CN108990797A

CN108990797A - 一种抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法

Info

Publication number: CN108990797A
Application number: CN201810683166.6A
Authority: CN
Inventors: 张汉尧; 张先昂; 魏卓; 张越; 刘小珍; 李升星; 李贻沛
Original assignee: Southwest Forestry University
Current assignee: Southwest Forestry University
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2018-12-14

Abstract

本发明涉及一种组织培养技术，具体为一种抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，本研究以黄肉中华猕猴桃Hort 16A后代优良单株SWFU 02外植体材料进行研究，建立快速繁殖体系，同时使用秋水仙碱诱变处理中华猕猴桃SWFU 02的组织。对诱变后的中华猕猴桃SWFU 02施加PEG‑6000进行抗旱筛选，获得抗旱黄肉中华猕猴桃抗旱种质，为进一步在大田生产中推广抗旱优质中华猕猴桃打下基础。

Description

一种抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法

技术领域

本发明涉及一种组织培养技术，具体为一种抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法。

背景技术

猕猴桃是一种经济价值较高的经济林树种，对土壤、湿度和空气湿度的要求较严格。而中华猕猴桃的抗旱性比普通果树的抗旱性差。当水分不足时，枝条的生长会受阻，叶片变小，叶缘呈枯萎状，甚至会发生落叶、落果现象等。由于猕猴桃杂交育种通常会引入不良连锁基因，而需要多代的回交或自交等工作才能去除，加之猕猴桃的童期较长(一般3-5年)，又加上高杂合度和倍性变异等使得猕猴桃属的物种之间的杂交困难，难以通过人工育种的方式获取具备抗旱性能的新的猕猴桃种质。中华猕猴桃种Hort 16A是猕猴桃黄色肉质的栽培品种,其糖分和酸度平衡，口味受消费者欢迎，营养价值也大大超过绿心猕猴桃。公开号为CN104604682A的发明专利公开了一种“中华猕猴桃Hort 16A后代优良品系组培苗多倍体诱导方法”，提供了中华猕猴桃Hort 16A多倍体诱导方法，直接用组培苗叶片做为外植体，取材简单方便，但该技术方案并未获得稳定的抗旱种质。目前尚未有通过选育培育出稳定抗旱和中华猕猴桃品种的报道。

发明内容

针对目前中华猕猴桃种群干旱逆境下的适应性较差的问题，本发明提出一种抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法。

本发明的抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1）获取外植体：采摘健康且生长旺盛无病无虫害的中华猕猴桃SWFU02的叶片作为外植体，置于流水下冲洗后进行消毒灭菌；将消毒后的外植体用无菌水充分的漂洗；

2）愈伤组织诱导及分化：基础培养基使用MS培养基，并添加蔗糖30g/L和琼脂4.5g/L，将pH值调整至5.8-6.0之间，光照强度设置为3200lx，每天光照时间15h，培养温度设置为25度，添加诱导剂培养20天，将产生的愈伤组织材料接入上述培养基，并添加激素培养30天；

3）诱导生根：基础培养基使用1/2MS培养基，其中加入蔗糖15g/L和琼脂4.5g/L，将pH值调整至5.8-6.0之间，光照强度设置为3200lx，每天光照时间15h，培养温度设置为25度，添加生根剂培养30天；

4）炼苗：将长势旺盛生根正常的组培苗放置在室温条件下，将组培瓶的瓶盖打开并掩住，经过10天炼苗之后，将小苗取出移栽到基质中，移栽基质为进口泥炭：炉灰：珍珠岩的比例为2:1:1，将其拌匀后使用，保持温度在26±3℃，湿度控制在80%以上，用多菌灵进行灌根处理；

5）多倍体诱导：采用秋水仙碱对中华猕猴桃SWFU02带有愈伤组织的叶片进行多倍体诱导，光照培养40天；

6）嵌合体分离：通过外部形态筛选出疑似多倍体的植株或者疑似多倍化的部位，将疑似变异的部位剥离下来和疑似变异的植株继续鉴定和分离6-8代直到变异性状稳定不分离，将疑似变异植株转入生根培养基中诱导不定根，鉴定筛选出纯合四倍体植株。将鉴定出的四倍体纯合植株作为母株进行扩繁得到稳定的四倍体猕猴桃组培苗；

