CN103525843B - 组蛋白去乙酰化酶基因调控水稻种子淀粉发育的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物转基因领域，涉及组蛋白去乙酰化酶OsSRT1基因在调控水稻种子淀粉发育的应用。发现OsSRT1抑制植株中的H3K9乙酰化修饰显著增强,说明该基因是组蛋白H3K9去乙酰化酶基因。研究抑制该基因的转基因植株，发现该植株育性显著降低，大多数种子在受精3天后就停止发育，逐渐枯萎。观察发现种子在受精后2天胚乳淀粉含量减少。用Realtime-PCR检测淀粉合成基因的变化，发现在受精后1天和2天的种子中，OsSRT1抑制植株中淀粉合成基因表达量与野生型相比显著下降。确认OsSRT1通过影响组蛋白乙酰化修饰来调控种子淀粉合成。

Description

组蛋白去乙酰化酶基因调控水稻种子淀粉发育的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及与调控水稻种子淀粉发育相关的组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1的功能验证及应用。

背景技术

水稻在我国粮食生产中占有着很重要的地位。胚乳占精米的90%以上，是水稻直接被食用的部分，胚乳的发育直接影响着水稻的产量和品质。所以研究与水稻胚乳发育相关的基因在实际生产上有很重要的意义。

目前的研究发现水稻淀粉合成的主要场所是淀粉体和叶绿体，光合作用提供其合成原料。水稻籽粒中淀粉的生物合成是一个非常复杂的生物化学过程。叶片光合作用后的产物首先以蔗糖的形式运输到淀粉合成的主要器官胚乳细胞，转化为1-磷酸葡萄糖（G-1-P）后进入造粉体体内，分别在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉脱支酶的作用下形成直链淀粉和支链淀粉（Progress in Key Enzymes ofStarch Synthesis in Rice.Chinese Agricultural Science Bulletin,2009）。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成途径中很重要的酶，超表达或者反义抑制此酶会分别使淀粉的含量增加或者减少（One of twodifferent ADP-glucose Pyrophosphorylase Genes from Potato responds strongly to elevated levels of sucrose.Molecular Genetic Genet,1990）。水稻中含有两个编码AGPase大亚基的基因和4个编码AGPase小亚基基因，这些基因在淀粉合成的不同时期发挥着作用。淀粉合成酶分为两种，分别是游离于造粉体基质中的可溶性淀粉合成酶（SSS）和与淀粉结合存在的结合态淀粉合成酶（GBSS）。水稻中总共有5种淀粉合成酶，分别是GBSS、SSSⅠ、SSSⅡ、SSSⅢ和SSSⅣ。研究发现结合态的淀粉合成酶主要负责直链淀粉的合成。例如，Wx基因编码的GBSSⅠ是调控直链淀粉合成的关键（水稻蜡质基因分子特性的研究.植物生理学报,1991）。除此之外，淀粉分支酶和脱支酶也会影响淀粉的发育（Progress in Key Enzymes of Starch Synthesisin Rice.Chinese Agricultural Science Bulletin,2009）。总之，淀粉的合成过程受到多种酶的调控。

水稻去乙酰化酶基因OsSRT1被抑制的植株会出现假病斑，超表达此基因的植株对百草枯的抗性增强，说明此基因具有抵抗氧化胁迫的功能（Down-Regulation of a SILENT INFORMATION REGULATOR2-RelatedHistone Deacetylase Gene,OsSRT1,Induces DNA Fragmentation and Cell Death in Rice.Plant Physiology,2007），目前此基因对水稻种子中淀粉发育的影响还未有报道。

