CN106929498B - 组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发育中的应用 - Google Patents

组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发育中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发育中的应用，所述的组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族HD2亚家族，其作为负调控因子参与了种子发育过程，通过转基因及功能鉴定证实超量表达组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDT701后减小种子的宽度和厚度。因此，组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在培育水稻新品种中具有非常重要的理论及应用价值。

Description

组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发 育中的应用
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发育中的应用。
背景技术：
近些年，有关水稻种子大小性状的分子遗传调控机制研究，已取得了一定进展，例如研究人员利用QTL定位了一些水稻种子大小相关基因，其中GIF1在水稻种子发育时，控制着蔗糖运输卸载和灌浆，从而影响种子的饱满度；HGW基因编码一个含有泛素相关结构域蛋白，调控水稻抽穗期和粒重；GS1的水稻突变体中，植株的生长速率和灌浆程度都严重降低，突变体成熟期推迟、籽粒缩小、灌浆不饱满；GS3编码一个膜蛋白，是籽粒大小和器官大小的负调控因子；GS5编码一个调节籽粒大小的丝氨酸羧肽酶，是控制籽粒大小的正调节因子，过表达可使水稻籽粒明显变大；GW2编码一个环型E3泛素连接酶，位于细胞质中，通过将其底物锚定到蛋白酶体进行降解，从而负调节细胞的分裂，影响稻谷的粒宽和粒重；GW5编码一个核定位蛋白，该蛋白包含一个核定位信号和一个富精氨酸区域，通过酵母双杂交实验证实它与多聚泛素有相互作用，表明其可能通过泛素蛋白酶体途径负调节粒宽和粒重。FLO2在叶和发育的种子中大量表达，它是通过影响胚乳中储藏性物质的积累，在调控水稻籽粒大小和淀粉品质中发挥关键作用。
在真核生物细胞核中，基因组DNA由组蛋白以及其它一些蛋白共同组成了核蛋白复合物，即常说的染色质。染色质的结构是高度动态的，并且能够被与其相关的一些蛋白所调控。目前已知水稻中含有18个组蛋白脱乙酰化酶成员，可分为3大亚家族：RPD3/HDA1亚家族14个成员、SIR2亚家族2个成员和HD2亚家族2个成员(Fu,et al.2007)。
发明内容：
本发明的目的是提供组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发育中的应用，所述的组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的调控植物种子发育优选为调控种子粒形和/或调控种子粒重。
所述的调控种子粒形优选为粒宽和粒厚减少；所述的调控种子粒重优选为千粒重降低。
所述的植物优选为水稻。
本发明从水稻中克隆得到的属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族HD2亚家族的组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701的编码基因组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDT701，组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701作为负调控因子参与了水稻的种子发育过程，通过转基因及功能鉴定证实超量表达组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701，转基因植株的种子的宽度和厚度减少。因此，组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在培育水稻新品种中具有非常重要的理论及应用价值。
附图说明：
图1是pUbiO l301植物双元表达载体图。
图2是野生型种子WT和OsHDT701超表达转基因种子图片。
图3是野生型种子WT和OsHDT701超表达种子的千粒重统计，其中，A为去壳情况下，B为不去壳情况下，其中，HDT701OX1、HDT701OX4和HDT701OX7分别代表OsHDT701超表达转基因植株OX1种子、OsHDT701超表达转基因植株OX4种子和OsHDT701超表达转基因植株OX7种子。
图4是野生型种子WT和OsHDT701超表达种子的粒长、粒宽和粒厚统计，其中，A为去壳情况下，B为不去壳情况下，其中，HDT701OX1、HDT701OX4和HDT701OX7分别代表OsHDT701超表达转基因植株OX1种子、OsHDT701超表达转基因植株OX4种子和OsHDT701超表达转基因植株OX7种子。
图5是控制水稻粒形相关基因在野生型植株WT和OsHDT701超表达转基因植株OX1和OX7中的表达量检测，其中，HDT701OX1和HDT701OX7分别代表OsHDT701超表达转基因植株OX1和OX7。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。
实施例中所用水稻(Oryza sativa L.)中花11种子购于广东省农科院；TriZolReagent购自Invitrogen公司，其货号为：15596026；逆转录酶M-MLV购自Promega公司，其货号为：M1701；pGEM-T载体购自Promega公司，其货号为：A1360；标准营养液为国际水稻所标准营养液；LB、YM和AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
实施例1：OsHDT701基因的克隆
