CN109122293A - 一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物育种技术领域，公开了一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法，包括：玉米杂交种桂单0810做母本，诱导系CAU5做父本对母本进行杂交；授粉后母本材料果穗成熟，收获并干燥，从果穗上挑选出玉米单倍体籽粒；玉米单倍体植株真实性田间鉴定：播种玉米单倍体籽粒，挑选真实玉米单倍体植株；采用滴心法加倍玉米单倍体、叶面喷雾法加倍玉米单倍体；将玉米单倍体植株的雌穗在吐丝前用硫酸钠纸袋套袋，进行人工自交授粉；授粉期结束后，统计散粉的玉米单倍体植株数量并计算玉米单倍体加倍率。本发明操作方法简便，有利于保护操作人员的身体健康和减少对环境的危害。

Description

一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法

技术领域

本发明属于含有有机磷化合物的杀生剂、害虫驱避剂或引诱剂，或植物生长调节剂技术领域，尤其涉及一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：玉米新品种选育是推动玉米生产发展的主要因素。如在中国玉米产量增长的过程中，单产的提高对玉米总产增长的贡献率为68.4％(戴景瑞，2010)。在玉米新品种选育过程中，自交系创制是核心环节。二环系或者一环系法选育玉米自交系，需要经历6-8代自交过程，耗时长，效率低。随着技术的发展，传统育种方法结合仍是玉米育种技术的中坚力量，但新技术正在发挥越来越重要的作用。玉米单倍体育种技术因为其具有速度快的显著优势，正在被国内外育种企业和单位广泛使用。玉米单倍体育种技术始于1960年代。美国育种家选育出能够诱导玉米材料产生一定比例单倍体的特殊玉米自交系stock6。利用stock6对普通玉米授粉，授粉果穗上有一定比例的籽粒是单倍体。即这部分籽粒的染色体比正常玉米籽粒的染色体减半。正常玉米植株的染色体为二倍体，染色体数为2n＝20条，而单倍体玉米植株的染色体只有2n＝10条。单倍体植株经过染色体加倍，就可育成遗传背景100％纯合的双单倍体纯系即DH系。DH系可直接利用来与传统的玉米自交系杂交，选育玉米新品种。或者DH系间相互杂交，选育玉米新品种。DH系的育成过程简单，速度快。其过程主要分为两步。第一步为诱导单倍体。利用诱导系的花粉对育种材料授粉，采收授粉果穗，从中挑选出玉米单倍体籽粒。第二部为单倍体加倍。将获得的玉米单倍体籽粒播种，然后利用一定的技术手段对玉米单倍体植株染色体加倍，加倍成功的单倍体植株具有开花散粉能力，对其自交后获得的自交果穗，即是DH系。这一过程一般耗时只需一年。在可实现玉米一年两季种植的南方热带地区，只需一年即可育成双单倍体纯系。而在温带地区，虽然当地玉米只能一年一季，可以通过利用温室大棚加代，或者将种子带到海南加代，也能实现一年即可选育出DH系的目标。目前，经过多代育种家的接力研究与改良，诱导系的诱导能力已获得显著提高。Coe选育的stock6，授粉后产生玉米单倍体的频率为1％左右，不利于玉米单倍体大规模生产。后来各国育种家经过努力，选育了诱导率更高的诱导系，如KWS公司的，中国农业大学选育的农大高诱1号，农大高诱5号等，诱导率有了大幅提升。农大高诱5号平均诱导率为9.76％，利用效率高于农大高诱1号，也显著或极显著高于原始诱导系Stock6。最近几年育成的诱导系，其诱导率高于10％有吉高诱3号。诱导率的大幅提升，使得规模化诱导玉米单倍体成为现实，有效解决了玉米单倍体群体量的问题。玉米单倍体染色体加倍是玉米单倍体技术应用的核心环节。通过诱导获得的玉米单倍体，需要对其染色体进行加倍，才能正常授粉结实，产生下一代，成为DH系。然而，玉米单倍体由于仅有一套染色体，具有天然不育性。单倍体植株一般表现为不育，主要表现为雌穗不能正常吐丝，吐丝后授粉不能结实或者散粉不正常，无法通过自交授粉获取下一代种子。研究证明，可通过自然加倍或者人工加倍措施处理玉米单倍体植株、雌穗和雄穗染色体加倍成为正常二倍体，使其能够正常吐丝散粉，然后自交，获得双单倍体纯系种子。通过自然加倍，受玉米育种基础材料的遗传背景影响，一般雄穗自然加倍结实率低于10％，极少有材料能达到10％及以上。因此，如何提高玉米单倍体加倍率，增加获得双单倍体纯系的机会，提高玉米单倍体育种效率，是当前玉米单倍体育种技术应用面临的主要问题。玉米单倍体加倍中，雌穗的自然加倍率高，一般都能达到90％以上，因而不是影响玉米单倍体加倍效率的瓶颈因素。玉米单倍体加倍效率的主要限制因素是雄穗加倍率低。大量结果显示，玉米单倍体植株雄穗由于不育，不产生可育花粉，因而使玉米单倍体育种技术应用面临困难。秋水仙素是解决这个问题有效化学试剂。秋水仙素处理可干扰有丝分裂，抑制纺锤体的形成，使分裂处于中期，分裂后期染色体不能移向两极，形成染色体加倍的细胞核，获得双单倍体植株。秋水仙素被广泛应用于细胞加倍处理，也是其他植物染色体加倍的有效试剂。然而由于秋水仙素有剧毒，中毒后引发恶心、呕吐、腹泻、腹痛、胃肠反应是等症状，甚至引起癌症，严重中毒可致人死亡。同时，使用秋水仙素废液的处理也比较复杂，如果处理不当，对人身安全和环境造成潜在危害。鉴于秋水仙素的毒性，在应用过程中造成对操作员和环境的不利影响，寻找低毒高效的加倍试剂成为当前研究的热点领域。玉米除草剂种类繁多，其中部分除草剂具有类似秋水仙素的功能。当使用低剂量的除草剂溶液处理玉米单倍体，可以起到使玉米单倍体植株的染色体加倍的作用。经过筛选试验，发现除草剂具有使玉米单倍体植株的染色体加倍的效果。甲基胺草膦、炔苯酰草胺和氟乐灵等除草剂等都对玉米单倍体的染色体具有加倍作用。前人利用除草剂加倍玉米单倍体的研究结果中，采用滴心法的加倍率达到27.9％，采用浸芽法的加倍率达到17.9％。本专利采用滴心法加倍率可达38.5％，采用叶面喷雾法可达21.7％，加倍效果优于前述研究方法。而本专利采用叶面喷雾法从操作步骤方面，要比浸芽法简便。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有玉米单倍体植株雄穗由于不育，不产生可育花粉，雄穗加倍率低，给玉米单倍体育种技术应用带来困难。

