CN105087611A - 源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用。所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因(<i>aroA</i><i>-Tm</i>)的核苷酸序列如SEQIDNO1，全长1266bp，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO2。所述<i>aroA</i><i>-Tm</i>基因是利用基因合成方法制备而成，经酶动力学特性分析和功能试验验证，本发明合成的该5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因具有较高的草甘膦耐受性，可用于转基因作物的培育中。

Description

源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用。

背景技术

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种之一。但是该除草剂同样是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。为了在农业生产中使用草甘膦，必须培育出具有草甘膦抗性或者降解性的农作物。

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate）毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性。该合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）生物合成过程中的一个关键酶，该酶由aroA基因编码。

目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断扩大，占全球种植转基因作物的78%以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和南非等七国的主要商品化转基因农作物。耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的62%。然而现在应用于生产的抗草甘膦基因仅有两个，且都受到专利的保护，因此发掘新型的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因对于培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因作物将是非常有必要的。

最近，来自于极端微生物体内的好多酶都已成为研究的热点，主要是因为微生物生长在极端环境中从而使这些酶可能具有潜在的特殊的生物功能。极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotogamartima)是一种革兰氏阴性菌，该菌最适生长温度80^oC，在pH=5.5-9.0和NaCl浓度0.25%-3.75%之间生长，严格厌氧。在过去的几年时间里，很多来自该极端嗜热菌的酶被分离出来并进行研究了。然而来自该菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶还从未研究过，也未见对该酶功能的研究报告。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用，利用基因合成法制备海栖热袍菌aroA-Tm基因，并对该基因进行酶动力学特性分析和功能试验验证，以证明其具有较高的草甘膦耐受性。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA-Tm，其核苷酸序列如SEQIDNo1，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO2。

所述来源于海栖热袍菌的aroA-Tm基因，含1266个碱基，编码的氨基酸421个。

所述来源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因应用于草甘膦耐受性中。

所述的来源于海栖热袍菌的aroA-Tm基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，它是根据植物密码偏爱通过化学合成方法得到的。即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成（PTDS）（NucleicAcidsResearch，2004，32：e98）。

具体合成方法包括以下步骤：

引物设计：设计长度大概为60bp左右的覆盖整个5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的寡核苷酸的序列33个，其中每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。

PCR扩增：利用PCR进行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶扩增。其中，在100μl反应体系中，P2~P32共31个引物的添加量为2ng，两个外侧引物P1和P33的添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min，94℃30s，50℃30s，72℃10min，使用的TaqDNA聚合酶为KODFXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。

转化：PCR结束后，用1%琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，在DH5α感受态中高效转化，获得长度为1266bp的SEQIDNo1序列的阳性克隆，即为本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，经序列测定，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。

将上述获得的阳性克隆利用BamHI和SacI进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将该基因与原核表达载体pYM4087（CurrMicrobiol，2011，62：833-839）相连，4℃连接2小时。然后将该载体转化感受态大肠杆菌TOP10（Invitrogen）。将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基（15g/L琼脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，磷酸缓冲液pH=7.0）37℃过夜培养。次日，挑取单菌落，接种于50ml液体LB培养基（10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，磷酸缓冲液pH=7.0）中，37℃摇床直到菌液的浓度达到OD₆₀₀为1.0时停止培养。培养液在5,000g重力加速度下离心5min，无菌水清洗1次。所得的细胞沉淀用1mL磷酸裂解缓冲液重悬，然后将其转移到微量离心管中。使用超声波仪裂解菌液30min，以12,000g离心30min。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrapHP（AmershamBiosciences公司）对其进行蛋白表达纯化。然后对其进行酶动力学特性分析。

本发明的来源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还与PEP保持较强的亲和性，这些特征将为用于转基因作物的培育提供可能。

附图说明

图1为本发明的来源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量MARKER，2代表在大肠杆菌BL21（DE3）过量表达的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白，3为用HisTrapHP试剂盒纯化的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白。

图2为本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的草甘膦耐受性实验结果，其中：

a代表在草甘膦浓度为0mM时大肠杆菌(Escherichiacoli)ER2799(携带p251-AroA-T.martima质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；

b代表在草甘膦浓度为150mM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-T.martima质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；

c代表在草甘膦浓度为300mM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-T.martima质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；

d代表在草甘膦浓度为400mM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-T.martima质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；

e代表在草甘膦浓度为450mM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-T.martima质粒)、ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况。

