res 35: 3100-3108.

6. Cantarel B, Korf I, Robb S, et al. (2008) MAKER: An easy-to-use annotation pipeline designed for emerging model organism genomes. Genome Research 18: 188-196.

7. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, et al. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25: 3389-3402.

8. Eddy SR (2009) A new generation of homology search tools based on probabilistic inference. Genome Inform 23: 205-211.

9. Haft DH, Selengut JD, White O (2003) The TIGRFAMs database of protein families. Nucleic Acids Res 31: 371-373.

10. Tatusov RL, Fedorova ND, Jackson JD, Jacobs AR, Kiryutin B, et al. (2003) The COG database: an updated version includes eukaryotes. BMC Bioinformatics 4: 41.

11. Suzek BE, Huang H, McGarvey P, Mazumder R, Wu CH (2007) UniRef: comprehensive and non-redundant UniProt reference clusters. Bioinformatics 23: 1282-1288.

12. Li H. and Durbin R. (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25:1754-60.

Ejemplo 5. Prueba de cepas aisladas de Methylobacterium adicionales para la estimulación del crecimiento de plantas de semillero de tomate

Se probaron las cepas aisladas NLS0017, NLS0037, NLS0038 y NLS0066 de Methylobacterium para la estimulación del crecimiento de plantas de semillero de tomate esencialmente como se describe en el Ejemplo 2, con las excepciones de que se determinó el peso en seco en vez de húmedo de las plantas de semillero y que la cantidad aplicada a cada semilla fue 0,25 mL en vez de 1 mL. Los resultados de dichos análisis se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Aumento en porcentaje en el peso en seco de plantas de semillero con respecto al control para los tratamientos con NLS0017, NLS0037, NLS0038 y NLS0066

Las cepas NLS0017 y NLS0066 se identificaron como cepas aisladas capaces de proporcionar crecimiento de las plantas de semillero de tomate mejoradas mientras que NLS0038 se identificó como una cepa aislada que no mejoró el crecimiento de plantas de semillero de tomate en estos experimentos.

Ejemplo 6. Identificación de genes ortólogos presentes en Methylobacterium sp. que pueden mejorar la producción de tomate

Las cepas de PPFM enumeradas en la Tabla 1 se cultivaron sobre medio de agar sólido que comprendía sales minerales de amonio (AMS) más glicerol y peptona a 30 °C durante 5 días, esencialmente como se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. de cesión común N°. Se extrajo ADN genómico usando el kit de aislamiento de ADN microbiano ultra-limpio de MO-BIO (Carlsbad, CA) y se usó 1 pg de ADN de alta calidad para la preparación de bibliotecas Illumina Nextera XT, seguido de secuenciación de 2x100 extremos emparejados de Illumina en un sistema HiSeq2000. Los datos sin procesar de la secuencia genómica de Illumina se sometieron a recorte basado en adaptador y en calidad para el control de calidad. Se logró el ensamblaje de secuencias aleatorias del genoma completo ensamblando datos basados en calidad usando el ensamblador de novo SPADES (33). Para el hallazgo y la anotación génica, se hace uso de los datos de aprendizaje de referencia de TIGRFAM (9), Pfam, COG (10) y UniRef100 (11). Los ARNr se identificaron con RNAmmer (5), los genes codificantes de proteína se identificaron con Glimmer (3) y Maker (6) y los ARNt se identificaron con tRNAscan-SE (4). Las funciones génicas se asignaron con blastx (7), blastp (7), HMMER (8) e InterProScan contra bases de datos de proteínas completas descritas anteriormente (datos de referencia). La detección de polimorfismos (SNP u otras variaciones de ADN que se producen como resultado de inserciones, deleciones y sustituciones (Indel)) en las cepas aisladas de Methylobacterium sp. se realizó con BWA (12) y el paquete Samtools (en internet en samtools.sourceforge.net/) y el Genome Analysis Toolkit (GATK, en el sitio de internet en la malla mundial "broadinstitute.org/gatk/"), la variación estructural se identificó con BreakDancer (en internet en breakdancer.sourceforge.net/) y CoGE (en internet en genomevolution.org/CoGe/).