(2)现有使用的秋水仙素有剧毒，使用秋水仙素废液的处理也比较复杂，如果处理不当，对人身安全和环境造成潜在危害，中毒后引发恶心、呕吐、腹泻、腹痛、胃肠反应是等症状，甚至引起癌症，严重中毒可致人死亡，给操作人员身体带来危害。

解决上述技术问题的难度和意义：本发明提出的利用滴心法和叶面喷雾法加倍玉米单倍体，对解决玉米单倍体育种程序中决定DH系获得效率的瓶颈因素做了探索和优化，提高玉米单倍体加倍率，增加获得DH系的数量，简化操作方法以及使用低毒化学试剂减少对操作人员及环境的危害等方面比现有方法均具有明显的改进效果。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法。

本发明是这样实现的，一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法，所述利用除草剂加倍玉米单倍体的方法的除草剂为地乐胺或氨磺乐灵；除草剂剂浓度为30-100umol/L；处理时间为玉米单倍体苗3-6叶期；除草剂溶液助剂为吐温40-80或二甲基亚砜；助剂浓度为1-3％。

进一步，所述利用除草剂加倍玉米单倍体的方法包括以下步骤：

步骤一，以玉米杂交种桂单0810做母本，利用诱导系CAU5做父本对母本进行杂交；待授粉后的母本材料果穗成熟，收获并干燥，从果穗上挑选出玉米单倍体籽粒；

步骤二，获得的玉米单倍体籽粒进行播种，从中挑选真实玉米单倍体植株；

步骤三，玉米单倍体加倍，采用滴心法加倍玉米单倍体、叶面喷雾法加倍玉米单倍体；

步骤四，在玉米单倍体开花散粉期，将玉米单倍体植株的雌穗在吐丝前用硫酸钠纸袋套袋，并分别取花粉进行人工自交授粉；对能正常散粉的植株做好标记；授粉期结束后，统计散粉的玉米单倍体植株数量并计算玉米单倍体加倍率。