取水稻中花11的幼苗叶片部位，用TriZol Reagent提取叶片总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为M-MLV，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物：HDT701F：5’-CGATGGAGTTCTGGGGTCTTGA-3’，HDT701R：5’-CGTCACTTGGCGGGGTGCTTGG-3’进行常规PCR扩增，PCR反应条件为：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃90sec，30个循环；72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接于pGEM-T载体上，连接反应：PCR产物7μL，pGEM-T载体1μL，3U T4连接酶1μL，10×buffer 1μL，共10μL体积，16℃连接3h。取5μL连接产物，转到大肠杆菌DH5α中，加800mL LB液体培养基，复苏1h，涂于含100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB平板上(已经涂布X-gal/IPTG)，37℃过夜。挑取白色克隆，在含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中扩增培养，送交测序。扩增的目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框从第85位到975位碱基，长891bp，将此开放阅读框命名为组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDT701，其编码297个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701。
实施例2：OsHDT701超表达转基因水稻的获得
1.组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDT701超表达载体的构建
根据组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDT701全长设计引物，以水稻中花11的cDNA为模板，高保真扩增获得组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDT701全长，同时在两条引物5’端加上BamHI酶切位点，扩增引物为oxHDT701F：5’-CGGGATCCATGGAGTTCTGGGGTCTTGA-3’，(下划线部分为BamH I酶切位点)；oxHDT701R：5’-CGGGATCCTCACTTGGCGGGGTGCTTGG-3’(下划线部分为BamH I酶切位点)。扩增产物经BamH I酶切纯化后，回收目的DNA片段；用BamH I酶切表达载体pUbiO1301(在pCAMBIA 1301载体的多克隆酶切位点连上一个玉米泛素Ubiquitin l启动子，见图1)，T4连接酶连接，得到目的质粒，然后鉴定插入正反向后，将正向插入的阳性克隆质粒进行PCR和测序验证。pUbiO1301载体是在pCAMBIA1301载体的基础上接了一个玉米泛素启动子(组成型高表达启动子，Ubi promoter)，将组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDT701(如SEQ ID NO.1的第85位到975位碱基所示)接在此启动子后面，构建成组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDT701超表达载体，将此重组表达载体命名为pUbiOl301-OsHDT701。
2.重组质粒pUbiO l301-OsHDT701转化到农杆菌EHA105
取1μL重组表达载体pUbiOl301-OsHDT701与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰上放置30min。然后液氮速冻1min后，迅速转到37℃放置5min。加800μL无抗生素的YM培养基，28℃，100rpm转速中培养2～4h。将培养物涂到25mL YM平板，YM培养基中含卡那霉素和硫酸链霉素，浓度都为50mg/L。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2天)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为oxHDT701F和oxHDT701R。选取转入了重组表达载体pUbiOl301-OsHDT701的农杆菌EHA105克隆作为阳性克隆。
3.农杆菌介导的水稻遗传转化
(1)水稻成熟胚的诱导
水稻成熟种子去壳后，用70％乙醇浸泡1min，0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水清洗4次，种子放在无菌滤纸上晾干后，接种在诱导培养基上，26℃暗培养。10-15天后，切除胚根和胚乳，转接到继代培养基上，26℃暗培养。两周后继代培养一次，挑选适合大小、紧密和色泽淡黄的愈伤组织转到新的继代培养基上，26℃暗培养3天。
(2)农杆菌EHA105的培养
将含有重组表达载体pUbiO l301-OsHDT701的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50mg/L Str的YM平板上划线，28℃黑暗培养3天，挑取单克隆于加有同样抗生素的5mL液体YM培养基中，28℃，200rpm培养12～24h，然后取1mL发酵液转接到30mL新鲜的加有同样抗生素的液体YM培养基中，28℃，200rpm扩大培养4～5h，5500rpm离心10min后收集菌体，用液体AAM培养基(内含100μmol/L乙酰丁香酮(As))重新悬浮(OD600约为0.5)，置于28℃摇床轻微振荡培养15-30min，该农杆菌悬浮液即可用于转化水稻愈伤。
(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选状态较好(预培养3天、色泽淡黄)的颗粒状愈伤组织放入50mL无菌三角瓶中，加入准备好的农杆菌悬浮液，静置培养20min，每隔5min轻轻摇一下三角瓶。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，22℃黑暗培养3天。
(4)抗性愈伤组织的筛选
将共培养3天后的愈伤组织放在含有500mg/L的头孢霉素(Cef)的灭菌水中清洗，每次4-5min，共4-5次。然后将愈伤组织置于灭菌过的滤纸上吸干水分。将干燥后的愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素(Hyg)和500mg/L的头孢霉素(Cef)的筛选培养基上，26℃暗培养2周，转到新配制的含有50mg/L潮霉素(Hyg)和500mg/L的头孢霉素(Cef)的筛选培养基上继续筛选2周(大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织)。