7）PEG抗旱处理：将组培苗放入超净工作台中灭菌40分钟以上，放入超净工作台中灭菌40分钟以上，把浓度为70g/L的聚乙二醇（PEG）注入温度60℃左右还未凝固的生根培养基中并混匀，光照强度设置为3200lx，每天光照时间光照15h，温度设置为（25±3）℃；十四天后转入正常的生根培养基中，20天后可复绿的，即为抗旱中华猕猴桃种质。

最优的，步骤1）中消毒剂选用升汞和酒精，酒精浓度为70%，处理时长为15s，升汞浓度为10%，处理时长为3min的消毒效果最佳。使用升汞和酒精对外植体消毒灭菌的效果显著强于次氯酸钠和酒精，酒精和升汞的共同作用是影响外植体消毒效果的主导因子。

步骤2）中诱导剂选用ZT和IAA的组合， ZT浓度为0.5 mg/L-1.5 mg/L和IAA浓度为0.25 mg/L-0.75 mg/L。诱导愈伤组织时，ZT和IAA的处理诱导率75.56%要极显著（P=0.000<0.010）的高于激动素和IBA的组合的诱导率43.75%，且ZT的处理组合诱导出的愈伤颜色翠绿质地紧密，易分化成不定芽且褐化率低。

步骤2）中激素选用6-BA 1.5mg/L＋NAA 0.2 mg/L。用 2.5mg/L的ZT 继代培养时，中华猕猴桃‘SWFU02’可获得 76.67 %愈伤组织的分化率。作为本发明的优选方案，6-BA1.5mg/L＋NAA 0.2 mg/L激素配方处理中华猕猴桃‘SWFU02’，可获得 73.33%愈伤组织的分化率，且使用成本远低于2.5mg/L的ZT，经济效益较好，易于商业推广。

步骤3）中生根剂选用4.5g/L Agar＋15g/L Sucrose＋0.75mg/L IBA＋100mg/LAC。该配方生根数及生根率明显优于现有技术提供的生根剂方案，生根率可达93.3%。

步骤5）中采用秋水仙碱混培法诱导，既在0.15%浓度的秋水仙碱溶液下处理180h，其诱导率为20.00%，死亡率为3.3%，污染率为13.3%。用秋混培法的诱导率显著优于浸渍法。

步骤6）所述的四倍体植株筛选方法，采用鉴定筛选方法采用形态学和气孔鉴定方法，具体为：四倍体的叶片厚度均值为0.68mm，四倍体的气孔太小为54μm。常规的四倍体鉴定方法为染色体鉴定或流式细胞仪鉴定，其中染色体鉴定方法通过平均根染色数来判定四倍体，流式细胞仪鉴定通过荧光强度判定四倍体，这两种方法鉴定相结合结果精确但存在成本高、用时长的缺点。

本发明公开的通过形态学和气孔鉴定方法，四倍体的叶片厚度均值为0.68mm和二倍体1.35mm，之间的差异呈极显著（P=0＜0.01）；气孔大小的四倍体为54μm和二倍体为24μm之间也呈差异极显著（P=0＜0.01）。对比看出，四倍体和二倍体在叶脉粗细、叶片厚度和气孔大小上的差异，鉴定筛选的方式简便快捷，成本较低，此方法在现有文献中尚未记载，具备一定创造性。

为体现本发明猕猴桃四倍体的抗旱特性，发明人对二倍体植株进行了同样的PEG抗旱处理，在浓度为70g/L的聚乙二醇（PEG）的干旱胁迫条件下，中华猕猴桃‘SWFU02’二倍体组培苗和四倍体组培苗的生长受到了不同程度抑制。随着胁迫时间的延长至第七天，二倍体组培苗幼嫩叶片首先出现了干枯和卷曲，成熟叶片也出现部分干枯黄化，并且发生了卷曲，其根尖也出现少部分褐化现象。在第七天时，中华猕猴桃‘SWFU02’四倍体仅有少部分叶片出现黄化的现象，其根部也仅有少部分褐化。到第十四天时，随着胁迫时间的增长二倍体组培苗完全死亡，叶片干枯卷曲并且脱落，整个根系完全褐化干枯死亡。而中华猕猴桃‘SWFU02’四倍体的新叶和部分成熟叶片也出现干枯脱落死亡的现象，并且成龄叶片也出现了叶缘黄化叶片上叶出现了一定的黄褐色斑点，出现了萎蔫的迹象，组培苗的茎出现了皱缩和黄化，根系也有部分褐化死亡，没有新根系长出。两周（即十四天）为四倍体可复绿的关键时间点。