进一步，所述步骤二倍体利用细胞学鉴定方法，取待测玉米单倍体植株根尖细胞，利用显微镜或者流式细胞仪观察细胞中的染色体数目，正常玉米植株染色体数为2n＝20，玉米单倍体植株染色体数为2n＝10。

进一步，所述步骤三具体包括：

(1)利用滴心法加倍玉米单倍体；将地乐胺，氨磺乐灵除草剂配制除草剂溶液，浓度为60-100umol/L，待玉米单倍体植株生长至3-6叶期，用带刻度的胶管将上述除草剂溶液滴入玉米心叶，每株玉米单倍体苗滴入除草剂溶液0.5-1ml；

(2)待玉米单倍体植株生长至3-6叶期，用手持式小喷雾器将除草剂溶液喷在玉米叶片上，喷到玉米单倍体叶片表面湿润为止。

进一步，所述步骤三处理前如玉米单倍体苗心叶中有水，将水排除后进行滴心处理。

进一步，所述步骤四中玉米单倍体加倍率(％)＝散粉株数/处理玉米单倍体株数*100％。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明利用除草剂加倍玉米单倍体植株，除草剂具有对玉米单倍体加倍效果，且加倍成功的玉米单倍体植株授粉结实的籽粒，经种植鉴定，跟自然加倍或利用秋水仙素加倍获得的玉米双单倍体植株具有一致的结果。经除草剂加倍获得的DH系在田间的性状表现为植株整齐一致，散粉正常，具有典型的DH系表型。

本发明利用除草剂作为加倍试剂的玉米单倍体加倍方法，其加倍率最高可达到38.5％，加倍效果优于自然加倍法，能显著提高玉米单倍体加倍率。在玉米单倍体育种技术应用实践中，可比自然加倍法获得更多的DH系，且除草剂低毒，操作方法简便，有利于保护操作人员的身体健康和减少对环境的危害。

附图说明

图1是本发明实施例提供的利用除草剂加倍玉米单倍体的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明旨在解决现有玉米单倍体植株雄穗由于不育，不产生可育花粉，雄穗加倍率低，给玉米单倍体育种技术应用带来困难；现有使用的秋水仙素有剧毒，使用秋水仙素废液的处理也比较复杂的问题。本发明利用除草剂作为加倍试剂的玉米单倍体加倍方法，其加倍率最高可达到38.5％，加倍效果优于自然加倍法，能显著提高玉米单倍体加倍率。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的利用除草剂加倍玉米单倍体的方法使用的除草剂为地乐胺或氨磺乐灵；利用除草剂加倍玉米单倍体的方法为滴心法或者喷叶法；除草剂剂浓度为30-100umol/L；处理时间为玉米单倍体苗3-6叶期；除草剂溶液助剂为吐温40-80，或(和)二甲基亚砜；助剂浓度为1-3％。除草剂溶液浓度，助剂浓度是以有效成分计算的最终浓度。

如图1所示，本发明实施例提供的利用除草剂加倍玉米单倍体的方法包括以下步骤：

S101：玉米单倍体的产生：以玉米杂交种桂单0810做母本，利用诱导系CAU5做父本对母本进行杂交；待授粉后的母本材料果穗成熟，收获并干燥，从果穗上挑选出玉米单倍体籽粒；

S102：玉米单倍体植株真实性田间鉴定：获得的玉米单倍体籽粒进行播种，从中挑选真实玉米单倍体植株；

S103：玉米单倍体加倍，可以采用滴心法加倍玉米单倍体、叶面喷雾法加倍玉米单倍体；

(1)利用滴心法加倍玉米单倍体；

将地乐胺，氨磺乐灵除草剂按照表1的配方配制除草剂溶液，浓度为60-100umol/L，待玉米单倍体植株生长至3-6叶期，用带刻度的胶管将上述除草剂溶液滴入玉米心叶，每株玉米单倍体苗滴入除草剂溶液0.5-1ml，以未经除草剂溶液处理的同期播种的玉米单倍体材料作为对照；