Los genes que codificaron marcos de lectura abiertos se predijeron a partir de las secuencias genómicas completas ensambladas de NLS0017, NLS0038 y NLS066 esencialmente como se ha descrito anteriormente. Se agruparon dentro de y entre genes ortólogos del genoma usando OrthoMCL (disponible en el sitio de internet en la malla mundial "orthomcl.org/orthomcl/"). Las supuestas anotaciones funcionales se asignaron a productos génicos usando BLASTP (disponible en el sitio de internet "blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi") contra la base de datos UniProt (disponible en el sitio de internet de la malla mundial "uniprot.org/"). Los genes presentes en genomas individuales de NLS0017 y NLS0066 que podrían mejorar la producción de tomate (como se muestra en el Ejemplo 5), pero ausentes en el genoma de NLS0038 que no mejoraron la producción de tomate (como se muestra en el Ejemplo 5), se identificaron en agrupaciones de OrthoMCL usando software a medida. Las proteínas codificadas encontradas en NLS0017 y NLS0066 de Methylobacterium que podrían mejorar la producción de tomate se proporcionan en el listado de secuenciación como SEQ ID NO: 1-4594. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de SEQ ID NO: 1-4594 son SEQ ID NO: 4595-9188, respectivamente. Las proteínas codificadas por genes presentes en NLS0017, pero ausentes de NLS0038, se proporcionan como SEQ ID NO: 1-2684. Las proteínas codificadas por genes presentes en NLS0066, pero ausentes de NLS0038, se proporcionan como SEQ ID NO: 2685­ 4594. Los grupos de genes ortólogos que representan genes que codifican proteínas encontradas en los genomas de al menos dos genomas individuales de NLS0017 y NLS0066 que podrían mejorar la producción de tomate (como se muestra en el Ejemplo 5), pero que están ausentes en el genoma de NLS0038 que no mejoraron la producción de tomate, se proporcionan en la Tabla 4. En la Tabla 4 se proporcionan grupos de genes ortólogos en cada fila, donde la secuencia más larga y el Número de Seq ID único asociado se designan como una secuencia de referencia para representar la agrupación de ortólogos (Columna 3 de la Tabla 4). El número de identificación del grupo de ortólogos se proporciona en la columna 1 de la Tabla 4, la identidad génica más próxima basándose en comparaciones de bases de datos se proporciona en la columna 2 de la Tabla 4, y la secuencia de referencia para cada agrupación de ortólogos se proporciona en la columna 3 de la Tabla 4. Ejemplos de secuencias de ortólogos encontradas en NLS0017 y NLS0066 se proporcionan como SEQ ID NO en la Tabla 4, columnas 4 y 5, respectivamente.

Tabla 4. Genes ortólogos encontrados en NLS0017 y NLS0066 que están ausentes en NLS0038

Referencias para el Ejemplo 6

1. Miller JR, Koren S, Sutton G (2010) Assembly algorithms for next-generation sequencing data. Genomics 95: 315-327.

2. Zerbino DR, Birney E (2008) Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Res 18: 821-829.

3. Delcher AL, Bratke KA, Powers EC, Salzberg SL (2007) Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with Glimmer. Bioinformatics 23: 673-679.

4. Lowe TM, Eddy SR (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res 25: 955-964.

5. Lagesen K, Hallin P, Rodland EA, Staerfeldt HH, Rognes T, et al. (2007) RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res 35: 3100-3108.

6. Cantarel B, Korf I, Robb S, et al. (2008) MAKER: An easy-to-use annotation pipeline designed for emerging model organism genomes. Genome Research 18: 188-196.

7. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, et al. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25: 3389-3402.

8. Eddy SR (2009) A new generation of homology search tools based on probabilistic inference. Genome Inform 23: 205-211.

9. Haft DH, Selengut JD, White O (2003) The TIGRFAMs database of protein families. Nucleic Acids Res 31: 371-373.

10. Tatusov RL, Fedorova ND, Jackson JD, Jacobs AR, Kiryutin B, et al. (2003) The COG database: an updated version includes eukaryotes. BMC Bioinformatics 4: 41.