具体实施方式

以下结合具体实施方式详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书【J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社】。

实施例1基因合成法合成来源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因

根据来源于海栖热袍菌的aroA序列（NCBIReferenceSequence:NC_000853.1）采取连续延伸PCR（NucleicAcidsResearch,2004,32,e98）按照植物密码子偏爱合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，设计33对引物用于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的人工合成。所设计的引物如下：

aroA-Tm-1:

GGATCCATGAAGGTTCTTCCTGCTAAGAAGGTTGAAGGTGTTCTTTCTGTTCCACCTGAC

aroA-Tm-2:

AGAGCAGACAGGATCAGTGCTCTGTGAGTGATAGACTTGTCAGGTGGAACAGAAAGAACA

aroA-Tm-3:

GAGCACTGATCCTGTCTGCTCTGGCTGAGACCGAGTCCACTCTCTACAACCTGTTGAGAT

aroA-Tm-4:

CTTCTCCAGGATGTCGTGGGTTCTCTCGGTGTCCAGACATCTCAACAGGTTGTAGAGAGT

aroA-Tm-5:

AACCCACGACATCCTGGAGAAGCTGGGTACTAGATTCGAAGGTGACTGGGAGAAGATGAA

aroA-Tm-6:

GTGGTTCGATTGGCTCAGCGAATGGCTTTGGGAAGACCTTCATCTTCTCCCAGTCACCTT

aroA-Tm-7:

TTCGCTGAGCCAATCGAACCACTGTTCTGTGGAAACTCTGGTACTACTACCAGACTGATG

aroA-Tm-8:

AGGACGGTGAACATCTCGTAGGATGCCAGGACACCAGACATCAGTCTGGTAGTAGTACCA

aroA-Tm-9:

CCTACGAGATGTTCACCGTCCTGTACGGTGATCCATCTCTGTCCAGAAGACCAATGAGAA

aroA-Tm-10:

GAATCTTGCACCCATCATCTCCAGTGGTTCGATGACTCTTCTCATTGGTCTTCTGGACAG

aroA-Tm-11:

GGAGATGATGGGTGCAAGATTCATGGCAAGACAGAACAACTACCTTCCAATGGCAATCAA

aroA-Tm-12:

CAGGAGTCTTGTAGGAGATACCAGAGAGGTGGTTTCCCTTGATTGCCATTGGAAGGTAGT

aroA-Tm-13:

GGTATCTCCTACAAGACTCCTGTTGCATCTGCTCAAGTCAAGTCTGCTGTCCTCCTTGCT

aroA-Tm-14:

GGTTCGATGACGATGGTTCTACCAGAAGCTCTCAGACCAGCAAGGAGGACAGCAGACTTG

aroA-Tm-15:

GTAGAACCATCGTCATCGAACCAGCAAAGTCCAGAGACCACACCGAGAGAATGCTGAAGA

aroA-Tm-16:

AACTCTAGTACCCTCAACCTCGACAGGAACACCAAGGTTCTTCAGCATTCTCTCGGTGTG

aroA-Tm-17:

CGAGGTTGAGGGTACTAGAGTTGTTCTGGAGCCTGCTACCTTCAGAGGTTTCACCATGAA

aroA-Tm-18:

CGACGAAGAATGCAGCAGAGGAGATGTCACCAGGGACCTTCATGGTGAAACCTCTGAAGG

aroA-Tm-19:

TCCTCTGCTGCATTCTTCGTCGTCCTTGGTGCTATCCATCCTAACGCTAGAATCACCGTC

aroA-Tm-20:

AGCAGACCAGTTCTGGTAGGGTTCAGACCAACGTCGGTGACGGTGATTCTAGCGTTAGGA

aroA-Tm-21:

ACCCTACCAGAACTGGTCTGCTGGAAGTCATGAAGCTGATGGGTGCTAACCTGGAGTGGG

aroA-Tm-22:

AACAGTACCGATTGGTTCGAGGTTCTCTTCGGTGATCTCCCACTCCAGGTTAGCACCCAT

aroA-Tm-23:

CCTCGAACCAATCGGTACTGTTAGAGTCGAGACCTCTCCAAACCTGAAAGGTGTCGTCGT

aroA-Tm-24:

GCAGTTCGTCGATCATCAGTGGGACCAGGTGTTCAGGAACGACGACACCTTTCAGGTTTG

aroA-Tm-25:

CCACTGATGATCGACGAACTGCCACTGGTCGCACTTCTGGGTGTCTTCGCTGAAGGTGAG

aroA-Tm-26:

TCCTTCTTTCTCAACTCCTCAGCGTTTCTGACGACGGTCTCACCTTCAGCGAAGACACCC

aroA-Tm-27:

CTGAGGAGTTGAGAAAGAAGGAGTCCGACAGAATCAGAGTCCTGGTCGAGAACTTCAAGA

aroA-Tm-28:

GAAACCGTCCTTGAACTCCTCGATCTCAACACCGAGTCTCTTGAAGTTCTCGACCAGGAC

aroA-Tm-29:

CGAGGAGTTCAAGGACGGTTTCAAGATCGTCGGTAAGCAGTCCATCAAGGGTGGTTCTGT

aroA-Tm-30:

AGAACAGCATAGCCATTCTGTGATCACCTTCTGGATCGACAGAACCACCCTTGATGGACT

aroA-Tm-31:

CACAGAATGGCTATGCTGTTCTCCATCGCTGGTCTCGTCTCTGAAGAGGGTGTTGATGTC

aroA-Tm-32:

AAGTTAGGGAAGGAGACAGCAACACACTCGTGGTCCTTGACATCAACACCCTCTTCAGAG

aroA-Tm-33:

GAGCTCTTAGGAGATGACGACTCTCTCCAGCAGTTCGTAGAAGTTAGGGAAGGAGACAGC

利用PCR进行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因扩增，在100μl反应体系中，P2至P32共31个内侧引物的添加量为2ng，外侧引物P1~P33添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，50℃30s，72℃2min，使用的TaqDNA聚合酶为KODFXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。

PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆，经序列测定其核苷酸序列与野生型有80.095%的相似性（参看表1），其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，它包含1266个碱基，其编码氨基酸421个，序列如SEQIDNO2所示。

表1本发明的按照植物密码子合成的源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶与原始基因的序列比对，其中上行序列是本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，下行序列是原始基因。

实施例25-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的大肠杆菌表达

将实施例1合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因用BamHI和SacI酶切后，与载体pET-28a（NEB公司）连接得到重组质粒pET-paroA _T.maritima ，并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）（Novagen公司），将转化子涂布于LB固体培养基中37℃培养16h。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrapHP（AmershamBiosciences公司）对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测，蛋白大小约46.5kDa，与预测值相符（参看图1）。

实施例35-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的酶活测定和动力学参数的测定

1.测定方法

无机磷标准曲线：10mM无机磷按1:10稀释，分别取0、1、2、3……20μl与1.5mlEppendorf离心管中，加入纯水至100μl混匀，加入MAT溶液0.8ml混匀，计时三分钟后加入SC溶液100μl迅速混匀，室温静置20min后测定A₆₆₀值，重复三次。以无机磷浓度为横坐标，A₆₆₀值为纵坐标作图，得到无机磷标准曲线。

1）酶活测定：蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法。在冰上与1.5mlEppendorf离心管中加入以下溶液：10mMPEP溶液2μl，10mMS3P溶液2μl，0.5MHEPES溶液2μl，1mM(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl和双蒸水7μl混匀，与37℃温浴2min后各管样品间隔2s加入5μl纯化蛋白并计时，2min后再间隔2s依次加入200μlMAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl34%SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定A₆₆₀值。对照除了以双蒸水代替纯化蛋白外，其余同样品管。样品管与对照管的A₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到酶的酶活力（nkat/mg）。

2）半抑制量（IC₅₀）测定：上述反应液中添加0、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度（nkat/mg）为Y轴作图。

3）K _m （PEP）测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度（0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM）下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S]（Eadic-Hofstee）法作图。

4）K _i （glyphosate）测定：在不同草甘膦浓度（0、10、50、100μM）下测定PEP浓度为0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM时5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的酶反应速度。采取双倒数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦的浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为K_i(glyphosate)值。