(5)抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选一定大小、乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L Hyg和500mg/L Cef的预分化培养基上暗培养7天，然后转至分化培养基上在16h光/8h黑暗的光周期条件下培养，温度为26℃，光照强度为10000lux，一般经过6-10天就会有绿点出现，20-30天后进一步分化出小苗。
(6)生根、壮苗和移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约8cm左右时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。
(7)GUS染色检测转基因阳性植株
将转化得到的苗进行GUS染色。染色后为蓝色的为转基因阳性植株，反之为阴性植株。
实施例3：OsHDT701超表达植株种子变小
在对野生型和转基因植株整个生长发育阶段进行观察还发现，超表达OsHDT701后，转基因植株的种子的粒宽和粒厚都显著减少。如图2，OsHDT701超表达转基因植株OX1、OX4和OX7的种子明显比野生型种子小。接着对种子的千粒重、粒长、粒宽和粒厚进行了统计。统计结果如图3和图4所示，OsHDT701超表达转基因植株种子的千粒重、粒宽和粒厚与野生型种子相比显著减少，而对种子的粒长影响不大。因此OsHDT701基因参与到种子的发育过程当中，负调控种子的千粒重、粒宽和粒厚。
实施例4：基因表达模式分析
1.取穗长为10cm左右的野生型植株、OsHDT701超表达转基因植株OX1和OX7的穗子，迅速放置在液氮中速冻保存；
2.RNA提取：用Trizol reagent进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程严格按照Trizolreagent的RNA提取流程说明进行；
3.逆转录：采用M-MLV逆转录酶逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明书进行；
4.实时定量RT-PCR：将所得cDNA稀释5倍后作为模板，进行实时定量RT-PCR反应。反应体系及程序参照Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)说明书，在ABI 7500Real-timePCR仪上进行反应。每个反应设置3个重复，所得数据使用ABI 7500Real-time PCR system软件进行处理。
5.结果分析：
超表达OsHDT701种子的粒重、粒宽和粒厚较野生型种子显著减少，因此我们对影响粒形和灌浆相关的基因的表达量进行检测(如图5)。其中FLO2在HDT701超表达材料中极显著下降，对FLO2的研究显示它在发育的种子中高表达，过表达FLO2可以显著增大稻谷籽粒的大小，而我们HDT701超表达材料的种子变小，可能是FLO2的表达量下降引起的。由上述结果推测，OsHDT701可能通过调节粒形相关基因的表达水平，来调节种子的发育过程。
附：涉及到转基因水稻过程中用的培养基：
1)诱导、继代培养基：
定容至1000mL，pH 5.8。
2)共培养基：
定容至1000mL，固体培养基加Phytagel 3g/L，pH 5.2。
3)筛选培养基：
向诱导培养基中加入终浓度为50mg/L的潮霉素和终浓度为500mg/L的头孢霉素制备得到含有50mg/L潮霉素和500mg/L的头孢霉素的筛选培养基。
4)预分化培养基：
用时加入50mg/L的潮霉素和500mg/L头孢霉素，定容至1000mL，pH 5.8。
5)分化培养基:
用时加入50mg/L的潮霉素和500mg/L头孢霉素，定容至1000mL，pH 5.8。
6)生根培养基：
定容至1000mL，pH 5.8。
7)N6大量元素母液(20×)：
每升母液中按成分称取对应的重量、依次溶解后加入，然后加水定溶至1000mL。
8)B5微量元素母液(1000×)：
每升母液中按成分称取对应的重量、依次溶解后加入，然后加水定容至1000mL。
9)铁盐(200×)：
Na2EDTA·2H2O 7.46g
FeSO4·7H2O 5.56g
分别溶解后混匀，定容至1000mL。
10)维生素储存液(1000×)：
每升母液中按成分称取对应的重量、依次溶解后加入，加水定容至1000mL。
11)肌醇(100×)：
肌醇 10g
加水定容至1000mL。
12)MS大量元素母液(20×)：
每升母液中按成分称取对应的重量、依次溶解后加入，加水定容至1000mL。
13)MS微量元素母液(1000×)：
每升母液中按成分称取对应的重量、依次溶解后加入，加水定容至1000mL。
14)MS维生素(1000×)：
每升母液中按成分称取对应的重量、依次溶解后加入，加水定容至1000mL。
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701及其编码基因和应用
<160> 2
<210> 1
<211> 1284
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa L.）
<400> 1
gagccttaaa ccctagctcc gcctcccacc tcccttttct tttctagggt tcttccgccg 60
ccgccgccgc cgccgccgat tccgatggag ttctggggtc ttgaagtcaa gcctggacag 120
actgtcaaat gtgagcctga agatgaacgc tttttgcacc tttctcaggc tgctcttggg 180
gaatcaaaga aaggatctga caatgcagta atgtatgtta aaactgatga tcaaaagcta 240
gtcattggaa ccctctcagc tgacaagttc cctcaaatcc agtttgattt ggtctttgac 300
aaagagtttg agctgtcaca cacttcaaag actgctagtg tgttcttttc tggctacaaa 360
gtttcccagc cggctgagga agatgaaatg gattttgatt ctgaagaagt tgaagatgaa 420
gaggaggaag aaaagatcat tccagctccc agggcaaatg gcaaagttga agggaaggaa 480