11. Suzek BE, Huang H, McGarvey P, Mazumder R, Wu CH (2007) UniRef: comprehensive and non-redundant UniProt reference clusters. Bioinformatics 23: 1282-1288.

12. Li H. and Durbin R. (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25:1754-60

Otras referencias

1. Abanda-Nkpwatt, D., M. Musch, J. Tschiersch, M. Boettner, and W. Schwab. 2006. Molecular interaction between Methylobacterium extorquens and seedlings: growth promotion, methanol consumption, and localization of the methanol emission site. J. Exp. Bot. 57: 4025-4032.

2. Broekaert WF, Terras FR, Cammue BP, Vanderleyden J (1990) An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiology Letters 69: 55-60.

3. Cao, Y-R, Wang, Q., Jin, R-X., Tang, S-K., He, W-X., Lai, H-X, Xu, L-H., and C-L Jiang. 2011. Methylobacterium soli sp. nov. a methanol-utilizing bacterium isolated from the forest soil. Antonie van Leeuwenhoek (2011) 99:629-634.

4. Corpe, W.A., and D.V. Basile. 1982. Methanol-utilizing bacteria associated with green plants. Devel. Industr. Microbiol. 23: 483-493.

5. Corpe, W.A., and S. Rheem. 1989. Ecology of the methylotrophic bacteria on living leaf surfaces. FEMS Microbiol. Ecol. 62: 243-250.

17

6. Green, P.N. 2005. Methylobacterium. In Brenner, D.J., N.R. Krieg, and J.T. Staley (eds.). "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume two, The Proteobacteria. Part C, The alpha-, beta-, delta-, and epsilonproteobacteria." Second edition. Springer, New York. Pages 567-571.

7. Green, P.N. 2006. Methylobacterium. In Dworkin, M., S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt (eds.). "The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria. Volume 5. Proteobacteria: Alpha and Beta Subclasses." Third edition. Springer, New York. Pages 257-265.

8. Holland, M.A. 1997. Methylobacterium and plants. Recent. Res. Devel. in Plant Physiol. 1: 207-213.

9. Holland, M.A., and J.C. Polacco. 1994. PPFMs and other covert contaminants: Is there more to plant physiology than just plant? Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45: 197-209.

10. Kutschera, U. 2007. Plant-associated methylobacteria as co-evolved phytosymbionts. A hypothesis. Plant Signal Behav. 2: 74-78.

11. Lidstrom, M.E. 2006. Aerobic methylotrophic prokaryotes. In Dworkin, M., S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt (eds.). "The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria. Volume 2. Ecophysiology and biochemistry." Third edition. Springer, New York. Pages 618-634.

12. Madhaiyan, M., S. Poonguzhali, H.S. Lee, K. Hari, S.P. Sundaram, and T.M. Sa. 2005. Pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria accelerate germination, growth and yield of sugarcane clone Co86032 (Saccharum officinarum L.) Biol. Fertil. Soils 41: 350-358.

13. Madhaiyan, M., S. Poonguzhali, M. Senthilkumar, S. Seshadri, H. Chung, J. Yang, S. Sundaram, and T. Sa.

2004. Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar C0-47 (Oryza sativa L.) by Methylobacterium spp. Bot. Bull. Acad. Sin.45: 315-324.

14. Madhaiyan, M., S. Poonguzhali, and T. Sa. 2007. Influence of plant species and environmental conditions on epiphytic and endophytic pink-pigmented facultative methylotrophic bacterial populations associated with field-grown rice cultivars. J Microbiol Biotechnol. 2007 Oct;17(10):1645-54.

15. Stanier, R.Y., N.J. Palleroni, and M. Doudoroff. 1966. The aerobio pseudomonads: A taxonomic study. J. Gen. Miorobiol. 43: 159-271.

16. Sy, A., Giraud, E., Jourand, P., Garoia, N., Willems, A., De Lajudie, P., Prin, Y., Neyra, M., Gillis, M., Boivin-Masson,C., and Dreyfus, B. 2001. Methylotrophic Methylobaoterium Bacteria Nodulate and Fix Nitrogen in Symbiosis with Legumes. Jour. Baoteriol. 183(1 ):214-220,

17. Sy, A., A.C.J. Timmers, C. Knief, and J.A. Vorholt. 2005. Methylotrophio metabolism is advantageous for Methylobaoterium extorquens during oolonization of Medioago trunoatula under oompetitive oonditions. Appl. Environ. Miorobiol. 71: 7245-7252.