2.测定结果

本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因酶活性为24.10.3nkat/mg，其动力学参数如下表2所示。

表2本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的动力学参数

根据表2的动力学参数可知：本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，与已经商业应用的来源于农杆菌CP4菌株（Agrobacteriumsp.strainCP4）的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶相比，具有相似的草甘膦抗性和PEP亲和性（农杆菌CP4的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的动力学参数为IC₅₀(glyphosate)11mM，K _m (PEP)3.5mM，K _i (glyphosate)6mM），表明来源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还与PEP保持较强的亲和性，这些特性为将本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因用于转基因作物的培育提供了可能。

实施例45-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的草甘膦耐受性实验

选择pG251(CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI和SacI(大连宝生物工程公司)酶切,同时将实施例1合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因用BamHI和SacI酶切，两者进行连接，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h。再将该载体转化入DH5α感受态中，得到p251-AroA-T.maritima。

以P1：(5’-CGGGATCCGTTAATGCCGAAATTTTGCTTAATC-3’)和

P2：(5’-CGGAGCTCAGGTCCGAAAAAAAACGCCGAC-3’)为引物，扩增大肠杆菌的EPSP合酶基因AroA-E.coli。以KODPlus(Toyobo日本)为TaqDNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30s，55℃30s，72℃90s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶(大连宝生物工程公司)，72℃延伸90s。将PCR片段用BamHI和SacI双酶切，同样连接到pG251得到p251-AroA-E.coli重组质粒。

将大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-T.maritima质粒)和ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)接种到含0-450mM草甘膦的M9液体培养基中，经过37℃、36h的摇床培养后，测定培养物的OD600进行耐受性试验，同时以无插入片断的质粒的大肠杆菌ER2799为阴性对照。

结果：将大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-T.maritima质粒)和ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)接种到含0-450mM草甘膦的M9液体培养基中，经过37℃、25-30h的摇床培养后，发现阴性对照在M9中几乎不能生长；而ER2799(携带p251-AroA-E.coli质粒)在150mM草甘膦的M9液体培养基中严重受到抑制；而ER2799(携带p251-AroA-T.maritima质粒)在含有400mM草甘膦的M9液体培养基中还能生长(参见图2)。由此结果可知本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因具有很强的草甘膦耐受性。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>SEQIDNo1

<211>1266

<212>DNA

<213>人工合成

ATGAAGGTTCTTCCTGCTAAGAAGGTTGAAGGTGTTCTTTCTGTTCCACCTGACAAGTCT60ATCACTCACAGAGCACTGATCCTGTCTGCTCTGGCTGAGACCGAGTCCACTCTCTACAAC120CTGTTGAGATGTCTGGACACCGAGAGAACCCACGACATCCTGGAGAAGCTGGGTACTAGA180TTCGAAGGTGACTGGGAGAAGATGAAGGTCTTCCCAAAGCCATTCGCTGAGCCAATCGAA240CCACTGTTCTGTGGAAACTCTGGTACTACTACCAGACTGATGTCTGGTGTCCTGGCATCC300TACGAGATGTTCACCGTCCTGTACGGTGATCCATCTCTGTCCAGAAGACCAATGAGAAGA360GTCATCGAACCACTGGAGATGATGGGTGCAAGATTCATGGCAAGACAGAACAACTACCTT420CCAATGGCAATCAAGGGAAACCACCTCTCTGGTATCTCCTACAAGACTCCTGTTGCATCT480GCTCAAGTCAAGTCTGCTGTCCTCCTTGCTGGTCTGAGAGCTTCTGGTAGAACCATCGTC540ATCGAACCAGCAAAGTCCAGAGACCACACCGAGAGAATGCTGAAGAACCTTGGTGTTCCT600GTCGAGGTTGAGGGTACTAGAGTTGTTCTGGAGCCTGCTACCTTCAGAGGTTTCACCATG660AAGGTCCCTGGTGACATCTCCTCTGCTGCATTCTTCGTCGTCCTTGGTGCTATCCATCCT720AACGCTAGAATCACCGTCACCGACGTTGGTCTGAACCCTACCAGAACTGGTCTGCTGGAA780GTCATGAAGCTGATGGGTGCTAACCTGGAGTGGGAGATCACCGAAGAGAACCTCGAACCA840ATCGGTACTGTTAGAGTCGAGACCTCTCCAAACCTGAAAGGTGTCGTCGTTCCTGAACAC900CTGGTCCCACTGATGATCGACGAACTGCCACTGGTCGCACTTCTGGGTGTCTTCGCTGAA960GGTGAGACCGTCGTCAGAAACGCTGAGGAGTTGAGAAAGAAGGAGTCCGACAGAATCAGA1020GTCCTGGTCGAGAACTTCAAGAGACTCGGTGTTGAGATCGAGGAGTTCAAGGACGGTTTC1080AAGATCGTCGGTAAGCAGTCCATCAAGGGTGGTTCTGTCGATCCAGAAGGTGATCACAGA1140ATGGCTATGCTGTTCTCCATCGCTGGTCTCGTCTCTGAAGAGGGTGTTGATGTCAAGGAC1200CACGAGTGTGTTGCTGTCTCCTTCCCTAACTTCTACGAACTGCTGGAGAGAGTCGTCATC1260TCCTAA1266