本研究发现组蛋白H3K9去乙酰化酶基因OsSRT1被抑制后，转基因植株育性降低，种子淀粉含量减少。进一步观察发现，育性降低的原因是在受精后第3天种子停止发育，并且逐渐枯萎。细胞学观察发现受精后第二天，发育中的种子胚乳中的淀粉含量显著降低。Realtime-PCR检测淀粉合成基因的表达发现，在抑制植株中这些基因的表达明显受到了抑制。以上结果表明OsSRT1通过影响组蛋白H3K9乙酰化修饰来调控种子淀粉的发育。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过对水稻组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1抑制植株种子淀粉发育过程进行观察与分析以及相关分子机理的研究，确定该基因在水稻种子淀粉发育过程中的功能，为水稻产量和品质改良提供遗传资源。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人克隆得到水稻组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1，其核苷酸序列从SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第6个碱基开始到1457个碱基结束，共由1452个碱基组成。该基因共编码483个氨基酸。在此基因的翻译区内设计一段该基因特异的片段，构建到用于一种抑制表达载体pDS1301-OsSRT1-2（图1），然后转化籼稻品种明恢63，得到转基因水稻植株。转基因阳性植株表现为育性降低，种子淀粉含量减少等多种表型，同时检测到OsSRT1抑制植株中的组蛋白H3K9乙酰化修饰增强，控制淀粉合成的基因的表达量较野生型植株相比显著降低。这说明本发明的所克隆到的组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1可以通过调控种子中的淀粉的发育来影响水稻的育性和产量。

本发明的具体技术方案如下：

（1）从ChromDB数据库（http://www.chromdb.org/index.html）得到OsSRT1基因（基因登录号LOC_Os04g20270）的DNA序列，根据该序列设计引物对，以明恢63叶片的cDNA为模板，用引物FL-F和FL-R扩增获得OsSRT1的全长cNDA（翻译起始位点上游5个碱基至下游302个碱基)，得到的全长序列为SEQ ID NO:1所示（其中6-1457为编码区)的核苷酸序列，扩增该片段的引物FL-F和FL-R的DNA序列如下：

FL-F:5’-GAGAGATGTCACTTGGCTATGC-3’

FL-R:5’-GCAGCAATAAAAAATTGTCTCG-3’

（2）以扩增到得OsSRT1的全长cDNA为模板，扩增了OsSRT1的特异的片段区域,其核苷酸序列如SEQID NO:3所示，扩增该片段的引物对的DNA序列如下：

ds-F：5’-GGGACTAGTGGTACCAGTCCTGCAAGAGTTGCAAC-3’

ds-R：5’-GGGGAGCTCGGATCCCCAGCTTTCACATGCACTAG-3’

（3）构建抑制载体pDS1301-OsSRT1-2（见图1）。

（4）利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei Y等，Efficient tra-nsformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.1994，6:271-282.)将构建的抑制载体pDS1301-OsSRT1-2导入水稻受体明恢63，获得转基因阳性植株。

（5）PCR及Realtime-PCR方法分析鉴定转基因植株的基因型及其OsSRT1的表达量，并观察统计转基因植株种子发育的表型。

（6）用Western blot方法检测OsSRT1转基因抑制植株中组蛋白H3K9乙酰化修饰。

（7）利用Realtime-PCR方法分析OsSRT1转基因抑制植株中与种子淀粉发育相关基因的表达。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

水稻是全世界最重要的粮食作物之一，对缓解粮食短缺，尤其是保障我国的粮食安全有着重要的意义。在此前提下研究如何提高水稻产量和品质已经成为一项具有重要意义的科学课题。组蛋白去乙酰化酶被抑制后，组蛋白的乙酰化程度增强，但其对育性的影响还知之甚少。本发明通过研究OsSRT1的抑制植株具有育性降低、种子淀粉含量减少的表型，进而阐明此基因对淀粉发育的影响。这对水稻产量和品质的研究有着重要的指导意义，为水稻品质改良和新品种的选育提供新的方法。

附图说明

序列表SEQ ID NO1：是本发明克隆的水稻组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1的核苷酸序列，序列全长为1759bp，其中该序列的第6-1457位为编码区。

序列表SEQ ID NO2：是本发明克隆的水稻组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1的蛋白质的氨基酸序列，编码483个氨基酸。

序列表SEQ ID NO3：是本发明克隆的水稻组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1的构建双链抑制载体的特异核苷酸序列，序列长度为411bp。

图1A和图1B：分别显示抑制表达载体pDS1301（图1A）、pDS1301-OsSRT1-1（图1B上图）和pDS1301-OsSRT1-2（图1B下图）示意图。