18. Vogel, H.J., and D.M. Bonner. 1956. Aoetylomithinase of Esoheriohia ooli: Partial purifioation and some properties. J. Biol. Chem. 218: 97-106.

19. Vogel, H. J. 1956. A oonvenient growth medium for Neurospora (Medium N). Miorobial Genet Bull 13: 42-43 20. Whittenbury, R., S.L. Davies, and J.F. Wilkinson. 1970. Enriohment, isolation and some properties of methane-utilizing baoteria. J. Gen. Miorobiol. 61: 205-218.

21. Vuilleumier S, Chistoserdova L, Lee MC, Bringel F, Lajus A, Zhou Y, Gourion B, Barbe V, Chang J, Cruveiller S, Dossat C, Gillett W, Gruffaz C, Haugen E, Houroade E, Levy R, Mangenot S, Muller E, Nadalig T, Pagni M, Penny C, Peyraud R, Robinson DG, Roohe D, Rouy Z, Saenampeohek C, Salvignol G, Vallenet D, Wu Z, Marx CJ, Vorholt Ja , Olson MV, Kaul R, Weissenbaoh J, Médigue C, Lidstrom ME. Methylobaoterium genome sequenoes: a referenoe blueprint to investigate miorobial metabolism of C1 oompounds from natural and industrial souroes. PLoS One. 2009;4(5):e5584. doi: 10.1371/journal.pone.0005584. Epub 2009 May 18. PubMed PMID: 19440302; PubMed Central PMCID: PMC2680597.

22. Marx CJ, Bringel F, Chistoserdova L, Moulin L, Farhan Ul Haque M, Fleisohman DE, Gruffaz C, Jourand P, Knief C, Lee MC, Muller EE, Nadalig T, Peyraud R, Roselli S, Russ L, Goodwin LA, Ivanova N, Kyrpides N, Lajus A, Land ML, Médigue C, Mikhailova N, Nolan M, Woyke T, Stolyar S, Vorholt JA, Vuilleumier S. Complete genome sequenoes of six strains of the genus Methylobaoterium. J Baoteriol. 2012 Sep;194(17):4746-8. doi: 10.1128/JB.01009-12. PubMed PMID: 22887658; PubMed Central PMCID: PMC3415506.

23. Knief C, Franoes L, Vorholt JA. Competitiveness of diverse Methylobaoterium strains in the phyllosphere of Arabidopsis thaliana and identifioation of representative models, inoluding M. extorquens PA1. Miorob Eool.

2010 Aug;60(2):440-52. doi: 10.1007/s00248-010-9725-3. Epub 2010 Aug 11. PubMed PMID: 20700590.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un método de aumento de la velocidad de crecimiento de la raíz del tomate, crecimiento de hojas, crecimiento de plantas de semillero o disminución del tiempo de ciclo desde la siembra de la semilla de tomate hasta la producción del fruto de tomate cuando se compara con una planta de tomate de control no tratada o planta de tomate de control cultivada a partir de una semilla no tratada, que comprende aplicar una composición que comprende Methylobacterium a una planta de tomate, una parte de la misma o a una semilla de tomate, en donde dicha composición comprende una cepa de Methylobacterium seleccionada del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0037 (NRRL B-50941) y NLS0066 (NRRL B-50940).

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición está agotada de sustancias que promueven el crecimiento de microorganismos residentes en dicha planta o semilla.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición recubre o recubre parcialmente dicha planta o una parte de la misma, o dicha semilla.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición se aplica en una disolución hidropónica.

5. Una parte de la planta de tomate o semilla de tomate que se recubre o recubre parcialmente con una composición que comprende una Methylobacterium seleccionada del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0037 (NRRL B-50941) y NLS0066 (NRRL B-50940), o que se sumerge o sumerge parcialmente en la composición.