<210>SEQIDNo2

<211>421

<212>PRT

<213>海栖热袍菌(Thermotogamartima)

MetLysValLeuProAlaLysLysValGluGlyValLeuSerValPro

151015

ProAspLysSerIleThrHisArgAlaLeuIleLeuSerAlaLeuAla

202530

GluThrGluSerThrLeuTyrAsnLeuLeuArgCysLeuAspThrGlu

354045

ArgThrHisAspIleLeuGluLysLeuGlyThrArgPheGluGlyAsp

505560

TrpGluLysMetLysValPheProLysProPheAlaGluProIleGlu

65707580

ProLeuPheCysGlyAsnSerGlyThrThrThrArgLeuMetSerGly

859095

ValLeuAlaSerTyrGluMetPheThrValLeuTyrGlyAspProSer

100105110

LeuSerArgArgProMetArgArgValIleGluProLeuGluMetMet

115120125

GlyAlaArgPheMetAlaArgGlnAsnAsnTyrLeuProMetAlaIle

130135140

LysGlyAsnHisLeuSerGlyIleSerTyrLysThrProValAlaSer

145150155160

AlaGlnValLysSerAlaValLeuLeuAlaGlyLeuArgAlaSerGly

165170175

ArgThrIleValIleGluProAlaLysSerArgAspHisThrGluArg

180185190

MetLeuLysAsnLeuGlyValProValGluValGluGlyThrArgVal

195200205

ValLeuGluProAlaThrPheArgGlyPheThrMetLysValProGly

210215220

AspIleSerSerAlaAlaPhePheValValLeuGlyAlaIleHisPro

225230235240

AsnAlaArgIleThrValThrAspValGlyLeuAsnProThrArgThr

245250255

GlyLeuLeuGluValMetLysLeuMetGlyAlaAsnLeuGluTrpGlu

260265270

IleThrGluGluAsnLeuGluProIleGlyThrValArgValGluThr

275280285

SerProAsnLeuLysGlyValValValProGluHisLeuValProLeu

290295300

MetIleAspGluLeuProLeuValAlaLeuLeuGlyValPheAlaGlu

305310315320

GlyGluThrValValArgAsnAlaGluGluLeuArgLysLysGluSer

325330335

AspArgIleArgValLeuValGluAsnPheLysArgLeuGlyValGlu

340345350

IleGluGluPheLysAspGlyPheLysIleValGlyLysGlnSerIle

355360365

LysGlyGlySerValAspProGluGlyAspHisArgMetAlaMetLeu

370375380

PheSerIleAlaGlyLeuValSerGluGluGlyValAspValLysAsp

385390395400

HisGluCysValAlaValSerPheProAsnPheTyrGluLeuLeuGlu

405410415

ArgValValIleSer

420421

Claims (4)

1.一种源于极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotogamartima)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。

2.根据权利要求1所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO2所示。

3.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的制备方法，其特征在于，是将海栖热袍菌中的aroA-Tm基因利用基因合成法制备而成。

4.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在草甘膦耐受性中的应用。