图2：OsSRT1基因在转基因植株中的表达量。图中：M代表明恢63野生型对照；R1到R10代表转基因抑制阳性植株T0代。

图3：用Western blot分析OsSRT1抑制转基因植株中组蛋白H3K9乙酰化修饰变化。图中：M代表野生型明恢63；-CK代表OsSRT1转基因抑制阴性植株；R代表OsSRT1转基因抑制阳性植株。

图4：OsSRT1转基因抑制植株的结实率统计。图中：M代表野生型对照；R代表不同的转基因抑制家系的植株。

图5：受精3天和4天的籽粒的形态。图中：M代表野生型对照；R代表转基因抑制植株。

图6：对受精1天和2天的籽粒进行半薄切片观察。图中：M代表野生型对照；R代表转基因抑制植株。

图7：对100粒转基因植株的成熟种子的重量与野生型种子进行比较。图中：M代表野生型对照；R代表转基因抑制植株。

图8：对成熟种子的淀粉颗粒进行扫描电镜观察。图中：M代表野生型对照；R代表转基因抑制植株。

图9：Realtime-PCR对发育1天和2天的种子中淀粉发育基因的检测。图中：M代表野生型植株；R代表转基因抑制植株。

具体实施方式

实施例1：OsSRT1基因全长cDNA的扩增

对本发明所需要的基因OsSRT1（基因登录号LOC_Os04g20270），主要通过RT-PCR方法（参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），北京，科学出版社，2002版）进行扩增得到OsSRT1基因全长序列。具体操作如下：

1）抽提来自水稻品种眀恢63的幼苗叶片的RNA，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒（具体操作步骤见该试剂盒的说明书）；

2）RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：

①配制混合液1：总RNA 4μg，DNaseI 2U,10×DNaseI buffer 1μl，加DEPC（焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂）处理水（0.01％DEPC）到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA；

②20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAseI活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)；

④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟；

⑤配制混合液2：混合液1 10μl，5×first strand buffer 4μl，0.1M DTT（巯基乙醇）2μl，10mM dNTPmixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时；

⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟；

⑦-20℃保存反应最终产物。

上述反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

3）然后根据NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）公布的OsSRT1基因的全长cDNA序列，设计引物PCR扩增片段。PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10×PCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，正向引物和反向引物各0.4μl，LATaq酶0.2μl，加水至20μl（所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司）。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③58℃30秒，④72℃60秒，⑤从②－④循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。扩增出全长序列。

用来克隆OsSRT1全长的引物如下所示：

FL-F:5’-GAGAGATGTCACTTGGCTATGC-3’

FL-R:5’-GCAGCAATAAAAAATTGTCTCG-3’

4)将扩增出的全长连接到T/A克隆载体pGEMT-vector（购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，即美国Promega公司）上用T7和SP6引物测序验证。

实施例2：OsSRT1双链抑制载体的构建

对本发明所需要的基因，通过RT-PCR方法（参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002版）进行扩增得到OsSRT1特异的一段序列，具体步骤是：通过以自己扩增得到的OsSRT1全长cDNA为模板，寻找OsSRT1特异的序列设计引物，PCR扩增RNAi抑制片段。扩增产物通过T/A克隆连接到pGEMT-vector(购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，即美国Promega公司）进行测序验证。

用来克隆OsSRT1的RNAi抑制片段的引物如下所示：

ds-F:5’-GGGACTAGTGGTACCAGTCCTGCAAGAGTTGCAAC-3’

ds-R:5’-GGGGAGCTCGGATCCCCAGCTTTCACATGCACTAG-3’

具体步骤如下：

1）将带有OsSRT1的RNAi片段的T/A克隆用Kpn I和Bam HI酶切，回收目标条带，与Kpn I和Bam HI酶切的表达载体质粒pDS1301（山东农业大学山东省农业微生物重点实验室，储昭辉教授赠送）；参见文献：Chu等,Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in diseaseresistance in rice.Genes Dev,2006,20:1250-1255.）连接（所使用的内切酶均购自宝生物工程大连有限公司，使用方法及用量按照该公司提供的产品说明书；连接酶为上海英俊生物技术公司产品，用法及用量按照该公司产品说明书）；