(2)利用叶面喷雾法加倍玉米单倍体

待玉米单倍体植株生长至3-6叶期，用手持式小喷雾器将上述除草剂溶液喷在玉米叶片上，喷到玉米单倍体叶片表面湿润为止，以未经除草剂溶液处理的同期播种的玉米单倍体材料作为对照；

S104：玉米单倍体加倍率调查与计算：在玉米单倍体开花散粉期，将试验中的玉米单倍体植株的雌穗在吐丝前用硫酸钠纸袋套袋，并分别取花粉进行人工自交授粉；对能正常散粉的植株做好标记；授粉期结束后，统计散粉的玉米单倍体植株数量并计算玉米单倍体加倍率。

在本发明的优选实施例中，步骤S101中，玉米单倍体籽粒表现为胚乳顶端紫色，胚尖无紫色。

在本发明的优选实施例中，步骤S102中，挑选真实玉米单倍体植株，通过真实的玉米单倍体植株和正常玉米植株之间的特征差异，真实玉米单倍体植株具有长势弱，生长缓慢，叶片较窄小等特点；也可利用细胞学鉴定方法，取待测玉米单倍体植株根尖细胞，利用显微镜或者流式细胞仪观察细胞中的染色体数目，正常玉米植株染色体数为2n＝20，玉米单倍体植株染色体数为2n＝10。

在本发明的优选实施例中，步骤S103中，地乐胺：英文名称butralin，纯度为99％；氨磺乐灵：英文名称oryzalin。纯度为99％；吐温：英文名称tuwen，分析纯；二甲基亚砜：英文名称dimethyl sulfoxide，分析纯；除草剂溶液浓度，助剂浓度是以有效成分计算的最终浓度。

在本发明的优选实施例中，步骤S103中，处理前如玉米单倍体苗心叶中有水，需将水排除后进行滴心处理。

在本发明的优选实施例中，步骤S104中玉米单倍体加倍率(％)＝散粉株数/处理玉米单倍体株数*100％。

下面结合具体实施例对本发明的应用效果做详细的描述。

实施例1

1、玉米单倍体的产生

以玉米杂交种桂单0810(为广西壮族自治区农业科学院玉米研究所授权广西兆和种业有限公司销售的玉米杂交种，公众可从市场购买)做母本，利用诱导系CAU5(已在“一种玉米单倍体诱导系的选育方法及其专用引物”专利中披露，申请号：201510278331.6，公众可以从中国农业大学获得)做父本对母本进行杂交。待授粉后的母本材料果穗成熟后收获并干燥，从果穗上挑选出玉米单倍体籽粒。玉米单倍体籽粒表现为胚乳顶端紫色，胚尖无紫色。

2、玉米单倍体植株真实性田间鉴定

将上述方法获得的玉米单倍体籽粒播种，通过利用真实的玉米单倍体植株跟正常玉米植株间的特征差异挑选真实玉米单倍体植株。真实玉米单倍体植株具有长势弱，生长缓慢，叶片较窄小等特点。

也可利用细胞学鉴定方法，取待测玉米单倍体植株根尖细胞，利用显微镜或者流式细胞仪观察细胞中的染色体数目，正常玉米植株染色体数为2n＝20，玉米单倍体植株染色体数为2n＝10。

3、玉米单倍体加倍

3.1利用滴心法加倍玉米单倍体。

将地乐胺，氨磺乐灵除草剂按照表1的配方配制除草剂溶液，浓度为60-100umol/L。

待玉米单倍体植株生长至3-6叶期，用带刻度的胶管将上述除草剂溶液滴入玉米心叶。

处理前如玉米单倍体苗心叶中有水，需将水排除。每株玉米单倍体苗滴入除草剂溶液0.5-1ml。

以未经除草剂溶液处理的同期播种的玉米单倍体材料作为对照。

表1玉米单倍体除草剂溶液配方

3.2利用叶面喷雾法加倍玉米单倍体

待玉米单倍体植株生长至3-6叶期，用手持式小喷雾器将上述除草剂溶液喷在玉米叶片上，喷到玉米单倍体叶片表面湿润为止。

以未经除草剂溶液处理的同期播种的玉米单倍体材料作为对照。

玉米单倍体加倍率调查与计算

在玉米单倍体开花散粉期，将试验中的玉米单倍体植株的雌穗在吐丝前用硫酸钠纸袋套袋，并分别取花粉进行人工自交授粉。对能正常散粉的植株做好标记。授粉期结束后，统计散粉的玉米单倍体植株数量并计算玉米单倍体加倍率。