植物体抗旱是一个复杂的生物体性状，是多方面生理功能协作完成的结果。发明人通过测定抗旱筛选处理后的四倍体植株的生理指标发现，海藻糖是干旱胁迫主要的保护物质，左旋葡萄糖醛酸是次级保护物质。在基因表达的层面，中华猕猴桃SWFU02四倍体的合成干旱胁迫主要保护物质的相关基因TPS1和DLD2的表达水平显著高于二倍体。这就直观的反应出中华猕猴桃‘SWFU02’四倍体苗的杰出抗旱性。

本研究以黄肉中华猕猴桃Hort 16A优良单株SWFU 02外植体材料进行研究，建立快速繁殖体系，同时使用秋水仙碱诱变处理中华猕猴桃SWFU 02的组织。对中华猕猴桃SWFU02变异体施加PEG-6000进行抗旱处理，获得抗旱黄肉中华猕猴桃抗旱种质，为进一步在大田生产中推广抗旱优质中华猕猴桃打下基础。

具体实施方式

实施例1：抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

获取外植体：采摘健康且生长旺盛无病无虫害的中华猕猴桃SWFU02的叶片作为外植体，置于流水下冲洗后进行消毒灭菌，消毒剂选用升汞和酒精，酒精浓度为70%，处理时长为15s，升汞浓度为10%；将消毒后的外植体用无菌水充分的漂洗；

愈伤组织诱导及分化：基础培养基使用MS培养基，并添加蔗糖30g/L和琼脂4.5g/L，将pH值调整至5.8-6.0之间，光照强度设置为3200lx，每天光照时间15h，培养温度设置为25度，添加诱导剂培养20天，诱导剂选用ZT和IAA的组合， ZT浓度为0.5 mg/L-1.5 mg/L和IAA浓度为0.25 mg/L-0.75 mg/L；将产生的愈伤组织材料接入上述培养基，并添加激素培养30天，激素选用6-BA 1.5mg/L＋NAA 0.2 mg/L；

诱导生根：基础培养基使用1/2 MS培养基，其中加入蔗糖15g/L和琼脂4.5g/L，将pH值调整至5.8-6.0之间，光照强度设置为3200lx，每天光照时间15h，培养温度设置为25度，添加生根剂培养30天，生根剂选用4.5g/L Agar＋15g/L Sucrose＋0.75mg/L IBA＋100mg/LAC；

炼苗：将长势旺盛生根正常的组培苗放置在室温条件下，将组培瓶的瓶盖打开并掩住，经过10天炼苗之后，将小苗取出移栽到基质中，移栽基质为进口泥炭：炉灰：珍珠岩的比例为2:1:1，将其拌匀后使用，保持温度在26±3℃，湿度控制在80%以上，用多菌灵进行灌根处理；

变异诱导：采用秋水仙碱对中华猕猴桃SWFU 02带有愈伤组织的叶片进行变异诱导，光照培养40天，中采用秋水仙碱混培法诱导，既在0.15%浓度的秋水仙碱溶液下处理180h；

嵌合体分离：通过外部形态筛选出疑似变异的植株或者疑似变异的部位，将疑似变异的部位剥离下来和疑似变异的植株继续鉴定和分离6-8代直到变异性状稳定不分离，将疑似变异植株转入生根培养基中诱导不定根，采用流式细胞仪和根尖染色体鉴定的方法筛选出纯合四倍体植株。将鉴定出的四倍体纯合植株作为母株进行扩繁得到稳定的变异猕猴桃组培苗；

PEG抗旱处理：将组培苗放入超净工作台中灭菌40分钟以上，放入超净工作台中灭菌40分钟以上，把浓度为70g/L的聚乙二醇（PEG）注入温度60℃左右还未凝固的生根培养基中并混匀，光照强度设置为3200lx，每天光照时间光照15h，温度设置为（25±3）℃；十四天后转入正常的生根培养基中，20天后得到可复绿的抗旱中华猕猴桃种质。

本实施例中公开的诱导剂、激素、生根剂以及变异植株的诱导方法，仅为本发明的最佳实施方案。只要采用了本发明的技术方案，均应落入本发明的保护范围。

此外，发明人对以中华猕猴桃‘SWFU02’二倍体和中华猕猴桃‘SWFU02’四倍体组培苗为材料，进行了抗旱相关基因qPCR检测，发现：

在二倍体组培苗干旱胁迫中DLD2基因表达量qPCR结果2^^-∆∆Ct值为1.094294，在四倍体组培苗干旱胁迫中DLD2基因表达量qPCR结果2^^-∆∆Ct值为21.555737。在干旱胁迫下二倍体‘SWFU02’猕猴桃和四倍体‘SWFU02’猕猴桃的DLD2基因表达量，它们之间P值为0，表明‘SWFU02’猕猴桃四倍体和二倍体之间在干旱胁迫下DLD2基因表达量qPCR结果2^^-∆∆Ct值出现上调且有极显著的差异。