aatgagcaga aaaaacaagg caagacagat tcttcagctt caaaatcaaa ggctgcagtg 540
aatgacgatg atgatgatga tgacagtgat gaggatgatt ctgaggacga agatctttct 600
cctgaggatg atgatgatga ttcttctgag gatgattcca gcgaagatga tgaggatgag 660
agtgacgagg aagatactcc caagaagcca gagactggaa agaggaaagt agctgaaatt 720
gtgttgaaga caccttcgtc tgataagaaa gcaaagattg ctacaccgtc aggccagaag 780
acaggtgaca agaagggtgt ccatgtagca actccacatc cggcaaagca ggctagcaag 840
acccccgtga atgacaagtc aaaggagaag tccccaaaat ccggtggtgg gtcaatttct 900
tgcaagtcat gcagcaagac gttcaacagt gaaatggctc tgcaatctca ctcgaaggcc 960
aagcaccccg ccaagtgaag aatgagacaa cggatgctga gctgagaaat attggtgtcg 1020
tttgagttgg ttatctgaaa tgaaatgaaa tgctgcaaac tatttggtgt tatgagtagt 1080
gtcgtgacgg tttatgtggt gcaaactatt tagtctagaa aaaaaaaatc tgtggtgcga 1140
actgagctac aattttattc ggtcaaggtc agtggagtga ttggtttatt ttggatggaa 1200
ttattgttct tccctgttat tcggttaatt cccacgagaa aggattgata acaccacact 1260
gaattgacta gctgaacaaa gtcg 1284
<210> 2
<211> 297
<212> PRT
<213> 水稻（Oryza sativa L.）
<400> 2
Met Glu Phe Trp Gly Leu Glu Val Lys Pro Gly Gln Thr Val Lys
5 10 15
Cys Glu Pro Glu Asp Glu Arg Phe Leu His Leu Ser Gln Ala Ala
20 25 30
Leu Gly Glu Ser Lys Lys Gly Ser Asp Asn Ala Val Met Tyr Val
35 40 45
Lys Thr Asp Asp Gln Lys Leu Val Ile Gly Thr Leu Ser Ala Asp
50 55 60
Lys Phe Pro Gln Ile Gln Phe Asp Leu Val Phe Asp Lys Glu Phe
65 70 75
Glu Leu Ser His Thr Ser Lys Thr Ala Ser Val Phe Phe Ser Gly
80 85 90
Tyr Lys Val Ser Gln Pro Ala Glu Glu Asp Glu Met Asp Phe Asp
95 100 105
Ser Glu Glu Val Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Lys Ile Ile Pro
110 115 120
Ala Pro Arg Ala Asn Gly Lys Val Glu Gly Lys Glu Asn Glu Gln
125 130 135
Lys Lys Gln Gly Lys Thr Asp Ser Ser Ala Ser Lys Ser Lys Ala
140 145 150
Ala Val Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Glu Asp Asp
155 160 165
Ser Glu Asp Glu Asp Leu Ser Pro Glu Asp Asp Asp Asp Asp Ser
170 175 180
Ser Glu Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Glu Asp Glu Ser Asp Glu
185 190 195
Glu Asp Thr Pro Lys Lys Pro Glu Thr Gly Lys Arg Lys Val Ala
200 205 210
Glu Ile Val Leu Lys Thr Pro Ser Ser Asp Lys Lys Ala Lys Ile
215 220 225
Ala Thr Pro Ser Gly Gln Lys Thr Gly Asp Lys Lys Gly Val His
230 235 240
Val Ala Thr Pro His Pro Ala Lys Gln Ala Ser Lys Thr Pro Val
245 250 255
Asn Asp Lys Ser Lys Glu Lys Ser Pro Lys Ser Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Ile Ser Cys Lys Ser Cys Ser Lys Thr Phe Asn Ser Glu Met Ala
275 280 285
Leu Gln Ser His Ser Lys Ala Lys His Pro Ala Lys
290 295 297

Claims (4)

1.组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发育中的应用，所述的组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的调控植物种子发育为调控种子粒形和/或调控种子粒重。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的调控种子粒形为粒宽和粒厚减少；所述的调控种子粒重为千粒重降低。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述的植物为水稻。
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