2）连接产物通过电转化的方法（电转化仪为eppendorf公司产品，使用电压为1800v，操作方法见该仪器说明书）导入大肠杆菌DH10B（购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，即美国Promega公司），在含有250ppm卡那霉素（购自罗氏生物公司产品）的LA（LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002版）抗性培养基上涂皿培养；

3）将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002版报道的方法抽提质粒，用Kpn I和BamHI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的抑制表达载体：pDS1301-OsSRT1-1(该质粒的图谱见图1);

4）将带OsSRT1干涉片段的TA克隆用Spe I和Sac I酶切，回收目标条带，与Spe I和Sac I酶切的质粒pDS1301-OsSRT1-1连接，依据2）、3）步得到抑制表达载体：pDS1301-OsSRT1-2(该质粒的图谱见图1A)。

实施例3：双元Ti质粒载体的转化及转基因植株阳性和表达量检测

1)把新构建的抑制表达载体pDS1301-OsSRT1-2（来自实施例2）通过电转化的方法（参考文献和使用的电压参数如实施例2的步骤2）所述）导入农杆菌EHA105（购自澳大利亚CAMBIA实验室）菌株中,转化pDS1301-OsSRT1-2的菌株被命名为pDS1301-OsSRT1-2-EHA105。

2）将上步得到的pDS1301-OsSRT1-2-EHA105转化水稻品种明恢63，转化方法参照Hiei等人报道的方法（Hiei等,Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282.）进行。将所获得的T0代转基因植株命名为Rn，其中n=1,2,3…代表转基因的不同家系。

3)取T0代转化植株叶片抽提总DNA,DNA抽提方法为CTAB法（Zhang等，genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis,1992,Theor Appl Genet,83,495-499）。以叶片总DNA为模板，用PCR方法对双联抑制T0代转化植株用载体第一链引物（pMCG1F和pMCG1R）和第二链引物（pMCG2F和pMCG2R）进行阳性检测。

引物的序列如下：

pMCG1F:5′-CTGCTCCACACATGTCCATT-3’

pMCG1R:5′-CCCACCATCTTGTGGAGCTA-3’

pMCG2F:5’-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3’

pMCG2R:5’-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3’

以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反应总体积为20μl，具体反应体系是：模板100ng，10×PCR buffer2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，正向引物、反向引物（即pMCG1F和pMCG1R，pMCG2F和pMCG2R）各0.4μl，r-Taq酶0.2μl,加去离子水至20μl（所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、r-Taq酶等均购自宝生物工程大连有限公司）。PCR反应条件如下：①94℃ 4分钟，②94℃ 30秒，③57℃ 30秒，④72℃ 1分钟，⑤从②步－④步循环32次，⑥72℃ 7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％（质量/体积）的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。因为载体第一链引物（pMCG1F和pMCG1R）和第二链引物（pMCG2F和pMCG2R）片段为转化载体所特有，这样能扩增出′特异条带的转基因植株即为阳性植株。从T0代阳性植株上收种子（称为T1代），为T1代的大田种植和性状调查做准备。

3)为了检测双链抑制植株中的目标基因的表达量，申请人采用Real-time PCR的方法对转基因T0代植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自分蘖期的水稻叶片，RNA抽提用的试剂是采用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒（具体操作步骤见该试剂盒说明书）；按照实施例1的方法进行反转录，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测OsSRT1的表达量。试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。Real-time-PCR所用引物序列为：

OsSRT1RT-F:5’-GCTGCCAAGGAGCAGTGTC-3’

OsSRT1RT-R:5’-CAAGCAGGAGTAATCTGCAGAC-3’

最终得到的T0代转基因植株中OsSRT1表达结果见图4。R-1到R-10为最终得到的10个转基因家系，Realtime-PCR结果显示在转基因材料中，OsSRT1的表达与野生型明恢63相比，下降了约60%左右，说明抑制效果很好。