玉米单倍体加倍率(％)＝散粉株数/处理玉米单倍体株数*100％。

除草剂处理的玉米单倍体加倍结果

表2不同除草剂及方法处理的玉米单倍体加倍率统计表

6、结果

本发明利用除草剂加倍玉米单倍体植株，试验结果显示，除草剂具有对玉米单倍体加倍效果，且加倍成功的玉米单倍体植株授粉结实的籽粒，经种植鉴定，跟自然加倍或利用秋水仙素加倍获得的玉米双单倍体植株具有一致的结果。经除草剂加倍获得的DH系在田间的性状表现为植株整齐一致，散粉正常，具有典型的DH系表型。

本发明利用除草剂作为加倍试剂的玉米单倍体加倍方法，其加倍率最高可达到38.5％，加倍效果优于自然加倍法，能显著提高玉米单倍体加倍率。其应用意义在于，在玉米单倍体育种技术应用实践中，比自然加倍法获得更多的DH系，且该方法使用的除草剂低毒，操作方法简便，有利于保护操作人员的身体健康和减少对环境的危害。

本发明中，所使用的实验方法，如无特殊说明，均采用常规实验方法；所使用的杂交种，化学试剂，除草剂等，如无特殊说明，均可从试剂销售公司购买；玉米杂交种桂单0810为广西壮族自治区农业科学院玉米研究所授权广西兆和种业有限公司销售的玉米杂交种，公众可从市场购买或者从兆和种业有限公司购买。诱导系CAU5，公众可以从中国农业大学获得。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法，其特征在于，所述利用除草剂加倍玉米单倍体的方法的除草剂为地乐胺或氨磺乐灵；除草剂剂浓度为30-100umol/L；处理时间为玉米单倍体苗3-6叶期；除草剂溶液助剂为吐温40-80或二甲基亚砜；助剂浓度为1-3％。

2.如权利要求1所述的利用除草剂加倍玉米单倍体的方法，其特征在于，所述利用除草剂加倍玉米单倍体的方法包括以下步骤：

步骤一，以玉米杂交种桂单0810做母本，利用诱导系CAU5做父本对母本进行杂交；待授粉后的母本材料果穗成熟，收获并干燥，从果穗上挑选出玉米单倍体籽粒；

步骤二，获得的玉米单倍体籽粒进行播种，从中挑选真实玉米单倍体植株；

步骤三，玉米单倍体加倍，采用滴心法加倍玉米单倍体、叶面喷雾法加倍玉米单倍体；

步骤四，在玉米单倍体开花散粉期，将玉米单倍体植株的雌穗在吐丝前用硫酸钠纸袋套袋，并分别取花粉进行人工自交授粉；对能正常散粉的植株做好标记；授粉期结束后，统计散粉的玉米单倍体植株数量并计算玉米单倍体加倍率。

3.如权利要求2所述的利用除草剂加倍玉米单倍体的方法，其特征在于，所述步骤二可以利用细胞学鉴定方法，取待测玉米单倍体植株根尖细胞，利用显微镜或者流式细胞仪观察细胞中的染色体数目，正常玉米植株染色体数为2n＝20，玉米单倍体植株染色体数为2n＝10。

4.如权利要求2所述的利用除草剂加倍玉米单倍体的方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：

(1)利用滴心法加倍玉米单倍体；将地乐胺，氨磺乐灵除草剂配制除草剂溶液，浓度为60-100umol/L，待玉米单倍体植株生长至3-6叶期，用带刻度的胶管将上述除草剂溶液滴入玉米心叶，每株玉米单倍体苗滴入除草剂溶液0.5-1ml；

(2)待玉米单倍体植株生长至3-6叶期，用手持式小喷雾器将除草剂溶液喷在玉米叶片上，喷到玉米单倍体叶片表面湿润为止。

5.如权利要求2所述的利用除草剂加倍玉米单倍体的方法，其特征在于，所述步骤三处理前如玉米单倍体苗心叶中有水，将水排除后进行滴心处理。

6.如权利要求2所述的利用除草剂加倍玉米单倍体的方法，其特征在于，所述步骤四中玉米单倍体加倍率(％)＝散粉株数/处理玉米单倍体株数*100％。