在二倍体组培苗干旱胁迫中TPS1基因表达量qPCR结果2^^-∆∆Ct值为1.094294，在四倍体组培苗干旱胁迫中TPS1基因表达量qPCR结果2^^-∆∆Ct值为3.723518。在干旱胁迫下二倍体‘SWFU02’猕猴桃和四倍体‘SWFU02’猕猴桃的TPS1基因表达量，它们之间P值为0，表明‘SWFU02’猕猴桃四倍体和二倍体之间在干旱胁迫下TPS1基因表达量qPCR结果2^^-∆∆Ct值出现降低且有极显著的差异。

实验结果表明在中华猕猴桃‘SWFU02’中海藻糖是干旱胁迫主要的保护物质。干旱胁迫时猕猴桃呼吸代谢增强，DLD2基因表达量显著上升，且四倍体DLD2的表达量显著高于二倍体。在基因表达的层面干旱胁迫中中华猕猴桃‘SWFU02’四倍体的抗旱能力优于二倍体。

Claims

1.抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

获取外植体：采摘健康且生长旺盛无病无虫害的中华猕猴桃SWFU02的叶片作为外植体，置于流水下冲洗后进行消毒灭菌；将消毒后的外植体用无菌水充分的漂洗；

愈伤组织诱导及分化：基础培养基使用MS培养基，并添加蔗糖30g/L和琼脂4.5g/L，将pH值调整至5.8-6.0之间，光照强度设置为3200lx，每天光照时间15h，培养温度设置为25度，添加诱导剂培养20天，将产生的愈伤组织材料接入上述培养基，并添加激素培养30天；

诱导生根：基础培养基使用1/2 MS培养基，其中加入蔗糖15g/L和琼脂4.5g/L，将pH值调整至5.8-6.0之间，光照强度设置为3200lx，每天光照时间15h，培养温度设置为25度，添加生根剂培养30天；

多倍体诱导：采用秋水仙碱对中华猕猴桃SWFU 02带有愈伤组织的叶片进行多倍体诱导，光照培养40天；

嵌合体分离：通过外部形态筛选出疑似多倍体的植株或者疑似多倍化的部位，将疑似变异的部位剥离下来和疑似变异的植株继续鉴定和分离6-8代直到变异性状稳定不分离，将疑似变异植株转入生根培养基中诱导不定根，鉴定筛选出纯合四倍体植株；

将鉴定出的四倍体纯合植株作为母株进行扩繁得到稳定的四倍体猕猴桃组培苗；

PEG抗旱处理：将组培苗放入超净工作台中灭菌40分钟以上，放入超净工作台中灭菌40分钟以上，把浓度为70g/L的聚乙二醇（PEG）注入温度60℃左右还未凝固的生根培养基中并混匀，光照强度设置为3200lx，每天光照时间光照15h，温度设置为（25±3）℃；十四天后转入正常的生根培养基中，20天后可复绿的，即为抗旱中华猕猴桃种质。

2.如权利要求1所述的抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于消毒剂选用升汞和酒精，酒精浓度为70%，处理时长为15s，升汞浓度为10%，处理时长为3min。

3.如权利要求1所述的抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于诱导剂选用ZT和IAA的组合， ZT浓度为0.5 mg/L-1.5 mg/L和IAA浓度为0.25 mg/L-0.75 mg/L。

4.如权利要求1所述的抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于激素选用6-BA1.5mg/L＋NAA 0.2 mg/L。

5.如权利要求1所述的抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于中生根剂选用4.5g/L Agar＋15g/L Sucrose＋0.75mg/L IBA＋100mg/L AC。

6.如权利要求1所述的抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于采用秋水仙碱混培法进行变异诱导，既在0.15%浓度的秋水仙碱溶液下处理180h，其诱导率为20.00%，死亡率为3.3%，污染率为13.3%。

7.如权利要求1所述的抗旱中华猕猴桃种质的诱导方法，其特征在于鉴定筛选四倍体的方法是形态学和气孔鉴定方法，具体为：四倍体的叶片厚度均值为0.68mm，四倍体的气孔太小为54μm。