实施例4：转基因植株性状调查和淀粉合成基因的表达分析

从10株明恢63植株上，每株取3个穗子，进行结实率统计；选择2个T1代转基因家系，每个家系选择10个植株，每个植株上选择3个穗子，进行结实率统计；选择2个T1代转基因阴性家系，每个家系选择10个植株，每个植株上选择3个穗子，进行结实率统计（图4）。取野生型对照明恢63和OsSRT1抑制植株3个家系中发育1天和2天的籽粒，此时野生型对照MH63与OsSRT1抑制植株的籽粒宏观上还没有差异。按照实施例1中抽提RNA的方法抽提RNA，并反转录得到cDNA，按照实施例3中Realtime-PCR的方法检测淀粉合成基因的表达量（图9）。引物序列如下：

OsSSI-F:5’-GGGCCTTCATGGATCAACC-3’

OsSSI-R:5’-CCGCTTCAAGCATCCTCATC-3’

OsSSIIa-F:5’-GCTTCCGGTTTGTGTGTTCA-3’,

OsSSIIa-R:5’-CTTAATACTCCCTCAACTCCACCAT-3’

OsSSIIb-F:5’-TAGGAGCAACGGTGGAAGTGA-3’

OsSSIIb-R:5’-GTGAACGTGAGTACGTGACCAAT-3’

OsSSIIc-F:5’-GACCGAAATGCCTTTTTCTCG-3’

OsSSIIc-R:5’-GGGCTTGGAGCCTCTCCTTA-3’

OsSSIIIa-F:5’-GCCTGCCCTGGACTACATTG-3’

OsSSIIIa-R:5’-GCAAACATATGTACACGGTTCTGG-3’

OsSSIIIb-F:5’-ATTCCGCTCGCAAGAACTGA-3’

OsSSIIIb-R:5’-CAACCGCAGGATAACGGAAA-3’

OsSSIVa-F:5’-GGGAGCGGCTCAAACATAAA-3’

OsSSIVa-R:5’-CCGTGCACTGACTGCAAAAT-3’

OsSSIVb-F:5’-ATGCAGGAAGCCGAGATGTT-3’

OsSSIVb-R:5’-ACGACAATGGGTGCCAAGAT-3’。

实施例5：半薄切片观察受精后野生型和转基因植株籽粒的发育

在野生型对照明恢63和OsSRT1抑制植株3个家系的的雌配子授粉1天和2天之后，取发育1天和2天的籽粒，用FAA固定液（福尔马林（38%甲醛）1ml；冰醋酸1ml；70%酒精18ml）中4℃固定过夜。之后用乙醇进行梯度脱水（70%，80%，95%，100%（加伊红染色），100%），每个浓度脱水1h。脱水后的样品立即转移到预渗透液（无水乙醇：base liquid Technovit7100=1:1；Technovit7100，Kulzer,Germany）中，预渗透2h。之后样品转移到渗透液中（1g硬化剂Ⅰ溶于100ml base liquid Technovit7100），渗透3h。包埋（1ml硬化剂Ⅰ加入到15ml渗透液中混合即可配成包埋剂），50℃聚合48h。用Leica RM2265切片机切片，厚度1-2um。用微分干涉显微镜（Nikon Eclipse80i,Japan）观察拍照（图6）。

实施例6：利用扫描电镜观察成熟种子的淀粉排布

取明恢63和OsSRT1抑制植株的成熟种子，将种子横切，厚度2mm左右，用2.5%戊二醛（0.1M磷酸缓冲液，pH7.3）在4℃固定过夜。之后用0.1M磷酸缓冲液（pH7.3）漂洗3次，每次15min。然后用1%四氧化锇后固定2h，再用0.1M磷酸缓冲液（pH7.3）漂洗3次，每次15min。样品用10%二甲亚砜脱水6h，之后临界点干燥。用IB-5离子溅射仪（EIKO Ltd.,Tokyo,Japan）镀白金膜。用JSM-6390 PLV扫描电子显微镜（JEOL Ltd.,Tokyo,Japan），在10kV加速电压下观察拍照（见图8）。结果表明眀恢63种子的淀粉排布比OsSRT1抑制植株的种子的淀粉排布紧密。

Claims (1)

1.水稻组蛋白去乙酰化酶OsSRT1基因在调控水稻种子淀粉发育中的应用，其特征在于，所述的OsSRT1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。